CN101250508A - 蜂王胶分解酶含有物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蜂王胶分解酶含有物、蜂王胶分解酶、蜂王胶分解物和蜂王胶的分解方法。所述蜂王胶分解酶含有物通过包括下述工序的方法由西方蜜蜂(Apis mellifera)的2～3日龄蜂王幼虫制备：(a)在6℃以下对所述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即白色固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序；以及(b)回收所述中层作为蜂王胶分解酶含有物的工序。所述蜂王胶分解酶的特征在于，包含在所述蜂王胶分解酶含有物中。所述蜂王胶分解物使用所述蜂王胶分解酶含有物或所述蜂王胶分解酶制备。所述蜂王胶的分解方法的特征在于，使用所述蜂王胶分解酶含有物或所述蜂王胶分解酶。

Description

蜂王胶分解酶含有物
技术领域
本发明涉及由西方蜜蜂(Apis mellifera)的2～3日龄蜂王幼虫制备的蜂王胶分解酶含有物、上述蜂王胶分解酶含有物中所含有的蜂王胶分解酶、以使用上述蜂王胶分解酶含有物或上述蜂王胶分解酶进行制备为特征的蜂王胶分解物、以及使用上述蜂王胶分解酶含有物或上述蜂王胶分解酶的蜂王胶的分解方法。
背景技术
蜂王胶是为了使蜂王幼虫生长，工蜂从咽下腺和上颚(mandible)腺分泌的乳白色胶状的营养物质。由于蜂王与工蜂在遗传上是同质的，因此认为蜂王胶中包含某些诱导向蜂王分化的控制因子，但上述物质尚未明确。上述控制因子以及向蜂王分化的诱导机理的阐明对于提高蜂王的人工生产效率等是有用的，因此正由世界上的研究者进行研究。
蜂王胶根据蜂群、品种、蜜蜂采花蜜或花粉等的花的种类等而变化，但是通常鲜重的约2/3为水分，且以蛋白质、糖类和脂肪酸为主要成分。此外，也含有大量的维生素或矿物质等，营养价值非常优异。此外，虽然未在科学上得到证实，但是一直认为具有疲劳恢复作用、抗过敏作用、抗癌作用、免疫增强作用等大量的药理作用。因此，广泛用于营养辅助食品或药品原料。
近年，约占蜂王胶干燥重量的40％的蛋白质作为蜂王胶的主要生理活性物质而备受瞩目。特别是，大量报告了利用蜂王胶蛋白质分解物的生理活性的发明。例如，报告了(1)涉及感染防御机能增强剂的发明，其特征在于，含有作为有效成分的、通过蛋白酶分解蜂王胶中的蛋白质而得到的分子量为3000以下的肽(例如，参照专利文献1。)。上述发明是基于下述知识而提出的发明：即，通过蛋白酶产生的蜂王胶蛋白质分解物，与未分解的蜂王胶蛋白质相比，感染防御机能优异，而且粘度低且为水溶性，稳定性优异，所以容易添加到食品中以及口服摄取。此外，还报告了(2)涉及用胰蛋白酶处理蜂王胶原料而得到的具有血管紧张素转换酶抑制作用的蛋白分解物的发明(例如，参照专利文献2。)。
此外，作为涉及用作食品的蜂王胶分解物的发明，还报告了(3)低过敏原蜂王胶，该低过敏原蜂王胶为降低了过敏性的低过敏原蜂王胶，其特征在于，含有10-羟基癸烯酸和来自蜂王胶的肽性成分，所述肽性成分由分子量4.5kDa以下的成分构成(例如，参照专利文献3。)。上述发明是基于下述知识而提出的发明：即，通过蛋白质分解酶处理和使用β-甘露糖苷酶的糖分解酶处理，在来自蜂王胶的肽性成分中分解除去易引起过敏的分子量超过4.5kDa的成分，从而容易降低过敏性。
如此，对于蜂王胶分解物、特别是对蜂王胶蛋白质分解物所具有的各种各样的生理活性有很多报告，但是阐明具体的生理活性物质、以至其具体的作用机理的报告非常少。生理活性物质的特定和作用机理的阐明有助于蜜蜂的分化机理的阐明、对人等动物更有效的药品或机能性食品等的开发，所以强烈期望对蜂王胶分解物进行进一步的研究、研究。而且，为了有效地进行蜂王胶分解物的研究等，重要的是得到含有丰富的机能性肽等生理活性高的分解物的蜂王胶分解物。
专利文献1：日本特开平8-59499号公报
专利文献2：日本特开2005-255670号公报
专利文献3：日本特开2005-287411号公报
但是，以上述(1)方法为代表的现在使用的方法大多只是使用通用的蛋白酶等来适当地分解蜂王胶蛋白质而已。上述通用蛋白酶等由于不以蜂王胶作为本来的基质，因此在不适当的部位分解，有可能使本来有用的肽的机能失去活性。通过使用以蜂王胶作为基质的蛋白酶等，可以解决上述问题，但是尚未发现这种酶。
发明内容
本发明的目的在于，提供最佳的蜂王胶分解酶以及上述蜂王胶分解酶含有物，用于从蜂王胶中有效地得到机能性肽等生理活性高的分解物。
此外，本发明的目的在于，提供以使用上述蜂王胶分解酶含有物等进行制备为特征的蜂王胶分解物、以及使用上述蜂王胶分解酶含有物等的蜂王胶的分解方法。
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果认为，以蜂王胶为主食、且通过摄食蜂王胶来控制向蜂王分化的蜂王幼虫先天具有最适于分解蜂王胶的分解酶，从而，通过从蜂王幼虫的幼虫体液提取物中分离含有具有蜂王胶蛋白质的分解活性的酶的馏分来完成本发明。
即，本发明提供蜂王胶分解酶含有物，通过包括下述工序的方法由西方蜜蜂(Apis mellifera)的2～3日龄蜂王幼虫制备：
(a)在6℃以下对上述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序；
(b)回收上述中层作为蜂王胶分解酶含有物的工序。
此外，本发明提供蜂王胶分解酶含有物，其特征在于，上述离心处理为8000～12000×g、5分钟以上的离心处理。
此外，本发明提供蜂王胶分解酶含有物，通过包括下述工序的方法由西方蜜蜂的2～3日龄蜂王幼虫制备：
(a’)将上述蜂王幼虫用冰冷却生理盐水洗涤后过滤，从而制备体组织悬浮物的工序；
(b’)使用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释上述体组织悬浮物后，在10000×g、5℃下进行10分钟的离心处理，从而分离为三层，即固体上层、悬浮溶液中层、沉淀下层的工序。
(c’)回收上述中层作为蜂王胶分解酶含有物的工序。
此外，本发明提供蜂王胶分解物，使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶含有物制备。
此外，本发明提供蜂王胶分解物，通过使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到，并且，其具有下述特点：
(1)对神经细胞的非特异性的细胞变性作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比降低；
(2)对由淀粉样蛋白所诱导的神经细胞死亡的抑制作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相等；
(3)对神经胶质细胞的细胞增殖作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比增大；
(4)对人轮状病毒感染的感染抑制作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比增大。
此外，本发明提供抗氧化剂，将通过使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到的蜂王胶分解物作为有效成分。
此外，本发明提供细胞增殖剂，将通过使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到的蜂王胶分解物作为有效成分。
此外，本发明提供感染抑制剂，将通过使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到的蜂王胶分解物作为有效成分。
此外，本发明提供神经细胞死亡诱导抑制剂，将通过使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到的蜂王胶分解物作为有效成分。
