CN101257903A - 用于癌症治疗的包括二芳基脲化合物和PI3、AKT激酶或mTOR抑制剂(雷帕霉素类)的组合治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的药物组合物和组合，包括二芳基脲化合物例如4{4－[3－(4－氯－3－三氟甲基苯基)－脲基]－3－氟苯氧基}－吡啶－2－羧酸甲基酰胺和PI3K/AKT信号传导路径抑制剂。PI3K/AKT信号传导路径抑制剂包括PI3抑制剂{像塞来考昔、绿胶霉素、渥曼青霉素}，AKT激酶抑制剂{像哌立福辛、曲西立滨}和mTOR抑制剂{像雷帕霉素类药物替西罗莫司和依维莫司}。

Description

用于癌症治疗的包括二芳基脲化合物和PI3、AKT激酶或mTOR抑制剂(雷帕霉素类)的组合治疗
发明背景
二芳基脲化合物例如US 20050038080描述的4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-3-氟苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺是拥有多种活性的有效抗癌和抗血管生成剂，其活性包括对VEGFR、PDGFR、raf、p38、和/或fit-3激酶信号分子的抑制活性。RAS/RAF/MEK/ERK路径与细胞的增殖、分化和转化有关，并且涉及多种癌症。PI3K/AKT信号传导路径是细胞里另一条重要的生理路径。它调节细胞外刺激物，包括生长因子、细胞因子、细胞-细胞粘附和细胞-胞外基体(Vivanco和Sawyers，Nat Rev Cancer，2：489-501，2002，Downward，Curr OpinCell Biol，10：262-267，1998)。AKT路径似乎在许多类型的人类癌症中表现活跃(Nicholson和Anderson，Cell Signal，14：381-395，2002)。
发明描述
本发明提供了一种药物组合，组合物，以及方法，用于治疗疾病和病症，包括，但不局限于，细胞增殖障碍(例如癌症)、炎症、免疫调节障碍、以及与异常或不需要的血管生成有关的病症。所述药物组合包括式I化合物和至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物。所述方法可包括，例如，施予下述的二芳基脲化合物和信号传导路径抑制剂，其药学上可接受的盐，以及其衍生物，等等。
磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和AKT(蛋白激酶B)信号传导路径调节许多生物过程，包括细胞存活、细胞增殖、细胞生长和细胞运动。PI3K-AKT信号传导的异常性促使多种疾病和病症发病，包括细胞增殖障碍(例如癌症)、炎症和免疫调节障碍。
许多生长和存活因子激活PI3K家族成员以将脂质信号分子之一PIP2特异地转换成另一种脂质信号分子PI(3，4，5)P3。磷酸化产物将Akt家族成员征集至内质膜，激活它们的蛋白激酶活性。迄今为止，多种参与数种生物过程的Akt效应物已经被确认。例如，通过使细胞凋亡机构组分磷酸化和失活，Akt激酶介导细胞存活。PI3K/AKT信号传导路径包括任何参与信号转导级联的成员或组分。它们包括，但不限于，例如，PI3-激酶、Akt-激酶、FKBP 12，mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶点；也称为FRAP、RAFT1或RAPT1)，RAPTOR(mTOR的调节相关蛋白)，TSC(结节状硬化复合体)，PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物)和其下游的效应物。本发明的组合可用于治疗和/或预防和上述活性中任一有关的任何病症和/或疾病。
PI3K/AKT信号传导路径的抑制剂是抑制一个或更多上述信号转导级联成员的化合物。虽然这样的化合物可被认为是路径抑制剂，本发明包括这些抑制剂用于治疗任意提及的疾病或病症的用途，而不管其作用机理或治疗效果如何达到。实际上，已确定这样的化合物可具有不只一个的靶点，并且化合物公认的初始活性可能不是当对受试者施予时该化合物在体内拥有的活性，或借此化合物能达到它的治疗功效的活性。因而，化合物作为路径或蛋白靶点(例如，Akt或mTOR)抑制剂的记载表明化合物拥有这样的活性，但决不是用来限制当化合物作为治疗剂或预防剂使用时具有那样的活性。
AKT家族成员的例子包括：Akt1、Akt2(通常在肿瘤中过表达；Bellacosa等Int.J.Cancer，64：280-285，1995)和Akt3。
PI3K家族成员的例子包括：p110-α、p110-β、p110-δ和p110-γ(催化的)。
PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的例子包括，但不限于，例如，FTY720(例如，Lee等，Carcinogenesis，25(12)：2397-2405，2004)；
UCN-01(例如，Amornphimoltham等，Clin Cancer Res.，10(12Pt l)：4029-37，2004)。
磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-激酶)抑制剂的例子，包括，但不限于，例如：
塞来考昔及其类似物，例如OSU-03012和OSU-03013(例如，Zhu等，CancerRes.，64(12)：4309-18，2004)；
3-脱氧-D-myo-肌醇类似物(例如，美国专利申请No.20040192770；Meuillet等，Oncol.Res.，14：513-27，2004)，例如PX-316；
2′-取代3′-脱氧-磷脂酰myo-肌醇类似物(例如，Tabellini等，Br.J.Haematol.，126(4)：574-82，2004)；
稠合的杂芳基衍生物(美国专利No.6,608,056)；
3-(咪唑并[1，2-a]吡啶3-基)衍生物(例如，美国专利Nos.6,403,588和6,653,320)；
Ly294002(例如，Vlahos等，J.Biol.，Chem.，269(7)5241-5248，1994)；
喹唑啉-4-酮衍生物，例如IC486068(例如，美国专利申请No.20020161014；Geng等，Cancer Res.，64：4893-99，2004)；
3-(杂)芳氧基取代的苯并(b)噻吩衍生物(例如，WO 04108715；也如WO 04108713)；
绿胶霉素，包括半合成绿胶霉素，例如PX-866(醋酸(1S，4E，10R，11R，13S，14R)-[4-二烯丙基氨基亚甲基-6-羟基-1-甲氧基甲基-10，13-二甲基-3，7，17-三氧代-1，3，4，7，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-2-氧杂-环戊烷并[a]菲-11-基酯)(例如，IhIe等，Mol Cancer Ther.，3(7)：763-72，2004；美国专利申请No.20020037276；美国专利5,726,167)；和
渥曼青霉素及其衍生物(例如，美国专利Nos.5,504,103；5,480,906，5,468,773；5,441,947；5,378,725；3,668,222)。
Akt-激酶(也称为蛋白激酶B)抑制剂的例子，包括，但不限于，例如：
Akt-1-1(抑制Akt1)(Barnett等，Biochem.J.，385(Pt.2)：399-408，2005)；
Akt-1-1，2(抑制Ak1和2)(Barnett等，Biochem.J.，385(Pt.2)：399-408，2005)；
API-59CJ-Ome(例如，Jin等Br.J.Cancer.，91：1808-12,2004)；
1-H-咪唑[4，5-c]吡啶基化合物(例如，WO05011700)；
吲哚-3-甲醇及其衍生物(例如，美国专利Nos.6,656,963；Sarkar和Li，J Nutr.，134(12Suppl)：3493S-3498S，2004)；
哌立福辛(例如，干扰Akt膜定位；Dasmahapatra等，Clin.Cancer Res.，10(15)：5242-52，2004)；
磷脂酰肌醇醚脂质类似物(例如，Gills和Dennis，Expert.Opin.Investig.Drugs，13：787-97，2004)；
曲西立滨(TCN或API-2或NCI鉴别剂：NSC 154020；Yang等，CancerRes.，64：4394-9，2004)。
