CN102433317B

CN102433317B - 一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法

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Publication number: CN102433317B
Application number: CN 201110363336
Authority: CN
Inventors: 谢恬; 陈飞飞; 王安明; 张方凯; 杜方川
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2031-11-16
Also published as: CN102433317A

Abstract

本发明提供了一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法，(1)载体活化：将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH₂浸渍在0.5～2.5mM的对苯醌溶液中，振荡活化1～3小时，离心，取沉淀洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；(2)酶的固定化：将活化的载体液，按40～100mg嗜热菌蛋白酶/g MCFs-NH₂的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应18～20h或者在0～7℃、20～50W微波条件下照射2～4min，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；通过本发明方法制得的固定化嗜热菌蛋白酶在性能上比自由酶有了很大的提高，还大大地缩短了固定化时间，从20h缩短到了3min，整整缩短了399倍，这使得酶固定化的成本得到了降低。

Description

一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法

(一)技术领域

本发明涉及一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法。

(二)背景技术

酶作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近几年酶工程研究的重点。

酶的固定化，即用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。依据酶的性质及用途，可分为吸附法、共价结合法、交联法、包埋法这几种。

嗜热菌蛋白酶(EC3.4.24.27)是一种存在于嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)中的耐热性中性金属蛋白酶，含有4个钙离子和1个锌离子。其曾被用来研究卵传铁蛋白的结构，因为嗜热菌蛋白酶可以完全消化N端叶却留下大多数的C端叶免受破坏。嗜热菌蛋白酶不但广泛应用于肽键的水解中，特别是水解亮氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等氨基酸的疏水性的或大的氨基侧链的N端，而且其还催化肽键的形成，特别是催化人造甜味剂阿斯巴甜的合成。阿斯巴甜是一种二肽甜味剂，甜度大约是蔗糖的200倍，其味如白糖，不腻不苦；低热量可减肥；不会使血糖升高，适合于肥胖症、糖尿病和心血管病人食用；不被微生物发酵、不怕发霉，无虞龋齿，现在在100多个国家中被广泛用于食品与饮料中。采用酶催化此甜味剂的合成，与化学工艺相比，具有明显优势，如：避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，使反应条件变的温和，从替代传统化学合成工艺催化剂的角度，该酶催化的反应具有很强的绿色属性，对传统化学工艺的绿色化学改造有着重要意义，因而该酶具有广阔的应用前景。

固定化能够改善酶的性质，使固定化酶比游离酶具有更好的稳定性和更高的使用效率，并且使酶能够回收利用，极大节约生产成本。但是由于嗜热菌蛋白酶溶解性低(1.0～1.2mg/ml)又只有9个氨基(嗜热菌蛋白酶通过氨基与载体共价连接)其共价固定化存在很大的困难。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种简单，快速，高效的嗜热菌蛋白酶共价固定化方法，该共价固定化是通过对苯醌交联剂与酶及载体的共价连接实现的，最终获得固定化酶产品，获得了性能比嗜热菌蛋白酶自由酶大为改善的嗜热菌蛋白酶固定化酶。

本发明采用的技术方案是：

一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法，所述方法包括：

(1)载体活化：将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH2浸渍在0.5～2.5mM的对苯醌溶液中，在20～30℃、100～200rpm的条件下振荡活化1～3小时，离心，取沉淀依次用20～30％乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；

(2)酶的固定化：将活化的载体液，按40～100mg嗜热菌蛋白酶(自由酶)/g MCFs-NH₂的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应18～20h或者在0～7℃、20～50W微波条件下照射2～4min，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；

步骤(1)中所制得的氨基化的MCFs载体是本领域常规的氨基化的介孔泡沫硅载体，其孔径约为26nm。

步骤(1)和(2)中所述MES-NaOH溶液组成如下：NaCl 2～5M，ZnCl₂ 10～30mM，MES-NaOH 0.01～0.05M，pH 7.0～7.5，溶剂为水。

