CN101325956B - 治疗心房颤动的化合物 - Google Patents
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Abstract
腺苷A2A受体拮抗剂可用于制备抗包括人类的哺乳动物心房颤动的药物。已发现所述腺苷A2A受体存在于人类心房心肌细胞中并参与作为心房颤动基础的病理机制。使用A2A拮抗剂相对于本领域公知的其它药剂的优点在于所述A2A拮抗剂特异地靶向患有心房颤动的患者。
Description
技术领域
本发明涉及人类药物和兽医药物的领域,并且具体涉及治疗心血管疾病的化合物,特别是,治疗心房颤动的化合物。
背景技术
心房颤动是最常见的心律失常并与实质发病率和死亡率相关。其发病率和流行性正在增加并意味着正在增加的临床负担和经济负担(当前流行性为总人口的2%)。除了诸如心悸、头晕、呼吸困难及其它的严重临床症状以外,心房颤动是75岁以上人群中缺血性中风的单一最重要的因素。总体上,心房颤动占医院接纳的心血管疾病的5%以上。在约90%的病例中,心房颤动在存在例如高血压性心脏病、充血性心力衰竭或心脏瓣膜病的其它心脏病下发生。仅在10%的病例中,心房颤动的确在没有心脏异常的情况下产生(“孤立的”心房颤动)。可区分三种形式的心房颤动:(1)阵发性心房颤动,其特征在于具有秒至天的持续时间的自限性心房颤动的发作;(2)持续性心房颤动,其不确定地持续直至经医药干预而终止;(3)永久性心房颤动,其不能通过药理复律或电复律而终止。
研究表明,心房颤动是由在心房附近随机移动的多种再进入微电波造成的。这些微波是由电触发物引起的,所述电触发物通常位于由左心房延伸至肺静脉近端5cm至6cm部分的心肌袖。一旦心房颤动被触发,心房中影响负责心率失常持续性的其电性质、机械性质和代谢性质的变化就产生了(心房重构)。在心房颤动存在下,心室率控制被提高了,并且如果不能用药物治疗来降低速率控制,心室率控制导致心室扩张和收缩功能的损伤,通常称为心动过速性心肌病。中风和血栓栓塞是与心房颤动相关的死亡和发病率的主要原因,其潜在的病理生理基础是与血流异常(例如心房阻塞)和内皮损伤或心内膜损伤相关的栓前状态或高凝状态。
正如心脏病学的其它分科中,诊断和治疗心率失常在过去的四十年间已取得重大进展。尽管有许多的进步,真正治疗心率失常和预防心律失常猝死仅在少数患者中完成。目前,心房颤动疗法包括减少心房颤动相关征状、预防血栓栓塞并发症以及在适当时候终止该心律失常。
通常有两种处理心房颤动的方法:a)处理心律失常自身和b)降低血栓栓塞风险(参见M.B.Iqbal et al.,″Recent developments in atrial fibrillation(心房颤动的最新进展)″,British Medical Journal2005,vol.330,pp.238-43)。处理心律失常包括心律控制(恢复和保持窦性心律)以及速率控制。药理学上,心律控制和速率控制是用抗心律失常药物(I类和III类抗心律失常药剂)来处理的。目前使用的抗心律失常药的实例有氟卡尼、普罗帕酮、胺碘酮、多非利特、伊布利特以及心得怡。非药理学地,心律控制和速率控制是用电复律、基于心房的起搏治疗、植入型心房除颤器、射频导管消融以及外科迷宫手术来处理的。
降低血栓栓塞风险以及因此的中风预防在治疗策略上是最重要的。药理学上,阿司匹林和华法林在大多数患者中被推荐以预防心房血栓形成和血栓栓塞事件。高危患者试验的集合数据表明,华法林在预防中风上优于阿司匹林,但用华法林的大出血风险是用阿司匹林的两倍。总之,抗凝处理需要基于年龄、并存病和禁忌症单独调整。非药理学上,降低血栓栓塞风险目前是通过除去左心耳处理或使用导管处理(方法在研究中)。
最新研究已强调了药理学上和非药理学上的处理策略的新方法。最有前景的药剂是血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和血管紧张素II受体阻断药物。蛋白酶抑制剂、具有足够选择性和专一性的磷酸酶或抗氧化剂也可提供新的治疗策略以降低或逆转结构改变、心房扩张、以及收缩功能障碍。然而,治疗心房颤动的问题还远没有得到满意的解决。
发明概述
发明人已发现公知的药物化合物群,即所述腺苷A2A受体拮抗剂,可用于制备针对包括人类的哺乳动物的心房颤动的药物。
本发明源自令人惊奇的发现:所述腺苷A2A受体存在于人类心房心肌细胞中并参与作为心房颤动基础的病理机制。特别地,本发明人已发现,作为质膜中功能性物质的所述同型二聚腺苷A2A受体物质的表达在心房颤动患者内上调。电生理学实验已证实,这样的患者的心房肌细胞中,腺苷A2A受体的活化导致以钙波测量的自发肌浆网钙释放的蛋白激酶A介导的增加。
此外,使用两种不同实验方法(共焦钙成像和膜片钳技术),本发明人已发现腺苷A2A受体拮抗剂降低在心房颤动中发现的升高的钙波频率。的确,腺苷A2A受体拮抗剂不仅逆转激动剂对钙波的刺激作用,而且降低基础钙波频率。一并考虑,这些结果提示,腺苷A2A受体介导的细胞内钙通量的失调对纤维性颤动的心房的复杂电重构起作用。这些事实使腺苷A2A受体拮抗剂成为治疗心房颤动的选择性治疗性药剂。