mTOR抑制剂的例子包括但不限于，例如：
FKBP 12增强剂；
雷帕霉素及其衍生物，包括：CCI-779(替西罗莫司(temsirolimus))、RAD001(依维莫司；WO 9409010)、TAFA93和AP23573；雷帕类似物(rapalogs)，例如在WO 98/02441和WO 01/14387中公开的，例如AP23573、AP23464、AP23675或AP23841；40-(2-羟乙基)雷帕霉素、40-[3-羟基(羟甲基)丙酸甲酯]-雷帕霉素(也叫CC1779)、40-表-(四唑基)-雷帕霉素(也叫ABT578)、32-去氧代雷帕霉素、16-戊炔基氧基-32(S)-二氢雷帕霉素，和在WO 05005434中公开的其它衍生物；在USP 5,258,389、WO 94/090101、WO 92/05179、USP 5,118,677、USP5,118,678、USP5,100,883、USP5,151,413、USP5,120,842、WO93/111130、WO 94/02136、WO 94/02485、WO 95/14023、WO 94/02136、WO 95/16691(例如SAR 943)、EP 509795、WO 96/41807、WO 96/41807和USP 5,256,790中公开的衍生物；
含磷雷帕霉素衍生物(例如，WO 05016252)；
4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物(例如，美国临时申请No.60/528,340)。
临床前使用或临床使用的化合物的例子，包括AP23573、AP23841、CCI-779和RAD001。
所关注的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-激酶)抑制剂例子是渥曼青霉素及其衍生物或其类似物，以及渥曼青霉素和它的衍生物和类似物在药学上可接受的盐。因此，本发明的方法包括使用式W的PI3-激酶抑制剂：
Figure A20068001851700091
式W化合物的衍生物或类似物、式W化合物的药学上可接受的盐和式W化合物的衍生物或类似物的药学上可接受的盐。
这里涉及的渥曼青霉素或“式W”化合物的衍生物和类似物意在包括美国专利Nos.5,504,103；5,480,906，5,468,773；5,441,947；5,378,725；3,668,222中鉴别的衍生物和类似物。式W化合物适合的衍生物和类似物包括：
a)式W1的化合物
Figure A20068001851700101
其中R是H(11-脱乙酰氧基渥曼青霉素)或乙酰氧基，和R′是C1-C6烷基，
b)式W2的Δ9，11-脱氢脱乙酰氧基渥曼青霉素化合物
Figure A20068001851700102
其中R′是C1-C6烷基，
c)式W3的17(α-二氢-渥曼青霉素化合物
其中R是H或乙酰氧基，和R′是C1-C6烷基，以及R″是H、C1-C6烷基、-C(O)OH或-C(O)O-C1-C6烷基；
d)式W4的渥曼青霉素化合物的开A-环的酸或酯
Figure A20068001851700111
其中R1是H、甲基或乙基，和R2是H或甲基，或
e)式W5的渥曼青霉素11-取代和17-取代的衍生物
其中R4是＝O或-O(CO)R6，R3是＝O、-OH或-O(CO)R6，每个R6独立地是苯基，C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，其中R4是＝O或-OH，R3不是＝O。
与4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-3-氟苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺对应的具有式(I)结构的化合物及其药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂化物、水合物、代谢产物及药物前体，在此统称为“式I化合物”。式(I)如下：
当在此使用的词语化合物、盐等的复数形式，这也表示单个的化合物、盐等等。
术语C1-6烷基，除非另外指出，表示含有1到6个碳原子的直链、支链或环状烷基，它可以是环状的、直线的或有一个或多个分支的支链。这样的基团包括例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丁基等等。本发明还涉及在此处公开的化合物的有用形式，例如药学上可接受的盐和代谢产物。本发明还涉及式(I)化合物的药物前体。术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物相对无毒的、无机或有机酸加成盐。例如，参见S.M.Berge等，″Pharmaceutical Salts，″J.Pharm.Sci.1977，66，1-19。药学上可接受的盐包括通过为形成盐而使起碱的作用的主化合物与无机酸或有机酸反应所获得的那些盐，例如，盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、樟脑磺酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐和柠檬酸盐。药学上可接受的盐还包括那些其中起酸作用的主化合物与适合的碱反应形成的盐，例如，钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐和胆碱盐。本领域的技术人员会进一步明白所要求化合物的酸加成盐可由所述化合物和适合无机或有机酸经由许多已知方法中的任意一种来反应制备。替代地，碱金属盐和碱土金属盐由本发明化合物和适合的碱经各种已知方法来反应制备。
本发明化合物代表性的盐包括常规的无毒盐和季铵盐，其例如由无机或有机酸或碱经本领域熟知的技术形成。例如，这样的酸加成盐包括醋酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、肉桂酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐(digluconate)、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟乙烷磺酸盐、衣康酸盐、乳酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、双氢萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐和十一酸盐。
碱盐包括碱金属盐例如钾盐和钠盐、碱土金属盐例如钙盐和镁盐、和与有机碱例如二环己基胺和N-甲基-D-葡糖胺成的铵盐。此外，碱性含氮基团可与诸如如下的试剂季铵化：低级烷基卤化物例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯、二乙酯和二丁酯；和硫酸二戊酯，长链卤化物例如癸基、十二烷基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物，芳基或芳烷基卤化物如苯甲基和苯乙基溴化物以及其它单取代的芳烷基卤化物或多取代的芳烷基卤化物。
符合本发明目的的溶剂化物是指那些化合物形式，其中溶剂分子形成固体复合物，并且包括但不限于如乙醇和甲醇。水合物是溶剂化物一种特殊的形式，其中溶剂分子是水。
某些药理学活性剂可进一步用不稳定的官能团修饰，所述官能团在体内给药后裂解得到母体活性剂和药理学非活性的衍生基团。这些衍生物，通称为药物前体，可以被用于如改变活性剂的理化性质，使活性剂靶向至特定组织，改变活性剂的药代动力学和药效学性质，以及降低不良副作用。本发明的药物前体包括，例如，较好耐受性的适宜本发明化合物的酯，药学上可接受的酯例如烷基酯，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或戊基酯。可使用其它酯例如苯基-C1-C5烷基酯，而优选甲酯。
在下列对此主题的综述中描述了可用于合成其它药物前体的方法，这些综述并入本文以参考对这些合成方法的说明：
·Higuchi，T.；Stella，V.编辑Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems.ACS SymposiumSeries.American Chemical Society：Washington，DC(1975).
