WO2007045705A2 - Compuestos para el tratamiento de la fibrilación auricular - Google Patents

Compuestos para el tratamiento de la fibrilación auricular Download PDF

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Carmen LLUÍS BISET
Christa MÜLLER
Joan Cinca Cuscullola
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Definitions

  • This invention relates to the field of human and veterinary medicine and specifically to compounds for the treatment of cardiovascular diseases, in particular for the treatment of atrial fibrillation.
  • Atrial fibrillation is the most frequent cardiac arrhythmia and is associated with substantial mortality and morbidity. Its incidence and prevalence is increasing and represents a growing clinical and economic burden (the current prevalence is 2% of the general population). In addition to severe clinical symptoms such as palpitations, dizziness, dyspnea and others, atrial fibrillation is the most important isolated risk factor for ischemic stroke in the population over 75 years of age. Overall, atrial fibrillation is responsible for 5% of hospital admissions for heart disease. In 90% of cases, atrial fibrillation occurs in the presence of other heart diseases such as hypertensive heart disease, congestive heart failure or heart valve diseases. In only 10% of cases, atrial fibrillation develops in the absence of cardiac abnormalities ("lone" atrial fibrillation).
  • Atrial fibrillation paroxysmal atrial fibrillation characterized by episodes of self-limited atrial fibrillation with durations that vary between seconds and days; (2) persistent atrial fibrillation that lasts indefinitely until it is terminated through medical intervention; (3) permanent atrial fibrillation that does not reverse after electrical or pharmacological cardioversion.
  • Atrial fibrillation is caused by multiple reentrant electric waves that move randomly around the atrium. These waves are initiated by extrasystoles commonly located in the myocardial extensions that go from the left atrium to the proximal 5-6 cm of the pulmonary veins. Once the atrial fibrillation has begun, changes in the atrium (atrial remodeling) that affect its electrical, mechanical and physical properties occur. metabolic, responsible for the perpetration of arrhythmia. The ventricular frequency in the presence of atrial fibrillation is high and if it cannot be reduced with medical treatment, ventricular dilation and systolic dysfunction known as tachy cardiomyopathy will occur.
  • Cerebral vascular accident or stroke (“stroke") and thromboembolism are the major cause of mortality and morbidity associated with atrial fibrillation, and the pathophysiological basis of this is the prothrombotic state or hypercoagubility associated with abnormalities of blood flow (atrial stasis , for example) and endothelial or endocardial damage.
  • stroke Cerebral vascular accident or stroke
  • hypercoagubility associated with abnormalities of blood flow (atrial stasis , for example) and endothelial or endocardial damage.
  • the arrhythmia control is directed to the rhythm control (restoration and maintenance of the sinus rhythm) and the speed control.
  • the rhythm and speed control is performed with antiarrhythmic drugs (class I and III antiarrhythmic agents). Examples of them used today are flecainide, propafenone, amiodarone, dofetilide, ibutilide and sotalol.
  • the rhythm and speed control by non-pharmacological means is performed with electrical cardioversion, atrial pacemaker, implantable atrial defibrillator and Maze surgical procedure.
  • thromboembolic risk The reduction of thromboembolic risk and therefore, the prevention of stroke is of greater importance in the therapeutic strategy.
  • Pharmacologically, aspirin and warfarin are recommended to most patients to prevent the formation of atrial thrombi and thromboembolic events. Data from clinical trials with high-risk patients indicate that warfarin is better than aspirin to prevent stroke, but that the risk of bleeding is twice as high with warfarin as with aspirin.
  • the anticoagulant treatment should be individualized based on age, comorbidity and contraindications.
  • the reduction of thromboembolic risk by non-pharmacological procedures is currently achieved by obliteration of the left atrial appendage or with a catheter (procedure under investigation).
  • the inventors have found that a well known group of pharmaceutical compounds, namely adenosine A 2A receptor antagonists. They are useful for the preparation of drugs against atrial fibrillation in mammals, including man.
  • the invention has originated from the surprising finding that the A 2A adenosine receptor is present in human atrial cardiomyocytes and participates in the fundamental pathological mechanisms of atrial fibrillation.
  • the inventors have found that the expression of the homodimeric species of the adenosine A 2 A receptor, which is the functional species in the plasma membrane, is regulated upwards in patients with atrial fibrillation.
  • Electrophysiological experiments have proven that the activation of the adenosine A 2A receptor in atrial myocytes of these patients results in increases mediated by the protein kinase A of spontaneous calcium releases from the sarcoplasmic reticulum measured as calcium waves
  • adenosine A 2A receptor antagonists reduce the high calcium wave frequency found in atrial fibrillation.
  • adenosine A 2A receptor antagonists not only reverse the agonist stimulatory effect on calcium waves but also reduce the basal calcium wave frequency.
  • these results suggest that a deregulation mediated by the A 2A adenosine receptor cIe intracellular calcium flows contributes to the complex electrical remodeling of the fibrillating atrium.
  • the invention relates to the use of an adenosine A 2A receptor antagonist for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of atrial fibrillation in a mammal, including a human.
  • A2A adenosine receptor antagonist 11 will be called” A 2 A antagonist "and" A 2 A 1 'adenosine receptor as "A 2 A receptor” -
  • This aspect of the invention can alternatively be formulated as a A method for the prevention and / or treatment of atrial fibrillation by antagonizing A 2A receptors, which comprises administering to a mammal (preferably a human) that needs an effective amount of A 2A antagonist together with appropriate amounts of acceptable diluents or carriers.
  • a 2A antagonists are specifically aimed at patients with atrial fibrillation.
  • the expression of functional dimeric A 2A receptors is low in patients with a normal atrial size and without a previous history of atrial fibrillation while the expression of the dimeric receptor species is strongly regulated upwards in patients with atrial fibrillation.
  • other agents currently employed act more widely on receptors or channels that critically regulate multiple functions in a variety of cells.
  • calcium antagonists will not only reduce calcium overload by inhibition of type L calcium channels, but also reduce cardiac contractility.
  • calcium channels type L also regulate the function of smooth muscle and secretory cells, with the consequent unwanted side effects of calcium antagonists.
  • Adenosine is a purine nucleoside produced by all metabolically active cells in the body. Adenosine exerts its effect through four different cell surface receptor subtypes: Ai, A2A, A 2 B and A 3 that belong to the superfamily of receptors coupled to protein G. Ai and A 3 couple inhibitory G protein, while A 2A and A 2B couple stimulatory G protein.
  • a 2A receptors are found mainly in the brain, both in neurons and in gual cells (maximum levels in striatum and nucleus accumbens, moderate to high in olfactory bulb, regions of hypothalamus and hippocampus). In striatum, the A 2A receptor regulates the release and function of neurotransmitters (cf. H.
  • a 2A receptors are known to be present in platelets, neutrophils, spleen, thymus, endothelial cells and vascular smooth muscle, where they induce a potent coronary vasodilation that allows the evaluation of myocardial perfusion in patients with coronary heart disease ( cf. Z.
  • an antagonist is a molecule that binds to the receptor without activating it. It competes with the endogenous ligand or substrates for receptor binding sites and thus inhibits the ability of the receptor to transduce an intracellular signal in response to endogenous ligand binding.
  • An antagonist works in several ways. It can bind to or sequester the adenosine with sufficient affinity and specificity to substantially interfere with, block or otherwise, preventing the binding of adenosine to the A 2A receptor, and thus, inhibiting, suppressing or causing the cessation of the biological activity mediated by the adenosine
  • the A 2 A receptor in cardiomyocytes and in the absence of endogenous ligand has a basal activity. This activity may be due to a constitutive activity of the receptor or activation of the receptor by endogenous adenosine. In this situation, the treatment of atrial fibrillation can be carried out by reducing this basal activity using an antagonist or an inverse agonist. Some of the A 2A antagonists of the invention may have inverse agonism.
  • the A 2A antagonists According to the known location and the function of the A 2A receptor, the A 2A antagonists have so far been used against Parkinson's and other CNS diseases (schizophrenia, senile dementia as in Alzheimer's disease, psychosis of organic origin, etc.). ). Among them, the main one is Parkinson's disease.
  • a 2A antagonist is contemplated for use for the purposes of this invention. Many different compounds have been deeply investigated as A 2A antagonists, which can be classified into two large families: xanthine derivatives and heterocycles not derived from xanthine.
  • the A 2A antagonist is a xanthine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Different substituents at various positions also azo- or deazo- analogs, or other heterocyclic analogs of the purine ring or tri- or tetracyclic derivatives / analogs, may have A 2A activity - similar antagonistic.
  • the xanthine derivatives the preferred structure common to some compounds is structure 1, 3,7-trichl-8-styryl-xanthine.
  • the antagonist A2 A is a compound is selected from the group consisting of theobromine, known as DMPX (formula 1); KF 17837 (formula 2); istradefillin, known as KW 6002 (formula 3); p-sulfoestiryl-DMPX (formula 4); BS-DMPX (formula 5); MSX-2 (formula 6); CSC (formula 7); "xanthine amine congener” (XAC, formula 8); and MSX-3.
  • the A 2A antagonist is KW 6002. This compound is currently in clinical phase III trials for Parkinson's disease.
  • the A 2 A antagonist is MSX-2.
  • the A 2A antagonist is MSX-3, the phosphoric acid ester of MSX-2, a prodrug of MSX-2.
  • xanthine compounds known to exhibit antagonistic activity for the A 2A receptor are described for example in US 5484920, US 5587378, US 5543415 and EP 1016407A1.
  • the A 2A antagonist is a heterocycle not derived from xanthine.
  • Typical non-xanthine A 2A antagonists can be derived from adenine and represent adenine derivatives in the broadest sense, including mono-, di-, tri- and tetracyclic compounds with various substituents.
  • Other heterocyclic compounds not derived from adenine that have A 2A antagonistic activity have been identified.
  • Some 2-aminopyridine compounds that exhibit antagonism to the A 2A receptor are known (eg WO 02/14282, WO 01/25210), and some 9-aminopyrimidine compounds are also known (eg US 2001/0027196) .
  • the A 2A antagonist is selected from the group consisting of SCH 58261 (formula 9); ANR-82 (formula 10); ZM 241385
  • the A 2A antagonist among the group of non-xanthine compounds is VER-6623.
  • a 2A antagonists are the pyrazolopyrimidine derivative of formula 18; the triazoloquinoxaline derivative of formula 19; the 9-substituted 2-amino-6-furyl-adenine derivative of formula 20; and triazolotriazine derivatives of formula 21, 22 and 23.
  • triazolopyrimidine A 2A antagonists are described for example in WO 2004/029056, WO 95/01356, US 5565460, WO 97/05138, WO 98/52568, WO 01/92264 and PCT / US02 / 32630.
  • substituted compounds of pyrazole [4,3-e] -1, 2,4-triazolo- [1,5-c] pyrimidine are described in WO 2005/054245, US 2004/220194 and US 2003212059.
  • A2A antagonists include the compounds described in the following patents, patent applications and articles: WO 95/01356, US 6630475, US 5935964, WO 03/032996, WO 03/048165, WO 03/048164, WO 03 / 048163, WO 2005/042500, WO 2005/058883, WO 2005/040151, WO 2005/039572, WO 2004/092177, US 2004138235, WO 2004/019949, WO 02/14282, WO 2004/016605, WO 03/082873, US 5484920, US 5703085, WO 92 / 06976, WO 94/01114, US 5565460, WO 98/42711, WO 00/7201, WO 99/43678, WO 99/26627, WO 01/92264, WO 99/35147, WO 00/13682, WO 00/13681 , WO 00/69464, WO 01/40230
  • a 2A antagonist for the purpose of the invention.
  • a 2A antagonists are prepared by known methods as described in the patents and applications cited.
  • an effective amount refers to that amount of active ingredient that is sufficient to give a beneficial or desired clinical result: alleviate, improve, stabilize, reverse or delay the progression of the disease or disorder, or if not, reduce the pathological consequences of the disease or disorder.
  • the effective amount Ia normally determines a doctor on a case-by-case basis.
  • the active compound for use in accordance with the invention in therapy can be administered in the form of a crude chemical compound, it is preferred to introduce the active ingredient, optionally in the form of a physiologically acceptable salt, into a pharmaceutical composition together with one or more adjuvants, excipients , carriers, buffers, diluents and / or other usual pharmaceutical auxiliaries.