先前,并且作为最接近的研究,本发明人仅描述了来自心房颤动发作的患者的分离的右心房肌细胞表现出比来自没有该心律失常的患者的肌细胞更频繁的自发肌浆网Ca2+释放(参见L.Hove-Madsen et al.,″Atrialfibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from thesarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes(心房颤动与来自人类心房肌细胞中肌浆网的增加的自发钙释放相关)″,Circulation 2004,vol.September,pp.1358-63)。
因此,本发明涉及腺苷A2A受体拮抗剂在制备预防和/或治疗包括人类的哺乳动物的心房颤动的药物中的用途。以下的“腺苷A2A受体拮抗剂”将被称为“A2A拮抗剂”而“腺苷A2A受体”则称为“A2A受体”。本发明的这方面可以可选择地表述为通过拮抗A2A受体而预防和/或治疗心房颤动的方法,所述方法包括给予有效量的A2A拮抗剂以及合适量的可接受的稀释剂或载体至需要其的哺乳动物(优选人类)。
相对于本领域公知的其它药剂,使用A2A拮抗剂的优点在于所述A2A拮抗剂特异地靶向心房颤动患者。因此,功能性二聚A2A受体的表达在具有正常心房尺寸且没有心房颤动前史的患者中是低的,而该二聚受体物质的表达在患有心房颤动的患者中强烈地上调。相反,目前使用的其它药剂对调节多种细胞内多种功能起关键作用的受体或通道更广泛地起作用。因此,钙拮抗剂将不仅通过抑制L型钙通道降低钙过载,而且降低心脏收缩性。此外,L型钙电流还调节平滑肌功能以及分泌细胞,因而具有不希望的钙拮抗剂的副作用。
A
2A
受体
腺苷是体内全部代谢活性的细胞产生的嘌呤核苷。腺苷通过四种已鉴定的不同亚型的细胞表面受体(A1、A2A、A2B和A3)发挥其作用,所述受体属于G蛋白偶联的受体超家族。A1和A3偶联抑制性G蛋白,而A2A和A2B偶联刺激性G蛋白。A2A受体主要发现于大脑,发现于神经元和胶质细胞两者内(在纹状体和伏核中具有最高水平,在嗅球和下丘脑与海马区具有中高水平)。在纹状体中,所述A2A受体调节神经递质的释放和功能(参见H.Kase et al.″Progress in pursuit of therapeutic A2Aantagonists:the adenosine A2A receptor selective antagonist KW 6002:research and development toward a novel nondopaminergic therapy forParkinson′s disease(寻求治疗性A2A拮抗剂的进展:腺苷A2A受体选择性拮抗剂KW 6002:新的治疗帕金森病的非多巴胺能疗法的研究与开发)″,Neurology 2003,vol.61,pp.97-100)。在外周组织中,已知A2A受体存在于血小板、中性白细胞、脾、胸腺、内皮和血管平滑肌细胞中,在其中引起强有力的允许对冠心病患者的心肌灌注进行评估的冠状血管舒张(参见Z.Gao et al.,″Novel short-acting A2A adenosine receptor agonists forcoronary vasodilatation:inverse relationship between affinity and duration ofaction of A2A agonists(新的冠状血管舒张的短效A2A腺苷受体激动剂:在A2A激动剂的亲和性与作用持续时间之间的负相关)″,J.Pharmacol.Exp. Ther.2001,vol.298,pp.209-18)。然而,直到现在A2A受体也从未在人类心房心肌细胞中定位。
治疗心房颤动的合适的化合物
通常,拮抗剂是与所述受体结合而不活化所述受体的分子。它与所述内源配体或底物竞争所述受体上的结合位点,并因此抑制所述受体转导应答内源性配体结合的细胞内信号的能力。拮抗剂以几种方式起作用。其可以以足够的亲和性和专一性与腺苷结合或螯合,以基本上干扰、阻断或以其它方式防止腺苷与所述A2A受体结合,从而抑制(inhibiting)、压制(suppressing)或造成所述腺苷介导的生物学活性的停止。
在心肌细胞中且不存在内源配体的A2A受体表现出基础活性。该活性可归因于所述受体的组成性活性或内源腺苷对所述受体的活化。在这种情况下,可通过使用拮抗剂或反向激动剂降低该基础活性而完成心房颤动的治疗。本发明的一些A2A拮抗剂可展示反向激动作用。
根据所述A2A受体的已知的定位和功能,到现在为止,A2A拮抗剂已用于对抗帕金森和其它CNS疾病(精神***症、如阿尔茨海默病中的老年痴呆、器质性精神病等)。其中主要的是帕金森病。
每种A2A拮抗剂都涉及用于本发明目的的用途。已经深入研究了作为A2A拮抗剂的很多不同的化合物,所述化合物可分为两大家族:黄嘌呤衍生物和非黄嘌呤杂环。