·Roche，E.B.Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs.American Pharmaceutical Association：Washington，DC(1977).
·Sinkula，A.A.；Yalkowsky，S.H.J Pharm Sci.1975，64，181-210.
·Stella，V.J.；Channan，W.N.Naringrekar，V.H.Drugs 1985，29，455-473.
·Bundgaard，H.编辑Design of Prodrugs.Elsevier：New York(1985).
·Stella，V.J.；Himmelstein，K.J.J.Med.Chem.1980，23，1275-1282.
·Han，H-K；Amidon，G.L.AAPS Pharmsci 2000，2，1-11.
·Denny，W.A.Eur.J.Med.Chem.2001，36，577-595.
·Wermuth，C.G.于Wermuth，C.G.编辑The Practice of Medicinal Chemistry Academic Press：San Diego(1996)，697-715.
·Balant，L.P.；Doelker，E.于Wolff，M.E.编辑Burgers Medicinal Chemistry And DrugDiscovery John Wiley&Sons：New York(1997)，949-982.
本发明化合物的代谢产物包括式I化合物的氧化衍生物，其中一个或多个氮被羟基取代；包括其中吡啶基团的氮原子以氧化物形式存在的衍生物，在本领域中被称为1-氧化-吡啶，或其中吡啶基团的氮原子具有一个羟基取代基的衍生物，在本领域中被称为1-羟基-吡啶。
一般的制备方法
本发明化合物可利用已知的化学反应和程序如在下列公开的国际申请WO2005/009961中描述的方法来制备。
式I化合物已被表征为具有各种活性，包括抑制Raf/MEK/ERK路径、raf激酶、p38激酶、VEGFR激酶、PDGFR激酶的活性。这些活性和它们用于治疗各种疾病和病症的应用在例如WO 2005/009961中公开，所述文献以全文并入本文作为参考。
适应症
本发明的药物组合可被用来治疗与经包含所述组合的混配物调节的细胞路径有关的或由经包含所述组合的混配物调节的细胞路径所介导的任意疾病或病症。这些路径包括但不限于信号传导路径，其中包含例如VEGFR、VEGFR2、Raf/ek/Erk、Akt/PI3K、MTOR、PTEN、等等(还可参见上面的内容)。所述药物组合可有效治疗与存在于这些路径中的一个或多个基因中突变有关的或由存在于这些路径中的一个或多个基因中突变所介导的疾病，所述基因中突变包括与癌症相关的PTEN、ras、Raf、Akt、PI3K等基因突变。
如上所述，虽然所述化合物可知作为特定抑制剂，本发明包括任意的改善或治疗效果，而不管作用机理或者该效果是如何实现的。
所述药物组合可拥有一个或多个下列活性，包括，抗增殖；抗肿瘤；抗血管生成；抑制内皮或肿瘤细胞的增殖；抗肿瘤形成；免疫抑制；免疫调节；促凋亡等等。
可根据本发明治疗的病症或疾病包括增殖障碍(例如癌症)、炎性病症、免疫调节障碍、***反应、自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎，或多发性硬化症)、异常或过度血管生成，等等。
可以治疗任何肿瘤或癌症，包括但不限于，具有在raf、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、Flt-3、ras、PTEN、Akt、PI3K、mTOR中以及它们作为之中一部分的信号传导路径的上游或下游成员中的一个或多个基因突变的癌症。肿瘤或癌症可用本发明的药物组合治疗，而不其作用机理。可以治疗任何器官的癌症，包括但不限于，例如，结肠、胰腺、乳腺、***、骨、肝、肾、肺、睾丸、皮肤、胰腺、胃、***、卵巢、子宫、头和颈、血细胞、淋巴等的癌症。
可根据本发明治疗的癌症，特别包括，但不限于，脑肿瘤、乳腺癌、骨的肉瘤(例如，骨肉瘤和尤因氏肉瘤)、未恶变支气管瘤、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、何杰金氏病、肾肿瘤、白血病、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴瘤、小脑发育不良性神经节细胞瘤病(Lhermitte-Duclose disease)、恶性胶质瘤、黑素瘤、恶性黑素瘤、转移瘤、多发性骨髓瘤、髓样化生、髓细胞生成综合症(myeloplastic syndromes)、非小细胞肺癌、胰腺癌、***癌、肾细胞癌(例如，晚期，晚期难治的)、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、皮肤的鳞状上皮癌和与缺失PTEN功能、活化的Akt有关的癌症(例如PTEN缺失肿瘤和带ras突变的肿瘤)。
乳腺癌的例子包括但不限于，侵入式导管癌、侵入式小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。
呼吸道癌症的例子包括但不限于，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管腺瘤和胸膜肺胚细胞瘤。
脑癌的例子包括但不限于，脑干和hypophtalmic神经胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和神经外胚层和松果体肿瘤。
***官的肿瘤包括但不限于***和睾丸癌。女性生殖器官的肿瘤包括但不限于，子宫内膜的、子宫颈的、卵巢的、***的和外阴的肿瘤，以及子宫肉瘤。
消化道肿瘤包括但不限于***的、结肠的、结肠直肠的、食管的、胆囊、胃的、胰腺的、直肠的、小肠和唾液腺癌症。
泌尿道的肿瘤包括但不限于膀胱、***的、肾、肾盂、输尿管和尿道的癌症。
眼部癌症包括但不限于眼内的黑素瘤和视网膜母细胞瘤。
肝癌的例子包括但不限于肝细胞性肝癌(有羽层状变体或没有羽层状变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆液胆管癌)和混合型肝细胞性胆管癌。
皮肤癌包括，但不限于鳞状细胞癌、卡波济氏肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌和非黑素瘤皮肤癌。