此外，本发明提供蜂王胶的分解方法，其特征在于，使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶含有物。
此外，本发明提供蜂王胶分解酶，其特征在于，包含在上述任意一项记载的蜂王胶分解酶含有物中。
此外，本发明提供蜂王胶分解酶，其特征在于，酶活性的最佳pH为7或9。
此外，本发明提供蜂王胶分解物，使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶制备。
此外，本发明提供蜂王胶的分解方法，其特征在于，使用上述任意一项记载的蜂王胶分解酶。
通过本发明的蜂王胶分解酶含有物和蜂王胶分解酶，可以不损害蜂王胶中所含有的机能性肽等所具有的生理活性而将蜂王胶分解。
此外，通过本发明的蜂王胶分解酶含有物等分解的蜂王胶分解物由于含有丰富的生理活性高的机能性肽等，在蜂王胶的生理活性的研究、研究中，可以提供非常有效的样品。进一步地，通过使用本发明的蜂王胶分解物，可以提供与以往食用的含有蜂王胶的食品等相比，机能性和消化吸收性优异的食品等。
此外，通过本发明的蜂王胶分解方法，可以有效地分解蜂王胶。
附图说明
图1为对添加混合有蜂王胶蛋白质和含有蜂王胶分解酶的溶液的酶反应液在37℃下进行反应后，为了分离酶反应液中的蜂王胶蛋白质而进行SDS-PAGE的结果得到的染色像按照pH表示的图。图1A中pH为4、图1B中pH为5、图1C中pH为6、图1D中pH为6.5、图1E中pH为7、图1F中pH为7.5、图1G中pH为8、以及图1H中pH为9。各图的泳道上的数字表示各自的反应时间。此外，M表示分子量标记(marker)。箭头a表示约51kDa的带，箭头b表示约46kDa的带。
图2为对实施例1的SDS-PAGE结果按照pH表示的图。图2A为pH7的染色像、图2B为pH9的染色像。各图的泳道上的数字表示各自的反应时间、M表示分子量标记。箭头a表示约51kDa的带、箭头b表示约46kDa的带、箭头c表示约33kDa的带、以及箭头d表示约25kDa的带。
图3为在实施例1中对图2的染色像的带的强度进行测定，以反应开始时间0下的带强度为1，表示随着反应时间的推移带强度变化的图。图3A表示约51kDa的带的强度比，图3B表示约46kDa的带的强度比，图3C表示约33kDa和约25kDa的带的强度比。图3A和图3B中的●表示pH7的带，○表示pH9的带。此外，图3C中的△表示pH7下约33kDa的带，▲表示pH7下约25kDa的带。
图4为表示在实施例2中pH9的条件下分解蜂王胶蛋白质的结果的图。图4A表示由SDS-PAGE的结果得到的凝胶的染色像、图4B表示约46kDa的带的强度比。图4A中的泳道上的数字表示各自的反应时间、M表示分子量标记。此外，箭头a表示约51kDa、箭头b表示约46kDa。
图5为表示实施例3中测定的280nm的吸光度的结果的图。图5A为反应开始前的结果、图5B为反应开始后8小时的结果、图5C为反应开始后16小时的结果、以及图5D为反应开始后24小时的结果。此外，图中的箭头a表示约350kDa的蛋白质的馏分、箭头b表示约60kDa的蛋白质的馏分、箭头c表示约5kDa的蛋白质的馏分、箭头d表示约3kDa的蛋白质的馏分、以及范围e表示数百Da的蛋白质的馏分。
图6为实施例8的使用HiTrapTM Desalting色谱柱的柱色谱中，测定吸光度(280nm)和传导率的结果得到的图。实线表示蜂王胶分解物(pH9)的吸光度、虚线表示蜂王胶分解物(pH7)的吸光度、双点划线表示蜂王胶分解物(pH9)的传导率、点划线表示蜂王胶分解物(pH7)的传导率。图中，“D1”为作为馏分D1取出的馏分，“D2”为作为馏分D2取出的馏分。
图7为表示实施例8中使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图7A为添加含有馏分D1(pH9)的培养液时的结果，图7B为添加含有馏分D1(pH7)的培养液时的结果。图中，“NC”表示对照培养液、“PC”表示含有10％FCS的培养液。此外，各浓度表示各培养液中的来自馏分D1的蛋白质浓度。
图8为实施例9的使用Cosmosil(注册商标)5C18-AR色谱柱的柱色谱中，测定吸光度(215nm)和传导率的结果得到的图。实线表示馏分D2(pH9)的吸光度、虚线表示馏分D2(pH7)的吸光度、双点划线表示馏分D2(pH9)的传导率、点划线表示馏分D2(pH7)的传导率。图中，“C1(pH7)”为作为馏分C1(pH7)取出的馏分、“C1(pH9)”为作为馏分C1(pH9)取出的馏分、“C2(pH7)”为作为馏分C2(pH7)取出的馏分、“C2(pH9)”为作为馏分C2(pH9)取出的馏分。
图9为表示实施例9中使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图9A为添加含有馏分C1(pH9)的培养液时的结果，图9B为添加含有馏分C1(pH7)的培养液时的结果。图中，“NC”表示对照培养液、“PC”表示含有10％FCS的培养液。
图10为表示实施例9中使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图10A为添加含有馏分C2(pH9)的培养液时的结果，图10B为添加含有馏分C2(pH7)的培养液时的结果。图中，“NC”表示对照培养液。此外，各浓度表示各培养液中的来自馏分C2的蛋白质浓度。
图11为表示实施例10中各PBS样品溶液的BSA浓度结果的图。图11A为添加蜂王胶分解物时的结果、图11B为添加抗坏血酸时的结果、图11C为添加肌肽时的结果。
图12为表示实施例7中蜂王胶分解物的细胞增殖活性的图。图12A为在pH7下对蜂王胶分解酶含有物进行处理时的结果，图12B为在pH9下对蜂王胶分解酶含有物进行处理时的结果。
图13为表示实施例11中SDS-PAGE结果的图。箭头a表示约55kDa的带、箭头b表示约46kDa的带。
具体实施方式
本发明中的蜂王幼虫若为西方蜜蜂的2～3日龄的蜂王幼虫则不特别限定。可以为活着的新鲜幼虫或冷冻保存后的幼虫。由于认为蜂王胶(下文简称为RJ。)分解酶等的活性高，优选使用活着的新鲜幼虫。幼虫的冷冻保存可以通过常规方法进行，但是为了防止RJ分解酶失去活性，优选使用液氮等急速冷却后，在-80℃下保存。
本发明中的体组织悬浮物是指幼虫的体组织、主要是内脏和体液的悬浮物。对上述内脏等不特别限定，但是优选为幼虫个体的全部体组织的悬浮物。
由幼虫制备体组织悬浮物的方法若为通常由动物等制备组织悬浮液的方法则不特别限定。例如，可以使用筛等过滤幼虫的全部体组织或内脏或者体液，也可以使用研钵、混合器、均化器等制备。由于可以在缓和的条件下制备体组织悬浮物，优选使用筛等进行过滤。上述筛优选筛眼的尺寸为80目～120目。使用混合器等时，为了防止产生过量的热，优选添加生理盐水等进行。而且，为了防止混入杂质，幼虫优选在制备体组织悬浮物之前，在冷冻保存时在保存之前，预先用生理盐水等洗涤。
为了制备本发明的RJ分解酶含有物，首先，作为工序(a)，通过在6℃以下对蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，分离为白色固体的上层、黄白色混浊溶液的中层、含有白色到稍褐色的沉淀的下层三层。进行离心处理前，优选使用中性且低浓度的缓冲液等进行稀释，从而适当对体组织悬浮物的粘度或浓度进行调整。这是由于体组织悬浮物的粘性或浓度高时，有可能降低RJ分解酶的提取效率、使操作性恶化。作为上述缓冲液，例如有磷酸缓冲液(50mM、pH7.0)或生理盐水等。而且，推定上述上层为脂质成分、上述下层为体组织的不溶性成分。
对于上述离心处理的条件若可以将体组织悬浮物离心分离为三层则不特别限定，但是优选在8000～12000×g、6℃以下进行5分钟以上的离心处理。特别优选在10000×g、5℃下进行10分钟的离心处理。离心速度低的情况或者离心时间短的情况下，有可能不能顺利地分离为三层。
