CN101235368A

CN101235368A - 固定化酶生物催化剂的制备方法

Info

Publication number: CN101235368A
Application number: CNA2008100341049A
Authority: CN
Inventors: 马文韬; 徐佳佳; 夏萱煜; 胡龙兴; 党松涛
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2008-08-06

Abstract

本发明设计一种使用硅基介孔分子筛和海藻酸钙固定酶生物催化剂的制备方法，属固定酶生物催化剂制备工艺技术领域。本发明是以硅基介孔分子筛MCM－41为载体，在二氧化硅载体的介孔孔道中固定生物酶分子，再将制备好的固定化酶生物催化剂二次固定于海藻酸钙凝胶体中。本发明方法采用了物理吸附包埋法和溶胶－凝胶法。本发明的固定酶生物催化剂具有较好的酶分散性和较高的载酶量，并且具有较高的酶活性回收率和重复利用率。本发明可以对辣根过氧化物酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶进行固定。本发明的固定酶生物催化剂可用于含酚废水的处理及脱色，具有较高的催化活性。

Description

固定化酶生物催化剂的制备方法

技术领域

本发明设计一种使用硅基介孔分子筛和海藻酸钙固定酶生物催化剂的制备方法，属固定酶生物催化剂制备工艺技术领域。

背景技术

有序介孔分子筛的合成早在20世纪70年代就已经开始，只是1992年的Mobil公司的MCM-41等介孔分子筛的报导才引起人们的广泛注意，并被认为是有序介孔分子筛合成的真正开始。他们使用表面活性剂作为模板剂，合成了M41S系列介孔分子筛。具有大的比表面积、孔道规则排列并可调节的有序介孔分子筛系列M41S的合成被人们称为分子筛发展史上的一个里程碑。之后又有各种各样的合成体系和合成途径问世，这些有序介孔分子筛正是许多研究和应用领域所需要的，是当前具有广泛应用前景的一类新分子筛，在分离提纯、生物分子筛、化学合成及转化的催化剂、半导体、光学器件、计算机、传感器件、药物递送、气体和液体吸附、声学、超轻结构分子筛等许多研究领域有着潜在的用途，在化学工业，生物技术、环境能源等诸多领域具有重要的应用价值。介孔分子筛的孔径在很大范围内可调，故不能为沸石分子筛所取代，因此，成为热门研究领域之一。介孔分子筛因为其均一可调的孔径、高的比表面积和规整的孔道结构以及易于表面功能化等优点，目前被广泛的用于酶蛋白质的固定充当生物催化剂载体，解决了天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其应用受到限制等问题。在介孔分子筛未用作酶的固定化载体之前，溶胶—凝胶法合成的硅基无机分子筛曾广泛地被用于酶等生物活性分子的固定或包埋，其优势在于酶泄漏少。但是，酶的活性受到溶胶—凝胶制备条件的影响，狭小的网格孔道限制了质量传递；同时，溶胶—凝胶法很难控制孔径的分布，对被固定物粒径的选择性很小；而且酶在这类基体中仍可凝结，而固定孔分布的载体将有利于防止酶的凝结。另外，由于水溶性酶易失活、稳定性较差，并且只能使用一次而导致处理成本高。为了提高酶活性、稳定性以及降低成本，发展酶的固定化技术是该领域的主要研究方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化酶生物催化剂的制备方法。本发明方法是以硅基介孔分子筛MCM-41为载体，在二氧化硅载体的介孔孔道中固定生物酶分子，再将制备好的固定化酶生物催化剂二次固定于海藻酸钙凝胶体中。

本发明系一种固定化酶生物催化剂的制备方法，其特征在于具有以下的制备过程和步骤：

a.硅基介孔分子筛载体的制备：

首先制备的硅基介孔分子筛MCM-41载体：以十六烷基溴化铵为模板剂，以正硅酸乙酯作为硅源。将十六烷基溴化铵溶解于去离子水中，再加入适量氨水、无水乙醇和扩孔剂TMB于上述溶液中。搅拌溶液，然后加入正硅酸乙酯，在室温下搅拌1-2小时，然后对样品溶液进行抽滤、水洗、烘干处理，得到的白色粉末即为带有模板剂的原MCM-41，最后是对原MCM-41进行煅烧。煅烧温度为550℃，且在该温度下保持6小时，然后自然降温。经煅烧后的粉末即是带有介孔孔道的硅基分子筛MCM-41。

b.在硅基介孔分子筛上载酶或固定酶：

将制备的硅基介孔分子筛MCM-41加入到磷酸盐缓冲溶液中，并置于磁力搅拌器上搅拌1-2小时，使其在溶液中分散，然后加入酶，使其固定，所用的酶为辣根过氧化物酶、蛋白酶或脂肪酶的任一种。加入酶后继续搅拌3-4小时，然后用高速离心分离机分离，并将分离所得产物在室温下自然干燥，将干燥后的载酶介孔分子筛加入到海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，用注射器滴入氯化钙溶液中，使其反应1-2小时。控制注射量和速度，最终制得不同粒径的凝胶珠，即为固定化酶生物催化剂。