头颈癌包括但不限于喉部、下咽的、鼻咽的和/或口咽的癌症，以及唇和口腔癌。
淋巴瘤包括但不限于AIDS相关的淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、皮肤的T细胞淋巴瘤、何杰金氏病和中枢神经***的淋巴瘤。
肉瘤包括但不限于软组织的肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。
白血病包括但不限于急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病，和毛细胞白血病。
除了抑制肿瘤细胞的增殖以外，本发明的药物组合还可致使肿瘤退化，例如，肿瘤尺寸或体内癌症范围的减小。
优选用于黑素瘤、肾癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、***癌、结肠直肠癌、乳腺癌或胰腺癌的治疗。
血管生成相关的病症和障碍也可用本发明的药物组合治疗。血管生成不适当的和异位表达对生物体可以是有害的。许多病理学病症与额外血管的生长相关。这些包括，例如，糖尿病视网膜病、新生血管性青光眼、银屑病、晶体后纤维组织增生、血管纤维瘤、炎症、再狭窄，等等。此外，增加的血液供给与癌性的和肿瘤的组织相关，刺激肿瘤生长，导致肿瘤迅速地增大和转移。而且，肿瘤中新血管的生长提供了变节细胞脱离路线，结果是刺激转移和导致癌症扩散。
用于调节血管生成的有效***，包括，例如，瘤外植物的新血管生成(例如，美国专利Nos.5,192,744；6,024,688)、鸡绒毛膜(CAM)测定(例如，Taylor和Folkman，Nature，297：307-312，1982；Eliceiri等，J.Cell Biol.，140，1255-1263，1998)、牛毛细管内皮(BCE)细胞测定(例如，美国专利No.6,024,688；Polverini，P.J.等，Methods Enzymol.，198：440-450，1991)、迁移测定和HUVEC(人脐带血管内皮细胞)生长抑制测定(例如，美国专利No.6,060,449)。另外，用于调节***发生的有效***，包括，例如，兔耳模型(例如，Szuba等，FASEB J.，16(14)：1985-7，2002)。
血管生成的调节可由任意适合的方法确定。例如，组织血管供应的程度典型地是由评价存在于给定样品中血管的数量和密度来确定的。例如，微血管密度(MVD)可由在一个高倍显微镜视野下计算内皮簇的数量来评价，或者检测微血管内皮特异性标记或其它生长性或已建立血管的标记，例如CD31(也被称为血小板-内皮细胞粘附分子或PECAM)。CD31抗体可按常规免疫组织学方法做成免疫染色组织切片，例如记载在Penfold等，Br.J.Oral and Maxill.Surg.，34：37-41；美国专利No.6,017,949；Dellas等，Gyn.Oncol.，67：27-33，1997；和其他文献中。其它血管生成的标记包括，例如Vezfl(例如，Xiang等，Dev.Bio.，206：123-141，1999)、血管生成素、Tie-1和Tie-2(例如，Sato等，Nature，376：70-74，1995)。
本发明的药物组合还具有治疗或预防许多疾病进程的广泛治疗活性，所述疾病例如炎性病症，冠状动脉再狭窄、肿瘤相关的血管生成、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、炎症、某些与肾小球或系膜细胞增殖相关的肾脏疾病、和与视网膜血管增殖相关的眼部疾病、银屑病、肝硬化、糖尿病、动脉粥样硬化、再狭窄、血管移植再狭窄、支架内狭窄、血管生成、眼部疾病、肺纤维化、闭塞性细支气管炎、肾小球肾炎、类风湿性关节炎。
本发明还提供人类和/或其它哺乳动物的一种或多种下列病症的治疗、预防、调节：视网膜病，包括糖尿病视网膜病、缺血性视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变和年龄相关性黄斑变性类视网膜病变；类风湿性关节炎、银屑病或与表皮下水疱形成有关的大疱病，包括大瘤性类天疱疮、多形性红斑或疱疹样皮炎、风湿热、骨吸收、绝经后骨质疏松病、脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、脓毒性休克、内毒素性休克、中毒性休克综合症、全身炎症反应综合症、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、雅里施-赫克斯海默反应、哮喘、成人呼吸窘迫综合症、急性肺纤维化病、肺结节病、过敏性呼吸系疾病、硅肺病、煤工尘肺病、肺泡损伤、肝衰竭、肝病的急性感染期、严重的酒精性肝炎、疟疾(恶性疟原虫和脑型疟)、非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、充血性心力衰竭、心脏病后损害、动脉粥样硬化、阿耳茨海默氏病、急性脑炎、脑损伤、多发性硬化症(多发性硬化里的脱髓鞘和少突神经胶质细胞的损失)、晚期癌症、淋巴恶性肿瘤、胰腺炎、感染中的、炎症中的与癌症中的伤口治愈不良、骨髓增生异常综合症、全身性红斑狼疮、胆汁性肝硬变、肠坏死、放射性损伤/施予单克隆抗体后的毒性、宿主抗移植物排斥反应(局部缺血再灌注损伤和肾、肝、心和皮肤的同种异体排斥反应)、肺同种异体移植物排斥反应(闭塞性支气管炎)或全髋置换导致的并发症，以及传染性疾病，其选自结核病、消化性溃疡病期间的幽门螺旋杆菌感染、克氏锥虫感染导致的Chaga氏病、大肠杆菌感染导致的志贺样毒素作用、葡萄球菌感染导致的肠毒素A作用、脑膜炎球菌感染和来自博氏疏螺旋体、***、巨细胞病毒、流感病毒、泰勒脑脊髓炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)的感染、***瘤、胚神经胶质瘤、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、肺癌、卵巢癌、***癌、鳞状上皮细胞癌、星形细胞瘤、头癌、颈癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、白血病、淋巴瘤、何杰金氏病、Burkitt氏病、关节炎、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、血管生成、再狭窄、支架内再狭窄、血管移植物再狭窄、肺纤维化、肝硬化、动脉粥样硬化、肾小球肾炎、糖尿病性肾病、微血管血栓综合症、移植物排斥、银屑病、糖尿病、创伤愈合、炎症和神经变性疾病、超免疫障碍、血管瘤、心肌血管发生、冠状和大脑并行血管化、局部缺血、角膜疾病、虹膜红变、新生血管性青光眼、早产儿黄斑变性视网膜病、创伤愈合、溃疡螺旋杆菌相关疾病、骨折、子宫内膜异位、糖尿病病症、猫抓热、甲状腺肥大、烧伤后的哮喘或水肿、创伤、慢性肺病、中风、息肉、脓胞、滑膜炎、慢性和过敏性炎症、卵巢过度刺激综合症、肺与脑水肿、瘢痕瘤、纤维症、肝硬化、腕管综合症、成人呼吸窘迫综合症、腹水、眼部病症、心血管病症、Crow-Fukase(POEMS)病、克罗恩病、肾小球肾炎、骨关节炎、多发性硬化症、移植物排斥、莱姆氏病、脓毒症、von