  • the components may be administered in a single or multiple doses by any of the acceptable modes of administration of agents with similar utility, including rectal, buccal, intranasal and transdermal routes, by intra-arterial, intravenous, intraperitoneal, parenteral, intramuscular injection, subcutaneous, oral, topical, as an inhalant, or via an apparatus impregnated or coated as a stent, for example, or a cylindrical polymer inserted in the artery.
  • agents with similar utility including rectal, buccal, intranasal and transdermal routes, by intra-arterial, intravenous, intraperitoneal, parenteral, intramuscular injection, subcutaneous, oral, topical, as an inhalant, or via an apparatus impregnated or coated as a stent, for example, or a cylindrical polymer inserted in the artery.
  • a preferred mode of administration is parenteral, particularly by injection.
  • the forms for administration by injection include aqueous or oily suspensions, or emulsions, as well as sterile aqueous solutions.
  • Oral administration is another preferred route of administration.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of pills, pills, powders, elixirs, suspensions, emulsions, syrup solutions, aerosols, capsules, etc.
  • compositions of the invention can be formulated to provide a rapid, sustained or delayed action release of the active ingredient after administration to the patient through the use of methods known in the art.
  • Controlled drug release systems for oral administration include osmotic pump systems and dissolution systems containing polymer coated reservoirs or formulations with a drug-polymer matrix.
  • Another formulation to be used in the methods of the present invention employs transdermal release devices (patches). These transdermal patches can be used to provide continuous or discontinuous infusion of the compounds in controlled amounts.
  • compositions are preferably formulated as a single dose.
  • the dose depends on the nature and severity of the disease and determining it is within the discretion of the doctor.
  • FIG. 1 Up-regulation of the expression of the A 2A receptor in patients with atrial fibrillation.
  • FIG. 2 Stimulation by A2A receptor agonists includes in patients with atrial fibrillation a PKA-dependent increase in release. Spontaneous calcium from the sarcoplasmic reticulum.
  • FIG. 3 The A 2A antagonists reduce the spontaneous basal calcium release from the sarcoplasmic reticulum in patients with atrial fibrillation. Experiments showing spontaneous INCX at a potential maintained at -80 mV.
  • FIG. 1A shows fresh myocytes isolated from the right atrium that were doubly stained with anti-A 2A receptor (panels 1, 4, 7 and 10) and anti-myosin (2), anti- ⁇ -actinin (5), anti-connexin- 43 (8) or ryanodine anti-receptor (11).
  • superimposition of double immunofluorescence images panels 3, 6, 9 and 12
  • the FlG The FlG.
  • FIG. 1B shows cell membranes of HEK cells transiently transfected with the human A 2A receptor (positive control, C +) and human heart atrial membranes of individuals with sinus rhythm (SINUS) or with atrial fibrillation (AF) resolved by SDS-PAGE and immunoblot using a rabbit antibody A 2A receptor - "Di” means dimer and "Mo” means monomer.
  • FIG. 1 C shows the relative densitometric scanning ("Relative Densitometric Sean", RDS) of the immunoblot of FIG. 1 B. The total amount of A 2A receptor (monomer plus dimer) is shown in black bars. The relative amounts of A 2A receptor monomer (white bars) and dimer (gray bars) are normalized using the total sum of A 2A receptor (dimer plus monomer) in each lane.
  • FIG. 2A the spontaneous IN C X was measured with the membrane potential maintained at -80 mV before (control), during (CGS) and after (washing, W) of the myocardial exposure to 200 nM of CGS 21680.
  • Horizontal and vertical scales correspond respectively to 30 s and 100 pA.
  • FIG. 2B shows the dependence with time of the stimulatory effect of CGS 21680 on the number of spontaneous currents of Na-Ca exchange (counted as events in each scan of 30 s, e / s). Thick line located on the bars indicates the period of application of CGS 21680.
  • FIG. 2C shows how the antagonist A 2A , ZM 241385 (1 ⁇ M) was able to reverse the stimulating effect of 200 nM of CGS 21680 on spontaneous IN C X.
  • the horizontal and vertical scale bars correspond respectively to 30 s and 100 pA.
  • FIG. 2D is a summary of the effect of CGS on the cardiomyocytes of 8 patients without and 11 patients with atrial fibrillation. The couples t test was used to assess the effect of CGS 21680 and p values are indicated on the bars.
  • INCX F stands for INCX frequency-
  • FIG. 2E shows that the addition of 10 ⁇ M of H-89 abolished the stimulating effect of 200 nM of CGS 21680 in 5 patients.
  • the A 2 A receptor antagonist, SCH 58261 (50 nM) caused a reversible reduction of the spontaneous l N cx frequency in samples of patients with atrial fibrillation.
  • the horizontal scale bars and. verticals correspond respectively to 30 s and 100 pA.
  • WF spontaneous calcium waves
  • the presence of the A 2A receptor in right atrial cardiomyocytes was investigated by immunoblot. The results show that the A 2A receptor is present in the human atrium and that both the monomeric and the dimeric form are expressed in this tissue, the minor dimeric species being in samples from the atrium in sinus rhythm.
  • the location of the A 2A receptor in the atrial myocardium was studied by confocal microscopy in doubly stained samples with antibodies directed against the A 2A receptor, myosin, ⁇ -actinine, connexin-43 or the ryanodine receptor (RyR).
  • the A 2A receptor was expressed according to a band pattern transverse to the axis of the myocardial fiber and colocalized at the level of the Z line of the sarcomere with the ⁇ -actinin cytoskeleton protein. The distribution of the A 2A receptor was quantitatively similar in samples of patients with and without atrial fibrillation.
  • the isolated atrial myocytes maintained the banded pattern of the A 2A receptor, the colocalization with ⁇ -actinin, and the distribution overlapped with the RyR that was revealed in the atrial tissue samples (cf. FIG. 1A). No differences were observed in cardiomyocytes of patients with and without atrial fibrillation (data not shown).
  • the protein levels corresponding to the A 2A receptor measured by immunoblot were markedly higher in patients with atrial fibrillation (cf. FIG. 1B-C) and interestingly, the dimeric species of A 2 A receptor, which is the functional form present on the surface cellular, was markedly elevated in atrial fibrillation (cf. FIG. 1C). No significant differences were observed in blood vessels. Therefore, the present findings not only demonstrate for the first time the existence of the A 2A receptor in human atrial myocytes, but its upward regulation, mainly in a homodimeric form, in patients with atrial fibrillation.
  • a receptors induces a PKA-dependent increase in the spontaneous release of calcium from the sarcoplasmic reticulum (SR ⁇ in patients with atrial fibrillation.
  • the effect of the A 2A receptor agonists on the spontaneous release of calcium from the SR was analyzed in atrial myocytes isolated from patients with sinus rhythm and in patients with atrial fibrillation. Both the release of unprogamed local calcium or calcium sparks (calcium sparks) and the regenerative calcium release of SR (calcium waves) were analyzed. Preincubation with the A 2A receptor agonist , CGS 21680 (200 nM), increased the number of calcium waves in patients with atrial fibrillation but not in those without arrhythmia.
  • the A 2A receptor Since the A 2A receptor is coupled to Gs proteins, its agonist-mediated activation must increase cAMP levels, which in turn results in the activation of PKA and phosphorylation of RyR.
  • the selective PKA inhibitor, H-89 was used. The stimulatory effect of CGS 21680 in myocytes of patients with atrial fibrillation was counteracted by H-89 (cf. FIG. 2E), confirming that the regulation of the spontaneous calcium release of the A 2A receptor-dependent SR is in fact mediated by Ia PKA activation.
  • H-89 not only abolished the effect of CGS 21680 but also reduces the spontaneous release of calcium to a level significantly lower than the baseline level existing before the application of CGS 21680.
  • the analysis of waves and flashes of calcium by confocal microscopy confirmed the dependence of PKA on the spontaneous release of calcium mediated by A 2A receptor.
  • Blocking ATA receptors reduces the basal level of spontaneous calcium release from the SR.
  • Cardiac tissue samples from a total of 54 patients undergoing cardiac surgery were used in this study. Although the samples corresponded to atrial tissue that is discarded during surgery, permission was requested from each patient to use them. The study was approved by the Ethical Committee of the Hospital de Sant Pau (Barcelona, Spain).
  • the primary antibodies used were: polyclonal antibody VC21-Ab anti-A 2A receptor affinity purified; VC21-Ab was developed against a peptide corresponding to the second intracellular loop of the A 2 A receptor; anti-A 2A receptor rabbit (Clone PA1-042, Affinity BioReagents, Golden, CO, USA); mouse muscle anti-myosin antibody (Clone NOQ7.5.4D, Chemicon International, Temecula, California, USA); anti- ⁇ -actinin mouse antibody (Clone EA-53, Sigma Aldrich
  • the secondary antibodies used were: goat anti-mouse IgG conjugated to ALEXAFLUOR 488 ® (1/1000), goat anti-rabbit IgG conjugated to TEXAS RED ® (1/2000) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), goat anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase (1/60000) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) and rabbit IgG anti-mouse (1: 2000) (Dako, Glostrup, Denmark).
  • the myocytes were isolated from samples of human atrial tissue by the protocol described previously (cf. L. Hove-Madsen et al., "Atrial fibrillation! S associated with increased spontaneous calcium relée from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes", Circulation 2004, vol. 110, pp. 1358-63).
  • samples were washed, cut into small pieces in a free calcium solution containing 30 mM monoxime butanedione (BDM), and incubated at 35 0 C in free solution of Ca 2+ containing 0.5 mg / ml of collagenase (Worthington type 2, 318 u / mg) and 0.5 mg / ml of proteinase (Sigma type XXIV, 11 u / mg solid). After 45 min, the tissue was extracted from the enzymatic solution and the cells were disintegrated in a Ca 2+ free solution with the help of a Pasteur pipette.
  • BDM monoxime butanedione
  • the remaining tissue was digested (3x15 minutes) in a fresh calcium-free medium containing 0.4 mg / ml collagenase.
  • the solutions containing the disintegrated cells were centrifuged at 600 rpm for 1 min, resuspended in calcium-free medium and then the calcium was gradually added to a concentration of 1 mM. Only elongated cells with clear cross striations and without granulations were used in the experiments.
  • HEK-293 cells were grown in a Dulbecco's medium modified by Eagle (DMEM, Sigma Aldrich Chemical Co.). The cells were transiently transfected with the DNA encoding the human A2A receptor (cf. M. Ca ⁇ áis et al. "Adenosine A 2A -dopamine D 2 receptor-receptor heteromerization: qualitative and quantitative assessment by fluorescence and bioluminescence energy transfer", J Biol. Chem. 2003, vol. 278, pp. 46741-9) by precipitation with calcium phosphate. The cells were collected 24 or 48 h after transfection.
  • DMEM Dulbecco's medium modified by Eagle
  • Calcium signals were detected in cells loaded with fluo-3 using a laser confocal microscope (Leica TCS SP2 AOBS, Germany).
  • the flashes and the calcium waves were measured in basal conditions (resting) for 2 x 10.24 s, at a scanning speed of 1 kHz.
  • the calcium flashes were identified according to the increase in the amount of signal of a 3 ⁇ m section through the center of the calcium flash, with no detectable increase in the adjacent 3 ⁇ m section. An increase in the amount of signal in two or more adjacent 3 ⁇ m sections was considered a calcium wave.
  • the amplitude of each calcium flash, and its half-life were determined from an exponential representation of the phase of decline of the transient signal of the calcium flash.
  • the frequency of calcium flashes was determined for each of the cells and normalized by the length of the scanned cell.
  • the transient input current of Na-Ca exchange associated with calcium waves was quantified in perforated patch configuration using a patch-clamp amplifier control software (EPC 10, HEKA, Germany).
  • the resistance of the pipette was 1.5-4 M ⁇ .
  • the experiments were carried out at room temperature and started when the resistance of the system was stable and the resistance of the pipette had decreased to less than 5 times.
  • the pipette solution contained (in mM): aspartic acid 109, CsCI 47, Mg 2 ATP 3, MgCI 2 1,
  • the calcium content releasable by caffeine was determined by transient exposure of the cells to 10 mM of caffeine.
  • the resulting Na-Ca exchange current was converted to pmoles (10 ⁇ 18 mol) of calcium released from the SR assuming a stoichiometry of 3Na + : 1Ca 2+ for the Na-Ca exchanger.