在本发明的特别实施方案中,所述A2A拮抗剂是黄嘌呤衍生物或其药物可接受的盐。不同位置的不同取代基,及脱偶氮或偶氮类似物或者所述嘌呤环或者三或四元环衍生物/类似物的其它杂环类似物,可具有相似的A2A拮抗剂活性。在黄嘌呤衍生物中,一些化合物共有的优选结构是1,3,7-三烷基-8-苯乙烯基-黄嘌呤结构。在优选实施方案中,所述A2A拮抗剂是选自以下的化合物:可可碱,所谓的DMPX(式1);KF 17837(式2);伊曲茶碱(istradefylline),所谓的KW 6002(式3);对-磺基苯乙烯基-DMPX(式4);BS-DMPX(式5);MSX-2(式6);CSC(式7);黄嘌呤氨基同源物(XAC,式8);以及MSX-3。
在更优选的实施方案中,所述A2A拮抗剂是KW 6002。该化合物目前在帕金森病的三期临床试验中。在另一优选实施方案中,所述A2A拮抗剂是MSX-2。在另一优选实施方案中,所述A2A拮抗剂是MSX-3、MSX-2的磷酸酯、MSX-2的前药。
已知表现A2A受体拮抗剂活性的其它黄嘌呤化合物在例如US5484920、US 5587378、US 5543415和EP 1016407A1中描述。
在本发明的另一特别实施方案中,所述A2A拮抗剂是非黄嘌呤杂环。典型的非黄嘌呤腺苷A2A拮抗剂可衍生自腺嘌呤并代表最广泛意义的腺嘌呤衍生物,其包括带有不同取代基的单环、二元环、三元环和四元环的化合物。已鉴定不是衍生自腺嘌呤的具有A2A拮抗剂活性的另外的杂环化合物。已知表现出A2A受体拮抗性的一些2-氨基吡啶化合物(例如WO 02/14282、WO 01/25210),并且还已知一些9-氨基嘧啶化合物(例如US 2001/0027196)。
在优选实施方案中,所述A2A拮抗剂选自SCH 58261(式9);ANR-82(式10);ZM 241385(式11);SCH 63390(式12),CGS 15943(式13),8FB-PTP(式14);VER-6623(还被称为V2006,式15);(-)R,S-甲氟喹(式16);以及7FB-PTP(式17)。在更优选的实施方案中,在非黄嘌呤化合物中的所述A2A拮抗剂是VER-6623。
其它优选作为A2A拮抗剂的化合物是式18的吡唑并嘧啶(pyrazolopyrimidine)衍生物;式19的***并喹喔啉(triazoloquinoxaline)衍生物;式20的9-取代的2-氨基-6-呋喃基-腺嘌呤衍生物;以及式21、22和23的***并三嗪(triazolotriazine)衍生物。
其它***并嘧啶A2A拮抗剂公开于例如WO 2004/029056、WO95/01356、US 5565460、WO 97/05138、WO 98/52568、WO 01/92264以及PCT/US02/32630。具体地,取代的吡唑[4,3-e]-1,2,4-***-[1,5-c]嘧啶化合物公开于WO 2005/054245、US 2004/220194以及US 2003212059。
合适的A2A拮抗剂的其它具体实例包括公开于以下专利、专利申请和文章的化合物:WO 95/01356、US 6630475、US 5935964、WO03/032996、WO 03/048165、WO 03/048164、WO 03/048163、WO2005/042500、WO 2005/058883、WO 2005/040151、WO 2005/039572、WO 2004/092177、US 2004138235、WO 2004/019949、WO 02/14282、WO 2004/016605、WO 03/082873、US 5484920、US 5703085、WO92/06976、WO 94/01114、US 5565460、WO 98/42711、WO 00/7201、WO99/43678、WO 99/26627、WO 01/92264、WO 99/35147、WO 00/13682、WO 00/13681、WO 00/69464、WO 01/40230、WO 01/02409、WO 01/02400、EP 1054012、WO 01/62233、WO 01/17999、WO 01/80893、WO 02/14282、WO 01/97786、WO 01/16134、WO 00/73307、US 2005043315、US2003149060、Baraldi et al.,″Recent developments in the field of A2A and A3adenosine receptor antagonists(在A2A和A3腺苷受体拮抗剂领域的最新进展)″,European Journal of Medicinal Chemistry 2003,vol.38,pp.367-82;E.Ongini,et al.″Selective adenosine A2A receptor antagonists(选择性腺苷A2A受体拮抗剂)″,Farmaco 2001,vol.56,pp.87-90;C.E.Müller et al., ″A2AAdenosine receptor antagonists-future drugs for Parkinson′s disease?(A2A腺苷受体拮抗剂—未来的帕金森病药物?)