Hippel Lindau病、类天袍疮、佩吉特氏病、多囊性肾病、结节病、甲状腺炎、高粘滞综合征、奥斯勒-韦伯-朗迪病、慢性闭塞性肺部疾病、辐射、缺氧、先兆子痫、月经过多、子宫内膜异位、单纯性疱疹感染、缺血性视网膜病、角膜血管生成、带状疱疹、人类免疫缺陷病毒、类痘病毒、原虫、弓形体病、脊椎关节炎、强直性脊椎炎、Morbus Bechterew、禽流感(包括例如血清型H5N1)，以及与肿瘤相关的渗液和水肿。
本发明提供了治疗任意上述疾病和/或病症(包括那些所有引用参考文献中提及的)的方法，包括施予有效量的式I化合物以及至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物(例如雷帕霉素或者雷帕霉素的衍生物或类似物，或渥曼青霉素或者渥曼青霉素的衍生物或类似物)。“有效量”是化合物能有效达到例如用以治疗疾病或病症的预期效果的量。
本发明还涉及抑制包含细胞的***里血管生成的方法，包括给予该***有效量的这里描述化合物的组合。包含细胞的***可以是体内***，例如患者体内的肿瘤，分离的器官、组织或细胞，体外测定***(CAM，BCE，等等)、动物模型(例如，体内，皮下的，癌症模型)、需要治疗的主体(例如，遭受具有血管原性成分的疾病例如癌症的主体；经历再狭窄的主体)等等。
此外，药物组合可被施予用以调节下列一个或多个过程：细胞生长(例如，增殖)、肿瘤细胞生长(包括，例如，分化，细胞存活，和/或增殖)、肿瘤消退、内皮细胞生长(包括，例如，分化，细胞存活，和/或增殖)、血管生成(血管生长)、血管生成和/或血细胞生成(例如，增殖，T-细胞发育等等)。
本发明的化合物或药物组合可以以任意形式经任何有效途径施予，所述有效途径包括例如经口服、胃肠外、肠道、静脉、腹膜内、表面、经皮(例如，使用任意标准贴剂)、经眼、经鼻、局部、非口服例如气雾剂、吸入剂、皮下、肌内、颊含、舌下、直肠、***、动脉内和鞘内等方式。它们可单独施予，或与任意活性或非活性成分组合。它们可以以任意有效剂量施予，例如，约0.1至约200mg/kg总体重。
本发明的组合可以在任意时间和以任意有效形式施予。例如，化合物可同时施予，例如，作为单一组合物或剂量单位(例如，同时含有两个组分的药丸或液体剂)，或者它们可作为分开的组合物但在同时施予(例如，其中一种药物由静脉内给药，而另一种口服或肌内给药)。所述药物还可以在不同时间相继施予。药剂可按照常规制成剂型以在较长时段例如12-小时、24-小时的时段达到预期释放率。这可通过添加使用药剂和/或其具有适宜代谢半衰期的衍生物达到，和/或通过使用控释剂型达到。
药物组合可以是增效的，例如，其中药物的合用作用是这样的：合用效果大于它们各自简单叠加的效果。因此，可减少施予药物的用量例如降低毒性或其它有害或不利作用，和/或使用与药剂单独给予时所使用的相同的量但能达到更大的功效，例如，具有更有效的抗增殖和促凋亡作用。
本发明的化合物或药物组合可进一步结合任意其它适合的添加剂或药学上可接受的载体。这样的添加剂包括任何已经提及的物质，也包括任何常规使用的物质，例如那些在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro和Gennaro编辑，20th版，Lippincott Williams&Wilkins，2000)；Theory and Practice of Industrial Pharmacy(Lachma等编辑，3rd版，Lippincott Williams&Wilkins，1986)；Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(Swarbrick和Boylan编辑，2nd版，Marcel Dekker，2002)中描述的。这些可在本文中称作“药学上可接受的载体”，以表示它们与活性药物结合，并且可为治疗目的对患者安全地施予。
此外，本发明的化合物或药物组合可以与其它活性剂或治疗(例如，放射疗法)共同施予，用来治疗任意上述提及的疾病和/或病症。
本发明提供了有效治疗疾病或病症的至少一种式I化合物和至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物的组合。针对本发明目的的“组合”包括：
-含有至少一种式I化合物和至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物的单一组合物或剂型；
-含有至少一种式I化合物和至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物以便被同时或相继施予的组合包装；
-包括至少一种式I化合物和至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物的试剂盒，所述至少一种式I化合物与所述至少一种第二化合物作为单位剂量或作为独立的单位剂量彼此分开包装，带有或不带有将它们同时或相继施予的说明书；和
-至少一种式I化合物和至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物的分开独立剂型可协同达到治疗效果，例如，同种疾病的预防或治疗，当同时或相继施予。
组合中每一种药剂的剂量可参考其它和/或疾病类型和/或疾病状态选择，以达到预期的治疗活性。例如，组合中活性剂可以固定组合存在和施予。“固定组合”这里是指组分按提供所需功效的固定比例存在的药物形式。对于特定的患者，这些量可常规地确定，其中利用不同的参数来选择适合的剂量(例如，癌症的类型、患者的年龄、疾病状态、患者健康状态、体重等等)，或者量可为相对标准的。
组合可包含有效量的至少一种式I化合物和至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物，其达到了比每一种化合物单独使用时更好的治疗功效。该组合可有效引起肿瘤退化，使得疾病病情稳定，预防或减少转移，或产生其它治疗点，其中治疗效果是当药剂单独使用时观察不到的，或者其中当施予该组合时观察到增强的效果。