  • the calcium determination experiments by electrophysiological techniques and confocal microscopy were carried out without knowledge of the clinical data of the patients.
  • the average of Ca 2+ flashes and quantified Ca 2+ waves in cells of the same patient was made. Except when otherwise maintained, the mean values of each patient were used for statistical analysis and expressed as mean + SEM The normality test for the data set was checked.
  • the Student t test was used to know if the differences were statistically significant for each specific effect.
  • the ANOVA test was used to compare multiple effects and the Student-Newman-Keuls post-test was used to evaluate the significance of the specific effects.
  • the membranes were obtained by centrifugation after disruption of the cells with a Polytron type homogenizer (Kinematica, PTA 20TS rotor, level 5, three periods of 15 s) in an ice-cold solution containing 0.32 M sucrose and 5 mM of Tris-HCI (pH 7.4; buffer A). The cell debris was removed by centrifugation at 1000 xg for 30 min at 4 0 C (3500 rpm in a 75Ti rotor).
  • the supernatant was centrifuged at 26,000 xg for 30 min at 4 0 C (20,000 rpm in a 75Ti rotor) and the residue was resuspended in buffer A, incubated at 37 0 C for 30 min and centrifuged under the same conditions.
  • the residue was resuspended in 0.3 M KCI, stirred overnight at 4 0 C, centrifuged at 26,000 xg for 30 min at 4 0 C (20,000 rpm in a 75Ti rotor) and washed once with the buffer as It is described above.
  • the final residue (membrane preparation) was resuspended in 50 mM Tris-HCl and frozen at -80 0 C.
  • the membrane suspension of cells transfected HEK were obtained as previously described (cf. C. Herrera, et al., "Adenosine A 2B receptors behave as an alternative anchoring protein for cell surface adenosine deaminase in lymphocytes and cultured cells", Mol. Pharmacol. 2001, vol. 59, pp. 127-34) .
  • the protein was quantified by the bicinconinic acid method (Pierce Chemical Co.)
  • Membranes from human cells or transiently transfected HEK cells were treated with buffer SDS-PAGE (8 M urea, 2% SDS, 100 mM DTT, 375 mM Tris, pH 6.8), they heated to 37 0 C for 2 h and Proteins were resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (10%).
  • the proteins were transferred to PVDF membranes by a semi-dry transfer system and the immunoblot was carried out with the antibody indicated in each case and subsequently with goat anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase (1 / 60,000). Immunoreactive bands were developed using a chemiluminescence detection kit (SuperSignal, West Pico Chemiluminiscent substrate, Pierce).
  • Samples were incubated with affinity purified anti-A 2 A receptor antibody (VC21, 25 ⁇ g / ml) and with anti- ⁇ -actinin antibodies (1: 500 dilution), anti-myosin (2 ⁇ g / ml), anti- connexin-43 (2.5 ⁇ g / ml) and ryanodine antireceptor (6.5 ⁇ g / ml) for one hour at room temperature and then washed three times for 10 min in TBS.
  • Goat anti-mouse IgG conjugated with ALEXA FLUOR 488 ® and goat anti-rabbit IgG conjugated to TEXAS RED ® were applied in blocking solution at a dilution of 1: 2000.
  • VECTASHIELD ® immunofluorescence medium VECTASHIELD ® immunofluorescence medium (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA).
  • VECTASHIELD ® immunofluorescence medium
  • freshly isolated human myocytes are they plated in 24 mm covers covered with poly-D-lysina. After adhesion of the cells, the myocytes were washed with phosphate-saline buffer (PBS) and fixed with 2% paraformaldehyde in PBS for 20 min at room temperature. The cells were washed with PBS and incubated with 0.1 M glycine 5 min to block the aldehyde groups. After washing with PBS, myocytes were permeabilized with 0.2% Triton-X-100 in PBS 15 min.
  • PBS phosphate-saline buffer
  • the cells were then washed with PBS, blocked 30 min with 10% horse serum at room temperature and incubated with the following primary antibodies: polyclonal anti-A2A receptor (10 ⁇ g / ml), anti- ⁇ -actinin (1: 500 dilution), anti-myosin (1: 500 dilution) and anti-connexin-43 (1: 150 dilution) for one hour at room temperature. They were washed three times with PBS and stained with anti-mouse antibody conjugated to ALEXA FLUOR 488 ® and / or anti-rabbit antibody conjugated TEXAS RED ® . Finally, the cells were washed again three times and mounted on VECTASHIELD ® medium. The confocal microscopy observations were carried out with the Leica TCS 4D equipment (Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg, Germany).

Abstract

Los antagonistas del receptor de adenosina A2A son útiles para la preparación de medicamentos contra la fibrilación auricular en mamíferos, incluyendo el hombre. Se ha encontrado que el receptor de adenosina A2A es presente en los cardiomiocitos auriculares humanos y participa en los mecanismos patológicos fundamentales de la fibrilación auricular. Una ventaja de utilizar antagonistas A2A sobre otros agentes conocidos en la técnica es que los antagonistas A2A van dirigidos específicamente a pacientes con fibrilación auricular.

Description

Compuestos para el tratamiento de Ia fibrilación auricular
Esta invención se relaciona con el campo de Ia medicina humana y veterinaria y específicamente con compuestos para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, en particular para el tratamiento de Ia fibrilación auricular.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La fibrilación auricular es Ia arritmia cardiaca más frecuente y se asocia a una mortalidad y morbilidad sustanciales. Su incidencia y prevalencia está incrementando y representa una creciente carga clínica y económica (Ia prevalencia actual es del 2% de Ia población general). Además de los síntomas clínicos severos como palpitaciones, mareos, disnea y otros, Ia fibrilación auricular es el factor aislado de riesgo más importante para el accidente isquémico cerebral en Ia población de más de 75 años de edad. En conjunto Ia fibrilación auricular es responsable de un 5% de los ingresos hospitalarios por enfermedades cardiacas. En el 90% de los casos Ia fibrilación auricular acontece en presencia de otras enfermedades cardiacas como Ia enfermedad cardiaca hipertensiva, el fallo cardiaco congestivo o las enfermedades de las válvulas cardiacas. En sólo un 10% de los casos Ia fibrilación auricular se desarrolla en ausencia de anormalidades cardiacas ("lone" fibrilación auricular). Se puede diferenciar entre tres formas de fibrilación auricular: (1 ) fibrilación auricular paroxística caracterizada por episodios de fibrilación auricular autolimitados con duraciones que varían entre segundos y días; (2) fibrilación auricular persistente que dura indefinidamente hasta que se termina por medio de intervención médica; (3) fibrilación auricular permanente que no revierte tras cardioversión eléctrica o farmacológica.
Existen estudios que han demostrado que Ia fibrilación auricular está causada por múltiples ondas eléctricas reentrantes que se mueven al azar alrededor de Ia aurícula. Estas ondas se inician por extrasistoles comúnmente localizados en las extensiones miocárdicas que van de Ia aurícula izquierda hasta los 5-6 cm proximales de las venas pulmonares. Una vez iniciada Ia fibrilación auricular se producen cambios en Ia aurícula (remodelado auricular) que afectan a sus propiedades eléctricas, mecánicas y metabólicas, responsables de Ia perpetración de Ia arritmia. La frecuencia ventricular en presencia de fibrilación auricular es elevada y si ésta no puede reducirse con tratamiento médico, se producirá una dilatación ventricular y una disfunción sistólica que se conoce como taquimiocardiopatía. El accidente vascular cerebral o ictus ("stroke") y el tromboembolismo son Ia mayor causa de mortalidad y morbilidad asociadas a Ia fibrilación auricular, y Ia base patofisiológica de ello es el estado protrombótico o de hipercoagubilidad asociado a anormalidades del flujo sanguíneo (estasis auricular, por ejemplo) y daño endotelial o endocárdico.
Como en otras subespecialidades en cardiología, se han realizado importantes progresos en las últimas cuatro décadas en el diagnóstico y el tratamiento de arritmias cardíacas. A pesar de dichos avances Ia curación real de las arritmias cardíacas y de Ia muerte súbita arrítmica sólo es posible en una minoría de pacientes. Actualmente Ia terapia para Ia fibrilación auricular está enfocada a reducir los síntomas relacionados con Ia fibrilación auricular, Ia prevención de las complicaciones tromboembólicas y Ia terminación de Ia arritmia cuando ello sea posible.
En general hay dos formas de enfocar el tratamiento de Ia fibrilación auricular: a) control de Ia propia arritmia y b) reducción del riesgo tromboembólico (cfr. M.B. Iqbal et al., "Recent developments ¡n atrial fibrillation", British Medical Journal 2005, vol. 330, pp. 238-43). El control de Ia arritmia va dirigido al control del ritmo (restauración y mantenimiento del ritmo sinusal) y al control de Ia velocidad. Farmacológicamente, el control de ritmo y de Ia velocidad se realiza con fármacos antiarrítmicos (agentes antiarrítmicos de clase I y III). Ejemplos de ellos que se usan hoy en día son flecainida, propafenona, amiodarona, dofetilida, ibutilida y sotalol. El control del ritmo y de Ia velocidad por medios no farmacológicos se realiza con cardioversión eléctrica, marcapasos auricular, desfibrilador auricular implantable y procedimiento quirúrgico de Maze.
La reducción del riesgo tromboembólico y por tanto, Ia prevención del ictus es de mayor importancia en Ia estrategia terapéutica. Farmacológicamente, Ia aspirina y Ia warfarina se recomiendan a Ia mayoría de pacientes para prevenir Ia formación de trombos auriculares y de episodios tromboembólicos. Datos de ensayos clínicos con pacientes de alto riesgo indican que Ia warfarina es mejor que Ia aspirina para prevenir el ictus, pero que el riesgo de hemorragia es dos veces mayor con warfarina que con aspirina. En cualquier caso, el tratamiento anticoagulante debe ser individualizado en base a Ia edad, comorbilidad y contraindicaciones. La reducción del riesgo tromboembólico mediante procedimientos no farmacológicos se consigue actualmente mediante la obliteración de Ia orejuela auricular izquierda o con catéter (procedimiento en fase de investigación).
Investigaciones recientes han vislumbrado nuevas aproximaciones en las estrategias de tratamiento farmacológico y no farmacológico. Los agentes más prometedores son los inhibidores del enzima convertidora de Ia angiotensina (ACE) y los agentes bloqueantes de los receptores de angiotensina II. Inhibidores de proteasas, fosfatasas con suficiente selectividad y especificidad o antioxidantes pueden también ofrecer estrategias terapéuticas noveles para reducir o revertir los cambios estructurales, Ia dilatación auricular y Ia disfunción contráctil. Sin embargo, el problema del tratamiento de Ia fibrilación auricular está todavía lejos de ser resuelto satisfactoriamente.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado que un grupo bien conocido de compuestos farmacéuticos, a saber los antagonistas del receptor de adenosina A2A. son útiles para Ia preparación de medicamentos contra Ia fibrilación auricular en mamíferos, incluyendo el hombre.
La invención se ha originado del sorprendente hallazgo de que el receptor de adenosina A2A es presente en los cardiomiocitos de aurícula humana y participa en los mecanismos patológicos fundamentales de Ia fibrilación auricular. En particular, los inventores han encontrado que Ia expresión de Ia especie homodimérica del receptor de adenosina A2A, que es Ia especie funcional en Ia membrana plasmática, está regulada al alza en pacientes con fibrilación auricular. Experimentos electrofisiológicos han probado que Ia activación del receptor de adenosina A2A en miocitos auriculares de estos pacientes da lugar a incrementos mediados por Ia proteína quinasa A de liberaciones espontáneas de calcio del retículo sarcoplásmico medidos como ondas de calcio.
Además, utilizando dos aproximaciones experimentales diferentes (captación de imágenes de calcio por confocal y técnica de patch clamp) los inventores han encontrado que los antagonistas del receptor de adenosina A2A reducen Ia frecuencia de onda de calcio elevada encontrada en fibrilación auricular. En realidad, los antagonistas del receptor de adenosina A2A no sólo revierten el efecto estimulatorio agonista sobre las ondas de calcio sino que además reducen Ia frecuencia de onda de calcio basal. Reuniéndolos, estos resultados sugieren que una desregulación mediada por el receptor de adenosina A2AcIe los flujos de calcio intracelular contribuye a Ia compleja remodelación eléctrica de Ia aurícula que fibrila. Estos hechos convierten a los antagonistas del receptor de adenosina A2A en agentes terapéuticos selectivos para tratar Ia fibrilación auricular.