本发明方法中采用了物理吸附包埋法和溶胶—凝胶法，制得的固定化酶生物催化剂具有良好的酶分散性和较高的载酶量，使用时有较高的酶活性回收率和重复利用率。另外，其工艺简单，操作方便，而且产品储存稳定。

介孔分子筛作为酶固定化载体与其他载体相比，前者具有一定的优越性：介孔分子筛的孔径可调，可适用于多种酶的固定化；另外，表面富含弱酸性羟基，有助于酶蛋白分子的固定化。采用海藻酸钙再次包埋，具有更好的机械稳定性和热稳定性，减少酶在固定化酶生物催化剂中的泄漏量，从而增加固定化酶生物催化剂的重复使用次数。

附图说明

图1为本发明固定化酶生物催化剂工艺流程图。

图2为本发明固定化酶生物催化剂去除水中酚的重复利用次数及酚去除率。

具体实施方式

现将本发明的一个具体实施例赘述于后。

实施例1

参见图1的工艺流程图。首先在常温条件下制备硅基介孔分子筛MCM-41载体。以十六烷基溴化铵为模板剂，正硅酸乙酯作为硅源。先将0.75g的CTAB溶解在15g的去离子水中，然后称取4.50g的氨水(25wt％，0.066mol)、23ml的无水乙醇(C₂H₅OH)和0.6g扩孔剂TMB加入到表面活性剂溶液中。搅拌溶液15min，然后加入1.4g的正硅酸乙酯(TEOS)，在室温下搅拌2h后，对样品溶液进行抽滤、水洗、烘干处理，所得的白色粉末即为带有模板剂的原MCM-41，最后是对原MCM-41进行煅烧。煅烧温度为550℃，并在此温度下保持6小时，然后自然降温。煅烧后的粉末即是带有孔道的MCM-41。将0.25gMCM-41加入到pH为8的10ml磷酸盐缓冲溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌1h，使其在溶液中分散均匀。搅拌完毕，将辣根过氧化物酶加入溶液中，使溶液中的酶浓度达到50u/ml，继续搅拌4小时。搅拌完毕，在室温下以8000rpm速度离心20min，并将所得产物在室温下自然干燥。将干燥后的载酶介孔分子筛加入到5ml的3％的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，用注射器滴入2％氯化钙溶液中，反应1h。控制注射速度，制得粒径为4mm的凝胶珠，即为固定化酶生物催化剂。

将上述包埋了辣根过氧化物酶的固定化生物催化剂来处理总酚含量为100mg/L的苯酚水溶液，试验表明，经过10次重复利用后，固定化酶生物催化剂仍然具有较高的催化活性，水溶液中的苯酚的去除率仍然可达80％以上。参见图2，图2中表明了该辣根过氧化物酶生物催化剂在去除水中酚的重复利用次数及相应酚去除率的实验曲线。

Claims

1.一种固定化酶生物催化剂的制备方法，其特征在于具有以下的制备过程和步骤：

a.硅基介孔分子筛MCM-41载体的制备：以十六烷基溴化铵为模板剂，以正硅酸乙酯作为硅源。将十六烷基溴化铵溶解于去离子水中，再加入适量氨水、无水乙醇和扩孔剂TMB于上述溶液中。搅拌溶液，然后加入正硅酸乙酯，在室温下搅拌1-2小时，然后对样品溶液进行抽滤、水洗、烘干处理，得到的白色粉末即为带有模板剂的原MCM-41，最后是对原MCM-41进行煅烧。煅烧温度为550℃，且在该温度下保持6小时，然后自然降温。经煅烧后的粉末即是带有介孔孔道的硅基分子筛MCM-41。

b.在硅基介孔分子筛上载酶或固定酶：将步骤a制备的硅基介孔分子筛MCM-41载体加入到磷酸盐缓冲溶液中，并置于磁力搅拌器上搅拌1-2小时，使其在溶液中分散，然后加入酶，使其固定，所用的酶为辣根过氧化物酶、蛋白酶或脂肪酶的任一种。加入酶后继续搅拌3-4小时，然后用高速离心分离机分离，并将分离所得产物在室温下自然干燥，将干燥后的载酶介孔分子筛加入到海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，用注射器滴入氯化钙溶液中，使其反应1-2小时。控制注射量和速度，最终制得不同粒径的凝胶珠，即为固定化酶生物催化剂。