CN101328469A - 具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02及其制备方法、用途 - Google Patents

Abstract

具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02及其制备方法、用途，涉及生物技术领域，特别是功能性乳酸菌的分离株及应用。先采用培养基从新疆民族传统乳制品中分离获得乳酸菌；再筛选出具有抗氧化活性、抗致病菌特性和破坏内毒素能力的乳酸菌；再通过动物实验比较从筛选出的乳酸菌中筛选出对酒精性肝损伤具有保护功能的乳酸菌，即为嗜热链球菌grx02。本发明是一种功能性乳酸菌，特别在肝损伤保护方面具有功能特性，如将本发明嗜热链球菌grx02开发成保健食品，长期服用可预防、缓解和辅助治疗肝损伤。

Description

具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02及其制备方法、用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是功能性乳酸菌的分离株及应用。

技术背景

对由酒精引起的肝损伤的保护研究，西欧国家侧重在酒精急性中毒或酒精肝病的治疗，以被动治疗方法为主；东南亚国家包括我国，大部分研究出发点以解酒、醒酒为目的，而忽视了预防、调节这一重要环节。并且进入体内的药物大多数要经过肝脏的转化。肝病患者肝功能减退，许多药物进入体内，势必增加肝脏负担。这些物质在肝中代谢又会进一步损伤肝脏，形成累积损伤过程，反而会进一步损害肝脏。

乳酸菌具有调节生理活性，预防疾病发生以及安全性极高的特点。乳酸菌的酒精性肝损伤保护作用在于其具有抗氧化活性，预防肝脏脂质过氧化，有效清除肝损伤产生的有害自由基；具有抗大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，维持肠道菌群平衡，减少内毒素生成和吸收，有效预防肝损伤时细菌易位和降低内毒素血症的发生。

发酵乳制品的肝损伤保护作用的强弱与其所使用的乳酸菌的种类密切相关。从众多乳酸菌种筛选出适合生产肝损伤保护的菌种具有重要的意义。如将具有肝损伤保护作用的乳酸菌开发成保健食品，长期服用可预防、缓解和辅助治疗肝损伤，这种方式必将为人们所接受。在食品向天然型和功能型发展的今天，生产功能性酸乳这种产品是乳酸菌制品发展的方向之一，酒精性肝损伤保护功能性乳酸菌产品的开发有较广阔的前景，颇具有市场潜力。

发明内容

本发明目的在于为了克服前述和其它缺点，发明一种具有酒精性肝损伤保护作用的乳酸菌——嗜热链球菌grx02。

本发明保藏于2008年5月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏号为CGMCC No：2525。

经试验本发明是一种功能性乳酸菌，特别在肝损伤保护方面具有功能特性，如将本发明嗜热链球菌grx02开发成保健食品，长期服用可预防、缓解和辅助治疗肝损伤。

本发明的另一目的在于发明上述嗜热链球菌grx02的制备方法：

包括以下步骤：

1)采用培养基从新疆民族传统乳制品中分离获得乳酸菌；

2)筛选出具有抗氧化活性、抗致病菌特性和破坏内毒素能力的乳酸菌；

3)通过动物实验比较从经步骤2)筛选出的乳酸菌中筛选出对酒精性肝损伤具有保护功能的乳酸菌，即为嗜热链球菌grx02。

经过以上方法获得的乳酸菌通过法国梅埃里公司API系列试剂条和16SrDNA序列测定所进行的鉴定，确定该菌株为嗜热链球菌(Streptococcusthermopilus)，鉴定准确率均超过99％。

本发明的第三目的是发明所述嗜热链球菌grx02的应用：

可用于制备具有酒精性肝损伤保护功能的食物。

还可用于制备具有酒精性肝损伤保护功能的发酵乳。

本发明提供的菌株发酵的各种产物可起到保护酒精性肝损伤的作用，该菌株发酵的牛奶，获得的经乳酸菌发酵的各种发酵乳产品、乳酸菌饮料产品等，都获得了具有不同程度的保护酒精性肝损伤的特性。

利用本发明菌株发酵脱脂牛乳或其它食品原料，经过干燥等加工处理，具有较好的稳定性和较长产品货架期，还是用于制备具有酒精性肝损伤保护功能的药物组合物的较好选择。长期服用可预防、缓解和辅助治疗肝损伤，特别适合长期大量饮酒人员，用无任何毒副作用。

