CN101370927A - 可变容积电穿孔室以及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了一种室式装置，用于体外电穿孔相对较大容积的含有生物细胞或小泡的流体介质，其中用于含有所述细胞和小泡的储存器的容积可按照需要加以变化并且其中所选容积直接与待电穿孔样品的容积有关。该装置具有进一步的具体实施方式，其中室是易处理的并且可以以与患者分离或与其相连的方式进行操作。

Description

可变容积电穿孔室以及其方法
技术领域
本发明涉及体外细胞和小泡的电穿孔。更具体地说，本发明涉及在电穿孔室、尤其是总容积具有按照需要加以变化的易处理室中对细胞和小泡进行电穿孔。
背景技术
以下描述包括可以用于理解本发明的信息。它并不是承认：任何这样的信息是现有技术，或与目前要求的发明有关，或明确地或隐含地提及的任何出版物是现有技术。
电穿孔技术领域充满转染生物细胞和小泡的活体外方式。例如，授权给Meserol的美国专利第5,720,921号披露了一种电穿孔室，其被设计成连续液流室，其中小泡被输送到该室、电穿孔并在施加电穿孔脉冲以后被清洗。其它液流室包括授权给Nicolau(U.S.P.N.5,612,207)、Dzekunov(U.S.P.A.N.2001/0001064)、以及Vernhes(U.S.P.N.6,623,964)的美国专利。在每一种这些披露内容的情况下，对于电穿孔生物细胞的临床应用，液流室并不是一种最佳设计。这是因为为了无菌性必须解决的机械问题并且由于难以在细胞群体的电穿孔和当细胞连续通过室时所使用的脉冲之间建立联系。
还披露了其它的电穿孔室，其中并没有使用含有(承载)小泡的介质的连续液流，但电穿孔室装置包括各种元件。例如，授权给Marshall的美国专利第4,906,576号披露了一种室，其连同其它元件一起具有磁芯。授权给Jarvis的美国专利第6,897,069号披露了一种具有可移除电极的电穿孔样品室。其它室是用于处理小样品的小池型(cuvette style)，即，约250μl至1.5ml。还有其它室，如在授权给Walters的WO 04/083,379中所披露的，提供更大的容积，即，达到10毫升左右，但这样的室并不是动态的，因为室的尺寸是固定的并且采用的电极是两个平行板，该板仅用于包含小泡的介质的固定范围的电导率，其必须相对于容积/细胞密度和传送到固定容积室的电导率加以计算。在Walters专利中，例如，介质的电导率被降低，使得可以处理并在单个电穿孔事件中电穿孔较大的容积。具体地说，对介质进行调节，使得介质具有0.01至1.0毫西门子的电导率(100-1000欧姆的电阻)。
在许多情况下，调节介质的电导率并不是所希望的或不现实的，因为最理想的介质是盐水基介质，其是内在导电的并为细胞提供稳定的和能生存的环境。盐水基介质是优选的，因为它们被设计为提供接近地类似细胞的自然生活环境的环境，从而使细胞死亡降至最小程度。最广泛使用的介质之一是磷酸缓冲盐溶液(PBS)，其是内在导电的，这是起因于溶液的离子含量。
在基因治疗装置中通常需要活体外转染患者的细胞，其中从患者移出细胞，如祖细胞和其它所谓的“干”细胞，然后在细胞培养将细胞的数目扩大许多倍。因为通常在悬浮培养中进行细胞的扩大，所以这样的细胞在其中扩大的容积是非常可变的。另外，就它们在培养物中的存活而言以及就电穿孔过程而论，细胞密度是重要的。因此，在期望转染大量细胞的情况下，个别样品之间的容积差异可能是高度可变的。这意味着，在临床装置中，一种机构必须用来加入处理步骤以使样品之间的容积变得均匀，以致可以使用固定尺寸的电穿孔室，或必须存在一种机构，用于适应在这样的介质容积方面的差异而无需直接调节容积或细胞密度和/或适应介质的特定的低电导率。