Previamente, y como investigación más cercana, los inventores habían sólo descrito que los miocitos aislados de aurícula derecha de pacientes con episodios de fibrilación auricular exhibían una liberación espontánea de Ca2+ de retículo sarcoplásmico más frecuente que miocitos de pacientes sin esta arritmia (cfr. L. Hove-Madsen et al., "Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium reléase from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes", Circulation 2004. vol. September, pp. 1358-63).
En consecuencia, Ia invención se refiere al uso de un antagonista del receptor de adenosina A2A para Ia preparación de un medicamento para Ia prevención y/o el tratamiento de Ia fibrilación auricular en un mamífero, incluyendo un humano. A partir de aquí, "antagonista del receptor de adenosina A2A11 será llamado "antagonista A2A" y "receptor de adenosina A2A1' como "receptor A2A" - Este aspecto de Ia invención se puede formular alternativamente como un método para Ia prevención y/o tratamiento de Ia fibrilación auricular antagonizando los receptores A2A, que comprende administrar a un mamífero (preferiblemente un humano) que Io necesite una cantidad efectiva de antagonista A2A junto con cantidades apropiadas de diluyentes o portadores aceptables.
Una ventaja de utilizar antagonistas A2A sobre otros agentes conocidos en Ia técnica es que los antagonistas A2A van dirigidos específicamente a pacientes con fibrilación auricular. Así, Ia expresión de los receptores A2A diméricos funcionales es baja en pacientes con un tamaño normal de aurícula y sin una historia previa de fibrilación auricular mientras que Ia expresión de Ia especie de receptor dimérico está fuertemente regulada al alza en pacientes con fibrilación auricular. Por el contrario, otros agentes actualmente empleados actúan más ampliamente sobre receptores o canales que regulan críticamente múltiples funciones en una variedad de células. Así, los antagonistas de calcio no sólo reducirán Ia sobrecarga de calcio por inhibición de los canales de calcio tipo L, sino que también reducen Ia contractibilidad cardiaca. Además, los canales de calcio tipo L también regulan Ia función del músculo liso y las células secretoras, con los consecuentes efectos secundarios indeseados de los antagonistas de calcio.
El receptor A?A
La adenosina es un nucleósido de purina producido por todas las células metabólicamente activas del cuerpo. La adenosina ejerce su efecto a través de cuatro subtipos diferentes de receptor de superficie celular: A-i, A2A, A2B y A3 que pertenecen a Ia superfamilia de receptores acoplados a proteína G. Ai y A3 acoplan proteína G inhibitoria, mientras que A2A y A2B acoplan proteína G estimuladora. Los receptores A2A se encuentran principalmente en cerebro, tanto en neuronas como en células guales (máximos niveles en striatum y nucleus accumbens, de moderados a altos en bulbo olfatorio, regiones del hypothalamus e hippocampus). En striatum el receptor A2A regula Ia liberación y Ia función de neurotransmisores (cfr. H. Kase et al. "Progress ¡n pursuit of therapeutic A2A antagonists: the adenosine A2A receptor selective antagonist KW 6002: research and development toward a novel nondopaminergic therapy for Parkinson's disease", Neuroloqy 2003, vol. 61 , pp. 97-100). En tejidos periféricos, los receptores A2A se conoce que están presentes en plaquetas, neutrófilos, bazo, timo, células endoteliales y del músculo liso vascular, donde inducen una potente vasodilatación coronaria que permite Ia evaluación de Ia perfusión miocárdica en pacientes con enfermedad coronaria (cfr. Z. Gao et al., "Novel short-acting A2A adenosine receptor agonists for coronary vasodilatation: inverse relationship between affinity and duration of action of A2A agonists", J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001 , vol. 298, pp. 209-18). Sin embargo, el receptor A2A no se había localizado nunca en cardiomiocitos de aurícula humana. Compuestos adecuados para tratar Ia fibrilación auricular
En general, un antagonista es una molécula que se une al receptor sin activarlo. Compite con el/los ligandos endógenos o el/los sustratos por los sitios de unión del receptor y así, inhibe la habilidad del receptor para transducir una señal intracelular en respuesta a Ia unión de ligando endógeno. Un antagonista funciona de varias maneras. Puede unirse a o secuestrar Ia adenosina con suficiente afinidad y especificidad para interferir sustancialmente con, bloquear o de otra manera, evitando Ia unión de Ia adenosina al receptor A2A, y así, inhibiendo, suprimiendo o causando Ia cesación de Ia actividad biológica mediada por Ia adenosina.
El receptor A2A en cardiomiocitos y en ausencia de ligando endógeno, presenta una actividad basal. Esta actividad puede ser debida a una actividad constitutiva del receptor o a activación del receptor por adenosina endógena. En esta situación, el tratamiento de Ia fibrilación auricular puede llevarse a cabo mediante Ia reducción de esta actividad basal utilizando un antagonista o un agonista inverso. Algunos de los antagonistas A2A de Ia invención pueden presentar agonismo inverso.
De acuerdo con Ia localización conocida y Ia función del receptor A2A, los antagonistas A2A han sido utilizados hasta ahora contra el Parkinson y otras enfermedades del SNC (esquizofrenia, demencia senil como en Ia enfermedad de Alzheimer, psicosis de origen orgánico, etc.). Entre ellas, Ia principal es Ia enfermedad de Parkinson.
Cada antagonista A2A se contempla para utilizarse para los propósitos de esta invención. Se han investigado profundamente muchos compuestos diferentes como antagonistas A2A, que pueden clasificarse en dos grandes familias: derivados de xantina y heterociclos no derivados de xantina.
En una realización particular de Ia invención, el antagonista A2A es un derivado de xantina o una sal farmacéuticamente aceptable de éste. Diferentes sustituyentes en varias posiciones, también análogos azo- o deazo-, u otros análogos heterocíclicos del anillo de purina o derivados/análogos tri- o tetracíclicos, pueden tener actividad A2A- antagonística similar. Entre los derivados de xantina, Ia estructura preferida común a algunos compuestos es Ia estructura 1 ,3,7-tr¡alquil-8-estiril-xantina. En una realización preferida, el antagonista A2A es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste de teobromina, conocida como DMPX (fórmula 1); KF 17837 (fórmula 2); istradefillina, conocida como KW 6002 (fórmula 3); p-sulfoestiril-DMPX (fórmula 4); BS-DMPX (fórmula 5); MSX-2 (fórmula 6); CSC (fórmula 7); "xanthine amine congener" (XAC, fórmula 8); y MSX-3 .
En una realización más preferida, el antagonista A2A es KW 6002. Este compuesto está actualmente en ensayos de fase clínica III para Ia enfermedad del Parkinson. En otra realización preferida, el antagonista A2A es MSX-2. En otra realización preferida, el antagonista A2A es MSX-3, el éster de ácido fosfórico de MSX-2, un profármaco de MSX-2.
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(3) (4)
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(5) (6)
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Otros compuestos de xantina conocidos por presentar actividad antagonística para el receptor A2A se describen por ejemplo en US 5484920, US 5587378, US 5543415 y EP 1016407A1.
En otra realización particular de Ia invención, el antagonista A2Aes un heterociclo no derivado de xantina. Antagonistas A2A no-xantina típicos pueden derivar de Ia adenina y representar derivados de Ia adenina en el sentido más amplio, incluyendo compuestos mono-, di-, tri- y tetracíclicos con varios sustituyentes. Se han identificado otros compuestos heterocíclicos no derivados de Ia adenina que poseen actividad antagonística A2A. Se conocen algunos compuestos 2-aminopiridina que exhiben antagonismo para el receptor A2A (p.ej. WO 02/14282, WO 01/25210), y también se conocen algunos compuestos 9-aminopirimidina (p.ej. US 2001/0027196).
En una realización preferida, el antagonista A2A se selecciona del grupo que consiste de SCH 58261 (fórmula 9); ANR-82 (fórmula 10); ZM 241385
(fórmula 11 ); SCH 63390 (fórmula 12), CGS 15943 (fórmula 13), 8FB-PTP (fórmula 14); VER-6623 (también conocido como V2006, fórmula 15); (-) R1S- mefloquina (fórmula 16); y 7FB-PTP (fórmula 17). En una realización más preferida, el antagonista A2A entre el grupo de compuestos no-xantina es VER-6623.
Otros compuestos preferidos como antagonistas A2A son el derivado de pirazolopirimidina de fórmula 18; el deirvado de triazoloquinoxalina de fórmula 19; el derivado 9-sustituido 2-amino-6-furil-adenina de fórmula 20; y los derivados de triazolotriazina de fórmula 21 , 22 y 23.
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(9) (10)
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(13) (14)
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(17) (18)
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(19) (20)
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(23)
Otros antagonistas A2A de triazolopirimidina se describen por ejemplo en WO 2004/029056, WO 95/01356, US 5565460, WO 97/05138, WO 98/52568, WO 01/92264 y PCT/US02/32630. Específicamente, compuestos sustituidos de pirazol[4,3-e]-1 ,2,4-triazolo-[1 ,5-c]pirimid¡na se describen en WO 2005/054245, US 2004/220194 y US 2003212059.
Otros ejemplos específicos de antagonistas A2A adecuados incluyen los compuestos descritos en las siguientes patentes, solicitudes de patente y artículos: WO 95/01356, US 6630475, US 5935964, WO 03/032996, WO 03/048165, WO 03/048164, WO 03/048163, WO 2005/042500, WO 2005/058883, WO 2005/040151, WO 2005/039572, WO 2004/092177, US 2004138235, WO 2004/019949, WO 02/14282, WO 2004/016605, WO 03/082873, US 5484920, US 5703085, WO 92/06976, WO 94/01114, US 5565460, WO 98/42711 , WO 00/7201 , WO 99/43678, WO 99/26627, WO 01/92264, WO 99/35147, WO 00/13682, WO 00/13681 , WO 00/69464, WO 01/40230, WO 01/02409, WO 01/02400, EP 1054012, WO 01/62233, WO 01/17999, WO 01/80893, WO 02/14282, WO 01/97786, WO 01/16134, WO 00/73307, US 2005043315, US 2003149060, Baraldi et al., "Recent developments in the field of A2A and A3 adenosine receptor antagonists", European Journal of Medicinal Chemistrv 2003, vol. 38, pp. 367-82; E. Ongini, et ai. "Selective adenosine A2A receptor antagonists", Fármaco 2001 , vol. 56, pp. 87-90; CE. Müller et al., "A2A Adenosine receptor antagonists - future drugs for Parkinson's disease?", Druqs of the Future 2000, vol. 25, pp. 1043- 52; LJ. Knutsen et al.,"KW-6002 (Kyowa Hakko Kogyo)", Curr. Opin. Investig. Druqs 2001 , vol. 2, pp. 668-73; B. Cacciari et al., "Medicinal chemistry of A2A adenosine receptor antagonists", Curr. Top. Med. Chem. 2003, vol. 3, pp. 403-11 ; G. Yao et al., "Synthesis of alkyne derivatives of novel triazolopyrazine as A2A adenosine receptor antagonists", Bioorq. Med. Chem. LeJt12005, vol. 15, pp. 511-5; E. Kiselgof et al., "6-(2-furanyl)-9H-purin-2- amine derivatives as A2A adenosine antagonists", Bioorq. Med. Chem. Lett. 2005, vol. 15, pp. 2119-22; S. M. Weiss et al., "Discovery of nonxanthine adenosine A2A receptor antagonists for the treatment of Parkinson's disease", Neuroloqy 2003, vol. 61 (Supp. 6), pp. S101-6; CB. Vu et al., "Novel diamino derivatives of [1 ,24]triazolo[1 ,5-a][1 ,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists", J. Med. Chem. 2005, vol. 48, pp. 2009- 18; CB. Vu et al., "Piperazine derivatives of [1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists", J. Med. Chem. 2004, vol. 47, pp. 4291-9.
