CN101322711B - 一种抗疲劳及增强免疫力的保健药品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种抗疲劳及增强人体免疫力的保健药品及其制备方法。它主要是由以下重量份数的药用原料制成：辅酶Q105-60、维生素C 12.5-200、维生素E 1.5-50、叶酸、0.04-0.6，本发明成份简单，疗效可靠，具有缓解体力疲劳，增强免疫力的保健功能。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种保健药品，特别是一种抗疲劳及增强人体免疫力的保健药品。
(二)背景技术
随着现代生活节奏的加快，社会竞争的加剧，疲劳、免疫力低下成为人们经常遇到的问题。疲劳是一种生理性现象，对人来说是一种保护性的机制。这是身体向我们发出应该休息的信号。如果对它不管不顾，身体就会受到损害，最后积劳成疾。免疫力低下者则容易感到疲劳，但是查不出器质性病变；经常感冒；伤口容易感染，愈合慢；肠胃功能差(这里主要是指稍微吃得不合适就上吐下泻)。
从国家食品药品监督管理局基础数据库查询得知，申报保健功能为缓解体力疲劳、增强免疫力的保健品有23个，其中20个为中药材组方的中药保健品。中药保健品多为药材经过适当的工艺提取制备而成，药材提取后的浸膏大多没有经过进一步的精制，因而其服用量较大，再者由于药材的来源不同，因而产品功能疗效可能会有差异，其质量不能达到完全控制，由于中药材成分复杂，还存在某些功效成分不明确的缺点。
(三)发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种疗效可靠，成份简单的缓解体力疲劳、增强免疫力的保健药品。
本发明是通过以下措施来实现的：
本发明抗疲劳及增强免疫力的保健药品，是由以下重量份数的药用原料制成：
辅酶Q10 15-60 维生素C 12.5-200
维生素E 1.5-50 叶酸 0.04-0.56
本发明所述的抗疲劳及增强免疫力的保健药品，所述的药用原料重量配比可优选为：
辅酶Q10 20 维生素C 50
维生素E 7.5 叶酸 0.15
本发明抗疲劳及增强免疫力的保健药品，所述药物可做成散剂、丸剂、片剂胶囊等不同的剂型。
本发明所述的抗疲劳及增强免疫力保健药品，可由以下重量份数的辅用原料制成：
大豆油 90-1500 蜂蜡 5-150
本发明所述的抗疲劳及增强免疫力保健药品，可由以下重量份数的原料制成：
辅酶Q10 20 维生素C 50
维生素E 7.5 叶酸 0.15
大豆油 307 蜂蜡 16
如上所述的本发明保健药品软胶囊的制备方法，包括以下步骤：
a)称取辅酶Q10、维生素C、维生素E、叶酸、大豆油、蜂蜡，备用；
b)将所述重量配比的大豆油加热后，加入所述重量配比的蜂蜡；
c)将所述重量配比的辅酶Q10、维生素E，加入到上述油液中，搅拌使溶解，降温到适度后，加入所述重量配比的叶酸、维生素C，搅拌混合均匀，用胶体磨研磨均匀，灌装，即得。
本处方中功效成分为辅酶Q10、维生素E、维生素C、叶酸，其中辅酶Q10、维生素C、维生素E，均为抗氧剂，能清除自由基，提高免疫力，叶酸能清除自由基，保护细胞膜，各种成分相互配合，通过控制自由基，保护人体免疫***，便可以缓解人们心理和生理的压力，从而达到缓解体力疲劳，增强免疫力的保健功能。本产品组方中，以辅酶Q10为主，配以其他三种成分，他们相互没有配伍禁忌，且能协同作用。
所述的辅酶Q10，它是细胞自身产生的天然的抗氧剂和细胞代谢激活剂，具有保护和恢复生物膜完整性、稳定膜电位作用，是机体的非特异性免疫增强剂，因此显示出极好的抗疲劳作用，辅酶Q10使细胞保持良好健康的状态，因而机体充满活力，精力旺盛，脑力充沛，此外，它还能促进热量转化为能量，在人体热量转化(为能量)过程中发挥重要作用。