然后，作为工序(b)，将三层中的中层作为蜂王胶分解酶含有物进行回收，从而可以制备本发明的RJ分解酶含有物。上述回收方法可以通过常规方法进行。为了提高提取精度，优选在与工序(a)相同的条件下对上述中层再次进行离心处理。
在工序(b)之后，为了除去混入到上述中层中的不溶性的组织片等不溶物，优选对上述中层进行过滤。由于可以防止因微生物所导致的污染，优选在上述过滤中使用0.2μm的过滤器等。
而且，由于制备幼虫体液提取物或从幼虫体液提取物制备蜂王胶分解酶含有物中，幼虫体液提取物中所含有的酶有可能失去活性，离心处理优选在3～6℃下进行。此外，其它的操作优选在冰冷却下进行。
本发明的RJ分解物可以通过本发明的RJ的分解方法、即使用本发明的RJ分解酶含有物来制备。上述RJ可以为新鲜的RJ或将干燥粉末RJ还原得到的RJ。此外，上述RJ可以为任意产地的RJ，可以为任意蜂种产生的RJ。进一步地，上述RJ也可以为通过常规方法由RJ通过常规方法分离得到的蛋白质。特别优选为RJ的水溶性蛋白质。这是由于可以期待含有大量的具有生理活性的物质。
RJ的水溶性蛋白质的分离若为可以分离水溶性蛋白质和疏水性蛋白质的方法则可以使用任意方法。作为上述方法，例如有用乙酸乙酯或丁醇等有机溶剂对混合有水溶性溶剂和RJ的悬浮液进行分配处理而萃取纯化的方法、通过将上述悬浮液静置后进行离心处理得到上清液的方法等。
例如，可以通过向RJ或RJ的水溶性蛋白质中添加本发明的RJ分解酶含有物进行培养的方法制备RJ分解物。RJ等也可以预先使用磷酸缓冲液等进行稀释。此外，也可以使用用磷酸缓冲液等调节蛋白质浓度或粘度的RJ分解酶含有物。
上述培养的温度或时间，若为不抑制本发明的RJ分解酶含有物的RJ分解活性的条件则不特别限定，但是反应温度条件优选为30～40℃、特别优选为34～38℃。此外，pH优选为6.5～10，pH特别优选为7～9.5。在pH为7～7.5的反应条件下进行时，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中，约51kDa的位置上以带的形式表示的蛋白质主要被分解，在pH为8.5～9的反应条件下进行时，在SDS-PAGE中，约46kDa的位置上以带的形式表示的蛋白质主要被分解。
以下对本发明的RJ的分解方法进行更具体的说明。
首先，使用Lowry法以BSA为标准物质对通过后述实施例1中记载的方法制备的RJ分解酶含有物的蛋白质浓度进行测定后，使用pH7的50mM磷酸缓冲液进行稀释，由此制备6mg/mL的含有RJ分解酶的溶液。
接着，向8mL的缓冲液中添加1mL的通过后述参考例2中记载的方法制备的RJ蛋白质溶液(30mg/mL)和1mL的上述含有RJ分解酶的溶液(6mg/mL)，进行混合制备酶反应液。使上述酶反应液在37℃下反应，冰冷却、停止反应后，通过SDS-PAGE确认RJ蛋白质的变化。对于分离的RJ蛋白质使用CBB R-250染色。缓冲液分别使用pH为4、5和5.5的50mM的乙酸缓冲液，pH为6、6.5、7和7.5的50mM的磷酸缓冲液，pH8和pH9的50mM的Tri-HCl缓冲液。
图1为按照pH表示SDS-PAGE的结果的图。图1A中pH为4、图1B中pH为5、图1C中pH为6、图1D中pH为6.5、图1E中pH为7、图1F中pH为7.5、图1G中pH为8、以及图1H中pH为9。各图的泳道上的数字表示各自的反应时间。此外，M表示分子量标记。若将通过后述参考例2中记载的方法制备的RJ蛋白质溶液进行SDS-PAGE，在约51kDa和约46kDa的位置上检测出较强的带。箭头a表示约51kDa的带，箭头b表示约46kDa的带。结果可知，在pH6～9下RJ蛋白质通过由含有RJ分解酶的溶液进行的处理而减少，以及随着pH的增大分解速度加快。特别是，确认了在pH7～7.5的反应条件下，约51kDa的蛋白质主要被分解，在pH8.5～9的反应条件下，约46kDa的蛋白质主要被分解。即，由图1的结果可知，通过后述实施例1中记载的方法制备的RJ分解酶含有物中，含有分解RJ蛋白质的酶。此外，中性条件和碱性条件下通过上述RJ分解酶含有物进行的RJ蛋白质分解的图案不同，因此上述RJ分解酶含有物中至少含有两种分解酶。即，上述RJ分解酶含有物中含有酶活性的最佳pH为6.5～7.5、优选pH为7～7.5、更优选pH为7的RJ分解酶和酶活性的最佳pH为8～9、优选pH为9的RJ分解酶。
通过使用本发明的RJ分解酶含有物，在pH9下对RJ优选进行2小时以上、更优选4小时以上、更进一步优选4小时～30小时、特别优选4小时～24小时的酶处理而得到的RJ分解物具有各种生理活性。上述生理活性，与未进行酶处理的RJ水溶性馏分所具有的生理活性相比，具有几个特征。
例如，上述RJ分解物，对于由淀粉样蛋白所诱导的神经细胞死亡的抑制作用，与未进行酶处理的RJ水溶性馏分相等，但是对于神经细胞的非特异性的细胞变性作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比降低。更具体地说，蛋白质浓度为30～125μg/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时的神经细胞存活率，与相同蛋白质浓度的未进行酶处理的RJ水溶性馏分和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时的神经细胞存活率大致相同，即两者之比(RJ分解物/未进行酶处理的RJ水溶性馏分)为1左右，优选为0.9～1.1。另一方面，蛋白质浓度为60～1000μg/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时，与相同蛋白质浓度的未进行酶处理的RJ水溶性馏分和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时相比，减少呈现出细胞变形的神经细胞数目。
此外，上述RJ分解物对于神经胶质细胞的细胞增殖作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比增大。更具体地说，蛋白质浓度为60～1000μg/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时，与相同蛋白质浓度的未进行酶处理的RJ水溶性馏分和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时相比，神经胶质细胞数目增加。
此外，上述RJ分解物对于人轮状病毒感染的感染抑制作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比增大。更具体地说，在人轮状病毒和上述RJ分解物的存在下进行细胞培养时，与在人轮状病毒和未进行酶处理的RJ水溶性馏分存在下进行细胞培养时相比，轮状病毒感染细胞数目减少。
通过使用本发明的RJ分解酶含有物，在pH9下对RJ进行优选2小时以上、更优选4小时以上、更进一步优选4小时～30小时、特别优选4小时～24小时的酶处理而得到的RJ分解物也具有抗氧化活性。因此，上述RJ分解物可以用作抗氧化剂。例如，上述RJ分解物通过其抗氧化活性可以抑制由于一氧化氯(ClO·)等自由基所导致的蛋白质分解。RJ由于自古以来为摄食的食品，所以上述RJ分解物也非常安全，与抗坏血酸等同样地，可以期待用作添加到饮食品中的抗氧化剂或者以保护生物体不受氧化应激为目的而摄食的增补剂的有效成分等。
通过使用本发明的RJ分解酶含有物，在pH9下对RJ进行优选2小时以上、更优选4小时以上、更进一步优选4小时～30小时、特别优选4小时～24小时的酶处理而得到的RJ分解物由于具有上述生理活性，所以可以作为抗氧化剂、细胞增殖剂、(病毒)感染抑制剂、诱导神经细胞死亡抑制剂等的有效成分而存在。上述细胞增殖剂中的上述RJ分解酶含有物的蛋白质浓度优选为0.5mg/ml～1mg/ml。这些生理活性剂可以作为增补剂等饮食品单独摄食，也可以与其它的饮食用组合物或药用组合物同样地用作饮食品或药品中的添加剂。
