CN101379393B - 基于液相色谱法的分析方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于液相色谱法的分析方法，以便迅速获得准确的温度梯度洗脱法。在该方法中，使柱(15)处于绝热状态，将流动相(1)从两条流动相送液流路(2a、2b)供给，混合后导入至柱(15)中。此时，将一条流动相送液流路(2a)的流动相温度设定成比在柱(15)中想要调节的温度范围的上限温度高的恒定温度，并将另一条流动相送液流路(2b)的流动相温度设定成比在柱(15)中想要调节的温度范围的下限温度低的恒定温度，通过调节两条流动相送液流路(2a、2b)的流量，使流动相的混合比率随时间而变化，从而使在柱(15)内的流动相的温度随时间而变化。由此来实施温度梯度洗脱法。
Description
技术领域
本发明涉及一种液相色谱法，将分析试料与流动相一齐导入分离柱，并通过检测器检测由该柱分离后洗脱出的试料的成分。
背景技术
液相色谱法(liquid chromatography)作为分析试料成分的分析技术正得到广泛应用。液相色谱法是利用物质相对于固定相与流动相(mobilephase)的这两相的分布状态的差别进行分离的方法，所述固定相形成在柱填充剂表面上或在毛细管内面上，所述流动相流经填充材料或毛细管柱的间隙，试料中的各成分根据其化学性质以不同的速度流过分离柱。
在对化学性质相互相差甚远的多种物质一齐进行分析时，分析所需要的时间会变长，但是由于若流动相的组成变化则物质的分布状态变化，通常采用使流动相组成随时间改变并在维持分离状态的同时缩短分析时间的流动相组成梯度洗脱法。
图4中表示使用了流动相组成梯度洗脱法的液相色谱仪。
在用于输送流动相1a、1b的流动相送液流路2a、2b上分别设置有送液泵5a、5b。送液泵5a、5b通过控制电动机的转速来调节送液量。流动相送液流路2a、2b在混合器11处进行合流，混合器11将流动相1a、1b混合后输送到分析流路12。在分析流路12中隔着试料注入部7设置有分离柱(separation column)15，并在柱15的下游设置有检测器19。
自试料注入部7注入的试料通过由混合器11混合后的流动相而被导入分离柱15中，按每个成分进行分离，由检测器19检测分离后的试料成分。
送液泵5a、5b通过控制装置21控制各自的送液量，并按照用于实现梯度洗脱法的规定的送液程序来改变送液量。
在这种液相色谱仪中，例如，如图5所示，从流动相A为100％、流
动相B为0％的送液状态开始分析，以渐渐地减小流动相A的浓度、增加流动相B的浓度的方式来改变流动相组成，最终使流动相A为0％、流动相B为100％，从而一边改变柱15中试料的保持力一边进行分析。尤其，这样使用多个送液泵在送液泵的下游侧将多个流动相合流的梯度方式被称为高压梯度方式(例如参照专利文献1)。并且，在图5中，纵轴的A、B坐标分别表示A液100％、B液100％。横轴为时间。
但是，在流动相组成梯度洗脱法中，由于检测器感应流动相的组成变化会引起基线的变动，所以，根据流动相的条件或检测方法有不能适用于分析的情况。
另外，仅使用流动相组成梯度洗脱法存在不能充分达到其目的的情况。
另一方面，由于温度也会使物质的分布状态改变，作为代替流动相组成梯度洗脱法的方法，提出了使柱周边的温度随时间改变的温度梯度洗脱法(例如参照非专利文献1)。在此方法中，通过从外部改变柱温度来改变柱内的流动相温度。
但是，在此方法中，由于因热介质的热容量、热介质或柱管材质的导热率及温度差而导热性变化，所以难以迅速且准确地使温度改变。而且，也有沿柱剖面方向产生温度梯度而易于引起峰形劣化的问题。因此，此提案的温度梯度洗脱法未得到广泛普及。