所述的维生素E是一种天然的脂溶性维生素，其基本生理作用是抗氧化功能，增强细胞膜免受自由基的侵袭，主要作用为保护细胞，避免其受氧化作用的侵害，从而达到抗疲劳的效果，此外还能提高机体免疫力，对体液免疫和细胞免疫均有明显的促进作用。
所述的维生素C作为天然的自由基清除剂，可以直接或间接消除自由基，从而可保护生物膜完整性，改善机体工作能力，推迟或减轻疲劳发生，加快疲劳恢复，提高机体内氧的利用，对提高有氧运动能力具有一定的作用。此外，维生素C还能促进免疫球蛋白(抗体)的形成以及增强体液免疫与细胞免疫功能，从而提高机体免疫力。
所述的叶酸是人体所需的重要维生素，参与核酸、蛋白质和磷脂的代射，同细胞的分化、增殖密切相关。叶酸能改善细胞内抗氧化防御***，减少同型半胱氨酸的产生；加强BH4与eNOS结合；并有直接的抗自由基作用。叶酸在抗自由基，保护细胞功能，提高免疫力等方面起着重要作用。
本发明的有益效果是：成份简单，疗效可靠，具有缓解体力疲劳，增强免疫力的保健功能。
(四)附图说明
图1为小鼠血清中SOD活力和MDA含量示意图
图2为辅酶Q10高效液相色谱图
图3为小鼠血浆及组织中辅酶Q10含量示意图
(五)具体实施方式
实施例1：
称取辅酶辅酶Q1020g，维生素C 50g，维生素E7.5g，叶酸0.15g，备用，称取307g大豆油加热适当温度，称取16g的蜂蜡加入油中，使缓缓溶解呈透明状；将所述重量的辅酶Q10、维生素E，加入到上述油液中，搅拌使全部溶解，温度降后，加入所述重量的叶酸、维生素C，搅拌使混合均匀，用胶体磨研磨均匀，灌装到的胶囊中，即得软胶囊。
实施例2：
称取辅酶Q105g，维生素C15g，维生素E2g，叶酸0.5g，加以适量辅料混合均匀，压制成片，即得片剂。
实施例3：
称取辅酶Q1055g，维生素C180g，维生素E50g，叶酸0.04g，加以辅料，充分搅拌，制粒，干燥，整粒，包装成袋即可，即得一种颗粒剂。
为证明本发明的效果，用本发明软胶囊作样品进行实验分析：
试验一：本发明的保健药品对小鼠的抗疲劳作用
本试验通过小鼠试验研究了本发明的保健药品的抗疲劳作用，同时研究了辅酶Q10在小鼠血浆、肝脏和心脏组织中的分布，旨在为开发本发明的保健药品提供科学依据。
1材料与方法
1.1试剂与仪器
辅酶Q10(98.0％~101.0％)：日清制药；
辅酶Q10标准品：Sgima公司；
生理盐水：国营张家港制药厂；
肝素：生化试剂，中国医药(集团)上海化学试剂公司；
VCXSO型超声处理器：美国SONICS & MATERIALS公司；
Nano-ZS90型粒径分析仪：英国Mavlern公司；
7170A全自动生化分析仪：日本日立公司；
超氧化物歧化酶(superoxdiedsimutase，SOD)、丙二醛(mlaondaildehyde，MDA)、肝糖元、血乳酸试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；
高效液相色谱***(配有1525二元泵，2996二极管阵列检测器和Empower色谱工作 站)：美国Waters公司。
1.2试验动物及饲料
雄性昆明种小鼠：体重(20±2)g，80只：购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2003-0003；
普通大小鼠生产繁殖饲料：中国科学院上海实验动物中心研制，上海斯莱克实验动物有限公司生产。
1.3试验制剂制备方法
本发明的保健药品的制备：将大豆油加热，加入适量的蜂蜡，使溶解呈透明状，然后将处方量辅酶Q10、维生素E，加入到上述油液中，搅拌使全部溶解，温度降低后，加入叶酸、维生素C，搅拌使混合均匀，用研磨均匀，灌装，即得。