El experto en Ia materia sabrá si un compuesto es un buen antagonista A2A para el propósito de Ia invención. Por ejemplo, hay en Ia técnica métodos adecuados para valorar si un compuesto es un buen antagonista A2A- Un ejemplo es el método basado en un ensayo de unión de radioligando que se describe en Ia solicitud de patente US 2004/0138235 secciones [0226]- [0240]. Es preferido para el tratamiento de Ia fibrilación auricular que el antagonista A2A sea selectivo para el receptor A2A- Todos los antagonistas A2A antes descritos son selectivos para el receptor A2A, pero el grado de selectividad es diferente entre ellos. Las selectividades pueden también diferir un tanto entre diferentes especies (p.ej. rata, humano).
Los antagonistas A2A se preparan por métodos conocidos como se describe en las patentes y solicitudes citadas.
Composiciones farmacéuticas y administración
En términos de tratamiento, una cantidad efectiva se refiere a aquella cantidad de ingrediente activo que es suficiente para dar un resultado clínico beneficioso o deseado: paliar, mejorar, estabilizar, revertir o retrasar Ia progresión de Ia enfermedad o desorden, o si no, reducir las consecuencias patológicas de Ia enfermedad o desorden. La cantidad efectiva Ia determina normalmente un médico caso por caso.
Mientras que el compuesto activo para usarse de acuerdo con Ia invención en terapia puede administrarse en forma de compuesto químico bruto, se prefiere introducir el ingrediente activo, opcionalmente en forma de sal fisiológicamente aceptable, en una composición farmacéutica junto con uno o más adyuvantes, excipientes, portadores, tampones, diluyentes y/o otros auxiliares farmacéuticos habituales. Los componentes pueden administrarse en una sola o en múltiples dosis por cualquiera de los modos de administración aceptables de agentes con utilidad similar, incluyendo las rutas rectal, bucal, intranasal y transdérmica, por inyección intra-arterial, intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, oral, tópica, como inhalante, o vía un aparato impregnado o recubierto como un stent, por ejemplo, o un polímero cilindrico insertado en Ia arteria.
Un modo de aministración preferido es el parenteral, particularmente por inyección. Las formas para Ia administración por inyección incluyen las suspensiones acuosas o oleosas, o las emulsiones, así como las soluciones acuosas estériles. La administración oral es otra ruta de administración preferida. La composición farmacéutica puede estar en forma de pastillas, pildoras, polvos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones jarabes, aerosoles, cápsulas, etc.
Las composiciones de Ia invención pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o de acción retardada del ingrediente activo después de Ia administración al paciente mediante el empleo de procedimientos conocidos en Ia técnica. Sistemas de liberación controlada del fármaco para administración oral incluyen sistemas de bombas osmóticas y sistemas disolucionales que contienen reservónos recubiertos de polímero o formulaciones con una matriz fármaco-polímero. Otra formulación para usarse en los métodos de Ia presente invención emplea aparatos de liberación transdérmica (parches). Estos parches transdérmicos pueden usarse para proporcionar Ia infusión continua o discontinua de los compuestos en cantidades controladas.
Las composiciones se formulan preferiblemente en forma de dosis única. La dosis depende de Ia naturaleza y Ia severidad de Ia enfermedad y determinarla queda dentro del criterio del médico.
Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en Ia materia a Ia que Ia invención pertenece. A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de Ia solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1. Regulación al alza (up-regulation) de Ia expresión del receptor A2A en pacientes con fibrilación auricular.
FIG. 2. La estimulación por agonistas del receptor A2A incluye en pacientes con fibrilación auricular un incremento dependiente de PKA de Ia liberación espontánea de calcio del retículo sarcoplásmico.
FIG. 3. Los antagonistas A2A reducen Ia liberación basal espontánea de calcio del retículo sarcoplásmico en pacientes con fibrilación auricular. Experimentos que muestran INCX espontáneo a un potencial mantenido a -80 mV.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Descripción detallada de las figuras
La FIG. 1A muestra miocitos frescos aislados de Ia aurícula derecha que fueron doblemente teñidos con anti-receptor A2A (paneles 1 , 4, 7 y 10) y anti- miosina (2), anti-α-actinina (5), anti-connexina-43 (8) o anti-receptor rianodina (11 ). La superimposición de las imágenes de immunofluorescencia doble (paneles 3, 6, 9 y 12) revela colocalización del receptor A2A con α-actinina y distribución solapada del receptor A2A con el receptor de rianodina (RyR). La FlG. 1B muestra membranas celulares de células HEK transfectadas transitoriamente con el receptor A2A humano (control positivo, C+) y membranas auriculares de corazón humano de individuos con ritmo sinusal (SINUS) o con fibrilación auricular (AF) resueltas por SDS-PAGE e ¡nmunoblot empleando un anticuerpo de conejo anti- receptor A2A- "Di" significa dímero y "Mo" significa monómero. La FIG. 1 C muestra el escaneado densitométrico relativo ("Relative Densitometric Sean", RDS) del inmunoblot de Ia FIG. 1B. La cantidad total de receptor A2A (monómero más dímero) se muestra en barras negras. Las cantidades relativas de monómero de receptor A2A (barras blancas) y de dímero (barras grises) se normalizan utilizando Ia suma total de receptor A2A (dímero más monómero ) en cada carril.
En Ia FIG. 2A, el INCX espontáneo se midió con el potencial de membrana mantenido a -80 mV antes (control), durante (CGS) y después (lavado, W) de Ia exposición del miocardiocito a 200 nM de CGS 21680. Las barras de escala horizontales y verticales corresponden respectivamente a 30 s y 100 pA. La FIG. 2B muestra Ia dependencia con el tiempo del efecto estimulador del CGS 21680 en el número de corrientes espontáneas de intercambio Na- Ca (contadas como eventos en cada barrido de 30 s, e/s). La línea gruesa situada sobre las barras indica el periodo de aplicación de CGS 21680. La FIG. 2C muestra cómo el antagonista A2A, ZM 241385 (1 μM) fue capaz de revertir el efecto estimulador de 200 nM de CGS 21680 sobre el INCX espontáneo. Las barras de escala horizontales y verticales corresponden respectivamente a 30 s y 100 pA. La FIG. 2D es un resumen del efecto de CGS en los cardiomiocitos de 8 pacientes sin y de 11 pacientes con fibrilación auricular. El test de t de parejas se usó para evaluar el efecto del CGS 21680 y los valores de p se indican sobre las barras. INCX F significa frecuencia INCX- La FIG. 2E muestra que Ia adición de 10 μM de H-89 abóle el efecto estimulador de 200 nM de CGS 21680 en 5 pacientes. ANOVA muestra un efecto significativo del tratamiento en Ia frecuencia de ondas (p=0.001 ) y el post-test dio una p=0.03 para CGS versus control, p=0.002 para CGS versus CGS+H-89 y p=0.05 para CGS+89 versus control.
En Ia FIG. 3A, el antagonista de receptor A2A, SCH 58261 (50 nM) causó una reducción reversible de Ia frecuencia lNcx espontánea en muestras de pacientes con fibrilación auricular. Las barras de escala horizontales y. verticales corresponden respectivamente a 30 s y 100 pA. En Ia FIG. 3B, los antagonistas A2A reducen Ia frecuencia de ondas de calcio espontáneas (WF) medidas por captación de imágenes de calcio por confocal (panel izquierdo, n=6) o por Ia técnica de patch-clamp (panel derecho, n=7). Los efectos de 50 nM de ZM 241385 y de SCH 58261 fueron comparables y se reunieron. La significación estadística empleando un test de t no aparejado en los experimentos de confocal y un test de t de parejas de patch-clamp se muestra sobre las barras.
Expresión y localización del receptor A?A en Ia aurícula humana derecha
La presencia de receptor A2A en cardiomiocitos de aurícula derecha se investigó por inmmunoblot. Los resultados muestran que el receptor A2A está presente en Ia aurícula humana y que tanto Ia forma monomérica como Ia dimérica se expresan en este tejido, siendo Ia especie dimérica minoritaria en muestras provenientes de aurícula en ritmo sinusal. La localización del receptor A2A en miocardio auricular se estudió por microscopía confocal en muestras teñidas doblemente con anticuerrpos dirigidos contra el receptor A2A, miosina, α-actinina, connexina-43 o el receptor de rianodina (RyR). El receptor A2A se expresó de acuerdo a un patrón de bandas transversal al eje de la fibra miocárdica y colocalizó a nivel de Ia línea Z del sarcómero con Ia proteína de citoesqueleto α-actinina. La distribución del receptor A2A fue cuantitativamente similar en muestras de pacientes con y sin fibrilación auricular.
Regulación al alza de Ia expresión de receptor A?A en pacientes con fibrilación auricular
Los miocitos auriculares aislados mantenían el patrón bandeado del receptor A2A, Ia colocalización con α-actinina, y Ia distribución solapada con el RyR que se puso de manifiesto en las muestras de tejido auricular (cfr. FIG. 1A). No se observaron diferencias en los cardiomiocitos de pacientes con y sin fibrilación auricular (datos no mostrados). Los niveles de proteína correspondientes al receptor A2A medidos por inmunoblot fueron marcadamente superiores en pacientes con fibrilación auricular (cfr. FIG. 1B- C) e interesantemente, Ia especie dimérica de receptor A2A, que es Ia forma funcional presente en Ia superficie celular, estaba notablemente elevada en fibrilación auricular (cfr. FIG. 1C). No se observaron diferencias significativas en vasos sanguíneos. Por Io tanto los hallazgos presentes no sólo demuestran por vez primera Ia existencia de receptor A2A en miocitos auriculares humanos, sino su regulación al alza, principalmente en forma homodimérica, en pacientes con fibrilación auricular.
Los estimulación por agonistas de los receptores A?A induce un incremento dependiente de PKA en Ia liberación espontánea de calcio del retículo sarcoplásmico (SR^ en pacientes con fibrilación auricular.
El efecto de los agonistas del receptor A2A en Ia liberación espontánea de calcio del SR se analizó en miocitos auriculares aislados de pacientes con ritmo sinusal y en pacientes con fibrilación auricular. Fueron analizadas tanto Ia liberación de calcio local no progagado o destellos de calcio ("calcium sparks") como Ia liberación de calcio regeneradora del SR (calcium waves). La preincubación con el agonista de receptor A2A, CGS 21680 (200 nM), incrementó el número de ondas (waves) de calcio en pacientes con fibrilación auricular pero no en aquéllos sin Ia arritmia.
Para determinar si el efecto del CGS 21680 en Ia liberación espontánea de calcio del SR es secundaria a un efecto en el potencial de membrana, se utilizó Ia técnica de patch-clamp para mantener el potencial de membrana a - 80 mV. Ello no impidió que el CGS 21680 incrementara de forma reversible el número de ondas de liberación espontánea de calcio medidas como comentes de intercambio Na-Ca (INCX) activadas por ellos (cfr. FIG. 2A y B). De hecho esta aproximación confirmó el efecto estimulador significativo del CGS 21680 en pacientes con fibrilación auricular (cfr. FIG. 2D). Por Io tanto, el incremento en Ia liberación espontánea de calcio del SR inducido por el CGS 21680 es debido a una regulación dependiente del receptor A2A en Ia actividad del RyR. El efecto específico del CGS 21680 fue revertido por los dos antagonistas selectivos ZM 241385 (cfr. FIG. 2C) y SCH 58261.
Puesto que el receptor A2A está acoplado a proteínas Gs, su activación mediada por agonistas debe incrementar los niveles de cAMP, que a su vez da lugar a Ia activación de Ia PKA y a Ia fosforilación del RyR. Para investigar si el receptor A2A ejerce su efecto a través de una activación de PKA mediada por cAMP, se empleó el inhibidor selectivo de Ia PKA, H-89. El efecto estimulador del CGS 21680 en miocitos de pacientes con fibrilación auricular fue contrarestado por H-89 (cfr. FIG. 2E), confirmando que Ia regulación de Ia liberación espontánea de calcio del SR dependiente de receptor A2A está de hecho mediada por Ia activación de Ia PKA. De manera interesante, el H-89 no sólo abolía el efecto del CGS 21680 sino que también reduce Ia liberación espontánea de calcio a un nivel significativamente menor que el nivel basal existente antes de Ia aplicación de CGS 21680. El análisis de las ondas y destellos de calcio mediante microscopía confocal confirmó Ia dependencia de PKA en Ia liberación espontánea de calcio mediada por receptor A2A.
El bloqueo de los receptores ATA reduce el nivel basal de liberación espontánea de calcio del SR.