将上述RJ分解物作为有效成分的这些生理活性剂的制备方法若为不抑制上述RJ分解物的生理活性的方法则不特别限定，通常可以使用制备含有RJ或RJ分解物的饮食用组合物或药用组合物时所使用的方法进行制备。对这些生理活性剂的剂型不特别限定，但是优选为适于口服剂的剂型。例如，可以为软胶囊剂、硬胶囊剂、片剂或糖浆剂等。此外，这些生理活性剂中所含有的上述RJ分解物量若为上述RJ分解物的生理活性可以发挥作用效果的量则不特别限定，可以考虑作为原料的RJ的种类、所需的上述RJ分解物的生理活性、剂型等来适当决定。
将上述RJ分解物作为有效成分的这些生理活性剂的摄取量若为上述RJ分解物的生理活性可以发挥作用效果的量则不特别限定，可以根据摄取的人或动物的体重、年龄、性别等来适当决定。例如，优选每天1次或分成数次摄取300mg～3g。
实施例
以下举出实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明并不限定于以下实施例。
[参考例1]幼虫悬浮物的制备
采集约15g的3日龄西方蜜蜂的蜂王幼虫后，用冰冷却的生理盐水洗涤。然后，通过使用聚酯制的平均100目的布(“テトロン”、东レ社制)过滤蜂王幼虫，破坏幼虫的表皮，榨出体液和内脏。由此制备乳白色的幼虫悬浮物。
[参考例2]RJ蛋白质溶液的制备
向RJ(中国产：浙江省江山恒亮蜂产品有限公司制)10ml中加入pH7.0的50mM磷酸缓冲液20mL进行混合，制备RJ稀释溶液。将上述RJ稀释溶液在25000×g、5℃下离心20分钟后，除去不溶性成分，回收上清液。然后，用pH7.0的50mM磷酸缓冲液稀释上述上清液，制备30mg/mL的RJ蛋白质溶液。
[实施例1]
1.RJ分解酶含有物的制备
将通过参考例1中记载的方法制备的幼虫悬浮物用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释2倍后，在10000×g、5℃下离心10分钟。通过上述离心处理，分离为白色固体的上层、黄白色混浊溶液的中层、含有白色到稍褐色的沉淀的下层三层。推定上述上层为脂质成分、上述下层为不溶性的体组织等。回收上述中层后，进一步在10000×g、5℃下离心10分钟分离成三层，回收中层作为RJ分解酶含有物。对于上述RJ分解酶含有物，为了除去未除尽的不溶性组织片且进行灭菌，使用0.2μm的纤维素乙酸酯类过滤器(DISMIC-25CS、ADVANTEC公司制)进行过滤。由此，得到黄色透明的RJ分解酶含有物。
2.RJ蛋白质的分解
使用Lowry法以BSA为标准物质对上述RJ分解酶含有物的蛋白质浓度进行测定，使用pH7的50mM磷酸缓冲液制备3mg/mL的含有RJ分解酶的溶液。
向8mL的缓冲液中添加1mL的通过上述参考例2中记载的方法制备的RJ蛋白质溶液(30mg/mL)和通过上述实施例1中记载的方法制备的1mL的含有RJ分解酶的溶液(6mg/mL)，进行混合制备酶反应液。上述缓冲液使用pH7的50mM的磷酸缓冲液或者pH9的50mM的Tri-HCl缓冲液。使上述酶反应液在37℃下反应，冰冷却、停止反应后，通过SDS-PAGE分离RJ蛋白质。干燥使用CBB R-250染色的凝胶后，使用荧光扫描仪Typhoon9400(アマシヤムバイオサイエンス社制)得到染色像。
图2为按照pH表示SDS-PAGE的结果的图。图2A为pH7的染色像、图2B为pH9的染色像。各图的泳道上的数字表示各自的反应时间、M表示分子量标记。箭头a表示约51kDa的带、箭头b表示约46kDa的带、箭头c表示约33kDa的带、以及箭头d表示约25kDa的带。其结果，确认了在pH7和pH9两者下，约51kDa和约46kDa的蛋白质被分解。特别是可知，在pH9下，在反应开始后4小时的短时间内，约46kDa的蛋白质被分解成无法检测出的程度。此外，在pH7下，随着反应时间的推移，检测出约33kDa和约25kDa的蛋白质。
使用图像分析软件Image Quant(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)，对图2的染色像的各带的带强度进行定量。图3以反应开始时间0下的带强度为1，表示了随着反应时间的推移带强度的变化。图3A表示约51kDa的带的强度比，图3B表示约46kDa的带的强度比，图3C表示约33kDa和约25kDa的带的强度比。图3A和图3B中的●表示pH7的带，○表示pH9的带。此外，图3C中的△表示pH7下约33kDa的带，▲表示pH7下约25kDa的带。
如图3A和图3B所示，可以定量地确认在pH7和pH9两者下，约51kDa和约46kDa的蛋白质被分解。此外，由图3C的结果确认了在pH7下，直至反应开始后16小时，约33kDa和约25kDa的蛋白质增加。该结果暗示了约33kDa和约25kDa的蛋白质有可能是约51kDa或约46kDa的蛋白质通过含有RJ分解酶的溶液中所含有的RJ分解酶分解得到的分解物。
[实施例2]
除了使反应时间为60分钟之外，全部与实施例1的pH9条件下的反应同样地操作，分解RJ蛋白质，通过SDS-PAGE分离RJ蛋白质，对各带的强度进行定量。图4A表示凝胶的染色像、图4B表示约46kDa的带的强度比。图中的泳道上的数字表示各自的反应时间、M表示分子量标记。此外，箭头a表示约51kDa、箭头b表示约46kDa。
结果确认了约46kDa的蛋白质通过含有RJ分解酶的溶液中所含有的RJ分解酶，在反应开始后1小时的短时间内分解大约80％。而且，由图4B可知，在反应开始后5分钟的时刻得到了几乎未产生分解的结果，但是推测这是因为在开始由RJ分解酶进行酶反应之前，在37℃下不预先培养RJ蛋白质溶液，因此直至开始酶反应发生了时间滞后。
[实施例3]
除了使反应时间为24小时之外，全部与实施例1的pH7条件下的反应同样地操作，分解RJ蛋白质。然后，对冰冷却、停止反应的酶反应液使用Super dex 200HR 10/30(フアルマシア社制)实施凝胶渗透色谱法，分离上述酶反应溶液中所含有的蛋白质。凝胶渗透色谱，使用含有0.15M氯化钠的50mM的磷酸缓冲液(pH7)作为洗脱液，在流速0.5mL/min，5℃的条件下进行。为了检测分离的蛋白质，使用UV检测器测定280nm的吸光度。
图5为表示实施例3中测定的280nm的吸光度结果的图。图5A为反应开始前的结果、图5B为反应开始后8小时的结果、图5C为反应开始后16小时的结果、以及图5D为反应开始后24小时的结果。此外，图中的箭头a表示约350kDa的蛋白质的馏分、箭头b表示约60kDa的蛋白质的馏分、箭头c表示约5kDa的蛋白质的馏分、箭头d表示约3kDa的蛋白质的馏分、以及范围e表示数百Da的蛋白质的馏分。
由图5的结果可知，随着反应时间的推移，约350kDa和约60kDa的蛋白质减少的同时，约5kDa、约3kDa以及数百Da的蛋白质增加。由此推测增加的约5kDa等的蛋白质为约350kDa等的蛋白质的分解物。换而言之，由通过凝胶渗透色谱分离的结果可以确认，通过本发明的RJ分解酶含有物，RJ的高分子蛋白质被分解。
[实施例4]
与参考例2同样地制备RJ蛋白质溶液(30mg/mL)。此外，除了使稀释后的浓度为3mg/mL之外全部与实施例1同样地操作制备了含有RJ分解酶的溶液(3mg/mL)。
向8mL的缓冲液中添加1mL的上述RJ蛋白质溶液(30mg/mL)和1mL的上述含有RJ分解酶的溶液(3mg/mL)，进行混合制备了酶反应液。上述缓冲液使用pH7的50mM的磷酸缓冲液或者pH9的50mM的Tri-HCl缓冲液。使上述反应液分别在4、20、37以及50℃下反应，冰冷却、停止反应。将在各温度的恒温槽中混合上述酶反应液的时刻作为反应开始时刻，使反应时间为4、16、24小时。通过对冰冷却后的上述酶反应液与实施例1同样地分离RJ蛋白质，观察反应温度的影响。
其结果，在37℃下与实施例2同样地，在pH7和pH9两者下，观察到约51kDa和约46kDa的蛋白质的分解。特别是在pH9下，在反应开始4小时的时刻约46kDa的蛋白质被分解至检测限以下，约51kDa的蛋白质在反应开始16小时的时刻也被分解至检测限以下。