专利文献1：特开2003-98166号公报
非专利文献1：金泽秀子，“温度响应性色谱法”分析，2004年6月号，第303～308页
发明内容
本发明的目的是提供一种快速且准确的温度梯度洗脱法。
本发明着眼于若将不同温度的流动相任意地进行混合则能迅速地实现温度调节，并且将流动相在2条流路中调节成相互不同的恒定温度，以任意的混合比将其混合后使其流入被绝热的柱来实现目的。
即，本发明的基于液相色谱法的分析方法，将所要分析的试料与流动相一齐导入至分离用柱，并将在该柱中分离并洗脱出的试料成分用检测器
进行检测，该基于液相色谱法的分析方法包括如下步骤，以进行温度梯度洗脱法：使柱处于绝热状态；从2条流动相送液流路供给流动相，在混合后导入至柱中，此时，将一条流动相送液流路的流动相温度设定成比在柱中想要调节的温度范围的上限温度高的恒定温度，并将另一条流动相送液流路的流动相温度设定成比在柱中想要调节的温度范围的下限温度低的恒定温度；和通过调节2条流动相送液流路的流量，使流动相的混合比率随时间变化，从而使柱内的流动相的温度随时间变化。
在流动相的混合比率的时间变化中，包括：从恒定温度向另一恒定温度分阶段地变化的方式；和从低温向高温或从高温向低温连续变化的方式。本发明包含这两种方式。阶段地进行变化的方式具有控制简单的优点。另一方面，在随时间连续改变混合比率时，能够在柱内沿流动相的移动方向形成温度梯度。
在本发明中，从柱流出的液体的温度也随时间而改变。因此，有时检测器会因温度而灵敏度发生变化或基线发生变动。以避免这类问题为目的，优选将从柱流出的液体调节到恒定温度，此后导入检测器。
另外，由于若柱中所导入的流动相的流量改变则峰值的保持时间改变，因此以进行更准确的分析为目的，优选对2条流动相输送流路的流量进行调节，以使柱中所导入的流动相的流量为恒定。
在可以应用流动相组成梯度洗脱法的情况下，以提高梯度洗脱法的作用为目的，在基于本发明的梯度洗脱法中，可以与流动相组成梯度洗脱法并用，该流动相组成梯度洗脱法使从2条流动相送液流路供给的流动相的组成随时间变化。
本发明的液相色谱仪具备：分离用柱；绝热容器，其收纳柱；第1流动相送液流路，其具备送液泵、设定为比在柱中想要调节的温度范围的上限温度高的恒定温度的恒温器；第2流动相送液流路，其具备与送液泵不同的送液泵、设定为比在柱中想要调节的温度范围的下限温度低的恒定温度的恒温器，并输送与第1流动相送液流路中输送的流动相相同的流动相；混合器，其将从第1、第2流动相送液流路供给的流动相混合后向柱送出；试料注入器，其在向柱供给流动相的流路中注入想要分析的试料；检测器，其配置在柱的下游，对在柱中分离并洗脱出的试料成分进行检测；
和梯度控制器，其对第1、第2流动相送液流路的送液泵的流量进行调节，使在混合器中的流动相的混合比率随时间而变化；由此使柱内的流动相的温度随时间变化来进行温度梯度洗脱法。
在梯度控制器所控制的流动相的混合比率的时间变化中，有分阶段的变化和连续的变化，但为了在柱内形成沿着流动相的移动方向的温度梯度，梯度控制器连续进行所述混合比率的随时间的变化，对第1、第2流动相送液流路的送液泵的流量进行调节。
优选在柱与检测器之间还具备恒温器，其将来自柱的流出液的温度调节到恒定温度。
梯度控制器的优选形态是对第1、第2流动相送液流路的送液泵的流量进行调节，以使导入柱中的流动相的流量达到恒定。
作为第1、第2流动相送液流路，可以还具备流动相组成梯度结构，其使第1、第2流动相送液流路所输送的流动相的组成随时间而变化。
配置试料注入器的位置只要是能将试料注入到柱中供给有流动相的流路中位置即可，例如是第1或第2流动相送液流路，或是混合器与柱之间的流路。