本发明在固定化时加入2～5MNaCl可以使嗜热菌蛋白酶的溶解性提高约10倍，使得嗜热菌蛋白酶可以充分分散在溶液中不至于聚集在一起从而能很好地与载体共价连接。

目前微波辐射在有机合成化学中的应用广泛受到关注，其可以大大地加快反应的进行并有效地提高产率。微波对物质分子的作用是直接作用于分子内部的。物质分子偶极振动同微波振动具有相似的频率，在快速振动的微波磁场中，分子的偶极振动尽力同磁场振动相匹配，而分子的振动又往往滞后于磁场，物质分子吸收电磁能以每秒数十亿次高速振动从而加速分子间的作用。其中极性物质受到微波的作用更加明显，而蛋白质和多肽都是典型的极性分子，所以微波能够加速嗜热菌蛋白酶与载体的共价连接。因此研究中性盐增溶和微波辐射强化嗜热菌蛋白酶固定化具有重要意义，可以将酶的固定化技术提高到一个新的水平。

所述嗜热菌蛋白酶以MES-NaOH溶液分散后添加到载体液中，所述嗜热菌蛋白酶在MES-NaOH溶液中浓度为0.5～2mg/mL，所述MES-NaOH溶液组成如下：NaCl 2～5M，ZnCl₂ 10～30mM，MES-NaOH 0.01～0.05M，pH 7.0～7.5，溶剂为水。

步骤(1)中对苯醌溶液与MCFs-NH₂的体积质量用量之比为2～5ml∶10mg。

步骤(1)中重新分散时所用的MES-NaOH溶液与MCFs-NH₂的体积质量用量之比为2～5ml∶10mg。

所述方法如下：

(A)酶的分散：取嗜热菌蛋白酶，用MES-NaOH溶液分散，在-4℃下放置半小时，即得嗜热菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液；

(B)载体活化：将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH₂浸渍在1.5mM的对苯醌溶液中，在25℃、160rpm的条件下振荡活化2小时，离心，取沉淀依次用20％乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；活化时所用的对苯醌溶液与MCFs-NH₂的体积质量用量之比为3ml∶10mg；重新分散时所用的MES-NaOH溶液与MCFs-NH₂的体积质量用量之比为2～2.6ml∶10mg；

(C)酶的固定化：将活化的载体液，按40～100mg嗜热菌蛋白酶(以自由酶计)/g MCFs-NH₂的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应20h或者在0～7℃、40W微波条件下照射3min，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；

步骤(A)～(C)中所述MES-NaOH溶液组成如下：NaCl 3M，ZnCl₂20mM，MES-NaOH 0.02M，pH 7.0，溶剂为水。

本发明中，所述氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH₂可按如下方法制备得到：

①水热过程：先称取P123(三嵌段共聚物：聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇))5～10g用水分批次溶解，再加入50～100mg氟化铵后开始搅拌，再加入5～10ml TMB(1.3.5-三甲苯)和25～50ml盐酸(36％～38％，w/w)，200～300rpm、10～50℃下搅拌20～60min，然后加入10～30ml TEOS(正硅酸四乙酯)，继续搅拌12～24h后，将溶液转入高压反应釜中，置于烘箱中100～200℃，老化6～30h，最后用水过滤，所得载体烘干待用；

②去模板反应：称取步骤①所制的载体0.5～3.5g于高压反应釜中，加入5～25ml浓硝酸(65％～68％，w/w)和1～10ml双氧水(H₂O₂浓度20～40％，v/v)，置于烘箱中50～150℃反应6～30h，用水洗涤过滤，得到去模板载体烘干待用；

③硅烷化：称取2～10g步骤②制得的去模板载体于三口烧瓶中，加入甲苯200～300ml和氨基化试剂(例如硅烷偶联剂)20～60ml，再通冷凝水，油浴100～150℃加热回流6～30h，待反应结束后冷却分别用甲苯和无水乙醇洗涤，待载体中的有机溶剂基本挥发之后，放入烘箱中烘干，即得所述氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH₂。