与此相对地，4℃下、在pH7和pH9两者下，几乎未观察到约51kDa和约46kDa的蛋白质的分解。20℃下与37℃的情况相比，虽然分解反应进行缓慢，但是观察到约51kDa和约46kDa的蛋白质的分解。另一方面，50℃下，与37℃相比分解反应进一步加快，在pH7和pH9两者下，确认了在反应开始4小时的时刻大部分的蛋白质被分解。
总之可知，在20～50℃的温度范围内，本发明的RJ分解酶含有物可以分解RJ，以及在上述温度范围内，温度越高则通过本发明的RJ分解酶含有物进行的RJ的分解反应越快。但是，通常在50℃下，有可能引起RJ的发褐或RJ蛋白质的变性等。因此，通过本发明的RJ分解酶含有物分解RJ时，优选在37℃附近温度下进行。
[实施例5]
研究了使用本发明的RJ分解酶含有物得到的RJ分解物所具有的针对脑神经细胞的生理活性。具体地说，研究了针对初代培养的小鼠胚胎海马神经细胞的、由淀粉样蛋白诱导的神经细胞死亡的RJ分解物的影响。而且，小鼠胚胎海马神经细胞是在37℃、5％CO2气氛下，将通过常规方法从小鼠胚胎中采取的海马神经细胞以4.0×104cells/well接种在培养了神经胶质细胞的96孔多孔板上，从而进行培养。作为细胞培养液，使用含有B27增补剂的ニユ一ロバ一サルメデイウム(ギブコ社制)。实验中使用培养后经过一周后的细胞。
首先，向RJ(中国产：浙江省江山恒亮蜂产品有限公司制)5mL中加入pH7.0的50mM磷酸缓冲液15mL进行混合，制备RJ稀释溶液。将上述RJ稀释溶液在25000×g、5℃下离心20分钟后，除去不溶性成分，回收上清液。然后，通过将上述上清液冷冻干燥，得到RJ水溶性粗馏分。使用pH7.0的50mM磷酸缓冲液稀释上述RJ水溶性粗馏分，制备30mg/mL的RJ水溶性粗馏分溶液。
然后除了使用上述RJ水溶性粗馏分溶液来替代通过上述参考例2中记载的方法制备的RJ蛋白质溶液、以及使反应时间为4小时之外，全部与实施例1同样地操作，分解上述RJ水溶性粗馏分溶液中所含有的RJ蛋白质，得到RJ分解物。
向培养小鼠胚胎海马神经细胞的96孔多孔板中添加淀粉样蛋白肽(ペプチド研究所制)和RJ水溶性粗馏分溶液或RJ分解物后，培养48小时。淀粉样蛋白肽以2mg/mL的浓度在37℃下保温48小时后，添加成最终浓度为20μg/mL。此外，RJ水溶性粗馏分溶液、pH7下分解得到的RJ分解物、或者pH9下分解得到的RJ分解物添加成各蛋白质的细胞培养液中的最终浓度分别为0、31.25、62.5、125、250、500或1000μg/mL。作为对照使用不添加淀粉样蛋白肽和RJ分解物等的任意一种、添加等量的细胞培养液而得到样品。
然后，通过使用了抗Map2抗体(Sigma公司制、Cat No.B2261)的免疫染色或赫希斯特(Hoechst)33342色素(Sigma公司制、Cat No.M4403)染色识别死亡细胞，分别对各培养皿中的小鼠胚胎海马神经细胞的存活数目、神经胶质细胞的存活数目进行测定。进一步地，通过显微镜观察对观察到细胞变形的小鼠胚胎海马神经细胞数目进行测定。而且，细胞变形是指神经细胞从具有树突的细胞体和轴突构成的神经细胞特有的形态发生变化。上述变化中，例如有，形成突起、轴突的萎缩、多轴突化、神经细胞之间的凝聚、神经细胞的死亡等。
[表1]
  蛋白质浓度(μg/mL)   0   31.25   62.5   125   250   500   1000
  RJ水溶性粗馏分溶液
  存活神经细胞(％)   43   44   55   61   48   10   3
  变性神经细胞(％)   57   56   45   59   52   90   97
  神经胶质细胞(％)   100   99   110   113   98   96   85
  pH7下分解得到的RJ分解物
  存活神经细胞(％)   43   41   57   58   9   3   4
  变性神经细胞(％)   57   59   43   42   91   97   96
  神经胶质细胞(％)   100   102   108   103   103   93   80
  pH9下分解得到的RJ分解物
  存活神经细胞(％)   43   43   60   64   59   36   31
  变性神经细胞(％)   57   57   40   36   41   64   69
  神经胶质细胞(％)   100   101   110   123   120   103   100
表1表示小鼠胚胎海马神经细胞数目等的测定结果。存活神经细胞数目和变性神经细胞数目以对照样品的神经细胞数目为100％表示，此外，神经胶质细胞数目以对照样品的神经胶质细胞数目为100％表示。若向初代培养的小鼠胚胎海马神经细胞中添加淀粉样蛋白肽，则约60％的神经细胞死亡，存活率约为40％。若同时添加淀粉样蛋白肽和RJ水溶性粗馏分溶液，则RJ水溶性粗馏分溶液容量依赖性地抑制由淀粉样蛋白诱导的神经细胞死亡。最大存活率恢复至60～70％。RJ水溶性粗馏分溶液带来的上述效果在62.5～250μg/mL的低浓度下也被认可。但是，若添加1000μg/mL以上的RJ水溶性粗馏分溶液，则观察到非特异性的神经细胞变形作用。
添加在pH7下分解得到的RJ分解物时，观察到与添加RJ水溶性粗馏分溶液时大致相同的效果。另一方面，添加在pH9下分解得到的RJ分解物时，也与RJ水溶性粗馏分溶液同样地观察到由淀粉样蛋白诱导的神经细胞死亡的抑制效果。进一步地，与RJ水溶性粗馏分溶液等相比，降低非特异性的神经细胞变形作用，提高对神经胶质细胞的细胞增殖作用。推测这是因为促进神经胶质细胞等的增殖的结果，更好地发挥神经保护效果，因此降低RJ水溶性粗馏分溶液所具有的非特异性神经细胞变形作用。
由表1的结果可知，使用本发明的RJ分解酶含有物、在pH9下进行4小时以上的酶处理而得到的RJ分解物具有下述特征：对于由淀粉样蛋白所诱导的神经细胞死亡的抑制作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分大致相同；对于神经细胞的非特异性的细胞变性作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比显著降低；且对于神经胶质细胞的细胞增殖作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比提高。
[实施例6]
为了研究使用本发明的RJ分解酶含有物得到的RJ分解物所具有的、针对人轮状病毒感染的感染抑制活性，进行中和活性试验。具体地说，通过以下记载的方法，向来自恒河猴胚胎肾脏的MA104细胞的细胞培养液中同时添加人轮状病毒和RJ或RJ分解物，由此观察RJ分解物对于人轮状病毒感染的影响。
作为上述RJ，使用与实施例4同样地操作制备的RJ水溶性粗馏分溶液。
作为上述RJ分解物，使用除了使反应温度为37℃、反应时间为24小时之外，全部与实施例4同样地操作，在pH7下分解得到的RJ分解物、或者在pH9下分解得到的RJ分解物。
上述MA104细胞在37℃、5％CO2气氛下培养。继代后3天期间，作为细胞增殖用培养液，使用向含有10％FCS(胎牛血清：SIGMA公司制)和10％TPB(胰蛋白磷酸盐肉汤：DIFCO公司制)的Eagle’s MEM培养基(日水制药社制)中添加若干量的抗生素等得到的培养液。继代第3天以后，除了将10％FCS替代为2％FCS之外，使用与上述细胞增殖用培养液相同组成的培养液作为细胞维持用培养液。
作为上述若干量的抗生素等，使用1％青霉素链霉素(使用将100万单位/瓶的青霉素G钾(万有制药株式会社制)1瓶和1g(效价)/1瓶的硫酸链霉素(明治制菓株式会社制)1瓶用灭菌PBS(-)定量至100ml后，用过滤器灭菌过滤得到的青霉素链霉素)和1％两性霉素B(三共株式会社制)。
中和活性试验