″,Drugs of the Future 2000,vol.25,pp.1043-52;L.J.Knutsen et al.,″KW-6002(Kyowa Hakko Kogyo)″,Curr. Opin.Investig.Drugs 2001,vol.2,pp.668-73;B.Cacciari et al.,″Medicinalchemistry of A2A adenosine receptor antagonists(A2A腺苷受体拮抗剂的药物化学)″,Curr.Top.Med.Chem.2003,vol.3,pp.403-11;G.Yao et al.,″Synthesis of alkyne derivatives of novel triazolopyrazine as A2A adenosinereceptor antagonists(作为A2A腺苷受体拮抗剂的新的***并吡嗪的炔衍生物的合成)″,Bioorg.Med.Chem.Lett.2005,vol.15,pp.511-5;E.Kiselgofet al.,″6-(2-furanyl)-9H-purin-2-amine derivatives as A2A adenosineantagonists(作为A2A腺苷拮抗剂的6-(2-呋喃基)-9H-嘌呤-2-胺衍生物)″,Bioorg.Med.Chem.Lett.2005,vol.15,pp.2119-22;S.M.Weiss et al,″Discovery of nonxanthine adenosine A2A receptor antagonists for thetreatment of Parkinson’s disease(治疗帕金森病的非黄嘌呤腺苷A2A受体拮抗剂的发现)″,Neurology 2003,vol.61(Supp.6),pp.S101-6;C.B.Vu et al.,″Novel diamino derivatives of[1,24]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potentand selective adenosine A2A receptor antagonists(作为强力的且选择性的腺苷A2A受体拮抗剂的[1,24]***并[1,5-a][1,3,5]三嗪的新二氨基衍生物)″,J.Med.Chem.2005,vol.48,pp.2009-18;C.B.Vu et al.,″Piperazinederivatives of[1,2,4]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selectiveadenosine A2A receptor antagonists(作为强力的且选择性的腺苷A2A受体拮抗剂的[1,2,4]***并[1,5-a][1,3,5]三嗪的哌嗪衍生物)″,J.Med.Chem.2004,vol.47,pp.4291-9。
本领域技术人员将知道化合物是否是用于本发明目的的良好的A2A拮抗剂。例如,在本领域已有评价化合物是否是良好的A2A拮抗剂的合适方法。实例是在专利申请US 2004/0138235中的段落[0226]至[0240]所描述的基于放射配体结合分析的方法。
治疗心房颤动优选所述A2A拮抗剂对A2A受体具有选择性。所有上述A2A拮抗剂对所述A2A受体都是具有选择性的,但其中的选择性程度是不同的。所述选择性在不同物种(例如大鼠,人类)之间也会有些不同。
所述A2A拮抗剂通过如引用的专利和申请中所述的已知方法制备。
药物组合物与给药
在治疗方面,有效量是指足以影响有益的或所需的临床结果的活性成分的量,所述有益的或所需的临床结果是:减轻、改善、稳定、逆转或减慢所述疾病或症状的进展,或以其它方式减少所述疾病或症状的病理后果。所述有效量通常是由医师基于个别病例而确定。
虽然根据本发明用于疗法的所述活性化合物可以未加工的化学化合物的形式给药,但优选可选择地以生理可接受的盐的形式,以连同一种或多种佐剂、赋形剂、载体、缓冲液、稀释剂和/或其它常用的药物辅料的药物组合物引入所述活性成分。所述组分可通过任何可接受的具有相似效用的药剂给药模式(包括直肠、口腔、鼻内和透皮途径)单剂量或多剂量地给药,所述给药模式通过动脉内注射、通过静脉、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、口服、局部、作为吸入剂、或者经诸如支架或例如***动脉的圆柱形聚合物的浸渍或包被装置。
一种优选的给药模式是肠胃外,特别是通过注射。通过注射的给药形式包括水或油的混悬剂或乳剂,以及无菌水溶液剂。口服给药是另一优选给药途径。所述药物组合物可以是以片剂、丸剂、粉剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、烟雾剂、胶囊剂等形式。
可配制本发明的组合物以便在通过使用本领域公知的方法对所述患者给药后提供快速的、持续的或延时的所述活性成分的释放。口服给药的控释药物递送***包括包含包被聚合物的贮存器或药物聚合物基质配制物的渗透泵***以及药物溶出***。用于本发明所述方法的另一配制物使用透皮递送装置(“贴剂”)。这样的透皮贴剂可用来提供控量的所述化合物的连续或不连续的注入。