附图说明

图1为嗜热链球菌grx02革兰氏染色显微观察图。

图2为嗜热链球菌grx02DNA的荧光图谱。

图3为嗜热链球菌grx0216SrDNA-PCR产物的荧光图谱。

图4为对照组小鼠的肝切片的HE染色图片(200倍)。

图5为模型组小鼠的肝切片的HE染色图片(200倍)。

图6为药物组小鼠的肝切片的HE染色图片(200倍)。

图7为乳酸菌对照C8M组小鼠的肝切片的HE染色图片(200倍)。

图8为嗜热链球菌grx02组小鼠的肝切片的HE染色图片(200倍)。

具体实施方式

本发明者试图获得新的嗜热链球菌菌株。该菌株可以发酵牛乳表现出具有肝损伤保护的功能特性——抗氧化活性、抗致病菌特性、破坏内毒素能力。

发明通过从新疆传统乳制品中分离获得的大量乳酸菌中利用研究抗氧化活性、抗致病菌特性的乳酸菌菌株。再通过细菌形态学、生理学和培养特征，并通过法国梅埃里公司API系列试剂条、菌株16SrDNA基因部分类聚序列进行分析鉴定，结果证实了本发明的菌株是嗜热链球菌grx02。

1.样品来源

本发明菌株来源于我国新疆民族传统乳制品一酸马奶。酸马奶(Koumiss)是以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然发酵形成的酸性低酒精含量乳饮料。

2.样品采集

将样品采集后放入事先准备好的缓冲溶液中，冷藏，2天之内对样品进行分离。

3.乳酸菌分离

将新疆民族传统乳制品酸马奶样品采用PTYG培养物于37℃培养24小时后。将该培养物涂布在PTYG琼脂平板上，然后在37℃培养3天，挑取单菌落，并进一步纯化，检测细菌特征，如下文所述的革兰氏染色如图1所示。

将分离获得的菌株用含11％脱脂乳的培养物培养后，加入保护剂，冻干、保存在-18℃，然后用于各种检测细菌特征的试验。

4.菌株的鉴定

在生理生化基础上进一步进行API鉴定及16SrDNA序列测定进行鉴定，上述细菌是嗜热链球菌grx02。

(1)使用法国梅埃里公司API系列鉴定试剂条进行糖发酵分析。

在37℃，在厌氧条件下将嗜热链球菌grx02在MRS琼脂平板上培养48小时，然后用悬浮培养基将所得培养物悬浮，悬浮液的浊度与McFarland 2的相同。然后，将该培养细胞接种到API 50CHL试剂条中，在其上层覆盖一层无菌石蜡，以便检测对49种糖的发酵能力。

使用API识别软件程序分析了糖发酵能力。结果显示，该菌株的糖发酵能力与嗜热链球菌类似(表1)，符合率为96.3％。

(2)菌株16SrDNA序列鉴定。

采用细菌基因组DNA小量抽提试剂盒，按照说明进行操作，所提嗜热链球菌grx02基因组DNA电泳条带清晰，说明基因组DNA完整性较好可用于PCR等分子生物学操作(如图2所示)。

以基因组DNA作为模板，采用50μl反应体系进行PCR扩增，其中模板DNA5μl(大约100ng)，2.5mM dNTP 4μl，10×buffer 5μl，10pmol上下游引物各1.5μl，Taq酶1.5U，Mg2+3μl，以ddH₂O补至50μl。PCR循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性1min，64℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸8min。吸取PCR产物5μl与1μl Loading buffer混合，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，电压为80V。电泳结束后用溴化乙锭(EB)染色20-30min，拍照。可见约1500bp的条带即为目标条带(如图3所示)。

测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序结果：嗜热链球菌grx02的16SrDNA序列长度为1456bp。与Genbank中发表的序列比对，本发明菌株以同源性高达99.65％被证实属于嗜热链球菌。

API鉴定与16SrDNA序列测定结果一致，本发明菌株为嗜热链球菌(S.thermophilus)grx02。

5.耐酸特性

在肉汤培养基中，按1∶1与11％脱脂乳培养基混合，用10mol/L的HCl调节pH值，pH值分别调整为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5。然后接种3％嗜热链球菌grx02培养液，37℃厌氧培养2天。结果发现嗜热链球菌grx02在pH值2.0时37℃培养48h活菌数量为10^4-5cfu/mL。