La existencia de un tono basal de cAMP in miocitos auriculares humanos se ha sospechado a partir de estudios de modulación neuro-hormonal de corrientes de calcio de tipo L. La observación de los inventores de que un bloqueante de Ia PKA, el H-89, reduce Ia frecuencia de ondas de calcio por debajo del nivel basal debe interpretarse como Ia existencia de un tono basal de cAMP dependiente de receptor A2A. En concordancia con esto, los antagonistas selectivos del receptor A2A, SCH 58261 o ZM 241385, aplicados a células de pacientes con fibrilación auricular que muestran un elevado nivel basal de liberación de calcio, redujeron significativamente Ia frecuencia de las ondas de calcio medidas por mciroscopía confocal o por Ia técnica de patch clamp (cfr. FIG. 3).
Muestras humanas
Se utilizaron es este estudio muestras de tejido cardiaco de un total de 54 pacientes sometidos a cirugía cardiaca. Aunque las muestras correspondían a tejido auricular que se desecha durante Ia cirugía, se pidió permiso a cada paciente para utilizarlas. El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital de Sant Pau (Barcelona, España).
Diecisiete de los 54 pacientes tuvo una historia de fibrilación auricular mientras que el resto no tenía Ia arritmia. Veinticinco pacientes no tenían fibrilación auricular pero sí dilatación auricular izquierda (diámetro de Ia aurícula izquierda > 40 mm). Cuando es pertinente se indica el número de pacientes empleados en series experimentales específicas. Los pacientes tratados con antagonistas de Ca2+ se excluyeron del estudio. Otro tipo de medicación no se consideró que pudiera afectar significativamente los parámetros medidos. En los estudios inmunohistoquímicos se emplearon un total de 8 pacientes con fibrilación auricular (diámetro de aurícula izquierda: 53.8 ± 6.8 mm). 15 pacientes sin dilatación auricular y sin historia de fibrilación auricular sirvieron de control (diámetro de aurícula izquierda: 36.5 ± 3.4 mm).
Anticuerpos
Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: anticuerpo policlonal VC21-Ab anti-receptor A2A purificado por afinidad; VC21-Ab fue desarrollado contra un péptido que corresponde al segundo bucle intracelular del receptor A2A; anticuerpo anti-receptor A2A de conejo (Clone PA1-042, Affinity BioReagents, Golden, CO, U.S.A.); anticuerpo de ratón anti-miosina muscular (Clone NOQ7.5.4D, Chemicon International, Temecula, California, U.S.A.); anticuerpode ratón anti-α-actinina (Clone EA-53, Sigma Aldrich
Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.); anticuerpo anti-connexina-43 (Clone 2, Transduction Laboratories, Lexington, KY, U.S.A.); anticuerpo anti-receptor de rianodina (Clone C3-33, Calbiochem, San Diego, California, U.S.A.)- Los anticuerpos secundarios empleados fueron: IgG de cabra anti-ratón conjugado a ALEXAFLUOR 488® (1/1000), IgG de cabra anti-conejo conjugado a TEXAS RED® (1/2000) (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.), IgG de cabra anti-conejo conjugado a peroxidasa de rábano (1/60000) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.) e IgG de conejo anti-ratón (1 :2000) (Dako, Glostrup, Denmark).
Obtención de miocitos
Los miocitos fueron aislados de muestras de tejido auricular humano mediante el protocolo descrito previamente (cfr. L. Hove-Madsen et al., "Atrial fibrillation ¡s associated with increased spontaneous calcium reléase from the sarcoplasmic reticulum ¡n human atrial myocytes", Circulation 2004, vol. 110, pp. 1358-63). Brevemente, las muestras se lavaron, se cortaron en pequeñas piezas en una disolución libre de calcio que contenía 30 mM de monoxima de butanodiona (BDM), y se incubaron a 35 0C en una disolución libre de Ca2+ que contenía 0.5 mg/ml de colagenasa (Worthington type 2, 318 u/mg) y 0.5 mg/ml de proteinasa (Sigma type XXIV, 11 u/mg solid). Después de 45 min, el tejido se extrajo de Ia disolución enzimática y las células se disgregaron en una disolución libre de Ca2+ con ayuda de una pipeta Pasteur. El tejido sobrante se digerió (3x15 minutos) en un medio fresco libre de calcio que contenía 0.4 mg/ml de colagenasa. Las disoluciones que contenían las células disgregadas se centrifugaron a 600 rpm durante 1 min, se resuspendieron en medio libre de calcio y entonces el calcio se añadió gradualmente hasta una concentración de 1 mM. Sólo las células elongadas con estriaciones cruzadas claras y sin granulaciones se usaron en los experimentos.
ι ; Control positivo: cultivo celular y transfección
Las células HEK-293 se hicieron crecer en un medio de Dulbecco's modificado por Eagle (DMEM, Sigma Aldrich Chemical Co.). Las células se transfectaron transitoriamente con el DNA que codifica para el receptor A2A humano (cfr. M. Cañáis et al. "Adenosine A2A-dopamine D2 receptor-receptor heteromerization: qualitative and quantitative assessment by fluorescence and bioluminescence energy transfer", J. Biol. Chem. 2003, vol. 278, pp. 46741-9) mediante precipitación con fosfato de calcio. Las células se colectaron a 24 o 48 h después de Ia transfección.
Liberación espontánea de calcio del SR.
Las señales de calcio (destellos y ondas de calcio) se detectron en células cargadas con fluo-3 empleando un microscopio confocal láser (Leica TCS SP2 AOBS, Germany). La solución experimental contenía (en mM): NaCI 136, KCI 4, NaH2PO4 0.33, NaHCO3 4, CaCI2 2, MgCI2 1.6, HEPES 10, Glucosa 5, ácido pirúvico 5, (pH = 7.4). La emisión de fluorescencia se detectó a 500 y 650 nm con excitación a 488 nm atenuada a 1-5 %. Los destellos y las ondas de calcio se midieron en condiciones básales (resting) durante 2 x 10.24 s, a una velocidad de barrido de 1 kHz. Los destellos de calcio se identificaron según el incremento en Ia cantidad de señal de una sección de 3 μm a través del centro del destello de calcio, sin incremento detectable en Ia sección de 3 μm adyacente. Un incremento en Ia cantidad de señal en dos o más secciones de 3 μm adyacentes se consideró una onda de calcio. La amplitud de cada destello de calcio, y su vida media fueron determinados a partir de una representación exponencial de Ia fase de declive de Ia señal transitoria del destello de calcio. La frecuencia de destellos de calcio se determinó para cada una de las células y se normalizó por Ia longitud de célula barrida.
Patch-Clamp
La corriente de entrada transitoria de intercambio Na-Ca asociada a las ondas de calcio se cuantificó en configuración de patch perforada utilizando un software de control del amplificador de patch-clamp (EPC 10, HEKA, Germany). La resistencia de Ia pipeta fue de 1.5-4 MΩ. Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente y se iniciaron cuando Ia resistencia del sistema fue estable y hubo decrecido hasta menos de 5 veces Ia resistencia de Ia pipeta. La solución intracelular contenía (en mM): NaC1 127, tetraetilamonio (TEA) 5, HEPES 10, NaHCO3 4, NaH2PO40.33, glucosa 10, ácido pirúvico 5, CaCI2 2, MgCI2 1.8, (pH = 7.4). La solución de Ia pipeta contenía (en mM): ácido aspártico 109, CsCI 47, Mg2ATP 3, MgCI2 1 ,
Na2fosfocreatina 5, Li2GTP 0.42, HEPES 10 and 250 μg/ml anfotericina B, (pH = 7.2). El agonista de receptor A2A, CGS 21860, los antagonistas ZM 241385 y SCH 58261 , y el inhibidor de PKA, H-89, se disolvieron en DMSO y se mantuvieron en disoluciones stock de 10 mM. El contenido de calcio liberable por cafeína se determinó por exposición transitoria de las células a 10 mM de cafeína. La corriente de intercambio Na-Ca resultante se convirtió a pmoles (10~18 mol) de calcio liberado del SR asumiendo una estequiometría de 3Na+: 1Ca2+ para el intercambiador Na-Ca.
Tratamiento de datos y estadística
Los experimentos de determinación de calcio por técnicas electrofisiológicas y de microscopía confocal se llevaron a cabo sin conocimiento de los datos clínicos de los pacientes. Se hizo Ia media de los destellos de Ca2+ y de las ondas de Ca2+ cuantificados en células de un mismo paciente. Excepto cuando se mantenía Io contrario, los valores medios de cada paciente se usaron para el análisis estadístico y se expresaron como media + S. E. M. Se comprobó el test de normalidad para el conjunto de los datos. El test de Ia t de Student se empleó para saber si las diferencias eran estadísticamente significativas para cada efecto específico. Se empleó el test de ANOVA para comparar múltiples efectos y el post-test de Student-Newman-Keuls se usó para evaluar Ia significación de los efectos específicos.
Preparación de membranas
Las membranas se obtuvieron por centrifugación después de una disrupción de las células con un homogenizador tipo Polytron (Kinematica, PTA 20TS rotor, nivel 5, tres periodos de 15 s) en una disolución refrigerada en hielo que contenía 0.32 M de sacarosa y 5 mM de Tris-HCI (pH 7.4; tampón A). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 1000 x g durante 30 min a 4 0C (3500 rpm en un rotor 75Ti). El sobrenadante se centrifugó a 26000 x g durante 30 min a 40C (20000 rpm en un rotor 75Ti) y el residuo se resuspendió en tampón A, se incubó a 37 0C durante 30 min y se centrifugó en las mismas condiciones. El residuo se resuspendió en 0.3 M de KCI, se agitó durante Ia noche a 4 0C, se centrifugó a 26000 x g durante 30 min a 4 0C (20000 rpm en un rotor 75Ti) y se lavó una vez con el tampón tal como se describe arriba. El residuo final (preparación de membranas) se resuspendió en 50 mM de Tris-HCI y se congeló a -80 0C. La suspensión de membranas de células HEK transfectadas se obtuvieron como se ha descrito previamente (cfr. C. Herrera, et al., "Adenosine A2B receptors behave as an alternative anchoring protein for cell surface adenosine deaminase in lymphocytes and cultured cells", Mol. Pharmacol. 2001 , vol. 59, pp. 127-34). La proteína se cuantificó por el método del ácido bicinconínico (Pierce Chemical Co.)
Electroforesis en qel e inmunoblot
Las membranas de células humanas o de células HEK transfectadas transitoriamente se trataron con tampón de SDS-PAGE (8 M urea, 2% SDS, 100 mM DTT, 375 mM Tris, pH 6.8), se calentaron a 37 0C durante 2 h y las proteínas se resolvieron por electroforesis en gel de polyacrylamide (10%). Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF mediante un sistema de transferencia semi-seco y el inmunoblot se llevó a cabo con el anticuerpo indicado en cada caso y subsecuentemente con IgG de cabra anti-conejo conjugada a peroxidasa de rábano (1/60,000). Las bandas inmunoreactivas se desarrollaron usando un kit de detección por quimioluminiscencia (SuperSignal, West Pico Chemiluminiscent substrate, Pierce).