首先，在24cm2TC培养瓶中以5.0×105cells/flask接种，并在37℃下培养5天得到单层的MA104细胞，用添加有0.025％EDTA的0.125％胰蛋白酶溶液将上述MA104细胞剥离，进行离心分离后，除去上清液，以2×105cells/ml加入细胞增殖用培养液制备细胞悬浮液。向该细胞悬浮液中添加人轮状病毒溶液(宫城县癌症中心、海老名卓三郎氏受让的人轮状病毒MO株(血清型3)：保持在-80℃下直至使用时)和RJ水溶性粗馏分溶液或RJ分解物。然后，在24孔载玻片上分别各注入20μl，37℃下培养22小时。
对于上述人轮状病毒溶液，通过预先用胰蛋白酶溶液在37℃下进行30分钟预培养使其活化，添加至最终浓度为6.5×104FCFU/mL。
此外，对于上述RJ水溶性粗馏分溶液和上述RJ分解物(pH7下分解得到的RJ分解物或pH9下分解得到的RJ分解物)，分别在37℃下进行预培养后，分别添加至各蛋白质的细胞培养液中的最终浓度为表2记载的浓度。
作为对照使用添加等量的细胞培养液来替代上述RJ分解物等的样品。
然后用抽吸器除去培养液，向各孔中各加入20μl的已灭菌的去离子蒸馏水，对残留在载波片上的盐类进行洗涤、风干后，在冷丙酮中浸渍20分钟进行固定，再次进行风干，保持在-30℃下直至测定。
然后，作为一次抗体，将特异性地识别鸽轮状病毒株PO-13的VP6的P3-1(歧阜大学应用生物科学部兽医学科兽医公众卫生讲座受让的抗体)稀释成5000倍得到的样品放置在固定的细胞上，在暗湿润箱中37℃下使其致敏45分钟后，用PBS(-)振荡洗涤3、5和7分钟。
然后，作为二次抗体，放置FITC标记山羊抗小鼠IgG(American Qualex公司制)，37℃下使其致敏45分钟。接着，与一次抗体致敏后同样地用PBS(-)洗涤细胞后，在载波片上滴数滴甘油缓冲液，用盖玻片封固，通过荧光显微镜对感染鸽轮状病毒的MA104细胞数目进行测定。
[表2]
  RJ水溶性粗馏分溶液
  蛋白质浓度(μg/mL)   13.3   27   53   106   212   424
  感染细胞(％)   80.2   70.0   79.6   77.5   83.0   114.5
  pH7下分解得到的RJ分解物
  蛋白质浓度(μg/mL)   1.2   2.3   4.6   9.3   18.5   37.0
  感染细胞(％)   32.7   53.4   67.9   52.0   83.8   120.3
  pH9下分解得到的RJ分解物
  蛋白质浓度(μg/mL)   1.0   2.1   4.1   8.3   16.5   33.0
  感染细胞(％)   59.9   46.7   30.8   19.8   15.2   27.4
表2表示人轮状病毒的中和活性试验的结果。感染细胞数目以对照样品的感染细胞数目作为100％表示。添加RJ水溶性粗馏分溶液时，观察到在约300μg/mL以上的浓度下促进病毒感染，在约300μg/mL以下的浓度下抑制病毒感染。换而言之，暗示了有可能具有高浓度下促进感染、低浓度下抑制感染的作用两面性。
另一方面，观察到在pH7下分解得到的RJ分解物具有在37μg/mL以上的浓度下促进病毒感染，在18.5μg/mL以下的浓度下抑制病毒感染的趋势。换而言之，在pH7下分解得到的RJ分解物与RJ水溶性粗馏分溶液同样地，高浓度下促进感染、低浓度下抑制感染，但是从抑制感染向促进感染转换的蛋白质浓度偏向低浓度侧。与此相对地，添加40μg/mL以下浓度的在pH9下分解得到的RJ分解物时，与添加RJ水溶性粗馏分溶液时相比表现出更强的感染抑制效果。特别是在pH9下分解得到的RJ分解物在16.5μg/mL以下的浓度表现出蛋白质浓度依赖性的感染抑制效果。此外，反应时间为4小时以上时，反应时间越长的RJ分解物在低浓度下的感染抑制效果的浓度依赖性越显著。
由表2的结果可知，使用本发明的RJ分解酶含有物、在pH9下进行4小时以上的酶处理而得到的RJ分解物具有下述特征：对于人轮状病毒感染的感染抑制作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比增大。
[实施例7]
为了研究使用本发明的RJ分解酶含有物得到的RJ分解物所具有的细胞增殖活性，使用来自大鼠小肠的IEC-6细胞实施WST-1法。WST-1法是通过测定细胞酶的代谢活性测定活细胞数目的方法。活细胞进行呼吸运动时，通过脱氢酶的作用乳酸、琥珀酸成为丙酮酸、富马酸，此时NAD+成为NADH。WST-1法中，向细胞中加入0.2mM的1-Methoxy PMS和WST-1试剂作为基质。1-Methoxy PMS转换成1-Methoxy PMS还原型、(NADH成为NAD+)1-Methoxy PMS还原型形成1-Methoxy PMS时，通过WST-1试剂产生黄色的甲簪(formazane)。对产生的甲簪用微读板器测定其吸光度。
WST-1法
i)试剂的制备
WST-1试剂
向WST-1(和光纯药工业株式会社、Cell Counting Kit.No.345-06463)16.3mg和HEPES 23.8mg中加入1-Methoxy PMS(0.2mM)5ml，用孔径0.22μm的过滤器(MILLEX-GV、已灭菌、Millipore公司制)过滤灭菌。
ii)试验培养基的制备
将RJ分解物溶解在DMEM(含有1％FCS)中，用孔径0.22μm的过滤器(MILLEX-GV、已灭菌、Millipore公司制)过滤灭菌。
iii)实验操作
IEC-6细胞是对10cm培养皿中形成铺满培养物(confluent)进行胰蛋白酶处理，并悬浮在DMEM(含有1％FCS)10ml中。以1000rpm离心5分钟吸引除去上清液后，以2.0×105cells/ml悬浮在DMEM(含有10％FCS)培养基中，每100μl接种在96孔板上。
在CO2培养箱(5％CO2、37℃)中培养24小时前，确认细胞粘合后，将DMEM(含有10％FCS)培养基吸引除去后，转移到100μl的试验培养基中。在CO2培养箱中进一步培养24小时后，吸引除去试验培养基，分别在各孔中加入DMEM(含有10％FCS)培养基100μl、WST-1试剂10μl，37℃下在5％CO2培养箱中培养2小时。然后，向各孔中各加入100μl的HCl，通过微读板器在450nm(参照波长：600nm)下测定吸光度。
作为上述RJ分解物，除了使反应时间为24小时之外全部与实施例4同样地操作，分别使用pH7下分解得到的RJ分解物、或者pH9下分解得到的RJ分解物。
IEC-6细胞的培养通过常规方法进行。
所得到的结果如图12A和图12B所示。
其结果，确认了对于pH7下分解得到的RJ分解物，RJ分解物的浓度为1mg/mL以下、具体地说为0.1～1mg/ml以下时促进细胞增殖，超过1mg/mL时抑制细胞增殖。此外，确认了对于pH9下分解得到的RJ分解物、特别是RJ分解物浓度为0.5～1mg/ml时有意义地促进细胞增殖。
由实施例6和7的结果推测出，作为在实施例6中观察到RJ蛋白质的浓度依赖性地促进以及抑制病毒感染的两面性的理由之一，可能是由于RJ蛋白质的细胞增殖促进效果。换而言之，暗示了作为控制细胞增殖的原因之一，可能是RJ蛋白质及其肽片段表现出控制人轮状病毒感染的作用。
[实施例8]
为了更具体地对使用本发明的RJ分解酶含有物而得到的RJ分解物所具有的细胞增殖活性进行分析，研究了对RJ分解物进行脱盐处理后的细胞增殖活性。
1.脱盐处理
首先，除了使反应温度为37℃、反应时间为24小时之外全部与实施例4同样地操作，使用本发明的RJ分解酶含有物，分别制备了pH7下进行酶处理而得到的RJ分解物(以下有时称为RJ分解物(pH7)。)、和pH9下进行酶处理而得到的RJ分解物(以下有时称为RJ分解物(pH9)。)。
使用HiTrapTM Desalting色谱柱(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)、通过下述方法分别对得到的RJ分解物(pH7)和RJ分解物(pH9)进行尺寸分离。