阳性对照：Liquid CoQ10(辅酶Q10含量为10mg/ml)：Nurittional Specaliites公司生产。
1.4试验方法
1.4.1血浆、心脏和肝脏中辅酶Q10含量的测定
(1)色谱条件：
色谱仪：Waters2690；检测器：Waters996紫外检测器；色谱柱：SunFrieTMC18 ODS(150×4.6mm，5μm)；流速：1ml/min；检测波长：UV275nm；柱温：35℃；进样量：20μl。
流动相：甲醇∶乙醇＝30∶70(V∶V)(血浆、心脏)，甲醇∶乙醇＝50∶50(V∶V)(肝脏)，
(2)标准曲线的绘制
取辅酶Q10乙醇标准溶液(108.9ug/ml)0，0.02，0.05，0.1，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0ml置于10ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度得标准系列，分别进样20μl，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，得回归方程：
A＝18959C-5776.2(R＝0.9990)流动相：甲醇∶乙醇＝30∶70(V∶V)；
A＝16987C+422.45(R＝0.9997)流动相：甲醇∶乙醇＝50∶50(V∶V)。
(3)样品预处理
参考文献方法并改进：取肝素抗凝的血浆样品500ul，加无水乙醇1ml，涡旋振荡1min，加入正己烷3ml，涡旋振荡3min后再加入正己烷0.5ml，静置5min，高速离心15min(2500r/min)，转移上层清液于离心管中，(45±0.5)℃水浴通N2吹干，残留物连同离心管于-20℃冰箱避光冷冻保存，待测。测定前用100μl无水乙醇溶解，进样20μl作HPLC分析。记录辅酶Q10的峰面积，采用外标法进行定量分析。因辅酶Q10结构中 含有异戊烯基，见光易降解，故样品的预处理均在避光条件下进行。
取心脏和肝脏组织匀浆液2ml，处理和测定方法同上述血浆样品。
1.4.2受试小鼠分组与灌胃剂量试验
小鼠适应性喂养3d后，随机分为5组，即阴性对照组、阳性对照组、低剂量试验组、中剂量试验组、高剂量试验组，每组16只。试验期间各组小鼠基础饲料喂养，自由饮用自来水。采用定量灌胃方式直接将样品灌入，灌胃量为0.1ml/10g，每天定时灌胃1次。阴性对照组以生理盐水灌胃，阳性对照组及低、中、高剂量组小鼠混合饮料灌胃总量为0.1ml/10g/d，见表1。
表1小鼠灌胃剂量表+
| 组别 | 生理 盐水/ml | LiquidCo Q10/mL | 本发明的保健药 品/mL | 运动型 饮料/mL | 辅酶Q10剂量 /(mg·kg-1· d-1) |
| 阴性对照 组 | 0.10 | - | - | - | 0 |
| 阳性对照 组 | - | 0.02 | - | 0.08 | 20 |
| 低剂量组 | - | - | 0.02(LC＝10 ％) | 0.08 | 4.3 |
| 中剂量组 | - | - | 0.02(LC＝20 ％) | 0.08 | 8.6 |
| 高剂量组 | - | - | 0.02(LC＝30 ％) | 0.08 | 12.9 |
+小鼠灌胃剂量(0.1mL/10g*d)
考虑到磷酯也具有抗疲劳作用，因此低、中、高3个剂量是在保证磷酯等辅料浓度相同的前提下用3个载量水平的本发明的保健药品进行试验，进一步研究辅酶Q10的抗疲劳作用。连续灌胃第30天时每组分为3个亚组进行运动耐力试验并测定相应指标。
1.4.3运动耐力试验
以负重游泳的方式建立疲劳模型，于末次灌胃30min后，在小鼠尾根部负重5％(g/g)体重的铅丝，放入水温为25±1℃、水深不低于30cm的游泳箱中，每箱一次放入4只小鼠。以秒表记时，游泳开始至死亡的时间为小鼠负重游泳时间(s)。
