CN112924683B - 尿液外泌体cd40蛋白及其多肽片段在膀胱癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种尿液外泌体CD40（又称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5）蛋白及其多肽片段的应用，具体为尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段在制备用于检测和辅助诊断膀胱癌制剂中的应用。本发明通过研究证实，与正常对照相比，CD40蛋白及其多肽片段在膀胱癌患者的尿液外泌体中均有表达，且表达均高于正常组，能够用于膀胱癌的检测和辅助诊断。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段。

Description

尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段在膀胱癌中的应用
技术领域
本发明涉及尿液CD40蛋白及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段在膀胱癌诊治中的应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿***最常见的恶性肿瘤之一，膀胱镜检查和细胞学检查是目前诊断膀胱癌的主要手段。其中，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的有效但有创的手段。同时它对原位癌（tis）的敏感性较低，而且检出效果取决于操作者，尿细胞学是一种非侵入性的诊断方法，但灵敏度低，细胞学阴性并不排除肿瘤的存在。膀胱癌病人有20%的患者会进展成浸润性膀胱癌，50%的浸润性膀胱癌患者会进展成不可治愈的转移性疾病。因此急需寻找能够快速、有效监测膀胱癌的手段，对患者的肿瘤进展进行监测。
尿液外泌体蛋白比尿液可溶性蛋白相比，具有更高价值的蛋白质，因为分泌到细胞外泌体中的蛋白质更直接地参与肿瘤的发生发展。同时，外泌体相较于尿液可溶性蛋白，更加不易被分解，使得蛋白检测的假阴性率大大降低。在蛋白质分析过程中，已经发现外泌体存在近百种蛋白和肿瘤等疾病相关。因此，外泌体在膀胱癌的研究中，具有较高的研究价值。
CD40是一种存在于肿瘤细胞表面的重要标志物，已经证实在卵巢癌、肝细胞癌等多种肿瘤中存在预测疾病发展的作用。CD40在肿瘤的发生发展中具有差异性表达的特点，具有较高的诊断治疗价值。CD40具有抗增殖和促凋亡的作用。研究结果表明，CD40通路在肿瘤中具有多方面的抗肿瘤活性，为今后的临床应用提供了可能性。在动物实验中，小鼠重组CD40配体疗法对CD40阳性卵巢肿瘤具有显著的抗肿瘤作用，影响CD40的表达能够增强顺铂的作用效果，实验证实CD40在肿瘤中是一种有价值的标志物。但在膀胱癌中，CD40的表达和预测价值并未得到验证，本发明将提供人尿液外泌体中CD40蛋白及其多肽片段在膀胱癌中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段在制备用于检测或辅助诊断膀胱癌制剂中的应用。
优选地，所述尿液外泌体CD40蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(MVRLPLQCVLWGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQHKYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGFFSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI IFGILFAILL VLVFIKKVAKKPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ）；或由SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述CD40蛋白及其多肽片段来自于尿液外泌体。
优选地，所述尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段在膀胱癌患者中高表达。
优选地，所述制剂为膀胱癌患者尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括能够特异性结合CD40蛋白及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述标准品包括CD40蛋白标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：CD40蛋白控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜。
优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种。
发明人首先收集了正常人和膀胱癌患者的晨尿尿液标本，离心后取上清，对尿液外泌体进行提取，收集得到的蛋白采用RIPA和加热的方法裂解提取蛋白质，并对外泌体中的CD40采用western blot法进行验证，结果与患者的临床进展结合，证实尿液外泌体中CD40和疾病进展的相关性。
本发明通过研究证实与正常对照组相比，CD40蛋白及其多肽片段在膀胱癌组患者的尿液中均有表达，均高于正常对照组，且与膀胱癌患者的疾病进展具有相关性，从而提出检测尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段可用于膀胱癌的诊治。
本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1是CD40蛋白在正常对照组和膀胱癌组尿液外泌体中的差异表达。
具体实施方式
实施例1 尿液外泌体提取
取正常人和膀胱癌患者的新鲜晨尿，收集样本置于冰上，4℃下3000g离心10分钟，去除细胞或者细胞碎片，离心后将尿液上清转移至新管中。取5.0ml处理后的尿液于15ml离心管中，加入0.5ml的结合缓冲液，盖紧盖子，颠倒混匀。吸取300ul结合树脂，加入离心管中，室温颠倒混匀15min后，3000g室温离心2min，弃去5.2ml上清，将剩余上清液体和结合树脂悬起，并将液体和结合树脂一并转移至纯化柱中，3000g室温离心2min，弃掉收集管中的收集液，并取0.5ml洗涤液加到离心柱中，用移液器将洗涤液和结合树脂充分混匀，室温静置1min后，3000g，室温离心2min，将收集管和收集液一并弃去。之后将纯化柱放入低吸附蛋白的1.5ml离心管中，加入200ul洗脱液，混匀反应10min后，3000g，室温离心2min，离心管中所得液体即为浓缩后的外泌体溶液。
实施例2尿外泌体蛋白的检测
采用western blot对蛋白进行验证。提取的溶液加入RIPA蛋白裂解液（1：4）提取总蛋白并进行12%的SDS-PAGE电泳，电压12V转膜60 min，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入1：1000一抗CD40、β-actin 4℃孵育过夜。PBST漂洗3次，每次20min，加入1：1000二抗，室温孵育90 min，PBST漂洗，ECL显色。如图1所示，应用western blot验证，外泌体验证蛋白CD63,CD9,TSG101均表达，提示尿液外泌体提取成功。同时，与正常对照相比，膀胱癌患者尿液外泌体中的CD40蛋白明显上升。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定为准。
序列表
<110> 张, 曼
<120> 尿液外泌体CD40蛋白及其多肽片段在膀胱癌中的应用
<130> 19PCD40-CN
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> urinary exosomes CD40 protein
<400> 1
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275

Claims (7)

1.尿液外泌体CD40蛋白在制备用于检测和辅助诊断人膀胱癌制剂中的应用，所述尿液外泌体CD40蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液外泌体CD40蛋白在膀胱癌患者中高表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为膀胱癌患者尿液外泌体CD40蛋白检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括能够特异性结合CD40蛋白的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述标准品包括CD40蛋白标准品、人源化标签抗体标准品；所述质控品包括：CD40蛋白质控品、人源化标签抗体质控品；所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种。
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