Tinción inmunológica
Para Ia ¡nmunohistoquímica, el tejido humano se embebió en OCT y se congeló en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. Secciones de ocho micrómetros se cortaron en un criostato enfriado a -18 0C. Las secciones se recogieron sobre láminas SUPERFROST PLUS® (BDH Chemicals Ltd., Poole, United Kingdom), se secaron al aire y se guardaron a -70 0C. Para Ia inmunofluorescencia, las secciones se bloquearon 30 min en un medio de 10% de suero de mulo en tampón Tris-salino (TBS) (150 mM NaCI/50 mM Tris-HCI, pH 7.5). Las muestras se incubaron con anticuerpo anti-receptor A2A purificado por afinidad (VC21 , 25 μg/ml) y con anticuerpos anti-α-actinina (1 :500 dilución), anti-miosina (2 μg/ml), anti-connexina-43 (2.5 μg/ml) y antireceptor de rianodina (6.5 μg/ml) durante una hora a temperatura ambiente y después lavadas tres veces durante 10 min en TBS. Las IgG de cabra antiratón conjugadas con ALEXA FLUOR 488® y las IgG de cabra anti-conejo conjugadas a TEXAS RED® se aplicaron en disolución de bloqueo a una dilución de 1 :2000. Las secciones se lavaron y se montaron en medio de inmunofluorescencia VECTASHIELD® (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, U.S.A.). Para Ia ¡nmunocitoquímica, miocitos humanos recién aislados se plaquearon en cubres de 24 mm recubiertos con poly-D-lysina. Tras Ia adhesión de las células los miocitos se lavaron con tampón fosfato-salino (PBS) y se fijaron con un 2% de paraformaldehido en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS y se incubaron con 0.1 M de glicina 5 min para bloquear los grupos aldehido. Después de lavar con PBS, los miocitos se permeabilizaron con 0.2% de Triton-X-100 en PBS 15 min. Las células fueron después lavadas con PBS, bloqueadas 30 min con suero de caballo al 10% a temperatura ambiente y se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: policlonal anti-receptor A2A (10 μg/ml), anti- α-actinina (1 :500 dilución), anti-miosina (1 :500 dilución) y anti-connexina-43 (1 :150 dilución) durante una hora a temperatura ambiente. Se lavaron tres veces con PBS y se tiñeron con anticuerpo anti-ratón conjugado a ALEXA FLUOR 488® y/o anticuerpo anti-conejo conjugado TEXAS RED®. Finalmente las células se lavaron de nuevo tres vesces y se montaron en medio VECTASHIELD®. Las observaciones de microscopía confocal se llevaron a cabo con el equipo Leica TCS 4D (Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg, Germany).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un antagonista del receptor de adenosina A2A para Ia preparación de un medicamento para Ia prevención y/o el tratamiento de Ia fibrilación auricular en un mamífero, incluyendo un humano.
2. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el antagonista A2A es un derivado de xantina o una sal farmacéuticamente aceptable de éste.
3. Uso según Ia reivindicación 2, donde el antagonista A2A es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en aquéllos con las siguientes fórmulas:
Figure imgf000025_0001
(5) (6)
Figure imgf000026_0001
4. Uso según Ia reivindicación 3, donde el antagonista A2A es el compuesto de fórmula (3) también conocido como KW 6002.
5. Uso según Ia reivindicación 3, donde el antagonista A2A es el compuesto de fórmula (6) también conocido como MSX-2.
6. Uso según Ia reivindicación 2, donde el antagonista A2A es el éster de ácido fosfórico del compuesto de fórmula (6) como se define en Ia reivindicación 3.
7. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el antagonista A2A es un derivado de pirazolopirimidina.
8. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el antagonista A2A es un derivado de triazoloquinoxalina.
9. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el antagonista A2A es un derivado de triazolotriazina.
10. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el antagonista A2A es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en aquéllos con las siguientes fórmulas:
Figure imgf000026_0002
(9) (10)
Figure imgf000027_0001
(17) (18)
Figure imgf000028_0001
(19) (20)
Figure imgf000028_0002
(21) (22)
Figure imgf000028_0003
(23)
11. Uso según Ia reivindicación 10, donde el antagonista A2A es el compuesto de fórmula (15) también conocido como VER-6623.
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BRPI0617369-1A BRPI0617369A2 (pt) 2005-10-14 2006-10-10 compostos para tratamento de fibrilaÇço auricular
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US12/090,115 US8012973B2 (en) 2005-10-14 2006-10-10 Compounds for the treatment of auricular fibrillation
CA002626020A CA2626020A1 (en) 2005-10-14 2006-10-10 Compounds for the treatment of atrial fibrillation
ES06830873T ES2386377T3 (es) 2005-10-14 2006-10-10 Antagonistas selectivos del receptor A2A para el tratamiento de la fibrilación auricular

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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3088900B1 (en) * 2011-10-17 2020-08-12 Roche Diagniostics GmbH Troponin as marker for intermittent atrial fibrillation
CZ2014307A3 (cs) * 2014-05-06 2016-01-13 Vysoká škola chemicko- technologická v Praze Kofein-8-hydrazony jako nová cytostatika pro léčbu onkologických onemocnění
WO2017008205A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted aminoquinazoline compounds as a2a antagonist
EP3594216B1 (en) * 2017-03-07 2022-04-06 Guangzhou Maxinovel Pharmaceuticals Co., Ltd. Aminopyrimidine five-membered heterocyclic compound, and intermediate, preparation method, pharmaceutical composition and application thereof
BR112020024700A2 (pt) 2018-06-04 2021-03-02 Exscientia Ltd compostos de pirazolopirimidina como antagonistas receptores de adenosina
CN108864114B (zh) 2018-06-04 2020-11-06 应世生物科技(南京)有限公司 选择性a2a受体拮抗剂

Citations (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992006976A1 (fr) 1990-10-18 1992-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Derive de xanthine
WO1994001114A1 (en) 1992-07-08 1994-01-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antidepressant
WO1995001356A1 (en) 1993-06-29 1995-01-12 Schering-Plough S.P.A. 1,2,4-TRIAZOLO[1,5-c]PYRIMIDINE HETEROCYCLIC ANALOGUES HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY ON ADENOSINE A2 RECEPTOR
US5484920A (en) 1992-04-08 1996-01-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for Parkinson's disease
US5565460A (en) 1993-07-27 1996-10-15 Kyowa Hakko Koygo Co., Ltd. Therapeutic purine agents for parkinson's disease
WO1997005138A1 (en) 1995-07-28 1997-02-13 Schering-Plough S.P.A. 1,2,4-TRIAZOLO[1,5-c]PYRIMIDINE HETEROCYCLIC ANALOGUES HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY ON ADENOSINE A2a RECEPTOR
US5703085A (en) 1994-02-23 1997-12-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Xanthine derivatives
WO1998042711A1 (fr) 1997-03-24 1998-10-01 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DERIVES [1,2,4]TRIAZOLO[1,5-c]PYRIMIDINIQUES
WO1998052568A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Schering-Plough S.P.A. THE USE OF 1,2,4-TRIAZOLO[1,5-c]PYRIMIDINE HETEROCYCLIC ANALOGUES FOR THE PREPARATION OF MEDICAMENTS USEFUL FOR THE TREATMENT OF CEREBROVASCULAR DISTURBANCES
WO1999026627A1 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Cerebrus Limited (-)-mefloquine to block purinergic receptors and to treat movement or neurodegenerative disorders
WO1999035147A1 (fr) 1998-01-05 1999-07-15 Eisai Co., Ltd. Derives de purine et antagonistes du recepteur a2 d'adenosine utiles comme moyens de prevention/traitement du diabete
WO1999043678A1 (fr) 1998-02-24 1999-09-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicaments et prophylaxie contre la maladie de parkinson
WO2000007201A1 (de) 1998-07-24 2000-02-10 Marquardt Gmbh Elektrischer schalter
WO2000013682A2 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Vernalis Research Limited 4-quinolinemethanol derivatives as purine receptor antagonists.(ii)
WO2000013681A2 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Vernalis Research Limited 4-quinolinemethanol derivatives as purine receptor antagonists (i)
EP1016407A1 (en) 1997-09-05 2000-07-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Remedial agent for neural degeneration
WO2000069464A1 (fr) 1999-05-12 2000-11-23 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvelle utilisation
WO2000073307A2 (en) 1999-06-01 2000-12-07 University Of Virginia Patent Foundation Substituted 8-phenylxanthines useful as antagonists of a2b adenosine receptors
WO2001002400A1 (fr) 1999-07-02 2001-01-11 Eisai Co., Ltd. Composes imidazole fusionnes et medicaments contre le diabete sucre
WO2001002409A1 (en) 1999-07-01 2001-01-11 Vernalis Research Limited Thieno- and furopyrimidine derivatives as a2a-receptor antagonists
WO2001016134A1 (en) 1999-08-31 2001-03-08 Vanderbilt University Selective antagonists of a2b adenosine receptors
WO2001017999A2 (en) 1999-09-06 2001-03-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Amino-triazolopyridine derivatives
WO2001025210A2 (de) 1999-10-01 2001-04-12 Bayer Aktiengesellschaft Substituierte 2-thio-3,5-dicyano-4-aryl-6-aminopyridine und ihre verwendung als adenosin-rezeptorliganden
WO2001040230A1 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Pyrazolopyrazines and their use as adenosine antagonists
WO2001062233A2 (en) 2000-02-25 2001-08-30 F. Hoffmann La Roche Ag Adenosine receptor modulators
WO2001080893A1 (fr) 2000-04-26 2001-11-01 Eisai Co., Ltd. Compositions medicinales favorisant les mouvements intestinaux
WO2001092264A1 (en) 2000-05-26 2001-12-06 Schering Corporation Adenosine a2a receptor antagonists
WO2001097786A2 (en) 2000-06-21 2001-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Benzothiazole derivatives
WO2002014282A1 (fr) 2000-08-11 2002-02-21 Eisai Co., Ltd. Composes 2-aminopyridine et leur utilisation comme medicaments
WO2003032996A1 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Schering Corporation Imidazo (4,3-e)-1,2,4-triazolo(1,5-c) pyrimidines as adenosine a2a receptor antagonists
WO2003048163A1 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Schering Corporation [1,2,4]-TRIAZOLE BICYCLIC ADENOSINE A2a RECEPTOR ANTAGONISTS
WO2003048164A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Schering Corporation Adenosine a2a receptor antagonists
WO2003048165A1 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Schering Corporation ADENOSINE A2a RECEPTOR ANTAGONISTS
US20030149060A1 (en) 2001-12-18 2003-08-07 Gloria Cristalli A2A adenosine receptor antagonists
WO2003082873A1 (en) 2002-04-01 2003-10-09 Almirall Prodesfarma, S.A. New-4-(pyrrolopyrimidin-6-yl)benzenesulphonamide derivatives
WO2004016605A1 (en) 2002-08-19 2004-02-26 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. 2-aminopyrimidine derivatives as adenosine a1 and a2a receptor antagonists
WO2004019949A1 (en) 2002-08-30 2004-03-11 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Adenosine a2a receptor antagonists for treating restless legs syndrome or related disorders
WO2004029056A1 (ja) 2002-09-24 2004-04-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. [１，２，４]トリアゾロ[１，５−ｃ]ピリミジン誘導体
US20040138235A1 (en) 2002-12-19 2004-07-15 Schering Corporation Adenosine A2a receptor antagonists for the treatment of extra-pyramidal syndrome and other movement disorders
WO2004092177A1 (en) 2003-04-09 2004-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Triazolopyrazines and methods of making and using the same
US20040220194A1 (en) 2003-04-23 2004-11-04 Schering Corporation 2-Alkynyl-and 2-alkenyl-pyrazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo-[1,5-c]-pyrimidine adenosine A2a receptor antagonists
US20050043315A1 (en) 2002-01-02 2005-02-24 Hideo Tsutsumi Aminopyrimidine compounds, processes for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
WO2005040151A1 (en) 2003-10-27 2005-05-06 Astellas Pharma Inc. Pyrazine derivatives and pharmaceutical use thereof
WO2005039572A1 (en) 2003-10-27 2005-05-06 H. Lundbeck A/S N-thiazol-2-yl-benzamide derivatives
WO2005042500A1 (en) 2003-10-03 2005-05-12 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Arylindenopyridines and arylindenopyridines and their use as adenosine a2a receptor antagonist
WO2005054245A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Schering Corporation Process for preparing substituted 5-amino-pyrazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidines
WO2005058883A1 (en) 2003-12-15 2005-06-30 Almirall Prodesfarma Ag 2, 6 bisheteroaryl-4-aminopyrimidines as adenosine receptor antagonists

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US599387A (en) * 1898-02-22 Cabinet
US4772607A (en) * 1986-05-20 1988-09-20 Warner-Lambert Company Dialkenyl derivatives of xanthine, pharmaceutical compositions and methods of use therefor
US4780464A (en) * 1986-12-08 1988-10-25 Warner-Lambert Company (1,2,4)triazolo(4,3-a)quinoxaline-4-amines
GB9124968D0 (en) * 1991-11-25 1992-01-22 Ici Plc Chemical process
US5736528A (en) * 1993-10-28 1998-04-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. N6 -(epoxynorborn-2-yl) adenosines as A1 adenosine receptor agonists
US6051578A (en) * 1996-02-12 2000-04-18 Pfizer Inc. Pyrazolopyrimidines for treatment of CNS disorders
US6060478A (en) * 1996-07-24 2000-05-09 Dupont Pharmaceuticals Azolo triazines and pyrimidines
JP2002524457A (ja) * 1998-09-04 2002-08-06 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 抗不整脈薬として有用な置換ジヒドロベンゾピラン
JP3347691B2 (ja) * 1999-07-05 2002-11-20 プロクター、エンド、ギャンブル、ファーマスーティカルズ、インコーポレーテッド 抗不整脈及び抗細動剤として有用な新規４−オキソ環式尿素類
US6194366B1 (en) 1999-11-16 2001-02-27 Esc, Inc. Post chemical-mechanical planarization (CMP) cleaning composition
US6258793B1 (en) * 1999-12-03 2001-07-10 Cv Therapeutics, Inc. N6 heterocyclic 5′ modified adenosine derivatives
MY125533A (en) * 1999-12-06 2006-08-30 Bristol Myers Squibb Co Heterocyclic dihydropyrimidine compounds
GB0100620D0 (en) * 2001-01-10 2001-02-21 Vernalis Res Ltd Chemical cokpounds V
US6599901B1 (en) * 2001-11-19 2003-07-29 Hoffman-La Roche Inc. Pyridone substituted benzothiazole derivatives
MXPA05010293A (es) * 2003-03-27 2005-11-17 Pfizer Prod Inc 4-amino[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalinas sustituidas.