另外，通常利用具有相对较高电导率的介质对悬浮液中的细胞进行电穿孔，如磷酸缓冲盐溶液(PBS)，其具有0.017西门子/cm的电导率。当试图电穿孔大量的包含能生存的生物细胞的介质时，甚至考虑使用具有0.4cm间隙的室，因此将需要较大的电流来同时对整个容积施加脉冲，这是由于试图施加脉冲通过较大横截面积所产生的低电阻，从而将可能受到损伤，或在脉冲条件下经受可变性。而一些发明已设法通过设计使用低电导率介质的***来克服这样的困难，这样的***的使用是不能实行的，因为低离子强度介质可能会损害细胞生存力。如最近在Current Gene Therapy(Vol.5，pp375-385，2005)中指出的，目前的电穿孔方法并不是一种可行的工具来转染某些细胞，这是由于较差的细胞存活(大约仅1％)，除非采用更加细胞友好的介质。然而，甚至先前改善的介质条件仅保证5-6％的细胞存活。
因此，在本技术领域需要促进使用活体外***来转染细胞和小泡如干细胞，其中采用大容积格式的分子，即，例如约1至高达100ml，其可以容易地和便宜地将上述分子传送到细胞而无需在每种情况下进行离子强度对容积对细胞密度的关键计算。因此，本发明通过提供在任何这样的容积下其电穿孔细胞的能力为动态的***来满足上述需要。
发明内容
在第一具体实施方式中，本发明提供了一种装置，用于活体外大容积电穿孔细胞和小泡，尤其是抗原呈递细胞、祖细胞和/或干细胞。一般地，这样的容积是在1至100ml之间、通常在5至75ml之间以及优选在10至50ml之间。干细胞是指来源于胚胎或成体来源的多能细胞，其保持可以被诱导以分化成各种细胞类型的表型，包括内胚层、中胚层以及外胚层(Mendez等人，2005)。其它有用的用途包括为了接种疫苗和治疗目的而转染免疫***的细胞。借助于本发明可以转染的免疫***的细胞包括单核细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞、树突细胞以及其它抗原呈递细胞。虽然本发明涉及使用人细胞，但借助于本发明也可以处理其它物种的细胞。
在第二具体实施方式中，本发明提供了一种用于电穿孔细胞和小泡的装置，其中所述装置包括一种这样的室，该室具有按照需要的能采取在1至100ml之间的任何递增的容积的能力。在一种有关的具体实施方式中，该装置可以在任何这样的容积下进行操作，而无需相对于电极的容积或表面积调节或计算比离子强度，其中电极与含有所述细胞或小泡的介质接触。
在第三具体实施方式中，本发明的室包括许多单独可寻址电极，在一种优选的具体实施方式中，其能够对流体介质的容积引发电脉冲而无需计算电极间隙与容积的比率，而如果仅使用跨越整个室的单电极对，则可能需要计算电极间隙与容积的比率。具体地说，对于使用的任何容积，脉冲条件(即，电压、脉冲形式、以及脉冲持续时间)与所述容积无关。在一种有关的具体实施方式中，包含细胞的流体介质的电导率可以包括可用于实施生物细胞和小泡的电穿孔的任何水平的电导率。例如，包含细胞的介质的电导率可以相当于磷酸缓冲盐溶液(PBS)或更小。
在另一种具体实施方式中，本发明的电穿孔室可以适应流体容积而没有暴露于露天环境，因而可以进行操作而不涉及或不需要在室中设计有空气过滤器或排气孔(air bleed orifice)。
