CN101249109B - 罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，首先进行罗伊氏乳杆菌的分离、纯化，再进行罗伊氏乳杆菌种子培养，然后将培养的种子提取液1000ml，加入淀粉5-20g，羧甲基纤维素5-20g，纤维素硫酸钠2-5g和氯化钙5-20g，通过挤压法来制备中空胶囊，再制备发酵培养基，通氮气发酵培养一段时间，最后将胶囊敷膜和干燥后得罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊；本发明提供了一种延长罗伊氏乳杆菌贮藏期，便于贮存、运输和使用的一种罗伊氏乳杆菌中空胶囊制剂的制备方法，制得的罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊具有能延长益生菌在室温条件下的存活时间和避免口服时受到胃酸的杀灭，使其安全到达肠道，定向释放发挥疗效的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法。
背景技术
罗伊氏乳杆菌(拉丁名：Lactobacillus reuteri)是一种栖息于人和动物的肠道中，具肠道表皮粘附能力的有益乳酸菌。研究表明罗伊氏乳杆菌代谢产生的罗伊氏乳素、蛋白、有机酸等物质，能广泛的抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长，具有广谱抗菌作用。罗伊氏乳杆菌能够作为饲料添加剂，改善动物肠道菌群分布，抑制有害菌的繁殖，从而避免动物出现一些肠道类的疾病。罗伊氏乳杆菌益生制剂也可用于改善机体衰老、肠道疾病、抗生素滥用、环境污染等引起的人肠道内有益菌数量下降的问题，促进肠道有益菌的增殖，从而促进人体健康。我国***也于2003年批准罗伊氏乳杆菌作为保健食品益生菌种。
益生菌制品主要是活菌制剂，目前已有罗伊氏乳杆菌益生菌制剂出现，为保证有效期内的活菌数，一般采用2-8℃的低温保存，给储存、运输和销售带来极大的不便。罗伊氏乳杆菌是一种专性厌氧菌，极易受到氧气、温度、酸碱等环境因素的影响，因此液体菌剂难以长期保持其高活性。益生菌要对人体产生有益作用，首先它必须通过食道、胃环境到达肠道末端并定殖于肠黏膜上，但口服的罗伊氏乳杆菌液体制剂，在通过人和动物的胃的时候，胃中的酸性环境(pH为2左右)和胆汁会杀死罗伊氏乳杆菌，使活菌数急剧降低，造成罗伊氏乳杆菌不能在肠道中大量定殖，从而影响罗伊氏乳杆菌的调节肠道菌群的治疗保健作用。据报道，口服的冻干菌剂，在胃中的存活率仅为百万分之一左右，存活率极低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，采用该制备方法所制得的罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊具有能保护其中的活性物质、酶和益生菌，以抵抗外界环境的影响，延长益生菌在室温条件下的存活时间和避免口服时受到胃酸的杀灭，使其安全到达肠道，定向释放发挥疗效的特点。
为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案，
一种罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)罗伊氏乳杆菌的分离、纯化：包括菌种分离培养基的制备以及菌种的分离筛选；
菌种分离培养基
牛肉蛋白粉10g，鱼肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，葡萄糖10g，***糖5g，蔗糖5g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温800.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，琼脂18g，蒸馏水1000ml。用醋酸调节pH至5.0。
菌种的分离筛选
将上述培养基装入Hunga t e试管制备培养基滚管。取三个月婴儿***物将其分散在无菌水中，摇匀静止，取上清液，加入Hungate滚管，滚动使上清液均匀分布在滚管培养基表面。用5％-12％二氧化碳培养箱37℃下培养24-72小时后，出现白色菌落。加入无菌水使菌分散在水中，取出后，涂平板。对得到的革兰氏阳性和接触酶阴性细菌进一步进行耐酸、耐胆盐、耐高铜和抗大肠杆菌筛选。对筛选得到的菌株考察其转化甘油生成罗伊氏素的能力，可确定其为罗伊氏乳杆菌。
