CN101283996B

CN101283996B - 右旋蛋氨酸在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用

Info

Publication number: CN101283996B
Application number: CN2008100534658A
Authority: CN
Inventors: 孟爱民; 李德冠; 王月英; 吴红英; 王勇; 褚丽萍; 张俊伶; 路璐; 常建辉
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2008-06-10
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2028-06-10
Also published as: CN101283996A

Abstract

本发明公开了右旋蛋氨酸在制备预防或治疗辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用。通过现代药理实验证明，小鼠注射300-1000mg/kg右旋蛋氨酸对化学毒物、辐射诱导的骨髓抑制具有明显的保护作用，提示预防性给药可防治化学毒物、辐射诱导骨髓的损伤，并且对肿瘤细胞生长具有抑制作用。通过将右旋蛋氨酸与常规药用辅料混合，还可制成各种剂型。对于放疗患者，营养液中加入一定量的D-met更具有抑制肿瘤细胞增长，保护造血细胞的功能。

Description

右旋蛋氨酸在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用

技术领域

本发明涉及氨基酸类药物在药学领域中的应用。更具体的说是一种右旋蛋氨酸(D-met)在制备防治辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用。

背景技术

机体暴露于外界物理化学及体内代谢产生的各种有害因素，如暴露于辐射或某些化学毒物，以及临床接受放疗、化疗的患者。造血***由少量骨髓造血干细胞及不同发育时期不同系列的造血细胞组成，对各种有害因素非常敏感，受到损伤后会出现不同程度的抑制，表现为外周血白细胞降低、骨髓增殖功能下降甚至发生再生障碍性贫血，对患者的生存质量造成严重的危害甚至危及生命。

目前临床上对出现骨髓抑制多是采用加强营养或给与各种生长因子增加造血细胞的增殖。另外一些具有抗氧化损伤作用的化合物或中药制剂。药物种类很多，多是联合应用，单独评价时疗效不很确定，还会有各种副作用的产生，如生长因子类，使用造价也比较昂贵。

右旋蛋氨酸(D-methionine，D-met)作为营养成分促进生长已做过多年的研究。蛋氨酸在高蛋白饮食中含量达26mg/g，发酵产品奶酪及酸奶中含量更高，发酵过程中蛋氨酸通过转氨作用可以从左旋转化为右旋。

右旋蛋氨酸(D-met)不仅作为营养成分还作为治疗药物。如WHO(1997)推荐蛋氨酸作为治疗醋氨酚过量使用产生的毒性。2005年FDA批准了口服D-met对辐射导致的口腔粘膜炎的临床前申请。

动物试验研究结果显示：右旋蛋氨酸(D-met)可以对抗铂类肿瘤药物、氨基甙类化合物以及噪声引起的听神经损伤，经注射或口服均可达到治疗作用。

各种动物学和人体试验结果显示D-met使用是安全的。如解除醋氨酚毒性的蛋氨酸推荐首次剂量是2.5g，随后每隔4h给与2.5g，12h内用量可以达10g。

D-met保护作用机制可能主要是通过直接或间接的抗氧化作用。1995年，Vogt发现D-met可以可逆性地发生氧化，成为自由基清除剂。作为含硫亲核剂的D-met可以保护含硫的酶和蛋白质。D-met可以保护顺铂引起的耳蜗超氧化物歧化酶、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶下降。还可以升高细胞内尤其是线粒体内的谷胱甘肽。

本发明人在实验中首次发现：右旋蛋氨酸(D-methionine，D-met)在防治骨髓抑制中具有明显的治疗作用。特别是防治辐射诱导骨髓抑制更加明显，基于上述的发现经过进一步试验从而完成了本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题是寻找能够保护各种因素诱导骨髓细胞和功能的损伤得到防治与治疗的药物。

因此，本发明的一个目的在提供右旋蛋氨酸在制备预防或治疗辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用。

本发明的另一个目的在于提供右旋蛋氨酸与其他营养物质、促进骨髓细胞增殖药物混合制成组合物或右旋蛋氨酸作为支持药物与抗肿瘤药物配合使用，降低化疗所带来的毒副作用。

本发明的再一个目的在于提供了右旋蛋氨酸与药学上可接受的药用辅料混合制成各种药物组合物，或制成各类保健品。

为解决上述问题，本发明提供如下的技术方案：

一种右旋蛋氨酸在制备预防辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用。一个优选的实施方式是：右旋蛋氨酸在制备防治辐射诱导骨髓损伤药物中的应用。所述的辐射诱导骨髓损伤，包括：接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。