在另一种具体实施方式中，许多电极包括一系列的平行“板”电极，其可以布置在本发明的室内使得所述板的长度在和对应的可变的容积可调节性相同的方向，即，柱塞的推拉方向进行延伸，或可以在与室容积扩大的方向成90度的方向进行延伸。在一种有关的具体实施方式中，单独的板可以包括任何有用的生物相容和导电材料，其包括钛和金。在一种进一步优选的具体实施方式中，板可以包括通常大于对置电极(对电极，opposing electrode)之间的距离或间隙的宽度尺寸，并且甚至优选大于间隙距离的两倍。每个电极板可以是由电脉冲独立地可寻址的，其中电脉冲足以对位于任何阴极与阳极电极板对之间的溶液中的生物细胞和小泡进行电穿孔。在另一种具体实施方式中，电极可以包括2至100个阴极和2至100个阳极之间的阵列，并且总是存在偶数的阴极和阳极以形成阳极和阴极对。
在又一进一步的具体实施方式中，阴极和阳极可以在储存器的相反内侧相隔0.4至1cm之间的距离，即，电脉冲必须透过的间隙大约在0.4cm至1cm之间。
在又一进一步的具体实施方式中，可以以2.4和29.5欧姆之间的负载电阻(以欧姆为单位)(其取决于室尺寸)对每对所述阳极和阴极进行供能。当室中的每个电极对被顺序地供能时，将用足以发生电穿孔而又不损伤细胞的等效能量对悬浮在室中的生物细胞(与它们在室中的位置无关)施加脉冲。
在一种进一步的具体实施方式中，本发明可以包括各种各样的仪器或其它部件如指示器，用于检测和显示给与暴露于细胞介质的系列电极的电穿孔脉冲序列已完成的通知。用户可使用这样的指示器来始终监视是否室已经暴露于脉冲。在另一个实例中，该室可以在其设计中包括一种键控部件(keying feature)来帮助以适当的取向将该室固定于其基底托盘以致以适当序列将脉冲给予到每个电极上。
根据以下附图、详细描述、以及所附权利要求，本发明的其它特征和优点将是明显的。
附图说明
图1是是示出了本发明的可变容积室10和电极激励托盘200的透视图。如图所示，室10被构造成可拆卸地连接或安装到托盘200上，使得室的每个电极板11的电极接触小块(electrode contactnub)15接触托盘电极接头(电极调整片)201。在该具体实施方式中，接触小块15从室外壳并从室的底部或底侧引出。
图2是本发明的室的视图，其示出了在端口14一侧室的端视图(侧视图)，该端口可以以任何方式加以构造以适合连接于包含待电穿孔的细胞的流体介质源，如小型快速接头(luer fitting)。
图3是示出了本发明的室10的分解图的透视图，其中示出带有推杆13和半弹性减震垫16的柱塞(活塞)12，其共同地并可滑动地接合室10的内壁(侧面、顶部以及底部)，从而提供密封，进而使流体可以吸入和推出室(类似于注射器)。电极11沿室10的相反侧排列。该图进一步示出了电极接触小块15，在该具体实施方式中，其从室外壳的侧面突出。
图4示出了包括端口14的室10末端的部分透视图。可对带有半弹性减震垫的柱塞加以定位以在室内产生不同的容积。
图5是本发明的室10的俯视图，其示出了柱塞12已定位在室的约一半容积17。
图6A-E示出了如在图5中的俯视图并且描述了电极对2至6的逐步脉冲(图6A-E)，使得每个电极对之间的电场18相对均匀地穿过电极之间的间隙距离。星号表示正被供能的电极对。
图7是一种可替换室设计的透视图，其中本发明的室100由相对较小表面积的电极111构成。这样的构造可以用于电极之间的间隙距离为约1cm的室构造中。
图8示出了来自经处理的细胞(如在实施例中所描述的)的平均荧光读数。
具体实施方式