(2)罗伊氏乳杆菌种子培养：包括固体斜面培养基的制备，种子培养基的制备，然后将由步骤(1)分离筛选得到的菌株接种于固体斜面培养基，在37℃下培养24小时。然后将斜面上的菌株接种到液体种子培养基37℃下厌氧培养12小时，然后将种子培养液加入含2L发酵培养基的3L发酵罐中，在37℃下厌氧培养12小时。
固体斜面培养基
牛肉蛋白粉10g，鱼肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，葡萄糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温800.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，琼脂18g，蒸馏水1000ml。用醋酸调节pH至5.4。
种子培养基
牛肉蛋白粉10g，鱼肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，葡萄糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温800.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，蒸馏水1000ml。用醋酸调节pH至5.4。
发酵培养基
牛肉蛋白粉10g，鱼肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，葡萄糖25g，甘油20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温800.1g，硫酸镁0.58，硫酸锰0.28，蒸馏水1000ml。用醋酸调节pH至5.4-6.5。
(3)取步骤(2)培养的种子提取液1000ml，加入淀粉5-20g，羧甲基纤维素5-20g，纤维素硫酸钠2-5g和氯化钙5-20g，通过挤压法来制备中空胶囊，再制备发酵培养基，取上述制备的胶囊100ml加入到1000ml发酵培养基，通氮气发酵培养一段时间，最后将胶囊敷膜和干燥后得罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊。
所述的步骤(3)中的挤压法制备中空胶囊是指将上述1000ml种子提取液，加入已经灭过菌的淀粉、羧甲基纤维素、纤维素硫酸钠和氯化钙，无菌条件下搅拌均匀，调配成合适粘度；将此混会液滴入一定量的已配置好灭菌的0.5-1.5％的海藻酸钠溶液，边滴边缓慢搅拌，滴10分钟，反应一段时间后，取出胶囊无菌水洗涤三次。
所述的0.5-1.5％的海藻酸钠溶液用量为1000ml。
所述的反应时间为20-60分钟。
所述的步骤(3)中的发酵培养的时间为24-48小时。
所述的步骤(3)中的胶囊敷膜和干燥是指将通氮气发酵培养后的胶囊用无菌水洗涤三次，将此胶囊加入0.1％-1％的壳聚糖溶液中，反应1-2小时，取出胶囊，冻干后即得产品。
本发明的有益效果是：本发明将罗伊氏乳杆菌包埋于肠溶性壁材制备的微胶囊中(淀粉、羧甲基纤维素、纤维素硫酸钠、氯化钙所组成的肠溶性壁材制备的微胶囊)，能抵抗外界环境的影响，确保其能抵御胃酸，顺利到达肠道。在医药和食品工业中已经提出了很多益生菌微囊化的方法，但都是在获得菌粉后将其通过一定手段包埋，在包囊过程中易对益生菌造成伤害，从而影响益生菌的稳定性。因此在益生菌微胶囊的方法存在一定缺陷。而本发明在罗伊氏乳杆菌外采用肠溶性的壁材进行包埋保护益生菌，提供了一种延长罗伊氏乳杆菌贮藏期，便于贮存、运输和使用的一种罗伊氏乳杆菌中空胶囊制剂的制备方法。本发明采用挤压法来制备益生中空微胶囊，中空胶囊不会对囊内的微生物生长产生体积效应，且有良好的传质性能，具有能保护其中的活性物质、酶和益生菌，以抵抗外界环境的影响，从而能延长益生菌在室温条件下的存活时间和避免口服时受到胃酸的杀灭，使其安全到达肠道，定向释放发挥疗效的特点。
具体实施方式
实施例1
本实施例将罗伊氏乳杆菌通过分离培养基进行分离、纯化后筛选出来的菌株接种到固体斜面培养基上，在37℃下培养24小时。然后将斜面上的菌株接种到200ml液体种子培养基，37℃下培养12小时。然后将200ml种子培养液加入含2L发酵培养基的3L发酵罐中，在37℃下厌氧培养12小时。取1000ml种子提取液，加入已经灭过菌的淀粉20g、羧甲基纤维素12g、纤维素硫酸钠2g、氯化钙20g，无菌条件下搅拌均匀。将此混合液滴入已灭菌的0.5％的海藻酸钠溶液1000ml，边滴边缓慢搅拌，滴10分钟，反应30分钟后，取出胶囊无菌水洗涤三次。取上述制备得到的胶囊，加入含1000ml发酵培养基的发酵罐中，通氮气培养48小时。将上述培养后的胶囊取出，用无菌水洗涤三次，将此胶囊加入0.1％的壳聚糖溶液中，反应1-2小时。取出胶囊，冻干后得罗伊氏乳杆菌益生微胶囊。