为了将微波辅助固定化与常规方法进行比较，本发明实施了嗜热菌蛋白酶的常规固定化和微波条件下固定化方法，微波条件下固定化方法得到的固定化嗜热菌蛋白酶在催化活力，耐热性，耐有机溶剂的性能上都得到了巨大的提高：(1)固定化嗜热菌蛋白酶的催化活力得到了提高，其催化活力是自由酶催化活力的1.6倍，是常规固定化酶催化活力的4.5倍。(2)固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性有所改善。当在70℃的条件下孵育3.5h，固定化嗜热菌蛋白酶的活力没有降低，而自由酶在孵育3h后就已经没有活性。当在80℃的条件下孵育60min，自由酶已经完全没有活性，而固定化酶却保留着74.1％的催化活性。(3)固定化嗜热菌蛋白酶抵御有机溶剂的性能也得到了很大的提高。在5％叔戊醇中70℃下孵育2h，固定化酶的活性没有改变，而自由酶的催化活力降低了32.5％。甚至在80％叔戊醇中70℃下孵育2h，固定化酶还保留着46.3％的催化活力，自由酶已经完全没有活力了。对于乙酸乙酯来说，固定化嗜热菌蛋白酶也展示了强大的抵御能力。在5％乙酸乙酯中70℃下孵育2h，当自由酶的活力降低了32.5％时，固定化酶却保留着92％的活力。而在80％乙酸乙酯中70℃下孵育2h时，自由酶已经毫无活力了，固定化酶却保留着53.1％的催化活力。

本发明的有益效果体现在，通过本发明方法制得的固定化嗜热菌蛋白酶在性能上比自由酶有了很大的提高。而且，通过本发明方法对嗜热菌蛋白酶进行固定化还大大地缩短了固定化时间，从20h缩短到了3min，整整缩短了399倍，这使得酶固定化的成本得到了降低。

(四)附图说明

图1为嗜热菌蛋白酶催化合成阿斯巴甜前体的机制；其中，ZD：N-苄氧羰基-L-天冬氨酸FM：L-苯丙氨酸甲酯ZDFM：N-苄氧羰基-L-天门冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；

图2为对苯醌浓度对固定化嗜热菌蛋白酶负载率与催化活力的影响；

图3为氯化钠增溶和微波辅助共价固定化嗜热菌蛋白酶的反应机制；

图4为微波辐射功率对固定化嗜热菌蛋白酶负载率与催化活力的影响；

图5为自由酶和固定化酶的温度稳定性；其中，■：微波固定化嗜热菌蛋白酶孵育于70℃水浴中，●：微波固定化嗜热菌蛋白酶孵育于80℃水浴中，▲：嗜热菌蛋白酶自由酶孵育于70℃水浴中，★：嗜热菌蛋白酶自由酶孵育于80℃水浴中；

图6为自由酶和固定化酶在70℃水浴中的耐叔戊醇性；FE：嗜热菌蛋白酶自由酶MW-IME：微波固定化嗜热菌蛋白酶；

图7为自由酶和固定化酶在70℃水浴中的耐乙酸乙酯性；FE：嗜热菌蛋白酶自由酶MW-IME：微波固定化嗜热菌蛋白酶；

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：制备嗜热菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液

(1)取2mg嗜热菌蛋白酶(自由酶，购自于西格玛奥德里奇上海分公司，下同)，用2ml pH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液分散，在-4℃下放置半小时，既得1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液。

(2)取2mg嗜热菌蛋白酶，用2ml含有20mM ZnCl₂的pH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液分散，在-4℃下放置半小时，既得1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液。

(3)取2mg嗜热菌蛋白酶，用2ml含有3M NaCl，20mM ZnCL₂的pH7.0，0.02M的MES-NaOH溶液分散，在-4℃下放置半小时，既得1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液。

实施例2：将嗜热菌蛋白酶自由酶制备成固定化嗜热菌蛋白酶：

A.制备嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液：取2mg嗜热菌蛋白酶自由酶，用2ml含有3M NaCl，20mM ZnCl₂的pH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液分散，在-4℃下放置半小时，既得1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液。