1.4.4肝糖原、血清尿素氮含量、血清中SOD活力、MDA含量及组织中辅酶Q10的含量的测定
末次灌胃30min后，将小鼠置于水温为30℃的游泳箱中不负重游泳90min后，摘眼球采血，分离血清，采用7170A全自动生化分析仪测定血清尿素氮；SOD活力、MDA含量测定按试剂盒说明书操作。
同时立即脱颈椎处死取肝脏和心脏，以生理盐水冲洗，用滤纸吸干。精确称取肝脏50mg，按试剂盒说明书操作测定肝糖原含量；将剩余肝脏及心脏组织称总重后分别加入适量冷生理盐水，在冰浴中用玻璃匀浆器制备一定浓度的组织匀浆，采用1.4.1中样品预处理方法测定并计算肝脏和心脏中辅酶Q10的含量。
1.4.5血乳酸含量变化及血浆中辅酶Q10含量的测定
末次灌胃30min后，小鼠眼眶取血，测定基础乳酸含量，再将小鼠放人游泳箱中(水深30cm，水温30℃)中负重4％(g/g)体重的铅丝游泳10min，分别于游泳后立即对小鼠眼眶取血和休息20min后摘眼球取血，按试剂盒说明测定全血乳酸含量。计算血乳酸曲线下面积，用以判断运动后血乳酸变化情况：
血乳酸曲线下面积＝5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后即刻血乳酸值+2×游泳后休息20min血乳酸值)
比较运动前后血乳酸含量变化情况。同时采用1.4.1中样品预处理方法测定血浆中辅酶Q10的含量。
1.4.7试验数据统计分析
数据用x±S.D.表示，用SPSS10.0软件进行数据处理，采用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05为差异具有显著性。
2结果与讨论
2.1本发明的保健药品对小鼠体重的影响
由表2可知，灌胃饲养30d后各组小鼠体重均无显著差异，这表明试验制剂不会对小鼠的正常生长产生明显影响。
表2各组小鼠体重的变化(n＝5，x±S.D.)
| 组别 | 试验前/g | 30d后/g |
| 阴性对照组 | 21.02±1.40 | 36.25±2.43 |
| 阳性对照组 | 20.84±1.65 | 36.12±2.30 |
| 低剂量组 | 21.28±1.31 | 36.58±1.92 |
| 中剂量组 | 20.92±1.54 | 37.38±2.23 |
| 高剂量组 | 20.72±1.20 | 37.75±2.72 |
2.2本发明的保健药品对小鼠运动耐力与生化指标的影响
运动耐力的提高是抗疲劳能力的直接体现。小鼠负重游泳试验结果显示(见表3)： 试验组与阴性对照组相比均能延长小鼠负重游泳时间，提高运动耐力，且中、高剂量组与阴性对照组之间存在显著差异(P＜0.05)。
疲劳的产生与高强度或长时间运动后体内能量物质如糖原等减少，代谢产物如血清尿素氮、乳酸蓄积等因素有关。肝糖原是维持血液中葡萄糖正常水平的重要贮存物、也是肌纤维收缩时能量的来源。从表3可看出，3个剂量组肝糖原含量均高于阴性对照组，其中阳性对照组及中、高剂量组与阴性对照组之间存在显著差异(P＜0.05)，说明本发明的保健药品有助于小鼠负重游泳后肝糖原消耗量的减少。运动后中、高剂量组血清尿素氮(BUN)水平明显低于阴性对照组(P＜0.05)，中、高剂量组血乳酸曲线下面积与阴性对照组相比明显降低(P＜0.05)。王启荣等通过人体试验也发现，含辅酶Q10的复合抗氧化剂可降低血清BUN水平，有促进运动员对运动负荷适应以及提高身体机能恢复的作用。YanJ等研究认为，辅酶Q10的生物活性主要来自于其醌环的氧化还原特性和其侧链的理化性质，其醌环在氧化呼吸链中起传递电子和质子的作用，这种作用不仅是所有生命形式必不可少的，而且还是形成ATP的关键。而ATP是机体能量的主要储存形式，也是所有细胞功能赖以正常发挥的重要基础。