实施例2
本实施例将罗伊氏乳杆菌通过分离培养基进行分离、纯化后筛选出来的菌株接种到固体斜面培养基上，在37℃下培养24小时。然后将斜面上的菌株接种到200ml液体种子培养基，37℃下培养12小时。然后将200ml种子培养液加入含2L发酵培养基的3L发酵罐中，在37℃下厌氧培养12小时。取1000ml种子提取液，加入已经灭过菌的淀粉12g、羧甲基纤维素5g、纤维素硫酸钠3g、氯化钙12g，无菌条件下搅拌均匀。将此混合液滴入已灭菌的1％的海藻酸钠溶液1000ml，边滴边缓慢搅拌，滴10分钟，反应20分钟后，取出胶囊无菌水洗涤三次。取上述制备得到的胶囊，加入含1000ml发酵培养基的发酵罐中，通氮气培养36小时。将上述培养后的胶囊取出，用无菌水洗涤三次，将此胶囊加入0.5％的壳聚糖溶液中，反应1-2小时。取出胶囊，冻干后得罗伊氏乳杆菌益生微胶囊。
实施例3
本实施例将罗伊氏乳杆菌通过分离培养基进行分离、纯化后筛选出来的菌株接种到固体斜面培养基上，在37℃下培养24小时。然后将斜面上的菌株接种到200ml液体种子培养基，37℃下培养12小时。然后将200ml种子培养液加入含2L发酵培养基的3L发酵罐中，在37℃下厌氧培养12小时。取1000ml种子提取液，加入已经灭过菌的淀粉5g、羧甲基纤维素20g、纤维素硫酸钠5g、氯化钙5g，无菌条件下搅拌均匀。将此混合液滴入已灭菌的1.5％的海藻酸钠溶液1000ml，边滴边缓慢搅拌，滴10分钟，反应60分钟后，取出胶囊无菌水洗涤三次。取上述制备得到的胶囊，加入含1000ml发酵培养基的发酵罐中，通氮气培养24小时。将上述培养后的胶囊取出，用无菌水洗涤三次，将此胶囊加入1％的壳聚糖溶液中，反应1-2小时。取出胶囊，冻干后得罗伊氏乳杆菌益生微胶囊。
Claims (6)
1.一种罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)罗伊氏乳杆菌的分离、纯化：包括菌种分离培养基的制备以及菌种的分离筛选；
(2)罗伊氏乳杆菌种子培养：包括固体斜面培养基的制备，种子培养基的制备，然后将由步骤(1)分离筛选得到的菌株接种于固体斜面培养基，在37℃下培养24小时，然后将斜面上的菌株接种到液体种子培养基37℃下培养12小时，然后将种子培养液加入含2L发酵培养基的3L发酵罐中，在37℃下厌氧培养12小时；
(3)取步骤(2)培养的种子提取液1000ml，加入淀粉5-20g，羧甲基纤维素5-20g，纤维素硫酸钠2-5g和氯化钙5-20g，通过挤压法来制备中空胶囊，再制备发酵培养基，取上述制备的胶囊100ml加入到1000ml发酵培养基，通氮气发酵培养一段时间，最后将胶囊敷膜和干燥后得罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊。
2.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中的挤压法制备中空胶囊是指将上述1000ml种子提取液，加入已经灭过菌的淀粉、羧甲基纤维素、纤维素硫酸钠和氯化钙，无菌条件下搅拌均匀，调配成合适粘度；将此混合液滴入一定量的已配置好灭菌的0.5-1.5％的海藻酸钠溶液，边滴边缓慢搅拌，滴10分钟，反应一段时间后，取出胶囊无菌水洗涤三次。
3.如权利要求2所述的罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，其特征在于：所述的0.5-1.5％的海藻酸钠溶液用量为1000ml。
4.如权利要求2所述的罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，其特征在于：所述的反应时间为20-60分钟。
5.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中的发酵培养的时间为24-48小时。
6.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌益生中空微胶囊的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中胶囊敷膜和干燥是指将通氮气发酵培养后的胶囊用无菌水洗涤三次，将此胶囊加入0.1％-1％的壳聚糖溶液中，反应1-2小时，取出胶囊，冻干后即得产品。
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