所述组合物优选以单位剂量形式配制。该剂量取决于疾病的性质和严重性并且是在该医师的判断力内确定。
除非另外定义,本文使用的所有科技术语与本发明所属领域内的普通技术人员通常所理解的具有相同含义。贯穿本说明书和权利要求书,词语“包括(comprise)”及其诸如“包括(comprising)”的变体不是为了排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。本申请的摘要在此并入。本发明的另外目的、优点和特征在研究本说明书后将对本领域技术人员变得显而易见或者可通过实施本发明而认识到。以下实施例和附图是通过举例而提供,并且并非旨在限制本发明。
附图简述
图1:在心房颤动患者中的A2A受体表达的上调。
图2:A2A受体激动剂刺激包括在心房颤动患者内自发肌浆网钙释放的依赖PKA的增加。
图3:A2A拮抗剂降低心房颤动患者中自发肌浆网钙的基础释放。实验显示钳制电位为-80mV下的自发INCX。
具体实施方式
附图详细说明
图1A表示刚刚分离的人类右心房肌细胞,其用抗A2A受体(第1、4、7和10幅)和抗肌球蛋白(第2幅)、抗α-辅肌动蛋白(第5幅)、抗连接蛋白-43(第8幅)或抗RyR(第11幅)双重染色。所述双重免疫荧光图像(第3、6、9和12幅)的叠印揭示了所述A2A受体与α-辅肌动蛋白的共定位以及A2A受体与所述兰尼碱受体RyR的重叠分布。图1B显示来自瞬时转染的具有人类A2A受体的HEK细胞的细胞膜(阳性对照,C+)以及由具有窦性心律(SINUS)或心房颤动(AF)的个体获取的人类心房心脏膜,所述膜由SDS-PAGE解析并使用兔抗A2A受体抗体而进行免疫印迹。“双”意指二聚体而“单”意指单体。图1C显示图1B的免疫印迹的相对密度计扫描(RDS)。A2A受体(单体加二聚体)的总量以黑条显示。A2A受体单体(白条)和二聚体(灰条)的相对量使用每一道中的A2A受体(二聚体加单体)的总和而标准化。
在图2A中,记录所述膜电位钳制于-80mV下,心肌细胞暴露于200nM的CGS 21680之前(对照)、之中(CGS)和之后(清洗,W)的自发INCX。水平和垂直定标线条分别对应于30s和100pA。图2B显示CGS 21680对自发Na-Ca交换电流数量(以每30s扫描的事件计,e/s)的刺激作用的时间曲线。条状物上的粗线表示应用CGS 21680的时段。图2C显示所述A2A拮抗剂ZM 241385(1μM)如何能够回复200nM CGS 21680对自发INCX的刺激作用。水平和垂直定标线条分别对应于30s和100pA。图2D是来自8例未患有心房颤动的对照患者和11例患有心房颤动的患者的心肌细胞中CGS作用的小结。使用配对t检验来评价CGS 21680的作用并且p值在条状物上面给出。INCX F是指INCX频率。图2E表明加入10μMH-89消除了5例患者中200nM CGS 21680的刺激作用。ANOVA显示所述处理对波频率的显著作用(p=0.001)并且后测给出CGS比对照的p=0.03、CGS比CGS+H-89的p=0.002和CGS+89比对照的p=0.05。
在图3A中,所述A2A拮抗剂SCH 58261(50nM)引起心房颤动患者样本中所述自发INCX频率的可逆降低。水平和垂直定标线条分别对应于30s和100pA。在图3B中,A2A拮抗剂降低了由共焦钙成像(左幅,n=6)或膜片钳技术(右幅,n=7)两者测量的所述自发钙波频率(WF)。50nM的ZM 241385和SCH 58261的作用是可比较的并被合并。对共焦实验使用非配对t检验以及对膜片钳实验使用配对t检验的统计学显著性在条状物以上给出。
人类右心房内A
2A
受体的表达和定位
通过免疫印迹研究人右心房心肌细胞内A2A受体的存在。结果表明A2A受体存在于右心房中,并且所述受体的单体物质和二聚物质两者都在该组织中表达,所述A2A受体在来自窦性心律心房的样本中是占少数的二聚形式。A2A受体在心房心肌中的定位通过共焦显微术在用抗所述受体A2A和抗肌球蛋白、α-辅肌动蛋白、连接蛋白-43或所述RyR的抗体双重标记的样本中进行研究。所述A2A受体按沿所述心肌纤维的横向带型而表达并与所述细胞骨架相关蛋白α-辅肌动蛋白在肌节的Z线水平下共定位。A2A受体的分布在来自患有及未患有心房颤动的患者的样本内定性地相似。
在患有心房颤动的患者中A
2A
受体表达的上调
分离的心房肌细胞保持所述A2A受体带型以及与α-辅肌动蛋白的定居和与心房组织样本中可见的RyR的重叠分布(参见图1A)。在来自患有和未患有心房颤动的患者的心肌细胞中未发现受体定位的不同(数据未显示)。通过Western印迹测量的A2A受体蛋白水平在患有心房颤动的患者中显著提高(参见图1B-图1C),并且有趣地,存在于所述细胞表面上的功能性形式的所述二聚A2A受体物质在心房颤动中显著增加(参见图1C)。在血管中未发现显著不同。因此,这些结果不仅第一次证明A2A受体在人类心房肌细胞中的表达,还证明其主要以所述同型二聚形式在患有心房颤动的患者中的上调。