表2本发明嗜热链球菌grx02的耐酸特性

6.耐胆盐特性

具体是，为了研究菌株的抗胆汁能力，在100mL、11％的脱脂乳中加入猪胆盐，使胆汁的浓度分别为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％和4.0％，然后将1mL(10⁹cfu/mL左右)的嗜热链球菌grx02培养物接种于这些脱脂乳中，分别厌氧培养2天。然后用保存在4℃的MRS肉汤培养物以10倍逐级稀释培养液，之后将稀释液涂布到平扳上厌氧培养，检测活细胞数。

表3本发明嗜热链球菌grx02的耐胆汁特性

胆汁浓度分别为1.0％～2.5％的脱脂乳中细菌37℃培养2天时活菌数量均在10^5-8cfu/mL的范围内；胆汁浓度为3.0％和3.5％的脱脂乳中细菌的数量均为10^3-5cfu/mL；胆汁浓度为4.0％的脱脂乳中经过2天培养活菌的数量仍能超过10²cfu/mL，证明本发明菌株对胆汁具有抗性。

7.抗氧化特性

(1)SOD活性

具体是，经三次活化的嗜热链球菌grx02按3％的接种量接种于15mL，11％脱脂乳中，在37℃进行培养，发酵液在4℃，3500rpm条件下离心20min。取上清液，调pH到6.0后，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性。从新疆共分离获得的26株乳酸菌中，SOD活性大于25U/mL的菌株数占15.38％，小于20U/mL的菌株数占38.46％，嗜热链球菌grx02的SOD活性明显高于其它菌株，其活性含量能达到28.77U/mL。

(2)清除DPPH自由基能力

具体是，经三次活化的嗜热链球菌grx02按3％的接种量接种于15mL，11％脱脂乳中，在37℃进行培养，菌株发酵液在4℃，3500rpm条件下离心20min后，取上清液，与95％的乙醇按体积比稀释成不同百分浓度，将不同稀释浓度的菌株发酵上清液及等体积浓度为30mg/L DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇匀，30min后用95％乙醇作参比测定其吸光度，计算清除率。发酵液上清清除DPPH·能力均随着浓度的升高其清除能力增强，发酵液浓度与DPPH·清除率呈线性关系。从新疆共分离获得的26株乳酸菌中，清除50％DPPH·时，所需消耗的发酵液浓度小于3.40％的菌株数占11.54％，所需消耗的发酵液浓度大于3.60％的菌株数占61.54％。嗜热链球菌grx02的清除DPPH·能力明显高于其它菌株，所需消耗的grx02发酵液浓度为3.34％。

(3)总抗氧化能力

具体是，经三次活化的嗜热链球菌grx02按3％的接种量接种于15mL，11％脱脂乳中，在37℃进行培养，菌株发酵液在4℃，3500rpm条件下离心20min后，取上清液，调pH在6.0。按试剂盒说明书(南京建成生物工程有限公司)测定总抗氧化能力(T-AOC)。从新疆共分离获得的26株乳酸菌中，总抗氧化能力大于15U/mL的菌株数占15.38％，小于10U/mL的菌株数占69.23％，嗜热链球菌grx02总抗氧化能力明显高于其它菌株，其抗氧能力能达到17.35U/mL。

综上所述，本发明嗜热链球菌grx02具有较高的抗氧化活性。

8.对致病菌的抑制特性

(1)对大肠杆菌抑制能力

采用单层琼脂平板扩散法。将埃希氏大肠杆菌接种于液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，平板计数法计活菌数，4℃冷藏，备用。通过稀释控制大肠杆菌活菌数在10⁶cfu/mL，此浓度易致病。分别吸取大肠杆菌菌液0.1mL于固体LB培养基平板上，用无菌涂抹棒涂布均匀，于超净工作台内通无菌空气，放置1h待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直径10mm，孔深3mm，将菌株样液0.2mL(10⁸cfu/mL)注入孔内，于37℃培养8h观察结果、测定抑菌圈直径。每个平板三个孔，做两个平板平行，用于分析。从新疆共分离获得的26株乳酸菌中，抑菌直径大于22mm的菌株数占26.92％，小于20mm的菌株数占46.15％，嗜热链球菌grx02抑制大肠杆菌能力比较好，抑菌直径在23mm左右。

(2)对沙门氏菌抑制能力

将伤寒沙门氏菌接种于液体LB培养基中，37℃培养6h后，平板计数法计活菌数，4℃冷藏，备用。操作步骤同上。从新疆共分离获得的26株乳酸菌中，抑菌直径大于24mm的菌株数占30.77％，小于22mm的菌株数占46.15％，嗜热链球菌grx02抑制沙门氏菌能力比较好，抑菌直径在26mm左右。