组合中每一种化合物的相对比例也可根据它们各自的作用机理和疾病生物学来选择。例如，在多于60％的人类黑素瘤患者中观察到B-RAF基因的激活性突变，以及用于治疗黑素瘤的组合物可有利地以较作为P13K/AKT信号传导路径抑制剂的化合物更强效的量包含式I化合物。比较起来，对于与PI3K/AKT信号传导路径中突变有关的癌症(例如，卵巢和乳腺癌)，在该信号传导路径中具有活性的药剂可以相对于Ref/MEK/ERK路径抑制剂更强效的量存在。每种化合物的相对比例可在广泛地变化，本发明包括这样的用于治疗癌症的组合，其中式I化合物和第二活性剂的剂量可例行调节使得其中任一种以较高的量存在。
组合物一种或多种药剂的释放也可以被控制以便在适当时当以单一剂型、组合包装、试剂盒或在分开的独立剂型存在时可提供所需的治疗活性。
测定
本发明组合的活性可根据任意有效的体内或体外方法测定。
激酶活性
激酶活性可使用常规的测定方法例行测定。激酶测定典型地包括激酶、底物、缓冲液和检测***组件。典型的激酶测定涉及蛋白激酶与肽底物和ATP如32P-ATP的反应，以产生磷酸化终产物(例如，当使用肽底物时得到磷蛋白)。所得终产物可使用任意适合的方法检测。当使用放射性ATP，放射性标记的磷蛋白可使用亲和膜或凝胶电泳从未反应的γ-32P-ATP分离，然后在凝胶上使用放射自显影法显现或用闪烁计数器检测。也可使用非放射性的方法。方法可利用能识别磷酸化底物的抗体，例如，抗磷酸酪氨酸抗体。例如，激酶可和底物在能有效使得酶磷酸化底物的条件下在ATP和激酶缓冲液存在下培养。反应混合物可被分离，例如，经电泳，然后可测量底物的磷酸化，例如，使用抗磷酸酪氨酸抗体通过蛋白质印迹法进行。抗体可用可探测的标记进行标记，例如，酶如HRP、抗生物素蛋白或生物素，化合发光试剂等等。其它方法可利用ELISA模式，亲和膜分离、荧光偏振测定、发光测定等等。
放射性模式的替代形式是时间解析的荧光共振能量转换(TR-FRET)。该方法遵循标准激酶反应，其中底物例如生物素化的聚(GluTyr)在ATP存在的情况下经蛋白激酶磷酸化。然后终产物可用铕螯合物磷酸特异性抗体(抗磷酸酪氨酸或磷酸丝氨酸/苏氨酸)和抗生物素蛋白链菌素-APC，其可结合生物素化的底物。这两种组分可在空间上结合，并且能量从磷酸特异性抗体转移到受体(SA-APC)，在均一模式(homogeneous format)中产生荧光读数。
Raf/MEK/ERK活性
c-Raf激酶测定可由Lck激酶激活(磷酸化)的c-Raf酶来进行。Lck-活化的c-Raf（Lck/c-Raf)在Sf9昆虫细胞中经用在多角体蛋白启动子的控制之下表达GST-c-Raf(从氨基酸302到氨基酸648)和Lck(全长)的杆状病毒共感染细胞产生。所述杆状病毒两者都在2.5的感染复数下使用，并且在感染后48小时收集细胞。
在Sf9昆虫细胞中通过在5的感染复数下用表达GST-MEK-1(全长)融合蛋白的杆状病毒感染细胞并且在感染后48小时收集细胞，从而产生MEK-1蛋白。对GST-c-Raf302-648和GST-MEK-1使用相似的纯化步骤。
转染细胞以每mL 100mg湿细胞生物质悬浮于含有10mM磷酸钠、140mM氯化钠pH 7.3、0.5％Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液。细胞用Polytron匀浆器进行破裂并30,000g离心30分钟。30,000g上层清液被供应到GSH-琼脂糖上。树脂用含有50mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl和0.01％TritonX-100的缓冲液洗涤。GST-标记的蛋白被含有100mM谷胱甘肽，50mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl和0.01％Triton X-100的溶液洗脱下来。纯化的蛋白透析到含有20mM Tris，pH 7.5，150mMNaCl和20％丙三醇的缓冲液中。
试验化合物在DMSO中稀释，使用三倍连续稀释度，至典型地50μM到20nM的贮备浓缩物(例如，测定中最终浓度可从1μM到0.4nM)。c-Raf生物化学测定是在96-孔Costar聚丙烯板(Costar 3365)中用放射性过滤垫测定完成的。板装载了75μL含有50mMHEPES pH 7.5，70mMNaCl，80ng的Lck/c-Raf和1μgMEK-1的溶液。接着，在ATP添加之前，往反应中加入2μL经连续稀释的各个化合物。反应以25μL含有5μM ATP和0.3μCi[33P]-ATP的ATP溶液起始。板被密封并且在32℃培育1小时。反应通过加入50μl的4％磷酸猝灭，并用Wallac Tomtec收集器收集到P30过滤垫(PerkinElmer)上。过滤垫先用1％磷酸冲洗，然后用去离子H2O冲洗。过滤垫在微波炉中干燥，浸渍在闪；烁液中并用Wallac 1205Betaplate 计数器(Wallac Inc.，Atlanta，GA，U.S.A.)读取。结果用抑制百分比表示。
％抑制＝[100-(Tib/Ti)]×100，其中
Tib＝(存在抑制剂情况下每分钟计数)-(背景)
Ti＝(无抑制剂情况下每分钟计数)-(背景)
Raf的活性还可由它起始导致ERK磷酸化(即raf/MEK/ERK)(这产生磷酸-ERK)的级联的能力监测。Bio-Plex磷酸-ERK1/2免疫测定法可按如下步骤进行：
使用激光流式细胞计量平台的96-孔磷酸-ERK(pERK)免疫测定法已经建立，用以测量细胞系中基部pERK的抑制。在完全生长培养基中，在96-孔微量滴定板中以每孔50,000个细胞涂覆MDA-MB-231细胞。针对试验化合物对基部pERK1/2抑制的效果，在涂覆后的第二天，将MDA-MB-231细胞转移至含0.1％BSA的DMFM中并用在0.1％DMSO中1∶3稀释至最终浓度3mM到12nM的试验化合物培育。细胞用试验化合物培育2h，冲洗，然后在Bio-Plex全细胞溶解缓冲液A中溶解。样品用缓冲液B 1∶1(v/v)稀释并直接转移至分析板或在-80℃冷冻直到处理。50mL稀释的MDA-MB-231细胞溶胞产物用约2000个和抗-ERK1/2抗体连接的5微米Bio-Plex珠培育，室温下在振荡器上过夜。第二天，进行生物素化的磷酸-ERK1/2夹心式免疫测定，在每个培育期间冲洗珠三次并且然后使用50mL PE-抗生物素蛋白链菌素作为显影试剂。PERK1/2的相对荧光单位通过用高灵敏度Bio-Plex流式细胞(探针)计数25个珠来检测。通过将未处理细胞取作最大值0以及将不含细胞情况(只有珠)取作背景来计算IC5。