表3小鼠抗疲劳相关指标(n＝5，x±S.D)
| 组别 | 负重游泳时间/s | 肝糖原 /(mg*g-1肝 脏) | 血清尿素氮 /(mmol·L-1) | 血乳酸曲线下面 积 /(mmol*L-1*min-1) |
| 阴性对照 组 | 457.75±91.77 | 13.59±12.25 | 9.00±1.03 | 334.62±37.60 |
| 阳性对照 组 | 638.00±76.68 | 17.96±1.78* | 8.80±0.77 | 302.06±31.32 |
| 低剂量组 | 545.25±64.75 | 16.75±2.63 | 8.64±0.89 | 308.57±29.08 |
| 中剂量组 | 713.00±157.11. | 16.75±2.63 | 7.60±10.38* | 257.97±14.75** |
| 高剂量组 | 1130.75±195.23* | 19.56±1.74* | 6.82±0.92** | 218.36±36.46** |
2.3本发明的保健药品对SOD活力和MDA含量的影响
SOD为体内唯一直接特异性清除自由基的酶，其活性越高代表机体清除自由基的能力越强，该酶活性下降，导致机体自由基过剩和氧化损伤。过多的自由基攻击细胞膜中不饱和脂肪酸，启动脂质过氧化反应形成MDA，MDA含量可代表机体中脂质过氧化程度。运动中自由基的大量产生和血浆脂质过氧化物的显著升高，是导致运动性疲劳产生的重要原因。图2结果显示，阳性对照组和低、中、高剂量组小鼠血清活性超氧化物歧化酶 (SOD)活力明显高于阴性对照组(P＜0.05)，但只有高剂量组与阳性对照组之间存在显著差异。阳性对照组和低、中、高剂量组血清中丙二醛(MDA)的含量也显著低于阴性对照组(P＜0.05)，但低、中、高剂量组与阳性对照组之.间无显著差异。这表明，补充外源性辅酶Q10有减少组织氧化损伤的趋势，避免脂质过氧化，从而延缓疲劳的产生或有助于运动后疲劳的消除。
有研究表明：含辅酶Q10的复合抗氧化剂可降低运动员训练后血清MDA水平，提高血清SOD活力，这可能是运动后身体机能的恢复与抗氧化作用密切相关。研究认为，辅酶Q10作为氧自由基清除剂可进入细胞内非特异地与细胞各个部位相结合，减少氧自由基的生成，抑制脂质过氧化反应，保护SOD活性中心及其结构免受自由基氧化损伤，提高SOD活性。
2.5本发明的保健药品对血浆及组织中辅酶Q10的影响
样品分析方法专属性测定结果见图2。结果表明，在试验确定的色谱条件下分析，当流动相条件为甲醇∶乙醇＝30∶70(V∶V)时，新能原的保健药品辅酶Q10的保留时间约为7.7min；当流动相条件为甲醇∶乙醇＝50∶50(V∶V)时，辅酶Q10的保留时间约为12.8min，无杂质峰干扰。
与阴性对照组相比，阳性对照组、3个剂量组血浆和心脏中辅酶Q10的含量均有升高但无显著差异(见图3a和图3b)。阳性对照组、3个剂量组肝脏中辅酶Q10的含量与阴性对照组相比均显著升高(P＜0.05)，并且中、高剂量组与阳性对照组肝脏中辅酶Q10的含量相比显著升高(P＜0.05)(见图3c)，说明以的保健药品为载体能提高辅酶Q10在血浆、肝脏和心脏中的含量。
有研究表明：与人类不同，小鼠内生辅酶Q10的含量低于另一种醌的同系物辅酶Q9，但通过长期补充外源性辅酶Q10可显著提高其在小鼠线粒体和组织中的含量，大部分辅酶Q10进入血液循环后被肝脏吸收并蓄积，也能分布于心脏、肌肉等部位。外源性辅酶Q10可被细胞膜上的氧化还原酶和硫辛酰胺脱氢酶转化为还原形式防止运动引起的细胞氧化损伤，体内的氧化磷酸化反应可能使辅酶Q10的消耗量增加，导致血浆中含量降低，心脏、肝脏组织中辅酶Q10与运动产生的自由基反应，因此，其含量在一定程度上降低有可能是血浆、心脏中辅酶Q10浓度无显著差异的原因之一。值得注意的是，肝脏中辅酶Q10含量受摄取量的影响很大其含量显著升高。