i)样品的制备
使用Millipore公司制“MILLI-Q(注册商标)”净化的水(下文简称为“ミリQ水”)中溶解各样品至100～150mg/mL后，在1500rpm下离心分离5分钟，用过滤器(MILLEX、孔径0.45μm、Millipore公司制)过滤上清液。
ii)缓冲液的制备
使用用超声波洗涤器脱气的ミリQ水。
iii)操作方法
将色谱柱连接到KTA explorer System(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)，以10ml/min的流速流动20％乙醇进行洗涤。然后，以10ml/min的流速流动已脱气的ミリQ水进行平衡。将1ml样品填充到色谱柱上后，以10ml/min的流速进行洗脱，在安装于馏分收集器上的试验管中各回收0.5ml。根据280nm下测定吸光度(mAU)和传导率(ms/cm)得到的洗脱图案，分别取出脱盐的馏分(以下称为馏分D1)和含有盐的馏分(下文称为馏分D2)两种馏分。
图6为在使用HiTrapTM Desalting色谱柱的柱色谱中，测定吸光度(280nm)和传导率的结果得到的图。实线表示RJ分解物(pH9)的吸光度、虚线表示RJ分解物(pH7)的吸光度、双点划线表示RJ分解物(pH9)的传导率、点划线表示RJ分解物(pH7)的传导率。图中，“D1”为作为馏分D1取出的馏分，“D2”为作为馏分D2取出的馏分。
2.细胞增殖活性的测定
除了细胞的培养液使用在不含有FCS等增殖因子的培养液(对照培养液)中含有RJ分解物(pH9)的馏分D1(馏分D1(pH9))的培养液、或者在对照培养液中含有RJ分解物(pH7)的馏分D1(馏分D1(pH7))的培养液之外，与实施例7同样地操作，对使用各培养液培养时的细胞增殖量进行测定。作为阳性对照使用含有10％FCS的培养液、作为阴性对照使用对照培养液。使用各培养液培养时的细胞增殖量以添加各培养液时产生的甲产物量相对添加对照培养液时产生的甲
Figure S200810007986XD00252
产物量的比例表示。
图7为表示使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图7A为使用含有馏分D1(pH9)的培养液培养时的结果，图7B为使用含有馏分D1(pH7)的培养液培养时的结果。图中，“NC”表示对照培养液、“PC”表示含有10％FCS的培养液。此外，各浓度表示各培养液中的来自馏分D1的蛋白质浓度。
如图7A的结果所示可知，培养液中的馏分D1(pH9)浓度依赖性地增大细胞增殖量。特别是使用馏分D1(pH9)浓度为50.5μg/mL的培养液培养时，与使用含有10％FCS的培养液时的促进细胞增殖程度大致相同。但是，在馏分D1(pH9)浓度为84.2μg/mL以上的培养液时，观察到细胞增殖量浓度依赖性地减少，所以暗示了通过馏分D1(pH9)所实现的细胞增殖促进效果(细胞增殖活性)存在最佳浓度。
另一方面，如图7B的结果所示可知，在培养液中含有馏分D1(pH7)时细胞增殖量几乎没有变化，馏分D1(pH7)不会对细胞增殖有显著影响。
即，由实施例8的结果可知，使用本发明的RJ分解酶含有物、在pH9下进行酶处理而得到的RJ分解物具有细胞增殖活性。
[实施例9]
为了更具体地对使用本发明的RJ分解酶含有物而得到的RJ分解物所具有的细胞增殖活性进行分析，研究了对RJ分解物进行粗纯化后的细胞增殖活性。
1.粗纯化
使用Cosmosil(注册商标)5C18-AR色谱柱(ナカライテスク社制)，通过下述方法对实施例8中制备的RJ分解物(pH9)的馏分D2(馏分D2(pH9))和RJ分解物(pH7)的馏分D2(馏分D2(pH7))进行粗纯化。
i)样品的制备
分别将上述馏分D2(pH9)和馏分D2(pH7)用过滤器(MILLEX、孔径0.45μm、Millipore公司制)过滤，加入TFA至0.05％浓度。
ii)缓冲液的制备
a)吸附缓冲液：0.05％TFA溶液
使用超声波洗涤器对ミリQ水进行脱气后，加入TFA至0.05％浓度。
b)洗脱缓冲液：0.05％TFA/90％乙腈
分别量取乙腈(和光纯药工业)450mL、ミリQ水50mL进行混合。用过滤器(RC-Vliesverstarkt、孔径0.22μm、Sartorius AG)过滤，通过超声波洗涤器脱气。然后，向90％乙腈溶液中加入TFA至0.05％。
iii)操作方法
将色谱柱(容量0.83mL)连接到KTA explorer System(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)，设定流速为1ml/min，用已脱气的ミリQ水洗涤。然后，用0.05％TFA溶液进行平衡。将5ml样品填充到色谱柱上后，以1ml/min的流速洗脱，在安装于馏分收集器上的试验管中各回收2ml。根据215nm以及280nm下测定吸光度(mAU)和传导率(ms/cm)得到的洗脱图案，分别取出非吸附馏分(以下称为馏分C1)和吸附馏分(以下称为馏分C2)两种馏分。
图8为在使用Cosmosil(注册商标)5C18-AR色谱柱的柱色谱中，测定吸光度(215nm)和传导率的结果得到的图。实线表示馏分D2(pH9)的吸光度、虚线表示馏分D2(pH7)的吸光度、双点划线表示馏分D2(pH9)的传导率、点划线表示馏分D2(pH7)的传导率。图中，“C1(pH7)”为作为馏分C1(pH7)取出的馏分、“C1(pH9)”为作为馏分C1(pH9)取出的馏分、“C2(pH7)”为作为馏分C2(pH7)取出的馏分、“C2(pH9)”为作为馏分C2(pH9)取出的馏分。
2.馏分C1的细胞增殖活性的测定
除了细胞的培养液使用稀释了馏分D2(pH9)的馏分C1(馏分C1(pH9))的培养液或者稀释了馏分D2(pH7)的馏分C1(馏分C1(pH7))的培养液之外，与实施例7同样地操作，对使用各培养液培养时的细胞增殖量进行测定。而且，稀释馏分C1(pH9)或馏分C1(pH7)时使用了对照培养液。
图9为表示使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图9A为使用含有馏分C1(pH9)的培养液培养时的结果，图9B为使用含有馏分C1(pH7)的培养液培养时的结果。图中，“NC”表示对照培养液、“PC”表示含有10％FCS的培养液。
如图9A和图9B的结果所示，在含有馏分C1(pH9)和馏分C1(pH7)的任意一种馏分的培养液都促进了细胞增殖。若将两者进行比较，则观察到与含有馏分C1(pH7)时相比，含有馏分C1(pH9)时存在细胞增殖促进效果好的趋势。
3.馏分C2的细胞增殖活性的测定
除了细胞的培养液使用在对照培养液中含有馏分D2(pH9)的馏分C2(馏分C2(pH9))的培养液、或者在对照培养液中含有馏分D2(pH7)的馏分C2(馏分C2(pH7))的培养液之外，与实施例7同样地操作，对使用各培养液培养时的细胞增殖量进行测定。
图10为表示使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图10A为使用含有馏分C2(pH9)的培养液培养时的结果，图10B为使用含有馏分C2(pH7)的培养液培养时的结果。图中，“NC”表示对照培养液。此外，各浓度表示各培养液中的来自馏分C2的蛋白质浓度。
其结果，观察到在培养液中含有馏分C2(pH9)时，培养液中的浓度为3.42μg/mL以下时存在浓度依赖性地增大细胞增殖量的趋势，超过3.42μg/mL时存在浓度依赖性地降低细胞增殖量的趋势。另一方面，观察到在培养液中含有馏分C2(pH7)时，培养液中的浓度为4.67μg/mL以下时存在浓度依赖性地增大细胞增殖量的趋势，超过4.67μg/mL时存在浓度依赖性地降低细胞增殖量的趋势。此外，若将两者进行比较，则观察到与含有馏分C2(pH7)时相比，含有馏分C2(pH9)时存在细胞增殖促进效果好的趋势。
