CN106566801B - 一种基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法，该方法为：以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)和玻璃作为芯片制作材料，选用小鼠胚胎成骨细胞MC3T3‑E1细胞系作为基础细胞并对其进行成骨分化诱导，利用灌流装置对芯片内的诱导分化成骨细胞进行时间为24h、速度为0.1μl/min***培养液(浓度为10μmol/L)灌流处理，以此构建骨质疏松病例同时模型；另一方面利用灌流装置对芯片内的诱导分化成骨细胞进行时间为24h、速度为0.1μl/min***和氯化锂药物(浓度为25mmol/L)灌流处理，以此构建骨质疏松治疗模型；本方法建立的模型可以为组织工程、再生医学等领域提供一个具有潜力的应用平台，并且其具有操作简单灵活、可控性强、自动化程度高、试剂消耗量小等优势。

Description

一种基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法

技术领域

本发明属于微流控芯片技术、组织工程技术、再生医学及其细胞学应用等领域，具体涉及一种基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法。

背景技术

骨质疏松是一种多病因起病，以单位体积内骨量减少、骨微结构破坏为特点的常见骨科代谢性疾病，在临床上通常以骨骼疼痛、骨脆性增加、易发骨折为特征。骨质疏松症可分为原发性、继发性和特发性三大类。原发性骨质疏松症约占骨质疏松症的90％，分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型为绝经后骨质疏松(post-menopausal osteoporosis,PMOP)，Ⅱ型为老年性骨质疏松症(senile osteoporosis,SOP)(程晓芝，阎东.骨质疏松症的影像学诊断.新医学，2007，38(1):11-13)。人的一生中，骨处于不断更新状态，破骨细胞清除旧骨(骨吸收)，继之以成骨细胞填补新骨(骨形成)，称为骨的重建。而当破骨细胞介导的骨吸收作用绝对或相对的增加超过成骨细胞的骨形成时则出现骨量持续丢失及骨密度的持续下降即骨质疏松发生(何伟涛，刘康，孙金胥，等.组织蛋白酶K与骨质疏松症治疗的研究进展.中国骨质疏松杂志，2008，14(9):671)。全世界约有2亿多人口患有骨质疏松，仅在我国就有8800万，其中中老年人、绝经后女性占绝大多数。而且随着人口老龄化的加重，骨质疏松将会严重影响人们的生活健康。在过去十年，骨质疏松的病理过程被与组织、细胞和分子水平联系在一起。作为“总开关”的信号整合了各种内分泌、神经内分泌、炎性及机械力的刺激作用。在细胞水平，主要骨细胞(骨形成成骨细胞、骨降解破骨细胞)的相互作用及偶联形成了骨的最小功能单位，且有一些重要的分子在骨重建过程中协调着成骨细胞与破骨细胞间的活动。破骨细胞，起源于造血干细胞并与单核巨嗜细胞密切相关。成骨细胞，代表一类由骨髓间充质干细胞分化而成的骨形成细胞。其前体细胞向成熟成骨细胞(分泌可矿化基质)分化的速度和效率以及成骨细胞的寿命决定了骨形成的速率。目前，对于骨质疏松的治疗仍缺乏有效的体外模型来深入研究其病理机理，同时更缺乏有效的治疗的方案。

微流控芯片技术近年来迅速被人们熟悉，并且正在向生物医学领域渗透，突显了其广阔的应用前景，越来越多的研究者将微流控芯片技术作为生物医学研究的重要实验平台，也逐渐渗入到一些临床的研究中去。微流控芯片又称芯片实验室，是指一个几平方厘米的芯片，用其微尺度空间在生物、化学等实验中将所有功能集成在该芯片上的新型科学技术。微流控芯片技术的出现，已经被视为细胞研究所需要的新型重要技术平台。它的主要特点和优势是能将多种单元技术进行整合集成，具有可控性。生物医学研究可在实际研究和需求中，结合基础和临床研究，设计和制备相关微流控芯片，能将此技术的发展带入一个新的领域，也能使生物医学研究中某些无法攻破的难题在微流控芯片的平台下得到突破性的进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法，该方法解决了以往体外构建骨质疏松模型过程中存在的药物浓度梯度生成不稳定、可控性差等问题。

本发明提供了一种基于微流控技术建立骨质疏松模型方的法，该方法的具体步骤如下：

——以SU8光刻胶为模板，以软光刻法制作带有树形通道与细胞培养室的微流控芯片；微流控芯片由上层的PDMS和下层的玻璃片封接而成，带有溶液进入口、浓度梯度生产单元、细胞培养室、废液口及细胞接种口；溶液进入口连接浓度梯度生产单元，后与细胞培养室联通，细胞培养室分别与废液口和细胞接种口联通；