综上所述，本发明嗜热链球菌grx02具有较强的抗致病菌能力。

9.在共培养时破坏内毒素特性

将0.2mL浓度为10eu/mL的内毒素与0.1mL(10⁸cfu/mL)菌液一起接于MRS培养液中，使内毒素终浓度在1eu/mL，将1eu/mL的内毒素与乳酸菌在37℃共培养，在6h、12h、24h时利用鲎试剂盒(上海市医学化验所)测定内毒素含量，观察乳酸菌不同培养时间破坏内毒素能力。与内毒素共培养条件下，从新疆共分离获得的26株乳酸菌中，相对于阳性对照OD值0.86左右，菌株破坏内毒素至OD值下降到0.30的菌株数占19.23％，嗜热链球菌grx02可明显破坏内毒素，随着培养时间的延长破坏内毒素的能力有不同程度的提高，OD值能下降到0.19。说明本发明嗜热链球菌grx02具有较强的破坏内毒素能力。

10.保护酒精肝损伤特性

获得的经该菌株发酵的乳产品，经小鼠急性酒精性肝损伤实验，获得了保护肝损伤的特性。

昆明种小鼠90只，雌雄各半，体重22～24g，购自南京江宁汤山青龙山实验动物中心提供；合格证：SCXK(苏)2002-0018。标准配方杆状饲料喂养，自由进水。小鼠饲养及实验均在本校医学院清洁级实验动物室内进行。

将90只小鼠随机分为9组：空白对照组、模型组、阳性药物组、乳酸菌对照组C8M、嗜热链球菌grx02组，乳酸菌组分高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只。空白对照组：自由进食；模型组：采用蒸馏水10mL/kg连续灌胃10d，与末次灌胃1h后灌50％酒精12mL/kg；阳性药物组：采用东宝肝泰10mL/kg(含东宝肝泰0.08g/mL)灌胃，连续10d与末次灌胃1h后灌50％酒精12mL/kg；乳酸菌高、中、低剂量三组：采用乳酸菌10.0mL/kg(108、107、106cfu/mL)连续灌胃10d，与末次灌胃1h后灌50％酒精12mL/kg。灌酒后，动物造模后出现肠道受损，二便失常，毛发渐干枯无光泽，精神萎靡不振等表现，各乳酸菌组的上述一般状况较模型组明显改善，可能与乳酸菌具有保护肠道作用有关。禁食12h后，摘眼球取血，解剖取肝脏测定各指标。结果如表4，表5。

表4嗜热链球菌grx02对小鼠血清中ALT、AST、TG、ALB、TP的影响(n＝10，X±s)

注：与正常空白组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01；与酒精模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

表5嗜热链球菌grx02对小鼠肝脏中MDA、GSH、SOD、ADH的影响(n＝10，X±s)

注：同表4。

由表4、5可看出：模型组与空白组的各指标比较，具有显著性差异(P＜0.05)说明模型建立成功。酒精刺激将使肝细胞受到一定程度的损伤，ALT、AST含量明显上升，而嗜热链球菌grx02有效地降低了肝细胞的损伤(P＜0.05)，并且，效果明显优于乳酸菌对照组C₈M。嗜热链球菌grx02的总蛋白含量、白蛋白含量明显高于模型组(P＜0.05)，但剂量关系不明确。嗜热链球菌grx02拮抗了酒精所致抗氧化酶活性的降低，抑制了自由基的产生，SOD活性明显高于模型组(P＜0.01)，MDA含量明显低于模型组(P＜0.01)，减少了酒精所致肝脏GSH的耗竭，GSH活性明显高于模型组(P＜0.01)与药物组无显著差异。并且，效果明显优于乳酸菌对照组C₈M。

取各组小鼠肝脏左叶同一位置评价乳酸菌在体内的护肝效果，小鼠病理切片如图4至8所示：空白对照组中央静脉位于肝小叶中，肝小叶结构清晰，肝细胞索结构完整，呈放射状，肝细胞胞质半满，无网状结构，核仁清晰，双核细胞较多，无炎性浸润。酒精模型组肝小叶界限不清，肝血窦模糊变窄，肝细胞胞质浑浊，肝细胞肿胀变形，有网状结构，可见度不清晰，少数核固缩，较多炎性细胞浸润。药物组较模型组为好，轻度炎症细胞浸润，核固缩轻微。乳酸菌对照组C₈M较少炎性细胞浸润，少数肝细胞肿胀，轻度损伤。嗜热链球菌grx02组基本接近正常，双核细胞较多。