虽然可调节的温度范围取决于流动相的组成，但是由于在流动相送液流路的恒温器中承受着由柱的流动阻抗所引起的高压，所以能够通过流动相的沸点上升对相当高的高温区域进行梯度分析。
(发明效果)
本发明的分析方法及液相色谱仪将流动相在2条流路上调节成相互不同的恒定温度，将其以任意的混合比混合后使其注入柱中，并且实施隔断来自柱的散热的方法，所以能够容易地使柱内的流动相的温度变化，并使原来困难的快速温度梯度洗脱法成为可能。
此外，由于与以往经由热介质对柱从外侧进行加温或冷却的方法不同，沿柱的剖面方向不产生温度梯度，所以不会招致峰形的劣化。
其结果，在本发明中，使高速且高精度的温度梯度洗脱法成为可能。
在本发明中连续地进行混合比率的随时间的变化时，由于沿柱中的流动相的流动方向产生温度梯度，所以利用其浓缩效果可以抑制柱内的物质的扩散，并达到高效率的分离。
若将从柱中流出的液体调节到恒定温度，然后导入检测器，则即便是示差折射光检测器那样对温度变化敏感的检测器也可以使用。
若使导入柱的流动相的流量恒定，则能提高峰值的保持时间的再现性，并提高测定精度。
若在本发明的温度梯度洗脱法中并用流动相组成梯度洗脱法，则可以实现更有效的梯度洗脱法。
附图说明
图1A是表示一个实施例的高速液相色谱仪的流路图。
图1B是表示另一实施例的高速液相色谱仪的流路图。
图2是表示进行了一个实施例的温度梯度洗脱时的色谱的波形图。
图3A是表示另一实施例的高速液相色谱仪的流路图。
图3B是表示本发明的另一实施例的高速液相色谱仪的流路图。
图4是表示具备现有的流动相组成梯度机构的高速液相色谱仪的流路图。
图5是表示流动相组成梯度动作中的流动相组成变化的曲线图。
图中：1，1a，1b-流动相；2a，2b-流动相送液流路；3-脱气装置；5a，5b-送液泵；7-试料注入器；9a，9b，17-恒温器；11-混合器；12-分析流程；13-绝热器；15-柱；19-检测器；21-梯度控制器。
具体实施方式
以下，利用实施例对本发明进行详细说明。
图1A是表示一个实施例的高速液相色谱仪的流路图。
该高速液相色谱仪具备将经过了对流动相1所含的气体进行脱气的脱气装置3后的流动相流路分支来送液的2条流动相送液流路2a、2b。一条流动相送液流路2a具备恒温器9a，其将送液泵5a、试料注入器7以及流动相设定为比想要在柱中调节的温度范围的下限温度低的恒定温度。另一条流动相送液流路2b具备恒温器9a，其将送液泵5b以及流动相设定为比想要在柱中调节的温度范围的上限温度高的恒定温度。
两条流动相送液流路2a、2b连接于混合器11。从混合器11开始的流
路12中连接有用于将试料按成分进行分离的分离柱15，在柱15的下游，隔着恒温器17连接有对利用柱15分离洗脱后的试料成分进行检测的检测器19。基于检测器19的情况，恒温器17可以省略。
混合器11和柱15以隔绝散热的方式收纳在绝热容器13中。如此图所示，优选从恒温器9a、9b的出口到柱15的出口为止收纳到绝热容器13中。
送液泵5a、5b连接于梯度控制器21，通过梯度控制器21对流动相送液流路2a、2b的送液泵5a、5b的流量进行调节，按照在混合器11中的流动相的混合比率随时间改变的方式对流动相送液流路2a、2b的送液量进行调整。
在恒温器9a、9b、17中收纳有基于不锈钢等的导热率高的材质的管，并以铝块或空气作为介质进行加热或冷却。混合器11及柱15和其配管的材质都采用如聚醚醚酮(P E E K)那样的导热率低的材质。