磷脂酰肌醇3-激酶活性
PKI3活性可例行地确定，例如，使用商业上可获得的试剂盒(例如，Perkin-Elmer，FlashPlate平台)，Frew等Anticancer Res.，14(6B)：2425-8，1994。还可参见，PKI3抑制剂下列举的出版物。
Akt活性
AKT可如在WO 05011700中描述从表达His-标记AKT1(aa 136-480)的昆虫细胞中分离出来。表达细胞使用Polytron(5ml溶解缓冲液/g细胞)在25mMHEPES，100mM NaCl，20mM咪唑(pH 7.5)溶解。细胞碎片经28,000xg离心30分钟后去除。上清液通过4.5微米滤膜滤过，然后装在预先用溶解缓冲液平衡过的镍螯合性柱上。柱子用5倍柱体积(CV)的溶解缓冲液洗涤，然后用5CV的20％缓冲液B洗涤，其中缓冲液B是25mMHEPES，100mMNaCl，300mM咪唑；pH 7。His-标记的AKT1(aa 136-480)用10CV 20-100％线性梯度的缓冲液B洗脱。将His-标记的AKT1(136-480)洗脱级分集中并用缓冲液C三倍稀释，其中缓冲液C是25mMHEPES，pH7。样品然后通过用缓冲液C预先平衡过的Q-琼脂糖HP柱进行层析。柱子用5CV缓冲液C洗涤，然后用5CV 10％D、5CV 20％D、5CV 30％D、5CV 50％D和5CV的100％D分步洗脱；其中缓冲液D是25mMHEPES，1000mMNaCl；pH7.5。
含有His-标记的AKT1(aa 136-480)的级分被集中，并在10-kDa分子量筛截浓缩器中浓缩。His-标记的AKT1(aa 136-480)通过用25mM HEPES、200mMNaCl、1mM DTT(pH 7.5)预先平衡过的Superdex 75凝胶过滤柱进行层析。His-标记的AKT1(aa 136-480)级分使用SDS-PAGE和质谱法检测。蛋白质被集中、浓缩，并在80℃储藏。
His-标记的AKT2(aa 138-481)和His-标记的AKT3(aa 135-479)可以相似方式被分离并纯化。
AKT酶测定化合物可在底物磷酸化测定中被测试AKT蛋白丝氨酸激酶抑制活性。该测定检测小分子有机化合物抑制肽底物的丝氨酸磷酸化作用的能力。底物磷酸化测定使用AKT 1、2或3的催化结构域。AKT 172和3也可从UpstateUSA，Inc通过商业途径获得。该方法测量分离的酶催化y-磷酸从ATP转移到生物素化合成肽(生物素-ahx-ARKRERAYSFGHHA-酰胺)丝氨酸-72残基上的能力。底物磷酸化可通过在WO 05011700中描述的步骤检测。
在384孔U-底白板上进行测定。10nM活化的AKT酶于室温下以含有50mM MOPS，pH 7.5，20mM mgCl2，4uM ATP 8uM肽，0.04uCi[g-33P]ATP/孔，1mM CHAPS，2mM DTT和1μl于100％DMSO中的试验化合物的20ul测定体积培育40分钟。通过加入50μl SPA珠混合物(不含mg2+和Ca2+的Dulbecco′sPBS，0.1％Triton X-100，5mM EDTA，50μM ATP 2.5mg/ml抗生物素蛋白链菌素包覆的SPA珠)使反应停止。将板密封，使珠静置过夜，然后将板在PackardTopcount微量反应板闪烁计数器(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)上计数。
剂量响应数据可以％对照(用数据还原公式100*(U1-C2)/(C1-C2)计算出)对化合物浓度(其中U是未知值，C1是对DIVISO获得的平均对照值，以及C2是对0.1MEDTA获得的平均对照值)绘图。将数据拟合y＝((Vmax*x)K+x))描述的曲线，其中Vmax是上渐进线，而K是IC50。
细胞增殖
细胞增殖测定的例子在下列实施例中描述。然而，增殖测定可通过任何适合的方法进行。例如，乳腺癌细胞增殖测定可按如下步骤进行。其它细胞类型可替代MDA-MB-231细胞系。
人类乳腺癌细胞(MDAMB-231，NCI)在添加了10％热灭活FBS的标准培养基(DMEM)中，在37℃、5％CO2(vol/vol)中在增湿的培养箱中培养。细胞以3000细胞/每孔的密度在90μl生长培养基中涂敷于96孔培养皿。为了测定T0hCTG值，涂敷24小时后，将100μl的CellTiter-Glo荧光试剂(Promega)加入每个孔中并且在室温培养30分钟。在Wallac Victor II仪器上记录荧光。CellTiter-Glo荧光试剂导致细胞溶解和与存在的ATP量成比例的荧光信号生成，该信号是直接与存在细胞的数量成正比的。
试验化合物溶于100％DMSO以制备10mM储备液。储备液进一步在生长培养基中1∶400稀释，以在0.25％DMSO里产生25μM试验化合物的工作储备液。试验化合物在生长培养基中连续稀释，所述生长培养基含有0.25％DMSO以在所有孔中保持恒定的-DMSO浓度。60μL稀释的试验化合物添加到每个培养孔中以达到180μL的最终体积。具有和没有各个试验化合物的细胞培养72小时，此时分别测量ATP荧光，如前面所述，产生T72h值。任选地，IC50值可使用化合物浓度对百分比抑制值以最小二乘法分析程序来确定。
％抑制＝[1-(T72h试验组-T0h)/(T72h对照组-T0h)]×100，其中
T72h试验组＝在试验化合物存在下在72小时的ATP依赖性发光
T72h对照组＝在没有试验化合物存在下在72小时的ATP依赖性发光
T0h＝在时间为0时的ATP依赖性发光
血管生成
一个研究血管生成的有用模型是如下的观察结果：当将补充有生长因子(如FGF-1)的经重构的(reconstituted)基膜基质例如Matrigel皮下注入宿主动物时，内皮细胞被召集进入所述基质，在数天后形成新血管。参见，例如，Passaniti等，Lab.Invest.，67：519-528，1992。通过在不同时间采样提取物，血管生成可暂时阻断，从而能识别涉及所有血管生成阶段的基因，所述阶段包括例如内皮细胞迁移进入基质，内皮细胞调配至血管生成路径，细胞伸长和囊样空间的形成，和包含含红细胞的被连接的线性结构的功能毛细管的建立。为了稳定生长因子和/或减缓它从基质的释放，可使生长因子与肝素或另一稳定剂结合。基质还可周期性地再注入以生长因子，以便提高和延伸血管生成进程。