——诱导的成骨细胞通过细胞接种口和通道到细胞培养室，贴壁后用于实验；

——将两个带有泵的注射器连接于上述芯片的溶液进入口处，注射器内装完全培养液和浓度为10μmol/L含***培养液，通过溶液进入口同时灌注24h，速度为0.1μl/min，液体经过浓度梯度形成部分后，六个细胞培养室中***的浓度将分别为0、2、4、6、8、10μmol/L；

——待芯片内细胞贴壁、增殖后，将浓度为25mmol/L氯化锂注入细胞；在细胞培养室内对细胞进行预处理1h，然后将含氯化锂培养液和含有***和氯化锂的培养液分别通过溶液进入口同时灌注24h，速度为0.1μl/min；

——考察MC3T3-E1成骨细胞在芯片内的活性及增殖，并做统计分析。

所述微流控芯片具有6个平行的细胞培养室，每个细胞培养室的大小为：长1200μm，宽1200μm，高150μm，容积大约为2μL，并带有独立的细胞接种口。

所述的微流控芯片材料为PDMS和玻璃。

利用***培养液和氯化锂溶液构建骨质疏松病理和治疗模型。

所述微流控芯片树形通道的结构可以根据两个进样口的溶液浓度通过多次流体分配形成浓度。

由于微流控技术的灵活性，本方法可以根据溶液进入口溶液种类、特性，浓度设计多级混合通道等方法，从而实现复杂的药物浓度梯度。细胞接种口可接种细胞悬液或含有细胞外基质的细胞混合液，来实现细胞2D和3D培养。

本发明提供微流控技术建立骨质疏松的模型方法，是利用***培养液和氯化锂溶液构建骨质疏松的病理和治疗模型。***药物的浓度为10μmol/L，氯化锂药物的浓度为25mmol/L。通过溶液进入口同时灌注24h，速度为0.1μl/min。

本发明将微流控芯片作为主要技术平台，用成骨细胞作为基础细胞体外构建激素诱导的骨质疏松模型(GIOP)，并根据芯片的特点模拟出不同阶段骨质疏松的状态，观察骨质疏松发生发展经过并对其进行治疗。

综上所述，本发明提供了一种有效、操作灵活、可控性强的体外构建骨质疏松的方法，并且可以一步实现的生成带有***梯度的方法，具有十分重要意义。

本发明提供的提供微流控技术建立骨质疏松的模型方法，其优点在于

1、可以通过一步法产生梯度的药物浓度；

2、药物梯度分布的可控性强；

3、与细胞培养室集成，可进行细胞二维和三维培养；

4、操作简单、快速、灵活且自动化程度高；

5、可以通过集成化提高通量；

6、试剂消耗量小。

附图说明

图1为基于微流控技术建立骨质疏松模型方法的微流控芯片示意图；

图2为基于微流控技术建立骨质疏松模型方法的微流控芯片结构细节示意图；

其中1溶液进入口1，2溶液进入口2，3浓度梯度生产单元，4细胞培养室，5废液口,6细胞接种口；

图3为基于微流控技术建立骨质疏松的模型方法产生的浓度梯度荧光表征图；

图4为在微流控芯片上MC3T3-E1细胞药物处理(***和氯化锂)24小时后细胞增殖统计；

图5为在微流控芯片上MC3T3-E1细胞药物处理(***和氯化锂)24小时后细胞凋亡统计；

图6为成骨细胞碱性磷酸酶活性检测。

具体实施方式

以下实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

1.聚合物混合的微流控芯片的制作。使用传统软光刻法制作SU8负胶模板并通过灌注法得到相应的带有通道的PDMS块(单体：引发剂＝10：1)。芯片共有上下两层：微流控芯片由上层的PDMS和下层的玻璃片封接而成，上层是通道层，下层是空白玻璃片，如图1所示。带有溶液进入口1和溶液进入口2、浓度梯度生产单元3、细胞培养室4、废液口5及细胞接种口6；溶液进入口连接浓度梯度生产单元3，后与细胞培养室4联通，细胞培养室4分别与废液口5和细胞接种口联通6；

当两种液体沿浓度梯度通道生产单元3下行时，每种液体都将在节点处分流然后与周围的液流以层流的方式合并，然后在蜿蜒的通道内混合(如图2所示)。液体持续的稀释，最后在浓度梯度输出口形成一系列浓度，浓度表征如图3所示。据现阶段研究，如果两个进液孔的液体浓度分别是0和C，这六个输出口的浓度将分别是0、1/5C、2/5C、3/5C、4/5C和C。细胞培养部分由六个培养池组成并与浓度梯度形成部分相结合，每个培养池的大小为：长1200μm，宽1200μm，高150μm，容积大约为2μl。成骨细胞通过进液孔和通道到达培养池，过夜后贴壁。