另一个优选的实施方式是：右旋蛋氨酸在制备治疗化学毒物诱导的骨髓型死亡药物中的应用。其中所述化学毒物诱导的骨髓抑制，包括：接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学毒物接触的工作人员及意外暴露的人员。

本发明所述的骨髓抑制(骨髓抑制性死亡)，包括外周血白细胞下降、骨髓增生不良或再生障碍性贫血。

本发明进一步公开了含有右旋蛋氨酸的药物组合物，它是将治疗有效量的右旋蛋氨酸与药学上可接受的药用辅料混合制成组合物。

本发明更进一步公开了含有右旋蛋氨酸与其它营养物质、促进骨髓细胞增殖药物或抗肿瘤药物的组合物，其中包括临床各种剂型的治疗药物、预防药物及保健食品等等。它是将右旋蛋氨酸与其他营养物质、促进骨髓细胞增殖药物混合制成组合物或右旋蛋氨酸作为支持药物与抗肿瘤药物如顺铂、卡铂、阿霉素、马里兰等配合使用，降低化疗所带来的毒副作用。

本发明所述的其他营养物质包括：其他的左旋氨基酸营养液、维生素、葡萄糖、脂肪乳、离子等。

本发明所述促进骨髓细胞增殖的药物包括：各种中药制剂如多糖类(枸杞、银耳、人参多糖等)、生物碱类(小檗碱、苦参总碱等)、皂甙类(人参皂甙、黄芪甙等)及其他如六味地黄口服液等升白中药制剂；人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rHuGM-CSF)、升白欣、肌苷、左旋咪唑、三株口服液、康力龙等。

本发明所述的右旋蛋氨酸与药学上可接受的药用辅料混合制成各种药物组合物，包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、预乳剂、微乳剂、混悬剂、糖浆剂、各种肠溶制剂或注射剂制剂等等。各制剂可以根据常规的工艺制备而成。在制备成药剂时可以加入药学上可接受的辅料，所述的药学上可接受的辅料，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠)等等。

当右旋蛋氨酸与药学上可接受的药用辅料混合组成药物组合物时，组合物中含有的活性成份右旋蛋氨酸的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，所用右旋蛋氨酸的量或浓度在一个较宽的范围内调节，通常右旋蛋氨酸的量范围为组合物的0.5％～90％(重量)。另一优选的范围为0.5％-70％。再一优选的范围为3％-50％。

本发明所述的右旋蛋氨酸与其他营养物质、促进骨髓细胞增殖药物混合制成药物组合物或右旋蛋氨酸作为支持药物与抗肿瘤药物配合使用。一般使用常规的技术，与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉针剂等等。

本发明对辐射诱导骨髓抑制的试验内容主要包括以下几个方面：

1.D-met对体外照射的骨髓细胞损伤具有保护作用。

2.D-met对接受全身照射的小鼠骨髓细胞功能损伤具有保护作用。

3.D-met对辐射所引起骨髓抑制性死亡具有保护作用。

4.D-met对机体没有损伤。

下面通过药效学实验进一步说明右旋蛋氨酸在预防或治疗辐射、化学毒物诱导骨髓抑制作用的药理实验情况。

一、实验方法

1、骨髓单个核细胞分离

无菌取小鼠股骨，含2％FCS的Hunks液冲洗骨髓，Ficoll分离，制备单个核细胞悬液，洗涤，计数调整所需的细胞浓度后待用。

2、细胞活力测定

向96孔板中设定孔加入100ul的单个核细胞悬液，按设计加入处理药物100ul，置入37℃ 二氧化碳孵箱中，培养6h或者18h。取出培养板，放置室温，加入生物发光试剂cell-titer 20ul，振荡混匀后，转入黑色测定板，GloMax^TM发光检测仪采用Promega自带检测程序Cell-titerProtocol进行检测。检测结果自动生成Excel数据。

3、集落形成(克隆)能力测定

分装甲基纤维素培养基，-20℃保存。用前置于2-8℃冰箱内或室温下解冻；分离小鼠骨髓细胞，胎盘蓝染色计数细胞调整细胞浓度加入M3534，振荡器充分混匀，静置待气泡消失，用3ml注射器连接16#平头注射器针头，加入24孔板放入湿盒，置入37℃，5％CO2培养箱中培养14天。