11.菌株保藏

将本发明菌株于2008年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏号为CGMCC No：2525。

应用示例

1、含嗜热链球菌grx02的酸乳的制作方法

将鲜乳加热到50℃以上，加入6％的白砂糖搅拌至完全溶解，预热到60～65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌5-8分钟，冷却至42～45℃，接种嗜热链球菌grx02。接种数量为2～3％。40～42℃发酵至pH值为4.2～4.5，冷却、冷藏，即制成凝固型酸乳。发酵结束后经搅拌，添加果酱果汁等，冷藏，即制成含活性嗜热链球菌grx02酸乳。

2、含嗜热链球菌grx02乳酸菌饮料的制作方法

按应用实施例1制备好酸乳，将酸乳用杀菌并冷却的水、糖浆、乳化稳定剂等混合物稀释3-4倍左右，制成可直接饮用的含活性嗜热链球菌grx02的乳酸菌饮料。

3、含嗜热链球菌grx02冰淇淋的制作方法

按应用实施例1制备好酸乳，冰淇淋原料配比如表5所示。

表51000kg冰淇淋配方

原料	重量(kg)
		嗜热链球菌grx02酸乳	400
白砂糖	75
		全脂奶粉	62.5
黄奶油	31.25
		椰子油	23
糖浆	26.25
		乳化稳定剂	6
水	276

将除酸乳以外的其它物料混合，预热到60～65℃，采用20Mpa～30Mpa进行均质，然后在80℃/20s杀菌，冷却到40～50℃，与酸乳混合，采用20Mpa～30Mpa进行均质，在2℃～4℃时，老化时间6h，经凝冻后经过硬化的为硬质冰淇淋，不经硬化的为软质冰淇淋。

4、含嗜热链球菌grx02粉末状食品的制作方法

将嗜热链球菌grx02酸乳冷冻至-40℃～-60℃，经干燥，至含水量为3％-5％，压碎成粉末状，可将粉末状产品加入奶粉、低聚糖、麦芽糊精、风味剂等制成粉末状或片块状产品，用于日常食用。

以上本发明提供的菌株发酵的各种产物可起到保护酒精性肝损伤的作用，该菌株发酵的牛奶，获得的经乳酸菌发酵的各种发酵乳产品、乳酸菌饮料产品等，都获得了具有不同程度的保护酒精性肝损伤的特性。

5、含嗜热链球菌grx02药物组合物的制作方法及病例防治示例

原料配比如表6所示。

表6原料配料表

原料	质量百分比(％)
		脱脂奶粉	12.0
低聚果糖	2.0
		酵母粉	0.8
蛋白胨	0.7
		纯净水	84.5

按照比例将脱脂奶粉、乳糖、酵母粉、蛋白胨以纯净水混合均匀，预热到60～65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌20～30分钟，冷却至42～43℃，接种3％嗜热链球菌grx02发酵剂，42℃发酵至pH值为4.1～4.5，离心，冷冻干燥至水份含量小于3％。即制备成嗜热链球菌grx02冷冻干燥物，将冷冻干燥物与麦芽糊精等量混合后装入胶囊中，即制成含嗜热链球菌grx02的药物组合物。

该产品长期服用可预防、缓解和辅助治疗肝损伤，特别是长期大量饮酒人员。长期服用无任何毒副作用，每天服用1-2次，每次至少含本发明活菌数量超过107个。

<110>扬州大学

<120>具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02及其制备方法、应用

<160>1

<210>1

<211>1456

<212>DNA

<213>乳酸菌

<220>

<223>从新疆民族传统乳制品中分离

<400>1

gggattggcg cgtgctatac atgcaagtag aacgctgaag agaggagctt gctcttcttg 60

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aggtggacag atttgg

Claims (5)

1、具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02，其特征在于，保藏号为CGMCC No：2525。

2、如权利要求1所述具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)采用培养基从新疆民族传统乳制品中分离获得乳酸菌；

2)筛选出具有抗氧化活性、抗致病菌特性和破坏内毒素能力的乳酸菌；

3)通过动物实验比较从经步骤2)筛选出的乳酸菌中筛选出对酒精性肝损伤具有保护功能的乳酸菌，即为嗜热链球菌grx02。

3、如权利要求1所述具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02用于制备具有酒精性肝损伤保护功能的食物。

4、如权利要求1所述具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02用于制备具有酒精性肝损伤保护功能的发酵乳。

5、如权利要求1所述具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02用于制备具有酒精性肝损伤保护功能的药物组合物。

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