关于图1A的流路结构，流动相1通过脱气装置3将气泡脱气后，分配到2条流路2a和2b。在流路2a中利用送液泵5a，在流路2b中利用送液泵5b，分别通过梯度控制器21设定成任意的流量比进行送液。在2条流路2a和2b中，流动相在各恒温器9a、9b中被调节到各个不同的温度后，由混合器11进行混合，并供给到柱15。通常，以混合后的流动相流量为恒定的方式设定各个送液泵5a、5b的流量，恒温器9a的温度设定得比想要调节的温度的下限低，恒温器9b的温度设定得比想要调节的温度的上限高。例如，当将柱15中的流动相的流量设定为1.0mL/分、并实施从30℃到70℃的线性温度梯度洗脱时，将恒温器9a设定为25℃，将恒温器9b设定为75℃，并使送液泵5a的流量在1分钟内从0.9mL/分向0.1mL/分变化，同时使送液泵5b的流量在1分钟内从0.1mL/分向0.9mL/分变化。此流量变化由梯度控制器21来控制。此时，若液相色谱仪工作在理想的状态，则流动相的温度将在1分钟内从30℃到70℃随时间线性地连续变化。
由柱15分离后的试料成分经过恒温器17调节成恒定温度，并在检测器19中进行检测。
接着，更具体地说明此高速液相色谱仪。
在柱15中，例如采用反相色谱仪用柱Shim-Pack FC-ODS(注册商标)(内径3mm、长度100mm)。但是，柱15只要采用PEEK等导热率低的材料作为柱管，则其它就可选用任何材料。
此外，在检测器19中可使用吸光度检测器、荧光检测器、示差折射检测器、蒸发光散射检测器等，若需要则可再连接质量分析仪。
在流动相中，作为一个示例，采用水和乙腈(acetonitrile)的混合液。但是，流动相是根据要分析的物质进行选择的，而不受其种类或温度、pH等任一个的制约。
图1B是表示其它的实施例的图。与图1A的实施例相比，试料注入器7的位置不同。在此实施例中试料注入器7在流路12中被配置于混合器11与柱15之间。
试料注入器7也可配置在恒温器9a或9b与混合器11之间。
测定条件如下：
(1)分析条件
柱：Shim-Pack FC-ODS(注册商标)(内径3mm、长度100mm)
流动相：水与乙腈(acetonitrile)的混合液(容量比1∶1)
流量：1.0mL/分
温度：从30℃到70℃的1分钟的温度梯度
(2)检测条件
检测器：吸光度检测器
检测波长：260nm
在图2中表示使用图1A的高速液相色谱仪，在此测定条件下，对含有对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯及对羟苯甲酸丁酯的对羟苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)混合标准试料进行分析后的结果的色谱。横坐标是时间，纵坐标是表示检测强度的吸光度(mAU)。温度从30℃向70℃相对于时间呈线性上升。
根据此结果，对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯及对羟苯甲酸丁酯可在1分钟以内洗脱，并且很好地相互分离。由此可知，通过本发明的温度梯度洗脱法它们被迅速地分离。
进而，参照图3A和图3B，对其他实施例进行说明。
这些实施例还具备流动相组成梯度机构，其在本发明的温度梯度洗脱法中随时间改变流动相的组成。
流动相1a、1b连接于具备可分别调整流量的阀4a、4b的流路6a、6b。流路6a、6b经由脱气装置3a连接于被分支后的2条流动相流路2a、2b。阀4a、4b也连接于梯度控制器21，流动相1a、1b的组成随时间进行调节。
流动相2a、2b以及在它们下游的结构与图1A、1B相同。
在图3A、3B的流路结构中，流动相1a、1b按照阀4a、4b的开口比设定成规定流量比，将被混合后的流动相通过脱气装置3进行脱气后混合，并分配到2条流动相流路2a、2b。此后，与图1A、1B的实施例同样执行温度梯度。