Patent Citations (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992006976A1 (fr) 1990-10-18 1992-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Derive de xanthine
US5484920A (en) 1992-04-08 1996-01-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for Parkinson's disease
US5587378A (en) 1992-04-08 1996-12-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for Parkinson's disease
WO1994001114A1 (en) 1992-07-08 1994-01-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antidepressant
US5543415A (en) 1992-07-08 1996-08-06 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antidepressants
WO1995001356A1 (en) 1993-06-29 1995-01-12 Schering-Plough S.P.A. 1,2,4-TRIAZOLO[1,5-c]PYRIMIDINE HETEROCYCLIC ANALOGUES HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY ON ADENOSINE A2 RECEPTOR
US5565460A (en) 1993-07-27 1996-10-15 Kyowa Hakko Koygo Co., Ltd. Therapeutic purine agents for parkinson's disease
US5703085A (en) 1994-02-23 1997-12-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Xanthine derivatives
US5935964A (en) 1995-07-28 1999-08-10 Schering Corporation 1,2,4-triazolo 1,5-c! pyrimidine heterocyclic analogues having antagonistic activity on adenosine A2a receptor
WO1997005138A1 (en) 1995-07-28 1997-02-13 Schering-Plough S.P.A. 1,2,4-TRIAZOLO[1,5-c]PYRIMIDINE HETEROCYCLIC ANALOGUES HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY ON ADENOSINE A2a RECEPTOR
WO1998042711A1 (fr) 1997-03-24 1998-10-01 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DERIVES [1,2,4]TRIAZOLO[1,5-c]PYRIMIDINIQUES
WO1998052568A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Schering-Plough S.P.A. THE USE OF 1,2,4-TRIAZOLO[1,5-c]PYRIMIDINE HETEROCYCLIC ANALOGUES FOR THE PREPARATION OF MEDICAMENTS USEFUL FOR THE TREATMENT OF CEREBROVASCULAR DISTURBANCES
EP1016407A1 (en) 1997-09-05 2000-07-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Remedial agent for neural degeneration
WO1999026627A1 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Cerebrus Limited (-)-mefloquine to block purinergic receptors and to treat movement or neurodegenerative disorders
WO1999035147A1 (fr) 1998-01-05 1999-07-15 Eisai Co., Ltd. Derives de purine et antagonistes du recepteur a2 d'adenosine utiles comme moyens de prevention/traitement du diabete
EP1054012A1 (en) 1998-01-05 2000-11-22 Eisai Co., Ltd. Purine derivatives and adenosine a2 receptor antagonists serving as preventives/remedies for diabetes
WO1999043678A1 (fr) 1998-02-24 1999-09-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicaments et prophylaxie contre la maladie de parkinson
WO2000007201A1 (de) 1998-07-24 2000-02-10 Marquardt Gmbh Elektrischer schalter
WO2000013682A2 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Vernalis Research Limited 4-quinolinemethanol derivatives as purine receptor antagonists.(ii)
WO2000013681A2 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Vernalis Research Limited 4-quinolinemethanol derivatives as purine receptor antagonists (i)
WO2000069464A1 (fr) 1999-05-12 2000-11-23 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvelle utilisation
WO2000073307A2 (en) 1999-06-01 2000-12-07 University Of Virginia Patent Foundation Substituted 8-phenylxanthines useful as antagonists of a2b adenosine receptors
WO2001002409A1 (en) 1999-07-01 2001-01-11 Vernalis Research Limited Thieno- and furopyrimidine derivatives as a2a-receptor antagonists
WO2001002400A1 (fr) 1999-07-02 2001-01-11 Eisai Co., Ltd. Composes imidazole fusionnes et medicaments contre le diabete sucre
WO2001016134A1 (en) 1999-08-31 2001-03-08 Vanderbilt University Selective antagonists of a2b adenosine receptors
WO2001017999A2 (en) 1999-09-06 2001-03-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Amino-triazolopyridine derivatives
WO2001025210A2 (de) 1999-10-01 2001-04-12 Bayer Aktiengesellschaft Substituierte 2-thio-3,5-dicyano-4-aryl-6-aminopyridine und ihre verwendung als adenosin-rezeptorliganden
WO2001040230A1 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Pyrazolopyrazines and their use as adenosine antagonists
WO2001062233A2 (en) 2000-02-25 2001-08-30 F. Hoffmann La Roche Ag Adenosine receptor modulators
US20010027196A1 (en) 2000-02-25 2001-10-04 Borroni Edilio Maurizio Adenosine receptor ligands and their use in the treatment of disease
WO2001080893A1 (fr) 2000-04-26 2001-11-01 Eisai Co., Ltd. Compositions medicinales favorisant les mouvements intestinaux
US6630475B2 (en) 2000-05-26 2003-10-07 Schering Corporation Adenosine A2a receptor antagonists
WO2001092264A1 (en) 2000-05-26 2001-12-06 Schering Corporation Adenosine a2a receptor antagonists
WO2001097786A2 (en) 2000-06-21 2001-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Benzothiazole derivatives
WO2002014282A1 (fr) 2000-08-11 2002-02-21 Eisai Co., Ltd. Composes 2-aminopyridine et leur utilisation comme medicaments
WO2003032996A1 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Schering Corporation Imidazo (4,3-e)-1,2,4-triazolo(1,5-c) pyrimidines as adenosine a2a receptor antagonists
WO2003048164A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Schering Corporation Adenosine a2a receptor antagonists
WO2003048165A1 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Schering Corporation ADENOSINE A2a RECEPTOR ANTAGONISTS
US20030212059A1 (en) 2001-11-30 2003-11-13 Schering Corporation Adenosine A2a receptor antagonists
WO2003048163A1 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Schering Corporation [1,2,4]-TRIAZOLE BICYCLIC ADENOSINE A2a RECEPTOR ANTAGONISTS
US20030149060A1 (en) 2001-12-18 2003-08-07 Gloria Cristalli A2A adenosine receptor antagonists
US20050043315A1 (en) 2002-01-02 2005-02-24 Hideo Tsutsumi Aminopyrimidine compounds, processes for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
WO2003082873A1 (en) 2002-04-01 2003-10-09 Almirall Prodesfarma, S.A. New-4-(pyrrolopyrimidin-6-yl)benzenesulphonamide derivatives
WO2004016605A1 (en) 2002-08-19 2004-02-26 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. 2-aminopyrimidine derivatives as adenosine a1 and a2a receptor antagonists
WO2004019949A1 (en) 2002-08-30 2004-03-11 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Adenosine a2a receptor antagonists for treating restless legs syndrome or related disorders
WO2004029056A1 (ja) 2002-09-24 2004-04-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. [１，２，４]トリアゾロ[１，５−ｃ]ピリミジン誘導体
US20040138235A1 (en) 2002-12-19 2004-07-15 Schering Corporation Adenosine A2a receptor antagonists for the treatment of extra-pyramidal syndrome and other movement disorders
WO2004092177A1 (en) 2003-04-09 2004-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Triazolopyrazines and methods of making and using the same
US20040220194A1 (en) 2003-04-23 2004-11-04 Schering Corporation 2-Alkynyl-and 2-alkenyl-pyrazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo-[1,5-c]-pyrimidine adenosine A2a receptor antagonists
WO2005042500A1 (en) 2003-10-03 2005-05-12 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Arylindenopyridines and arylindenopyridines and their use as adenosine a2a receptor antagonist
WO2005040151A1 (en) 2003-10-27 2005-05-06 Astellas Pharma Inc. Pyrazine derivatives and pharmaceutical use thereof
WO2005039572A1 (en) 2003-10-27 2005-05-06 H. Lundbeck A/S N-thiazol-2-yl-benzamide derivatives
WO2005054245A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Schering Corporation Process for preparing substituted 5-amino-pyrazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidines
WO2005058883A1 (en) 2003-12-15 2005-06-30 Almirall Prodesfarma Ag 2, 6 bisheteroaryl-4-aminopyrimidines as adenosine receptor antagonists

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. CACCIARI ET AL.: "Medicinal chemistry of A2A adenosine receptor antagonists", CURR. TOP. MED. CHEM., vol. 3, 2003, pages 403 - 11
BARALDI ET AL.: "Recent developments in the field of A2A and A3 adenosine receptor antagonists", EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 38, 2003, pages 367 - 82
C. HERRERA ET AL.: "Adenosine A2B receptors behave as an alternative anchoring protein for cell surface adenosine deaminase in lymphocytes and cultured cells", MOL. PHARMACOL., vol. 59, 2001, pages 127 - 34
C.B. VU ET AL.: "Novel diamino derivatives of [1,24]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists", J. MED. CHEM., vol. 48, 2005, pages 2009 - 18
C.B. VU ET AL.: "Piperazine derivatives of [1,2,4]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists", J. MED. CHEM., vol. 47, 2004, pages 4291 - 9
C.E. MOLLER ET AL.: "A2A Adenosine receptor antagonists - future drugs for Parkinson's disease?", DRUGS OF THE FUTURE, vol. 25, 2000, pages 1043 - 52
E. KISELGOF ET AL.: "6-(2-furanyl)-9H-purin-2-amine derivatives as A2A adenosine antagonists", BIOORQ. MED. CHEM. LETT, vol. 15, 2005, pages 2119 - 22
E. ONGIN ET AL.: "Selective adenosine A2A receptor antagonists", FARMACO, vol. 56, 2001, pages 87 - 90
G. YAO ET AL.: "Synthesis of alkyne derivatives of novel triazolopyrazine as A2A adenosine receptor antagonists", BIOORQ. MED. CHEM. LETT, vol. 15, 2005, pages 511 - 5
H. KASE ET AL.: "Progress in pursuit of therapeutic A2A antagonists: the adenosine A2A receptor selective antagonist KW 6002: research and development toward a novel nondopaminergic therapy for Parkinson's disease", NEUROLOGY, vol. 61, 2003, pages 97 - 100
L. HOVE-MADSEN ET AL.: "Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes", CIRCULATION, 2004, pages 1358 - 63
L. HOVE-MADSEN ET AL.: "Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes", CIRCULATION, vol. 110, 2004, pages 1358 - 63
L.J. KNUTSEN ET AL.: "KW-6002 (Kyowa Hakko Kogyo", CURR. OPIN. INVESTIQ. DRUQS, vol. 2, 2001, pages 668 - 73
M. CANALS ET AL.: "Adenosine A2A-dopamine D2 receptor-receptor heteromerization: qualitative and quantitative assessment by fluorescence and bioluminescence energy transfer", J. BIOL. CHEM., vol. 278, 2003, pages 46741 - 9
M.B. IQBAL ET AL.: "Recent developments in atrial fibrillation", BRITISH MEDICAL JOURNAL, vol. 330, 2005, pages 238 - 43
S.M. WEISS ET AL.: "Discovery of nonxanthine adenosine A2A receptor antagonists for the treatment of Parkinson's disease", NEUROLOGY, vol. 61, no. 6, 2003, pages 101 - 6
Z. GAO ET AL.: "Novel short-acting A2A adenosine receptor agonists for coronary vasodilatation: inverse relationship between affinity and duration of action of A2A agonists", J. PHARMACOL. EXP. THER., vol. 298, 2001, pages 209 - 18

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