如本领域技术人员将明了的，以下描述详细地描述了本发明的某些优选具体实施方式，并且仅是示例性的而不是描述本发明的实际范围。在详细描述本发明以前，应当明了，本发明并不限于所描述的特定的装置布置(device arrangement)、***以及方法，因为它们可以变化。还应当明了，本文所使用的术语仅是为了描述特定的具体实施方式，而不是用于限制由所附权利要求所限定的本发明的范围。
本发明涉及电穿孔哺乳动物细胞和其它小泡，尤其是干细胞和祖细胞的活体外方法，其中细胞被悬浮在较大容积室内的导电介质中。该较大容积室包含许多电极对，其以这样的方式加以布置使得在暴露于所述流体介质的那部分室中在对置电极的每个连续对之间的介质暴露于电能的多个顺序脉冲。在这样的室中，并不是同时电穿孔全容积的含有生物细胞的介质而是通过对单个电极对或可替换地对电极对的组部分地施加脉冲来进行电穿孔。这样的脉冲可以顺序地在单个或许多对中，或交错地由一个以上的电极对施加脉冲，例如，第一和第二对电极发送脉冲，接着是第二和第三对发送脉冲，然后是第三和第四对发送脉冲，等等。
在一种优选的具体实施方式中，本发明的较大容积室保证将来自用于整个室的单脉冲的电脉冲载荷分为一系列更小的载荷，以避免自然发生的物理限制，其是起因于给定表面积的电极能够施加的最大极限能量，尤其是在使用高电导率介质的情况下。在一种有关的具体实施方式中，本发明的室还便于避免特殊的处理要求，而如果采用许多单独的单个标准小池或如果采用特殊选择的低离子强度介质，则将需要上述特殊的处理要求。在固定尺寸的电穿孔中可以逐渐减小脉冲载荷，但鉴于适应各种各样的容积的实际需要，本发明克服了采用特殊处理要求的需要，而对固定尺寸的室而言则是必要的，如容积调节、起因于容积调节的离子强度变化，以及需要泵或其它装置来输送介质进出这样的室。
在另一种具体实施方式中，本发明包括一种使用本发明的室的方法，其中含有细胞的介质的电导率大于50毫西门子(电阻小于20欧姆)并且甚至大于500毫西门子(电阻小于2欧姆)。这相反于常规***如由Bio-Rad制造的***(即，Gene Pulser XcellElectroporation System)，其被规定用来在大于20欧姆的条件下进行操作，即，优选用于这样的装置的介质电导率(低电导率)是小于50毫西门子。虽然使用高电导率溶液可以导致发生电弧或与其它性能问题有关，但仅当同时将电穿孔脉冲传送到整个室时才可能发生这样的问题。然而，本发明的室并不易于发生电弧，这是由于：它使用来自单独电极对的一系列脉冲，从而在被电穿孔的总容积的任何给定部分逐渐减小了电脉冲载荷。
现转向本发明的室，在第一优选的具体实施方式中，如图1所示，室10优选包括矩形室，其内部容积(取决于其构造)能够接收多达并且甚至大于100ml的流体介质的容积。实际上，虽然较大容积室的设计便于容积按比例扩大到任何容积，但本发明的装置通常被构造成处理在实验室和临床装置中通常要处理(experienced)的容积，即，小于100ml的容积。因此，通常，本发明的室可以优选被构造成容纳5、10、15、20、25、30、35、40、50或甚至100ml的最大容积或在5至100ml之间的任何递增容积的流体介质。
本发明的室10的构造类似于注射器和柱塞，其中通过将矩形柱塞12***矩形室来增加或减少所述室的容量。矩形柱塞被构造成典型的注射器柱塞式样，其中半弹性惰性橡胶减震垫16连接于柱塞的室侧面以及柱塞杆13在另一侧。在室开口(其中柱塞被***室内部)的末端附近，存在至少一个由调整片(tab)或室本身的端壁形成的柱塞止动件，其使柱塞免于完全脱离室内部。可以经由端口14进入室内部，其中端口14可以位于室的端壁或可替换地在端壁附近但在顶部、底部或侧壁上。