B.将嗜热菌蛋白酶自由酶制备成固定化嗜热菌蛋白酶：

(1)载体MCFs-NH₂的制备：

①水热过程：先称取P123(三嵌段共聚物：聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇)，PEO-PPO-PEO)5.34g用水分批次溶解使其能全部转移到容器中去，再加入61.34mg氟化铵后安装开始搅拌，再加入6.2ml TMB(1.3.5-三甲苯)和27.4ml盐酸(36.5wt％)。设置搅拌转速为250rpm，40℃下搅拌45min，然后加入12.6ml TEOS(正硅酸四乙酯)，继续搅拌20h。搅拌完毕之后，将溶液转入高压反应釜中，至于烘箱中120℃，老化24h。最后用水过滤，烘干待用；

②去模板反应：称取上面所制的载体1.0g于高压反应釜中，加入10ml浓硝酸(65.5wt％)和7ml双氧水(30％，v/v)，置于烘箱中100℃反应12h。然后用水洗涤过滤，烘干待用；

③硅烷化：称取4.5g步骤②制得的去模板载体于三口烧瓶当中，然后加入甲苯270ml，氨基化试剂27ml(硅烷偶联剂JH-A112)，然后通冷凝水，油浴110℃加热回流12h，待反应结束后冷却然后分别用甲苯和无水乙醇洗涤，待载体中的有机溶剂基本挥发之后，放入烘箱中烘干得MCFs-NH₂，孔径为26nm；

(2)对载体进行活化处理：选用对苯醌溶液3ml使其在反应液的终浓度为1.5mM和10mg的MCFs-NH₂在25℃的恒温水浴摇床中160rpm的条件下振荡2小时，离心，取沉淀分别用20％(v/v)乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀并将其重新分散于2.6ml含有3M NaCl，20mM ZnCl₂的pH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液中，其中因离心过程中固液实现分离，故认为载体重量保持不变，仍为10mg。

(3)取步骤(2)得到的活化的载体液2.6ml，再加入步骤A制得的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液0.4ml，混匀得混合液，所述的固定化酶制备过程中加酶量为40mg嗜热菌蛋白酶自由酶/g MCFs-NH₂.(4)取步骤(3)的混合液进行固定化处理：将混合溶液在冰浴中电磁搅拌反应20h，离心，用含有3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶。

实施例3：将嗜热菌蛋白酶自由酶用微波法制备成固定化嗜热菌蛋白酶：

B.将嗜热菌蛋白酶自由酶制备成固定化嗜热菌蛋白酶：

(1)载体的制备：

同实施例2。

(2)对载体进行活化处理：选用对苯醌溶液3ml使其在反应液的终浓度为1.5mM和10mg的MCFs-NH₂在25℃的恒温水浴摇床160rpm的条件下振荡2小时，离心，取沉淀分别用20％乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀并将其重新分散于2.6ml含有3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液中，其中因离心过程中固液实现分离，故认为载体重量保持不变，仍为10mg。

(3)取步骤(2)得到的活化的载体液2.6ml，再加入步骤A制得的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液0.4ml，混匀得混合液，所述的固定化酶制备过程中加酶量为40mg嗜热菌蛋白酶自由酶/gMCFs-NH₂。

(4)取步骤(3)的混合液进行固定化处理：将混合溶液在0～7℃，40W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用含有3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到微波固定化嗜热菌蛋白酶。

实施例4：活化载体的交联剂种类对固定嗜热菌蛋白酶的影响

用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液和戊二醛溶液分别对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(1)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液。

对于环氧基化的MCFs不需要活化，直接将10mg环氧基化的MCFs(制备过程参见实施例2，这里用的硅烷偶联剂是JH-S1891)溶解于2ml PH7.0，0.02M MES-NaOH溶液中。再按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(1)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml混匀得混合液。

将以上三种混合液分别在冰浴中电磁搅拌反应20h，离心，用PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶。对这三个固定化酶进行活力测定，结果见表1。

表1：交联剂种类对固定化嗜热菌蛋白酶活性的影响

由表1可见，交联剂为对苯醌时其固定化酶比活力为2357.6U/mg，为这三组实验的最优结果，因而后续实验选用的交联剂为对苯醌。

实施例5：活化载体的对苯醌浓度对载体MCFs-NH₂固定嗜热菌蛋白酶的影响

用3ml终浓度分别为0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM的对苯醌溶液分别对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(1)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液，并在冰浴中电磁搅拌反应20h，离心，用PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶。