2成骨细胞在微流控芯片内的接种与培养

将封接后的芯片置于25mm直径的培养皿中，用PBS冲洗一遍然后再用DMEM培养液润洗一遍，以确保通道内无气泡存在。将胰酶消化后的成骨细胞通过细胞灌注孔以4×10⁵/ml的密度均匀接种于芯片上，随后放入孵箱培养过夜。

3骨质疏松模型的建立

镜下观察细胞贴壁、增殖后，分别将完全培养液和含***培养液(浓度为10μmol/L)通过两溶液进样口同时灌注24h，速度为0.1μl/min(此速度流体剪切力不会对细胞产生影响)，液体经过浓度梯度形成部分后，六个细胞培养室内***的浓度将分别为0、2、4、6、8、10μmol/L。

4骨质疏松模型的治疗

待芯片内细胞贴壁、增殖后，将氯化锂(浓度为25mmol/L)注入细胞培养池内对细胞进行预处理1h，然后将含氯化锂培养液和含有***和氯化锂的培养液分别通过溶液进入口同时灌注24h，速度为0.1μl/min。

实施例2

***和氯化锂同时作用对MC3T3-E1活性及增殖的影响

对诱导后的MC3T3-E1氯化锂预处理1h，然后对其进行氯化锂和***灌流24h后，六个细胞培养室中的成骨细胞在形态、增殖速率及活性上无明显差异，如图4和图5所示，说明氯化锂对***造成的细胞增殖及活性降低的影响具有治疗作用。通过对凋亡标记物的检测，来记录***对成骨细胞凋亡损伤的影响，MMP反映早期可逆的凋亡损伤，而核形态和质膜通透性的改变则代表细胞损伤晚期不可逆的凋亡损伤。这些指标的相关分析能够反映出不同凋亡阶段细胞的状态，从而反映出药物对细胞损伤的过程。

实施例3

成骨细胞碱性磷酸酶活性检测

诱导后的MC3T3-E1细胞经***培养液灌流24h处理后，细胞碱性磷酸酶的活性较灌流前均有明显的下降，具有明显的统计学差异，说明***能明显地影响成骨细胞的碱性磷酸酶活性；诱导后的MC3T3-E1细胞经氯化锂灌流24h处理后，细胞碱性磷酸酶的活性较灌流前无明显的改变，如图6所示，说明氯化锂对成骨细胞碱性磷酸酶的活性无明显影响；对诱导后的MC3T3-E1氯化锂预处理1h，对其进行氯化锂和***灌流24h后，细胞碱性磷酸酶活性较灌流前无明显变化，说明氯化锂对***造成的细胞碱性磷酸酶活性降低具有治疗作用。

Claims (4)

1.一种基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法，其特征在于：利用***培养液和氯化锂溶液构建骨质疏松病理和治疗模型，该方法的具体步骤如下：

——以SU8光刻胶为模板，以软光刻法制作带有树形通道与细胞培养室的微流控芯片；微流控芯片由上层的PDMS和下层的玻璃片封接而成，带有溶液进入口、浓度梯度生产单元、细胞培养室、废液口及细胞接种口；溶液进入口连接浓度梯度生产单元，后与细胞培养室联通，细胞培养室分别与废液口和细胞接种口联通；

——诱导的成骨细胞通过细胞接种口和通道到细胞培养室，贴壁后用于实验；

——将两个带有泵的注射器连接于上述芯片的溶液进入口处，注射器内装完全培养液和浓度为10μmol/L含***培养液，通过溶液进入口同时灌注24h，速度为0.1μl/min，液体经过浓度梯度形成部分后，六个细胞培养室中***的浓度将分别为0、2、4、6、8、10μmol/L；

——待芯片内细胞贴壁、增殖后，将浓度为25mmol/L氯化锂注入细胞；在细胞培养室内对细胞进行预处理1h，然后将含氯化锂培养液和含有***和氯化锂的培养液分别通过溶液进入口同时灌注24h，速度为0.1μl/min；

——考察MC3T3-E1成骨细胞在芯片内的活性及增殖，并做统计分析。

2.按照权利要求1所述的基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法，其特征在于：所述微流控芯片具有6个平行的细胞培养室，每个小培养室的大小为：长1200μm，宽1200μm，高150μm，容积约为2μL，并带有独立的细胞接种口。

3.按照权利要求1所述的基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法，其特征在于：所述的微流控芯片材料为PDMS和玻璃。

4.按照权利要求1所述的基于微流控技术建立骨质疏松模型的方法，其特征在于：所述微流控芯片树形通道的结构可以根据两个进样口的溶液浓度通过多次流体分配形成浓度。