该室进一步包括许多对置阳极和阴极11。在一种优选的具体实施方式中，对置阴极与阳极(即，在室的相反侧上的电极)之间的距离或间隙是在0.4cm至0.1cm之间。在特别优选的具体实施方式中，每个电极的宽度大于对置电极之间间隙的测量结果并且优选大于间隙距离的两倍。因此，电极的宽度可以在0.4至5cm的范围内。该特征可以保证电场的强度在间隙距离的范围内保持相对均匀，而如果距离大于电极的宽度，则电场将易发生显著的减弱。在一种有关的具体实施方式中，布置在室中的电极11可以垂直于柱塞的拉伸方向、或这样设置在室中使得它们平行于柱塞拉伸的方向延伸室的长度。
如图1进一步示出的，通过将室设置到基底接触器托盘200中用电穿孔脉冲给室电极11供能，其中基底接触器托盘200保证室中的电极和基底托盘200中电极接头之间的接触以及电能源。基底接触器托盘200可以包括另外的实施方式，用于控制如电极脉冲的顺序。可替换地，电极脉冲的控制可以集成到电脉冲源，即，电穿孔发生器。
在又一种具体实施方式中，本发明的室可以构造成具有任何数目的电极对(即，包括阳极和阴极的对)，但优选对的数目将取决于每个电极的表面积与它们之间的间隙。这是因为，在有具有生理范围、即离子强度范围类似于磷酸缓冲盐溶液(PBS)的电导率的细胞介质存在的情况下，对可以施加通过给定尺寸的间隙而没有发生电弧的电力负载量存在物理性限制。例如，如表1所示，电极可以设计成具有各种表面积供各种间隙距离之用，从而利用各种各样的脉冲条件来电穿孔样品。在每种情况下，电穿孔的实际容积与实际脉冲条件无关，因为室被构造成保证容易地在远低于最大载荷的脉冲载荷下使用电极，其中如果同时对所有电极施加脉冲则最大载荷是必要的。因此，在一种优选的具体实施方式中，电极可以被构造成具有0.8至20cm2之间的表面积。对于另一个实例，对于具有最大容积20ml的室，电极数目可以在1至50之间，每个具有1至20cm2之间的表面积，其取决于对置电极之间的间隙距离。
表1
 
室容积(ml) 电极对数目 电极间隙(cm) 电极板面积(cm2) 负载电阻(Ω)
5 1 0.4 12.5 1.9
5 2 0.4 6.2 3.8
5 5 0.4 2.5 9.4
5 15 0.4 0.8 28.3
10 1 0.4 25 0.9
10 5 0.4 5 4.7
10 10 0.4 2.5 9.4
10 25 0.4 1.0 23.6
20 1 0.4 50 0.5
20 5 0.4 10 2.4
20 10 0.4 5 4.7
20 50 0.4 1.0 23.6
20 1 1.0 20 3.0
20 2 1.0 10 5.9
20 5 1.0 4 14.8
20 10 1.0 2 29.5
40 1 0.4 100 0.2
40 10 0.4 10 2.4
40 20 0.4 5 4.7
40 100 0.4 1 23.6
40 1 1.0 40 1.5
40 2 1.0 20 3.0
40 5 1.0 8 7.4
40 15 1.0 2.7 22.1
75 1 0.4 188 0.1
75 10 0.4 18.8 1.3
75 20 0.4 9.4 2.5
75 100 0.4 1.9 12.6
75 1 1.0 75 0.8
75 5 1.0 15 3.9
75 15 1.0 5.0 11.8
75 30 1.0 2.5 23.6
100 1 1.0 100 0.6
100 5 1.0 20 2.9
100 15 1.0 6.7 8.8
100 40 1.0 2.5 23.6
没有阴影＝所期望的电穿孔载荷；灰色阴影＝可工作的电穿孔载荷；深色阴影＝不可工作的电穿孔载荷