对这五个对苯醌浓度活化载体的酶分别进行活力测定，对应各组所得固定化嗜热菌蛋白酶的比活力为1188.6U/mg、1569.1U/mg、2357.6U/mg、1936U/mg、1888.9U/mg，结果见图1。

由图1可见对苯醌浓度为1.5mM时其固定化酶比活力为2357.6U/mg，为几组实验的最优结果，因而后续微波固定化嗜热菌蛋白酶的制备中对苯醌终浓度选定为1.5mM。

实施例6：中性盐对固定化嗜热菌蛋白酶催化活性的影响。

用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml分别包含CaCl₂；ZnCl₂；CaClL₂、ZnCl₂；ZnCl₂、NaCl的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(1)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液，将混合液在0～7℃，30W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用固定化所用的缓冲液洗涤，得到微波固定化嗜热菌蛋白酶。并对这几组固定化酶进行活力测定，不同的体系对应的相对活力见表2。

表2：中性盐对固定化嗜热菌蛋白酶活力的影响

由表2可见，CaCl₂对固定化嗜热菌蛋白酶的催化活性几乎没有影响，NaCl对固定化嗜热菌蛋白酶的催化活性有着巨大的提高，虽然ZnCl₂对固定化嗜热菌蛋白酶的催化活性有着一定的影响，但相比于NaCl其的影响力相对较小。20mM ZnCl₂、3M NaCl的体系使得固定化嗜热菌蛋白酶的相对活力为82.9％，故后续反应以此体系为反应体系。

实施例7：常规固定化与微波辅助固定化的对比

(1)用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(1)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液，并在冰浴中电磁搅拌反应20h，离心，用PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶。

(2)用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml包含20mM ZnCl₂PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(2)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液，并在冰浴中电磁搅拌反应20h，离心，用包含20mM ZnCl₂PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶。

(3)用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml包含3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(3)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液，并在冰浴中电磁搅拌反应20h，离心，用包含3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶。

(4)用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(1)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液，将混合溶液在0-7℃，40W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到微波固定化嗜热菌蛋白酶。

(5)用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml包含20mM ZnCl₂PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(2)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液，将混合溶液在0～7℃，40W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用含有20mM ZnCL₂PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到微波固定化嗜热菌蛋白酶。

(6)用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2ml包含3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(3)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液1ml，混匀得混合液，将混合液在0～7℃，40W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用含有3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到微波固定化嗜热菌蛋白酶。

(7)将以上制得的固定化嗜热菌蛋白酶进行活力测试对应的相对活力，结果见表3。

表3：常规固定化与微波固定化嗜热菌蛋白酶活力的比较

由表3可见，微波辐射不但可以使固定化嗜热菌蛋白酶的催化活性得到提高，而且还使得固定化时间缩短了399倍。

实施例8：加酶量对固定嗜热菌蛋白酶的影响

用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体分别用2～2.6ml包含3M NaCl，20mMZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。分别按照40-100mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(3)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液0.4～1ml，混匀得混合液，将混合液在0～7℃，40W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用含有3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到微波固定化嗜热菌蛋白酶。再将这4组固定化嗜热菌蛋白酶进行活力测定得到相对活力，结果见表4。

表4：加酶量对固定化嗜热菌蛋白酶活力的影响

由表4可见，当加酶量为40mg酶/g载体时固定化嗜热菌蛋白酶的相对活力为115.4％为最优。

实施例9：微波辐射功率对固定嗜热菌蛋白酶的影响

用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对10mg的MCFs-NH₂进行活化处理，将经活化处理后的载体用2.6ml包含3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照40mg酶/g载体的质量比，加入实施例1(3)得到的1mg/ml的嗜热菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液0.4ml，混匀得混合液，将混合液在0～7℃，20～50W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用含有3M NaCl，20mM ZnCl₂的PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液洗涤，得到微波固定化嗜热菌蛋白酶。再将这7组固定化嗜热菌蛋白酶进行活力测定得到的相对活力分别为82.9％、110.8％、115.4％、129.2％、156％、85.7％、82.5％，结果见图4。