A
2A
受体的激动剂刺激在患有心房颤动的患者中引起自发肌浆网(SR)
钙释放的依赖PKA的增加
在来自窦性心律患者以及患有心房颤动的患者的分离的心房肌细胞中分析A2A受体激动剂对自发SR钙释放的作用。对局部非传播钙释放(钙火花)以及来自所述SR的再生钙释放(钙波)均进行分析。与所述A2A受体激动剂CGS 21680(200nM)的预孵育增加了患有心房颤动的患者中的钙波数但不增加未患有所述心律失常的患者中的钙波数。
为了确定CGS 21680对自发SR钙释放的作用对于对所述膜电位的作用是否是次级的,使用膜片钳技术以将所述膜电位钳制在-80mV。这并不阻止CGS 21680可逆地增加作为由其活化的Na-Ca交换电流(INCX)而测量的自发钙波数(参见图2A和图2B)。的确,此方法证实了心房颤动患者内CGS 21680的显著刺激作用(参见图2D)。因此,由CGS 21680引起的增加的自发SR钙释放是由于所述RyR活性的依赖A2A受体的调节。CGS 21680的特异作用由所述两种选择性A2A拮抗剂ZM 241385(参见图2C)和SCH 58261而逆转。
由于A2A受体偶联Gs蛋白,激动剂介导的受体活化应当增加cAMP水平,这将依次导致PKA活化和RyR磷酸化。为了检验A2A受体是否经PKA的依赖cAMP的活化而发挥其作用,使用所述选择性PKA抑制剂H-89。CGS 21680在来自患有心房颤动的患者的肌细胞的刺激作用被H-89消除了(参见图2E),证实自发SR钙释放的依赖A2A受体的调节事实上是由PKA活化介导的。有趣地,H-89不仅消除了CGS 21680的作用,事实上,还使自发钙释放减少到比应用CGS 21680之前记录的基线显著更低的水平。用共焦显微术对钙火花与钙波的分析证实了A2A受体介导的自发钙释放的PKA依赖性。
A
2A
受体阻断减少基础自发SR钙释放
人类心房肌细胞内基础cAMP张力在所述L型钙电流的神经激素调节的研究中被主张。本发明人的观察结果,即PKA阻断剂H-89将所述钙波频率降低至基线水平以下,进一步提示在人类心房肌细胞中存在依赖A2A受体的基础cAMP张力。与此观点一致,应用于显示升高的基础SR钙释放的来自心房颤动患者的细胞的A2A受体选择性拮抗剂SCH 58261或ZM 241385显著降低由共焦显微术或膜片钳技术测量的所述钙波频率(参见图3)。
人类样本
在本研究中使用来自经历心脏手术的总共54例患者的心脏组织样本。尽管所述心房组织样本是由通常会在手术期间弃去的组织组成的,但仍从每例患者获得在本研究中使用的许可。本研究是由圣波医院(SantPau Hospital)(巴塞罗那,西班牙)伦理委员会批准的。
所述54例患者中的17例有心房颤动史而剩余的患者没有这种心律失常。25例患者不患有心房颤动但确实有左心房扩张(左心房直径>40mm)。用于具体实验序列的患者数在合适处标明。将采用Ca2+拮抗剂治疗的患者从本研究中排除。未发现显著影响所述所测量参数的其他患者药物治疗。为免疫组织化学分析,总共8例患有心房颤动的患者(左心房直径:53.8±6.8mm)和15例没有心房扩张并且没有心房颤动史的患者(左心房直径:36.5±3.4mm)作为对照。
抗体
使用以下第一抗体:兔亲和纯化的抗A2A受体多克隆抗体VC21-Ab,其针对与A2A受体的第二细胞外环相应的肽而开发;兔抗A2A受体抗体(Clone PA 1-042,Affinity BioReagents,Golden,CO,U.S.A.);小鼠抗慢肌肌球蛋白抗体(Clone NOQ7.5.4D,Chemicon International,Temecula,California,U.S.A.);小鼠抗α-辅肌动蛋白抗体(Clone EA-53,SigmaAldrichChemical Co.,St.Louis,MO,U.S.A.);小鼠抗连接蛋白-43抗体(Clone 2,Transduction Laboratories,Lexington,KY,U.S.A.);小鼠抗兰尼碱受体抗体(Clone C3-33,Calbiochem,San Diego,California,U.S.A.)。使用的第二抗体为:ALEXAFLUOR 488偶联的山羊抗小鼠IgG(1/1000)、TEXAS RED偶联的山羊抗兔IgG(1/2000)(Molecular Probes,Eugene,OR,U.S.A.)、辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG(1/60000)(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL,U.S.A.)和兔抗小鼠IgG(1∶2000)(Dako,Glostrup,Denmark)。
肌细胞分离