如表1所示，室可以被构造成具有各种各样的最大容量、各种各样的电极间隙、各种各样的电极数目，其保证逐渐减小每个脉冲的电力负载，并同时保持与在生理范围的细胞介质电导率相容。
用于电穿孔的最广泛使用的介质之一是PBS，由于溶液的离子含量，其是内在导电的。因为PBS具有0.017西门子/cm的电导率，所以在标准0.8ml小池中使用PBS将产生大约12欧姆的电阻负载。用小于100欧姆的负载电阻进行电穿孔是难以实现的，因为最常规的电穿孔设备不能在低电阻的范围内进行操作。例如，由Biorad制造的电穿孔设备，具体地说，Gene Pulser Xcell具有公布的20欧姆的低载荷限制。其它设备如BTX电穿孔发生器具有限制，其是基于设备、导线以及连接(connections)的固有容量。在导线、连接器以及电容器中要求0.2欧姆至1欧姆电阻并不是不合理的。当在这样的***中对2欧姆载荷施加脉冲时，在设备中可以损失多达33％的电穿孔电压(和能量)。另外，低电阻载荷还引起其它困难，其是起因于需要较大的冲击电流。这些复杂情况可以进一步包括瞬时转换信号噪声、仪器可靠性以及样品加热。
就本发明而论，我们已发现，将载荷分为负载电阻为2欧姆或更大的可管理水平可便于顺序地对单独的电极施加脉冲而不是对用于待电穿孔的介质的整个容积的单个电极对施加脉冲。在一种有关的具体实施方式中，使用生理离子强度可保证电穿孔过程的简化，因为细胞可以提取自细胞培养物、用PBS洗涤、以及直接放入可变容积室中。
如本领域技术人员明了的，使用中，制备患者细胞群体样品，如扩大的干细胞或其它祖细胞的群体，用于分送到室中。通常，在其中对细胞进行处理的介质具有相当于生理盐水的离子强度。另外，取决于特定的细胞样品，样品的容积大约在5至50ml的范围内。
在用包含细胞的介质填充室以后，将该室放置在基底托盘中并将传感器加入托盘中以确定暴露于流体介质的电极数目。在包括载荷检测器、或电极暴露于流体介质的具体实施方式中，检测器可以测量这样的要素如电流。然后，在检测了脉冲的适当电极以后，从室的一端到另一端，对暴露于介质的电极的每个相反对逐步施加脉冲。可替换地，可以以各种各样的形式对电极施加脉冲。例如，不是一个接一个地逐步给一对对置电极施加脉冲，而是可以对两个对置电极对同时施加脉冲，接着对第二个两个相反对施加脉冲。可以以重叠形式对电极进一步施加脉冲，其中，例如，在对电极的两个相反对施加脉冲以后，接着的要给予脉冲的电极可以和已经刚被给予脉冲的相邻电极同时被施加脉冲。在每种情况下，脉冲的形式将可能提供足够的电能来电穿孔在样品中的所有细胞。另外，如本领域技术人员所很好明了的，填充室的每个操作、柱塞的移动、以及电极的激活都可以通过单调方式来完成，如通过电子设备或电动机。
实施例
以下实施例是用来说明本发明的某些方面、具体实施方式、以及用途，以及帮助本领域技术人员实施它。该实施例并不以任何方式限制本发明的范围。
该实施例描述了一系列实验，其中利用了一系列三个小池对单个小池。
在标准组织培养烧瓶中并在补充有10％胎儿牛血清和90g/ml艮他霉素的Mcoy＝s介质中将鼠B16细胞(ATCC CRL 6475)培养成单层。利用0.05％胰蛋白酶和0.02％ EDTA的溶液，从烧瓶中除去细胞。在除去以后，通过在225×g下的离心作用并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞三次，然后悬浮在小容积的PBS中。利用标准血细胞计数器和台盼蓝排阻染料对得到的悬浮液进行计数。大约90％的细胞是能生存的。在计数的悬浮液中细胞的浓度被调节到1×106个细胞/ml。