其它研究血管生成的有用***，包括，例如，肿瘤外植物的新血管形成(例如，美国专利Nos.5,192,744；6,024,688)、鸡绒毛膜(CAM)测定(例如，Taylor和Folkman，Nature，297：307-312，1982；Eliceiri等，J.Cell Biol.，140，1255-1263，1998)、牛毛细管内皮(BCE)细胞测定(例如，美国专利No.6,024,688；Polverini，P.J.等，Methods Enzymol.，198：440-450，1991)、迁移测定、HUVEC(人类脐带血管内皮细胞)生长抑制测定(例如，美国专利No.6,060,449)。
本发明提供一个或多个下列特征。
一种治疗任意上述疾病和/或病症的方法，包括施予有效量的式I化合物和作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物。
一种调节(例如，抑制)一种或多种上述活性的方法，包括施予有效量的式I化合物和作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物。
包含式I化合物和作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物的组合。
无需进一步的详细描述，相信本领域技术人员能够利用上述说明以最充分的程度利用本发明。下列优选的特定实施方式，因而将被理解为仅仅是说明性的，并且不是以任何方式限制所述公开的其余部分。在上面和下面引述的所有专利和出版物的完整公开以其全文并入本文。

Claims (16)

1.一种组合，包含
式I化合物
Figure A20068001851700021
或其药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂化物、水合物、代谢产物或药物前体形式，和至少一种作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物。
2.如权利要求1所述的组合，其中所述的第二化合物是塞来考昔、OSU-03012、OSU-03013、PX-316、2′-取代3′-去氧-磷脂酰基-myo-肌醇衍生物、3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)衍生物、Ly294002、IC486068、3-(杂)芳氧基取代的苯并(b)噻吩衍生物、PX-866、哌立福辛、曲西立滨、FKBP12增强剂、磷脂酰肌醇醚脂质类似物、渥曼青霉素或雷帕霉素或其衍生物，或其药学上可接受的盐。
3.如权利要求1所述的组合，其中所述的第二化合物是式W的渥曼青霉素化合物：
Figure A20068001851700022
式W渥曼青霉素化合物的衍生物或类似物、式W渥曼青霉素化合物的药学上可接受的盐、或式W渥曼青霉素化合物的衍生物或类似物的药学上可接受的盐。
4.如权利要求3所述的组合，其中所述的式W的衍生物或类似物选自a)式W1化合物
Figure A20068001851700031
其中R是H(11-脱乙酰氧基渥曼青霉素)或乙酰氧基，和R′是C1-C6烷基，
b)式W2的Δ9，11-去氢脱乙酰氧基渥曼青霉素化合物
Figure A20068001851700032
其中R′是C1-C6烷基，
c)式W3的17(α-二氢-渥曼青霉素化合物
Figure A20068001851700033
其中R是H或乙酰氧基，和R′是C1-C6烷基，和R″是H、C1-C6烷基、-C(O)OH或-C(O)O-C1-C6烷基；
d)式W4的渥曼青霉素化合物的开A-环酸或酯
Figure A20068001851700034
其中R1是H、甲基或乙基，和R2是H或甲基，或
e)式W5的渥曼青霉素11-取代和17-取代衍生物
其中R4是＝O或-O(CO)R6，R3是＝O、-OH或-O(CO)R6，每个R6独立地是苯基、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，其中R4是＝O或-OH，R3不是＝O。
5.如权利要求1所述的组合，其中所述的第二化合物是Akt-激酶抑制剂。
6.如权利要求1所述的组合，其中所述的第二化合物是Akt-1-1、Akt-1-1，2、API-59CJ-Ome、1-H-咪唑并[4，5-c]吡啶基衍生物、吲哚-3-甲醇及其衍生物、哌立福辛、磷脂酰肌醇醚脂质类似物、曲西立滨或其药学上可接受的盐。
7.如权利要求1所述的组合，其中所述的第二化合物是mTOR抑制剂。
8.如权利要求1所述的组合，其中所述的第二化合物是雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、AP23573、AP23675、AP23464、AP23841、40-(2-羟乙基)雷帕霉素、40-[3-羟基(羟甲基)丙酸甲酯]-雷帕霉素、40-表-(四唑基)-雷帕霉素、32-脱氧代雷帕霉素、或16-戊炔基氧基-32(S)-二氢雷帕霉素、SAR 943或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求1所述的组合，包含式(I)化合物和渥曼青霉素。
10.如权利要求1所述的组合，包含式(I)化合物和雷帕霉素。
11.如权利要求1-10任意一项所述的组合，其中组合中活性成分的量是增效的。
12.如权利要求1-11任意一项所述的组合，其用于治疗癌症。
13.如权利要求12所述的组合，其中所述的癌症是黑素瘤、肝细胞癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、***癌、结肠直肠癌、乳腺癌或胰腺癌。
14.一种治疗需要治疗的受试者癌症的方法，包括施予有效量的式I化合物
Figure A20068001851700051
或其药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂化物、水合物、代谢产物或药物前体，和作为PI3K/AKT信号传导路径抑制剂的第二化合物。
15.制造用于治疗癌症的权利要求1-11任意一项所述的组合的方法。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述的癌症是黑素瘤、肝细胞癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、***癌、结肠直肠癌、乳腺癌或胰腺癌。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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