3结论
本发明的保健药品能延长小鼠负重游泳时间，维持游泳小鼠肝糖原水平，抑制蛋白质分解，降低血清中血乳酸含量，具有一定的抗疲劳作用。辅酶Q10作为生物抗氧化剂，可通过消除体内因运动而产生的过氧自由基，提高血清中SOD活力，降低血清中MDA 含量，从而延缓疲劳的产生，有助于运动后疲劳的消除。与阳性对照组(国外乳状液产品)相比，本发明的保健药品能有效提高了辅酶Q10在小鼠肝脏中的蓄积量。
试验二：本发明的保健药品对小鼠的增强免疫力作用
本试验通过小鼠试验研究了本发明的保健药品的增强免疫力作用。
1.实验动物：ICR种小白鼠，许可证号：SCXK(沪)2002-0010，体重18～22克，雌性，由中国科学院上海实验动物中心提供清洁级动物。实验动物饲养室温20--25℃，相对湿度40--70％，实验动物许可证号SYXK(沪)2004-0011，动物饲养料，由苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司提供，登记证号：苏E饲生字(2002)006。
2.剂量设计：本发明人体推荐剂量每日0.8g/60kg，本试验设低、中、高三个剂量组，另设蒸馏水空白对照组。
3.给样途径：灌胃。
4.实验方法和结果：
4.1体重：动物称重，按体重随机分组，分为20组，每组10只，每四组唯一实验组，按剂量设计连续喂养30天，每周称一次，计算实验初、中和实验末体重。免疫一组进行NK细胞和淋转试验，免疫二组进行DTH、脾指数、胸腺指数试验，免疫三组进行溶血空斑和溶血素试验，免疫四组进行碳廓清试验，免疫五组进行吞噬试验。
本发明(免疫一组)对动物体重(克)的影响
由上表可见，样品各剂量组与对照组相比，均无显著差异。
本发明(免疫二组)对动物体重(克)的影响
由上表可见，样品各剂量组与对照组相比，均无显著差异。
本发明(免疫三组)对动物体重(克)的影响
由上表可见，样品各剂量组与对照组相比，均无显著差异。
本发明(免疫四组)对动物体重(克)的影响
由上表可见，样品各剂量组与对照组相比，均无显著差异。
本发明(免疫五组)对动物体重(克)的影响
由上表可见，样品各剂量组与对照组相比，均无显著差异。
4.2血清溶血素试验：
动物连续给样30天，用2％(v/v)SRBC免疫动物五天后，眼眶采血，颈椎脱臼处死，分离血清。在96孔微量血凝板上加25ul血清，以后各排作对倍稀释，每孔加1％SRBC100ul，震荡后37℃放置3小时，当血球对照出现沉落后观察结果。
血清溶血素试验
*p＜0.05与对照组相比(经方差分析)
统计学分析：本发明中剂量、高剂量组与对照组相比均具有显著性差异。
4.3抗体生成检测试验：
动物连续给样30天，将腿纤维羊细胞免疫五天后，动物颈椎脱臼处死，去脾脏制脾细胞悬液，调整细胞浓度5×106个/ml，将表面培养基加热溶解，放45℃水保温，与等量pH7.2-7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分成0.5ml每试管，再加入50ul100％SRBC，20ul脾细胞悬液，速混匀，倾于已刷琼脂薄层的6cm平皿上，放入CO2培养箱温育1.5h，再用缓冲稀释的补体(1∶10)加到平皿，温育1.5h，计数溶血空斑数，结果用方差分析统计。
抗体生成检测试验
统计学分析：本发明高剂量组与对照组相比均具有显著性差异。
4.4胸腺指数脾指数测定：
动物连续给样30天，称重，颈椎脱臼处死，取胸腺、脾称重，计算胸腺指数脾指数。
胸腺指数、脾指数
统计学分析：本发明各剂量组与对照组相比均无显著性差异.