如前所述由人类心房组织样本分离肌细胞(参见L.Hove-Madsen etal.,″Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calciumrelease from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes(心房颤动与来自人类心房肌细胞中肌浆网的增加的自发钙释放相关)″,Circulation2004,vol.110,pp.1358-63)。简言之,将所述样本漂洗,在含有30mM丁二酮单肟(BDM)的不含钙的溶液中切成小片,以及在含有0.5mg/ml胶原酶(Worthington type 2(2型),318u/mg)和0.5mg/ml蛋白酶(Sigma typeXXIV(XXIV型),11u/mg solid(固体))的不含Ca2+的溶液中在35℃下孵育。45分钟后,将该组织从所述酶溶液中移除并且用巴斯德移液管将细胞在不含Ca2+的溶液中分散。所述剩下的组织在含有0.4mg/ml胶原酶的新鲜的不含钙的溶液中消化3×15分钟。含有分散的细胞的溶液在600rpm下离心1min,在不含钙的溶液中重悬,然后将钙逐渐增加至1mM。实验仅使用具有清晰横纹且没有肉芽形成的伸长的细胞。
阳性对照:细胞培养和转染
在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Sigma Aldrich Chemical Co.)中生长HEK-293细胞。通过磷酸钙沉淀,用编码人类A2A受体的DNA瞬时转染细胞(参见M.Canals et al.″Adenosine A2A-dopamine D2receptor-receptor heteromerization;qualitative and quantitative assessment byfluorescence and bioluminescence energy transfer(腺苷A2A-多巴胺D2受体-受体异聚化:通过荧光和生物发光能量转移的定性和定量评价)″,J.Biol. Chem.2003,vol.278,pp.46741-9)。在转染后24小时或48小时收获所述细胞。
自发SR钙释放
使用激光扫描共焦显微镜(Leica TCS SP2 AOBS,Germany)检测在加入fluo-3的细胞中的钙火花和钙波。所述实验溶液含有(按mM):NaCl136、KCl4、NaH2PO4 0.33、NaHCO3 4、CaCl2 2、MgCl2 1.6、HEPES 10、葡萄糖5、丙酮酸5,(pH=7.4)。在500nm至650nm收集在488nm下激发的衰减至1%至5%的荧光发射物。以1kHz的扫描速率在2×10.24s期间测量静息状态下钙火花和钙波。钙火花作为经所述钙火花中心的3μm切片的信号团的增加而被检测,但在相邻的3μm切片没有任何可检测到的增加。在两或更多相邻的3μm切片的所述信号团的增加计作钙波。每一钙火花的幅度及其半衰期是由所述钙火花瞬时的衰减期的指数拟合确定的。对每一细胞确定所述钙火花频率并将该频率标准化为所述扫描的细胞长度。
膜片钳
使用软件控制的膜片钳放大器(EPC 10,HEKA,Germany)将与钙波有关的所述瞬时向内的Na-Ca交换电流记录在所述穿孔膜片结构中。所述移液管电阻是1.5MΩ至4MΩ。实验是在室温下进行并且在所述接入电阻是稳定的且已降至小于5倍所述移液管电阻时开始。所述细胞外溶液含有(按mM):NaCl 127、四乙铵(TEA)5、HEPES 10、NaHCO34、NaH2PO40.33、葡萄糖10、丙酮酸5、CaCl22、MgCl21.8,(pH=7.4)。所述移液管溶液含有(按mM):天门冬氨酸109、CsCl 47、Mg2ATP 3、MgCl21、磷酸肌酸二钠5、Li2GTP 0.42、HEPES 10以及250μg/ml两性霉素B,(pH=7.2)。将所述A2A受体激动剂CGS 21860、拮抗剂ZM 241385和SCH58261、以及蛋白激酶A抑制剂H-89全部溶于DMSO中并作为10mM的储备溶液而保存。可释放咖啡因的SR钙含量是通过将细胞瞬时暴露于10mM咖啡因而测量的。假定所述Na-Ca交换器的化学计量关系为3Na+:1Ca2+,将所得Na-Ca交换电流的时间积分转化为由所述SR释放的钙的pmole(10-18mol)。
数据分析和统计
在不知道所述患者的临床数据的情况下进行电生理学和共焦钙成像实验。对来自相同患者的细胞内记录的所述Ca2+火花和Ca2+波取平均值。除非另外说明,来自每一患者的平均值用于统计分析并且表达为平均±标准误。对数据集检验正态性。当检验特异作用时,使用t检验来评价显著性差异。ANOVA用于比较多种作用而q检验后测用于评估特异作用的显著性。
膜制备