在图3A、3B所示的流路结构的情况下，具有以下效果，例如，基于流动相1a和1b的组成的分配系数极不相同，进一步当基于温度的分配系数也极不相同时，利用两者性质的相乘效果分配系数将变得更不相同。因此，可以提供梯度效果更大的色谱仪。
Claims (12)
1.一种基于液相色谱法的分析方法，将所要分析的试料与流动相一齐导入至分离用柱，并将在该柱中分离并洗脱出的试料成分用检测器进行检测，
该基于液相色谱法的分析方法包括如下步骤，以进行温度梯度洗脱法：
使所述柱处于绝热状态；
设定一条流动相送液流路的流动相温度至比在所述柱中想要调节的温度范围的上限温度高的恒定温度，并设定另一条流动相送液流路的流动相温度至比在所述柱中想要调节的温度范围的下限温度低的恒定温度；
从2条流动相送液流路供给流动相，在混合后导入至所述柱中；和
通过调节所述2条流动相送液流路的流量，使流动相的混合比率随时间变化，从而使所述柱内的流动相的温度随时间变化。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
通过连续进行所述混合比率的随时间的变化，从而在所述柱内形成沿着流动相的移动方向的温度梯度。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
将从所述柱流出的液体调节到恒定温度后导入至所述检测器。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
调节所述2条流动相送液流路的流量，使导入至所述柱中的流动相的流量达到恒定。
5.如权利要求1～4中任一项所述的分析方法，其特征在于，
与流动相组成梯度洗脱法并用，该流动相组成梯度洗脱法使从所述2条流动相送液流路供给的流动相的组成随时间变化。
6.一种液相色谱仪，具备：
分离用柱；
第1流动相送液流路，其具备送液泵、设定为比在所述柱中想要调节的温度范围的上限温度高的恒定温度的恒温器；
第2流动相送液流路，其具备与所述送液泵不同的送液泵、设定为比在所述柱中想要调节的温度范围的下限温度低的恒定温度的恒温器，并输送与第1流动相送液流路中输送的流动相相同的流动相；
混合器，其将从第1、第2流动相送液流路供给的流动相混合后向所述柱送出；
绝热容器，其收纳所述柱和所述混合器；
试料注入器，其在向所述柱供给流动相的流路中注入想要分析的试料；
检测器，其配置在所述柱的下游，对在柱中分离并洗脱出的试料成分进行检测；和
梯度控制器，其对第1、第2流动相送液流路的送液泵的流量进行调节，使在所述混合器中的流动相的混合比率随时间而变化；
由此使所述柱内的流动相的温度随时间变化来进行温度梯度洗脱法。
7.如权利要求6所述的液相色谱仪，其特征在于，
为了在所述柱内形成温度梯度，所述梯度控制器按照连续进行所述混合比率的随时间的变化的方式，对第1、第2流动相送液流路的送液泵的流量进行调节。
8.如权利要求6所述的液相色谱仪，其特征在于，
在所述柱与检测器之间还具备恒温器，其将来自柱的流出液的温度调节到恒定温度。
9.如权利要求6所述的液相色谱仪，其特征在于，
所述梯度控制器对第1、第2流动相送液流路的送液泵的流量进行调节，以使导入所述柱中的流动相的流量达到恒定。
10.如权利要求6～9中任一项所述的液相色谱仪，其特征在于，
还具备流动相组成梯度机构，其使第1、第2流动相送液流路所输送的流动相的组成随时间而变化。
11.如权利要求6所述的液相色谱仪，其特征在于，
所述试料注入器配置于第1或第2流动相送液流路。
12.如权利要求6所述的液相色谱仪，其特征在于，
所述试料注入器配置于所述混合器与柱之间的流路。
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