4.5小鼠碳廓清试验：
动物连续给样30天，为静脉注射1∶3稀释的印度墨汁，2分钟后从眼静脉取20ul加Na2CO3溶液中，测OD值。计算吞噬指数，结果用方差分析统计。
碳廓清试验
*p＜0.05与对照组相比(经方差分析)
统计学分析：本发明中剂量、高剂量组与对照组相比均具有显著性差异。
4.6ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验：
动物连续给样30天，颈椎脱臼处死，取脾脏制脾细胞悬液，调整细胞浓度2×106个/ml，将细胞悬液分两空加入24孔培养板，每孔1ml，一孔加50ulConA，另一孔对照，于37℃、5％CO2培养72h，培养结束前4h，每孔吸取上清液0.7ml，加入不含小牛血清的PRMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50ul/孔，继续培养4h后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，待紫色结晶溶解，以570nm波长比色，结果用方差分析统计。
ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验
*p＜0.05与对照组相比(经方差分析)
统计学分析：本发明中剂量、高剂量组与对照组相比均具有显著性差异。
4.6DTH测定：
动物连续给样30天，去毛，将1％DNFT50ul涂抹致敏。五日后用1％DNFT10ul抹于小鼠右耳。24小时后脱臼处死，取8mm左右二耳，称重，计算肿胀度。
DTH测定
统计学分析：本发明各剂量组与对照组相比均无显著性差异.
4.7NK细胞活性测定：
动物连续给样30天，颈椎脱臼处死，取脾脏，制脾细胞悬液(效应细胞)，去传代后24hYAC-1细胞加1640完全培养液，使细胞浓度为1×105个/ml(靶细胞)，取靶细胞、效应细胞各100ul，加入U型96孔培养板，靶细胞自动释放孔加靶细胞和培养液各100ul，最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100ul，上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中四小时，每孔吸取上清液100ul至平地96孔培养板，同时加入LDH基质液100ul，反应3分钟，每孔加1mol/L的
HCL 30ul终止，用酶标仪在490mm处测光密度值(OD)。
NK细胞活性测定
*p＜0.05与对照组相比(经方差分析)
统计学分析：本发明中剂量、高剂量组与对照组相比均具有显著性差异。
4.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：
动物连续给样30天，每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1，隔30分钟，颈椎脱臼处死，固于鼠板，剪开腹壁皮肤，注射生理盐水2转动鼠板1分钟，吸出腹腔洗液1，分滴于2篇玻片，37℃孵箱湿
孵30分钟，用生理盐水漂洗，晾干，以1∶1丁酮甲醇溶液固定，4％--磷酸缓冲液染色三分钟，用蒸馏水漂洗晾干，油镜镜检，计算吞噬％和吞噬指数。
巨噬细胞吞噬试验
*p＜0.05与对照组相比(经方差分析)
统计学分析：本发明中剂量、高剂量组与对照组相比均具有显著性差异。
5.结论：动物经口给予本发明具有增强免疫力的作用。
Claims (6)
1.一种抗疲劳及增强免疫力的保健药品，其特征在于是由以下重量份数的原料药制成：
辅酶Q10 5-60 维生素C 12.5-200
维生素E 1.5-50 叶酸 0.04-0.6 。
2.根据权利要求1所述的抗疲劳及增强免疫力的保健药品，其特征在于所述原料药的重量配比为：
辅酶Q10 20 维生素C 50
维生素E 7.5 叶酸 0.15 。
3.根据权利要求1所述的抗疲劳及增强免疫力的保健药品，其特征在于: 所述药物的剂型为软胶囊、片剂、颗粒剂或胶囊。
4. 根据权利要求1所述的抗疲劳及增强免疫力保健药品，其特征在于还包括以下以下重量份数的辅用原料：
大豆油 90-1500 蜂蜡 5-150 。
5. 根据权利要求4所述的抗疲劳及增强免疫力保健药品，其特征在于是由以下重量份数的原料药和辅用原料制成：
辅酶Q10 20 维生素C 50
维生素E 7.5 叶酸 0.15
大豆油 307 蜂蜡 16 。
6. 一种如权利要求4或5所述的保健药品的制备方法，包括以下步骤:
ａ）称取辅酶Q10、维生素C、维生素E、叶酸、大豆油、蜂蜡，备用；
ｂ）将所述重量配比的大豆油加热后，加入所述重量配比的蜂蜡；
c）将所述重量配比的辅酶Q10、维生素E，加入到上述油液中，搅拌使溶解，降温到适度后，加入所述重量配比的叶酸、维生素C，搅拌混合均匀，用胶体磨研磨均匀，灌装到胶囊中，即得软胶囊。
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