因此，由实施例9的结果可知，使用本发明的RJ分解酶含有物进行酶处理而得到的RJ分解物具有细胞增殖活性，以及与在pH7的反应条件下进行酶处理而得到的RJ分解物相比，在pH9的反应条件下进行酶处理而得到的RJ分解物具有更高的细胞增殖活性。
[实施例10]
对使用本发明的RJ分解酶含有物而得到的RJ分解物所具有的抗氧化活性进行研究。
1.RJ分解物的制备
向RJ(中国产：浙江省江山恒亮蜂产品有限公司制)中加入纯水得到悬浮物，使用孔径10kD的透析膜，在纯水中对该悬浮物透析72小时。回收透析膜内液体，进行冷冻干燥后，再次悬浮在纯水中，制备了30mg/mL的RJ蛋白质溶液。
向1mL的上述RJ蛋白质溶液中加入1mL的RJ分解酶含有物(3mg/mL)、8mL的Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，37℃下培养24小时。然后，使用孔径500Da的透析膜，在纯水中透析5天。回收透析膜内液体，进行冷冻干燥，将冷冻干燥物作为RJ分解物。而且，RJ分解酶含有物使用与实施例1同样地操作制备的分解酶含有物。
2.抗氧化活性测定
对于RJ分解物的抗氧化活性，根据柳内等(日本食品科学工学会志、第51卷第5号、第238～246页、2004年)的方法，通过研究RJ分解物对由于一氧化氯(ClO·)所引起的BSA分解的影响来进行测定。
具体地说，首先，通过向含有BSA的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)中添加使用PBS稀释的RJ分解物，制备含有BSA(最终浓度40μg/mL)和RJ分解物(最终浓度0、0.3、0.5、1.0或2.0μg/mL)的PBS样品溶液。向上述PBS样品溶液中以最终浓度为1.7mM加入次氯酸钠，37℃下培养30分钟。然后，通过SDS-PAGE分离PBS试样溶液中的蛋白质，通过CBB染色进行检测。通过扫描仪获得CBB染色像后，对相当于BSA的带的浓度进行分析。对于各PBS试样溶液的BSA浓度，以未添加次氯酸钠的PBS试样溶液作为空白溶液，研究空白溶液的BSA浓度为1时的相对浓度。而且，带的浓度分析使用美国国立卫生研究所(National Institutes of Health)提供的分析软件Image J进行。此外，对添加公知的抗氧化剂抗坏血酸(最终浓度0、3.0、4.0、5.0或7.5mM)或肌肽(最终浓度0、2.5、5.0、7.5或10.0mM)来替代RJ分解物而得到的PBS试样溶液，同样地研究了BSA浓度。
图11为表示各PBS试样溶液的BSA浓度的结果的图。图11A为添加RJ分解物时的结果、图11B为添加抗坏血酸时的结果、图11C为添加肌肽时的结果。其结果，在未添加RJ分解物时，BSA通过CBB染色未检出带，几乎全部的BSA被分解。与此相对地，添加了RJ分解物时，与抗坏血酸或肌肽同样地，对PBS样品溶液的添加量依赖性地增大BSA的相对浓度。推测这是因为由次氯酸钠产生的一氧化氯所引起的BSA的分解受到RJ分解物的抑制。
此外，基于图11的结果，算出将由一氧化氯所引起的BSA分解抑制至50％的浓度时，在RJ分解物中为0.92±0.24mg/mL、抗坏血酸中为0.67±0.01mg/mL(3.83±0.08mg/mM)、肌肽中为0.84±0.10mg/mL(3.65±0.32mg/mM)。即，确认了对于由一氧化氯所引起的BSA分解的抗氧化力，尽管RJ分解物为混合物，但具有与公知的抗氧化剂抗坏血酸或肌肽相匹敌的抗氧化力。
由实施例10的结果可知，使用本发明的RJ分解酶含有物、在pH9下进行酶处理而得到的RJ分解物具有抗氧化活性。
[实施例11]
除了使反应时间为1～3小时、反应温度为37℃或55℃之外，全部与实施例1的在pH9条件下的反应同样地操作，分解RJ蛋白质，通过SDS-PAGE分离RJ分解物。图13表示凝胶的染色像。图中，“std”表示分子量标记，“9-0”表示对反应时间0(pH9)的样品进行电泳的结果。此外，箭头a表示约55kDa、箭头b表示约46kDa。
其结果，确认了使RJ蛋白质与RJ分解酶含有液在55℃下进行反应时，在反应开始后1小时的短时间内，约51kDa和约46kDa的蛋白质都基本上被分解。
产业上的可利用性
本发明的RJ分解酶含有物含有蜂王幼虫所具有的、以RJ为本来基质的RJ分解酶，最适于分解RJ，所以可以用于RJ的生理活性研究、使用RJ的药品和/或食品的开发等领域中。

Claims (14)

1、一种蜂王胶分解酶含有物，其特征在于，通过包括下述工序的方法由西方蜜蜂的2～3日龄蜂王幼虫制备：
(a)在6℃以下对所述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序；
(b)回收所述中层作为蜂王胶分解酶含有物的工序。
2、根据权利要求1所述的蜂王胶分解酶含有物，其特征在于，所述离心处理为8000～12000×g、5分钟以上的离心处理。
3、一种蜂王胶分解酶含有物，其特征在于，通过包括下述工序的方法由西方蜜蜂的2～3日龄蜂王幼虫制备：
(a’)将所述蜂王幼虫用冰冷却生理盐水洗涤后过滤，从而制备体组织悬浮物的工序；
(b’)使用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释所述体组织悬浮物后，在10000×g、5℃下进行10分钟的离心处理，从而分离为三层，即固体上层、悬浮溶液中层、沉淀下层的工序；
(c’)回收所述中层作为蜂王胶分解酶含有物的工序。
4、一种蜂王胶分解物，其特征在于，使用权利要求1～3任意一项所述的蜂王胶分解酶含有物制备。
5、一种蜂王胶分解物，其特征在于，通过使用权利要求1～3任意一项所述的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到，并且，其具有下述特点：
(1)对神经细胞的非特异性的细胞变性作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比降低；
(2)对由淀粉样蛋白所诱导的神经细胞死亡的抑制作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相等；
(3)对神经胶质细胞的细胞增殖作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比增大；
(4)对人轮状病毒感染的感染抑制作用，与未进行酶处理的蜂王胶水溶性馏分相比增大。
6、一种抗氧化剂，其特征在于，将通过使用权利要求1～3任意一项所述的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到的蜂王胶分解物作为有效成分。
7、一种细胞增殖剂，其特征在于，将通过使用权利要求1～3任意一项所述的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到的蜂王胶分解物作为有效成分。
8、一种感染抑制剂，其特征在于，将通过使用权利要求1～3任意一项所述的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到的蜂王胶分解物作为有效成分。
9、一种神经细胞死亡诱导抑制剂，其特征在于，将通过使用权利要求1～3任意一项所述的蜂王胶分解酶含有物，在pH9下对蜂王胶进行酶处理而得到的蜂王胶分解物作为有效成分。
10、一种蜂王胶的分解方法，其特征在于，使用权利要求1～3任意一项所述的蜂王胶分解酶含有物。
11、一种蜂王胶分解酶，其特征在于，包含在权利要求1～3任意一项所述的蜂王胶分解酶含有物中。
12、根据权利要求11所述的蜂王胶分解酶，其特征在于，酶活性的最佳pH为7或9。
13、一种蜂王胶分解物，其特征在于，使用权利要求11所述的蜂王胶分解酶制备。
14、一种蜂王胶的分解方法，其特征在于，使用权利要求11所述的蜂王胶分解酶。
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