从培养第5天开始在倒置显微镜下进行观察。低倍观察集落形成情况，细胞数≥30为阳性集落，集落形成率以每10⁵个细胞形成的集落数表示。

4、全身照射小鼠生存率测定全身照射后，定期称重，每日观察小鼠死亡情况。

二、实验结果与讨论

1、对造血细胞免疫细胞细胞毒性(对比实验)

分离小鼠骨髓单个核细胞，调整细胞浓度至2×10⁶/ml。不同浓度(10^-2M～10^-6M)的L-met及D-met分别由RPMI-1640培养基或不含met的改良培养基进行配制。常规RP1640培养基中L-met含量在10^-4M。取细胞悬液100ul及不同浓度处理药物加入96孔培养板，孵育18小时后，生物发光法进行细胞活力测定。结果发现利用改良培养基进行实验，两种met均未发现明显的细胞毒性作用。而在常规培养基，10^-2、10^-3L-met对骨髓细胞具有一定的毒性。结果见表1、图1。

表1 Met对骨髓细胞活力的影响(RLU×1000)

2、对肿瘤细胞细胞毒性

根据预试验，选定人肺癌细胞系460，人卵巢癌细胞系ES-2，人白血病细胞HL60A耐药株及HL60S药物敏感细胞株接种浓度。接种至96孔培养板，加入不同浓度的L-met和D-met，孵育48h后，测定细胞活力。结果发现，加入L-met和D-met对460细胞生长无明显影响(图2A)，其他细胞ES-2、HL60A、HL60S也取得相同结果。利用改良培养基培养的460细胞，与D-met比较，L-met具有促进增殖的作用(图2B)，在10^-3～10^-6M范围，二者差异有显著性(P＜0.01)。

3、对造血免疫细胞体外辐射损伤的保护作用

分离骨髓单个核细胞，加入不同浓度的药物后(10^-2M～10^-6M)，孵育30min，进行照射。照射后继续孵育18h，进行细胞活力测定。结果发现照射后骨髓细胞活力1、4、8Gy分别下降52％、72％、73％。与放射对照组比较，D-met对细胞活力有一定的保护作用(p＜0.05～0.01)。结果见表3，图3。

表3 Met对受照射骨髓细胞活力的影响(RLU×1000)

检测不同时间加药对骨髓造血细胞辐射损伤的保护作用，选择1格瑞(Gray，Gy)照射剂量，分别在照射前30min，0min，照射后15min、30min、1h、2h加入10^-3D-met，结果发现以提前30min及同时加药保护效果较好。

4.对化学物诱导造血免疫细胞体外损伤的保护作用

分离骨髓单个核细胞，按一定浓度接种至培养板，加入不同浓度的右旋蛋氨酸(10^-2M～10^-6M)，孵育30min，分别加入终浓度5uM VP16或60uM喜树碱，继续孵育18h，进行细胞活力测定。结果发现VP16使骨髓细胞细胞活力下降60.5％、喜树碱下降35.1％。与抗肿瘤药组比较，未发现D-met对细胞活力的抑制有保护作用(p＞0.05)。

表4 D-met对抗肿瘤药物导致的骨髓细胞损伤的保护作用

三、体内实验

1、D-met对辐射暴露小鼠骨髓细胞集落形成率的影响

小鼠按照射剂量分为0、1、4、6.5Gy四组，9只/组。照射前分别给予生理盐水、300mg/kg、1000mg/kg，腹腔注射，每处理组3只。照射后，取骨髓细胞，接种，进行粒单系集落形成试验(colony-formingunit-granulocyte-macrophage，CFU-GM)。结果发现，不同照射剂量对小鼠CFU-GM具有明显的抑制作用，而D-met对1Gy照射具有明显的保护作用(P＜0.01)。

表5 D-met对照射小鼠骨髓CFU-GM的影响

2、D-met对辐射暴露小鼠存活率的影响

雄性C57小鼠30只，分为3组，分别给予生理盐水、D-Met 300mg/kg、D-Met 1000mg/kg，腹腔注射，观察30天。给药后未发现小鼠异常表现。给药组体重与对照组无差异。30d取材，称取脑、肺、胸腺、肝、脾、肾等重要脏器重量，计算脏器指数，各组未见明显差异。

表6 D-met对健康小鼠体重的影响(g)