由图4可见，当微波辐射功率为40W时，固定化嗜热菌蛋白酶的相对活力为156％，为最优结果。

实施例10：嗜热菌蛋白酶自由酶、微波固定化嗜热菌蛋白酶性能比较：

取嗜热菌蛋白酶自由酶(简称自由酶)，实施例3制得的微波固定化嗜热菌蛋白酶(简称微波固定化酶)进行如下实验：

(1)温度稳定性

在工业中采用较高的反应温度，有以下一些优势：较高的反应速率、变反应平衡、更好的底物溶解性、较低的反应介质粘度以及微生物污染可能性降低等。因此热稳定性的酶对于工业应用具有重要意义。自由酶、微波固定化酶在不同温度分别保温30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟后，测定其残余活力，和未保温的样品相比，评价其温度稳定性，结果见图5。

结果显示，微波固定化酶在70℃条件下保温3.5小时后活力保持不变，在80℃条件下保温1小时后，微波固定化酶残余活力仍有74.1％，较自由酶其温度稳定性有很大提高。

(2)耐叔戊醇性

自由酶、微波固定化酶在70℃下分别在不同含量叔戊醇的体系中保温2小时测定其残余活力，和在水相中未保温的样品相比，评价其耐叔戊醇性，结果见图6。

结果显示，微波固定化酶在5％的叔戊醇中保温2小时后活力保持不变甚至在80％的叔戊醇中还保持着46.3％的活性。而自由酶在5％的叔戊醇中保温2小时后失去了32.5％的活性，在80％的叔戊醇中基本没有活性了。

(3)耐乙酸乙酯性

自由酶、微波固定化酶在70℃下分别在不同含量乙酸乙酯的体系中保温2小时测定其残余活力，和在水相中未保温的样品相比，评价其耐乙酸乙酯性，结果见图7。

结果显示，微波固定化酶在5％的乙酸乙酯中保温2小时后只有8％的活力丢失，而自由酶却丢失了32.5％的活力。当在80％的乙酸乙酯中保温2小时后，微波固定化酶仍有53.1％的催化活性，而自由酶完全失去活性

(4)固定化酶的动力学性能

将自由酶、微波固定化酶在不同ZAPM底物浓度下反应，测试其酶的催化活性。结果见表5。

表5：微波固定化嗜热菌蛋白酶的相关动力学常数

结果显示，微波固定化酶在低底物浓度下的催化效果可以达到自由酶在高底物浓度作用下的催化效果。

Claims

1.一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法，所述方法包括：

（1）载体活化：将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH₂浸渍在0.5~2.5mM的对苯醌溶液中，在20~30℃、100~200rpm的条件下振荡活化1~3小时，离心，取沉淀依次用20~30%乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；

（2）酶的固定化：将活化的载体液，按40~100mg嗜热菌蛋白酶/gMCFs-NH₂的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应18~20h或者在0~7℃、20~50W微波条件下照射2~4min，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；所述嗜热菌蛋白酶以MES-NaOH溶液分散后添加到载体液中；步骤（1）和（2）中所述MES-NaOH溶液组成如下：NaCl2~5M，ZnCl₂10~30mM，MES-NaOH0.01~0.05M，pH7.0~7.5，溶剂为水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中对苯醌溶液与MCFs-NH₂的体积质量用量之比为2~5ml：10mg。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中重新分散时所用的MES-NaOH溶液与MCFs-NH₂的体积质量用量之比为2~5ml：10mg。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

（A）酶的分散：取嗜热菌蛋白酶，用MES-NaOH溶液分散，在-4℃下放置半小时，即得嗜热菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液；

（B）载体活化：将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH₂浸渍在1.5mM的对苯醌溶液中，在25℃、160rpm的条件下振荡活化2小时，离心，取沉淀依次用20%乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；

（C）酶的固定化：将活化的载体液，按40~100mg嗜热菌蛋白酶/gMCFs-NH₂的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应20h或者在0~7℃、40W微波条件下照射3min，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；

步骤（A）~（C）中所述MES-NaOH溶液组成如下：NaCl3M，ZnCl₂20mM，MES-NaOH0.02M，pH7.0，溶剂为水。