在含有5mM Tris-HCl(pH 7.4,缓冲液A)的0.32M蔗糖冰***液中,用Polytron匀浆器(Kinematica,PTA 20TS转子,设置5,三个15s时段)破碎细胞之后通过离心得到膜。通过在4℃、1000×g下(3500rpm,采用75Ti型转子)离心30min而分离细胞碎片。所述上清液在4℃、26000×g下(20000rpm,采用75Ti型转子)离心30min并且沉淀物在缓冲液A中重悬,37℃下孵育30min以及在相同条件下离心。沉淀物在0.3M KCl中重悬,在4℃下搅拌过夜,在4℃26000×g下(20000rpm,采用75Ti型转子)离心30min并如上所述用缓冲液A清洗一次。最终的沉淀物(膜碎片)在50mM的Tris-HCl中重悬并在-80℃下冷冻。如前述所述(参见C.Herrera,et al.,″Adenosine A2B receptors behave as an alternativeanchoring protein for cell surface adenosine deaminase in lymphocytes andcultured cells(在淋巴细胞和培养细胞中腺苷A2B受体表现为细胞表面腺苷脱氨酶的可选锚定蛋白)″,Mol.Pharmacol.2001,vol.59,pp.127-34)获得来自转染的HEK细胞的膜上清液。通过双金鸡宁酸法对蛋白定量(PierceChemical Co.)。
凝胶电泳和免疫印迹
通过在37℃加热2h用SDS-PAGE样本缓冲液(8M尿素,2%SDS,100mM DTT,375mM Tris,pH 6.8)处理来自人类细胞或瞬时转染的HEK细胞的膜并将其通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在10%凝胶中解析。使用半干转移***将蛋白转移至PVDF膜并且用所述标明的抗体和随后的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔IgG(1/60000)将其免疫印迹。使用化学发光的检测试剂盒(SuperSignal,West Pico Chemiluminiscent substrate,Pierce)显影免疫反应性条带。
免疫染色
为免疫组织化学,将人类心房组织包埋于OCT中并在液氮冷却的异戊烷中冷冻。在冷却至18℃的低温恒温器中切8微米切片。将切片收集至SUPERFROST PLUS(BDH Chemicals Ltd.,Poole,United Kingdom)载玻片上、空气干燥并在-70℃储存。为免疫荧光,将切片在溶于Tris缓冲的盐水(TBS)(150mM NaCl/50mM Tris-HCl,pH 7.5)的10%驴血清中阻断30min。用亲和纯化的抗A2A受体(VC21,25μg/ml)以及用抗α-辅肌动蛋白(1∶500稀释)、抗肌球蛋白(2μg/ml)、抗连接蛋白-43(2.5μg/ml)和抗兰尼碱受体(6.5μg/ml)在室温下孵育所述载玻片1小时,然后在TBS中清洗3次持续10min。将ALEXA FLUOR 488偶联的山羊抗小鼠IgG和TEXAS RED偶联的山羊抗兔IgG应用于以1∶2000稀释的阻断液。漂洗切片并用VECTASHIELD免疫荧光培养基(Vector Laboratories Inc.,Burlingame,CA,U.S.A.)将其固定。为免疫细胞化学,将新分离的人类心肌细胞接种于包被多聚D-赖氨酸的24mm玻璃盖玻片中。粘附后,在磷酸盐缓冲液中漂洗分离溶液细胞并在室温下用溶于PBS的2%低聚甲醛固定20min。用PBS清洗细胞并用0.1M甘氨酸孵育5min以淬灭所述醛基基团。用PBS清洗之后,用溶于PBS中的0.2%Triton-X-100可渗透化处理肌细胞15min。然后用PBS清洗细胞,在室温下用10%的马血清阻断30min并用接下来的第一抗体:兔多克隆抗A2A受体(10μg/ml)、抗α-辅肌动蛋白(1∶500稀释)、抗肌球蛋白(1∶500稀释)和抗连接蛋白-43(1∶150稀释)在室温下孵育1小时,用PBS清洗3次并在其中用与ALEXAFLUOR 488偶联的抗小鼠抗体和/或与TEXAS RED偶联的抗兔抗体染色。最后,再将细胞漂洗3次并用VECTASHIELD将其固定。用莱卡TCS 4D共焦激光扫描显微镜(Leica Lasertechnik GmbH,Heidelberg,Germany)进行共焦显微镜观察。
Claims (11)
1.选择性腺苷A2A受体拮抗剂在制备预防和/或治疗包括人类的哺乳动物的心房颤动的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其中所述选择性腺苷A2A受体拮抗剂是黄嘌呤衍生物或其药物可接受的盐。
4.如权利要求3所述的用途,其中所述选择性腺苷A2A受体拮抗剂是还被称为KW 6002的式(3)的化合物。
5.如权利要求3所述的用途,其中所述选择性腺苷A2A受体拮抗剂是还被称为MSX-2的式(6)的化合物。
6.如权利要求2所述的用途,其中所述选择性腺苷A2A受体拮抗剂是权利要求3定义的式(6)的化合物的磷酸酯。
7.如权利要求1所述的用途,其中所述选择性腺苷A2A受体拮抗剂是吡唑并嘧啶衍生物。
8.如权利要求1所述的用途,其中所述选择性腺苷A2A受体拮抗剂是***并喹喔啉衍生物。
9.如权利要求1所述的用途,其中所述选择性腺苷A2A受体拮抗剂是***并三嗪衍生物。
11.如权利要求10所述的用途,其中所述选择性腺苷A2A受体拮抗剂是还被称为VER-6623的式(15)的化合物。
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