细胞以1:1比率与120μM新鲜制备的钙黄绿素溶液(在PBS中)进行混合，然后利用BTX T820电穿孔脉冲发生器进行电处理。在标准4mm间隙电穿孔小池或三联(triple)小池中对细胞进行处理，其中三联小池是通过紧密并置三个4mm间隙电穿孔小池而制成，并在中心小池和每个相邻小池之间***有胶质玻璃隔离物。在组装前，对胶质玻璃隔离物和待并置的中心和末端小池的侧面进行机械加工，以使流体可以在三个小池之间流动。使用了三联小池的三种不同的模型。一种模型在相邻小池之间具有2mm间隔，另一种模型在小池之间具有3mm间隔，以及第三种模型在相邻小池之间具有4mm隔离物。
通过应用一个电极作为阳极和另一个电极作为阴极(其被集成到装置中)，将脉冲施加于标准4mm间隙小池。然而，以非常特定的方式将脉冲施加于三联小池。首先施加脉冲穿过末端小池的4mm间隙。接着施加脉穿过中心小池的4mm间隙。最后，施加脉冲穿过另一末端小池的4mm间隙。手控开关盒用来将脉冲从BTXT820电穿孔电源引导到三联小池。
在单个和所有三个三联小池中，通过施加标称场强为1600V/cm的8个直流脉冲，对与钙黄绿素混合的B16细胞进行处理。对于单个小池，施加一组8个脉冲。对于每个三联小池，施加三组脉冲，每组为8个脉冲。将一组施加穿过每个连接的小池的4mm间隙。在电处理以后，从小池移走B16细胞并在37℃下温育20分钟。用PBS洗涤细胞三次，同时通过离心作用(225xg)在洗涤之间进行造粒。在洗涤以后，将在每个样品中的细胞再悬浮在400μl的PBS中并利用荧光微量滴定板读出器(Biotek)进行荧光光谱(spectrafluorametrically)分析。该分析包括对来自每个样品的三个100μl等分的细胞悬浮液进行分析。计算平均荧光数据以获得每个样品的单个读数。汇集来自三份样品的平均数据。图8示出了平均荧光读数，其来自：暴露于钙黄绿素(没有被施加脉冲)的细胞、暴露于钙黄绿素并在单个室中被施加脉冲的细胞、以及暴露于钙黄绿素并在三个三联室中被施加脉冲的细胞。数据表明，相对于仅暴露于钙黄绿素的细胞，在所有四种类型的小池中施加电场均导致增加的细胞荧光。
根据本文披露的内容，可以进行和执行本文披露和要求的所有结构(组成，composition)和方法，而无需过度的实验。虽然已通过优选的具体实施方式描述了本发明的结构和方法，但对于本领域技术人员来说明显的是，可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下，对结构和方法以及本文描述的方法的步骤或步骤顺序施加变化。更具体地说，描述的具体实施方式在各个方面都仅是说明性的而不是限制性的。对本领域技术人员来说明显的是，所有类似置换和改进被认为是在如所附权利要求所限定的本发明的精神和范围内。
在本说明书中提及的所有专利、专利申请、以及出版物表示在与本发明有关的领域中技术人员的水平。所有专利、专利申请、以及出版物(包括对其要求优先权或另外益处的那些专利、专利申请、以及出版物)以引用方式结合于本文，其结合程度与如单个出版物被具体和单个指明被结合于此作为参考是一样的。