雄性C57小鼠45只，分为生理盐水、D-Met 300mg/kg、D-Met 1000mg/kg3组，给予7.5Gy照射。照射前分别注射生理盐水、D-Met 300mg/kg、D-Met1000mg/kg。照射后每日观察记录小鼠死亡情况，定期称重。计算LD50/30。结果发现D-Met 300mg/kg对照射诱导的骨髓型死亡具有一定的保护作用，见图4。

根据体外、体内实验结果发现，D-met对辐射诱导的骨髓细胞功能损伤具有一定的保护作用，并且对肿瘤细胞没有促进增殖作用，提示预防性给药可防治辐射诱导骨髓的损伤。因此，根据上述对肿瘤和骨髓细胞的实验数据，如果是放疗患者，在服用的营养液中将L-met更换为D-met有利于抑制肿瘤保护造血细胞。

本发明与现有技术相比所具有的积极效果在于：

1、D-met是常用的具有促进生长作用的氨基酸，来源广阔、安全有效、经济适用，有广泛的市售来源。

2、D-met通过各种途径给药均有药效学作用。

3、D-met可以在300-1000mg/kg大剂量下使用没有明显的毒副作用。

附图说明：

图1 Met对骨髓细胞活力的影响(％)；

图2 Met对肺癌细胞系460增殖的影响；

图3 Met对受照射骨髓细胞活力的影响(％)；

图4 Met辐射小鼠的保护作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明并不限于此。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制剂实施例。这些实施例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。

实施例1

D-met100mg，乳糖50mg，微晶纤维素80mg，淀粉50mg，羟甲纤维素40mg，硬脂酸镁5mg。将活性成分，乳糖、淀粉、微晶纤维素过100目筛，并充分混匀，将2％羟甲纤维素水溶液加入到上述混合粉末中混合，过20目筛制软材，制得湿颗粒于45-55℃干燥，将羧甲淀粉钠、硬脂酸镁加入到上述的干燥颗粒中压片。

实施例2

D-met 100mg，升白新500mg，加4g(乳糖-微晶纤维5∶1)、硬脂酸镁1％，用70％乙醇制粒、压片即得。

实施例3

D-met 10g，甘露醇60g，加1000ml注射用水溶解，补足注射用水至2000ml，加适量活性炭除热源，0.2um微孔滤膜滤过，灌装，冷冻干燥，制得2000支冻干粉针。规格：70mg/支，供静脉注射用。

实施例4

D-met 10g，加糊精10g、乳糖30g用60％乙醇制粒、干燥、装胶囊，制得1000粒胶囊剂。规格：50mg/粒。

实施例5

D-met 20g，党参5g、黄芪5g，加入淀粉10g，微粉硅胶5g，硬脂酸镁1.5g，混匀后装入胶囊，制成1000粒胶囊。

实施例6

D-met 0.3g，肌苷0.2g，甘露醇9.4g，阿司巴甜0.2g，焦亚硫酸钠0.003g，香精0.1g，将主药与辅料分别过100目筛。先将辅料充分混合，然后称取处方量辅料与主药充分混合。再加入粘合剂制软材，20目筛制粒，55℃干燥，20目筛整粒，筛出细粉，制成颗粒剂，包装。

实施例7

D-met 10g，生物碱类小檗碱15g加入苯甲酸钠3g，加水至1000ml，静置，滤过，灌封，杀菌，即得口服液。

实施例8

D-met 10g，三株口服液1000ml，山梨酸钾3g，加水至1000ml，静置，滤过，灌封，杀菌，即得保健品口服液。

综上所述，本发明的内容并不局限在的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims

1.右旋蛋氨酸作为唯一活性成分在制备防治辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于右旋蛋氨酸作为唯一活性成分在制备预防辐射诱导骨髓损伤药物中的应用。

3.权利要求1所述的应用，其特征在于作为唯一活性成分在制备治疗化学毒物诱导的骨髓抑制性死亡药物中的应用。

4.权利要求1所述的应用，其中所述辐射诱导的骨髓抑制，为接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。

5.权利要求1所述的应用，其中所述化学毒物诱导的骨髓抑制，为接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学毒物接触的工作人员及意外暴露的人员。

6.权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于所述的骨髓抑制，为外周血白细胞下降、骨髓增生不良或再生障碍性贫血。

7.权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于将治疗有效量的右旋蛋氨酸与药学上可接受的药用辅料混合制成组合物。

8.权利要求7所述的应用，其特征在于所述的组合物是片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、混悬剂、糖浆剂、各种肠溶制剂或注射剂。