本文描述的发明可以适当地在没有任何在本文中未具体披露的元件的情况下加以实施。因此，例如，在本文的每一种情况下，任何术语“包括”、“基本上由...组成”、以及“由...组成”可以用其它两个术语的任何一个加以代替。已采用的术语和表达是用作描述的而不是限制的术语，因此使用这样的术语和表达并不意味着全部或部分地排除所示出和描述的特征的任何等效替换，而是应当明了，在本发明要求的范围内各种改进是可能的。因此，应当明了，虽然已通过优选的具体实施方式和可选特征具体地披露了本发明，但本领域技术人员可以利用本文披露的构思的改进和变化，并且这样的改进和变化被认为是在如由所附权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (17)

1.一种用于在悬浮介质中电穿孔生物细胞和小泡的可变容积电穿孔室，包括：
形成储存器的外壳，其中所述外壳包括所述储存器的四个侧壁、顶部以及底部；
阀，所述阀包括外孔和内腔，所述内腔将所述孔连接至所述储存器，所述腔与所述储存器的所述连接位于所述外壳中；
在所述储存器内的可滑动调节装置，用于通过所述腔和孔将流体介质吸入或排出所述储存器；
彼此相对平行并且沿着所述储存器的至少两个对置内侧壁放置的许多隔开的细长阴极和阳极，其中电极是单独地用电脉冲可寻址的；以及
连接于所述电极的电能源，其中可以用足够电能对所述电极施加脉冲以在所述储存器中引起包含在流体介质中的生物细胞和小泡的电穿孔。
2.根据权利要求1所述的可变容积室，其中，所述可滑动调节装置包括柱塞。
3.根据权利要求1所述的可变容积室，其中，所述室包括矩形。
4.根据权利要求1所述的可变容积室，其中，所述室包括圆筒形。
5.根据权利要求3所述的可变容积室，其中，所述柱塞包括矩形。
6.根据权利要求4所述的可变容积室，其中，所述柱塞包括圆筒形。
7.根据权利要求1所述的可变容积室，其中，所述孔包括停止旋塞以及用于连接至外部管道或其它装置的连接器。
8.根据权利要求1所述的可变容积室，其中，所述许多电极包括阳极和阴极，所述阳极沿着所述储存器的一个内侧壁排列而所述阴极沿着相反侧的内侧壁进行排列。
9.根据权利要求8所述的可变容积室，其中，所述电极平行于所述柱塞沿其可以在所述储存器中滑动地移动的纵向排列。
10.根据权利要求9所述的可变容积室，其中，所述阴极和所述阳极在所述储存器的相反侧上相隔0.4至1.0cm。
11.根据权利要求8所述的可变容积室，其中，所述电极垂直于所述柱塞沿其可以在所述储存器中滑动地移动的纵向排列。
12.根据权利要求11所述的可变容积室，其中，所述阴极和所述阳极在所述储存器的相反侧上相隔0.4至1.0cm。
13.根据权利要求8所述的可变容积室，其中，所述许多电极包括3至20个阴极以及3至20个阳极，阴极和阳极的数目总是彼此相等。
14.根据权利要求8所述的可变容积室，其中，所述阴极和阳极包括宽度在0.4至5cm之间的板。
15.一种在液体介质中活体外电穿孔生物细胞和小泡以将感兴趣的分子递送到所述细胞和小泡的方法，包括：
将所述细胞/小泡和所述感兴趣的分子放置在权利要求1所述的电穿孔室中，其中通过在将所述液体介质引导入所述储存器的方向上滑动所述柱塞而将所述细胞/小泡和分子吸入所述储存器；
将所述室设置在包括电能源的底座中并激活所述电能源以将电能的至少一个电穿孔脉冲给予每对暴露于所述液体介质的阴极和阳极；
通过在迫使所述细胞/小泡流出所述储存器的方向上滑动所述柱塞来从所述储存器中排出包含所述分子的所述细胞/小泡，从而将所述感兴趣的分子递送到所述细胞和小泡。
16.根据权利要求15所述的方法，进一步包括通过测量电流信号来检测穿过电极间隙的载荷。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述生物细胞包括哺乳动物祖细胞和/或干细胞。
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