CN109750025A

CN109750025A - 一种水凝胶包覆树枝状二氧化硅固定化cpo酶反应器及其制备方法和应用

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Publication number: CN109750025A
Application number: CN201811630107.9A
Authority: CN
Inventors: 蒋育澄; 张广才; 王渭军; 任建军; 陈宝林
Original assignee: Zhejiang Pharmaceutical Ltd By Share Ltd Changhai Biological Branch Co; Shaanxi Normal University
Current assignee: Zhejiang Pharmaceutical Ltd By Share Ltd Changhai Biological Branch Co; Shaanxi Normal University; Zhejiang Medicine Co Ltd Changhai Biological Co
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-05-14

Abstract

本发明公开了一种水凝胶包覆树枝状二氧化硅固定化CPO酶反应器及其制备方法和应用，首先合成具有开放性中心辐射状的树枝状二氧化硅球形纳米粒子，以此为固相载体将CPO包埋于载体的孔道中，最后在载体外部包覆一层水凝胶薄膜，在不影响固定化酶催化活性的前提下，改善酶在物理吸附固定方式中容易泄露的问题。本发明固定方法简单，降低了酶的成本，具有客观经济效益，与共价固定相比，酶的活性损失较少，固定化酶的催化活性为游离酶的91.45％，重复使用10次后能保持90％催化活性，重复使用20次后仍能保持50％的活性；用此酶反应器降解左氧氟沙星，当左氧氟沙星含量达到100μg/mL时，降解率达到83.05％；用此酶反应器降解利福昔明，当利福昔明含量达到50μg/mL时，降解率达到85.70％。

Description

一种水凝胶包覆树枝状二氧化硅固定化CPO酶反应器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶的固定化技术领域，具体涉及一种水凝胶包覆的树枝状二氧化硅纳米粒子固定化氯过氧化物酶反应器，以及该酶反应器的制备方法和应用。

背景技术

酶是一类由生物细胞产生的具有催化功能的蛋白质，对于催化反应具有专一高效、速度快、条件温和、环境友好等特点，因此被广泛用于合成化学、食品、制药、废水处理等行业。而游离酶在实际应用中也存在着弊端，比如在高温、有机溶剂、强酸强碱、机械外力作用等环境下都容易导致酶变性失活，导致催化效率降低，难以回收重复利用。酶固定化技术是抑制弊端的有效方法。与游离酶相比，固定化酶具有提高酶的操作稳定性，在反应体系中容易实现底物与产物分离，可实现多次重复使用，从而降低酶的使用成本等多种优势。

然而，在固定化酶的设计和制备方面目前仍然存在着一些普遍性的问题：与游离酶相比，固定化酶的稳定性得以提高常常是以牺牲部分催化活性为前提和代价的，因为：(1)酶固定化过程中酶与载体之间的相互作用不可避免地会在一定程度上改变酶分子表面氨基酸残基的构象以及活性位点的微环境，这两种因素都导致固定化酶与游离酶相比催化活性有所下降；(2)为了克服固定化酶在使用过程中酶分子的脱落现象，需要加强酶分子与载体之间的相互作用，但往往相互作用越强，酶分子的结构和构象的改变就越大，因而酶活性损失就越大。

因此，如何制备兼具高催化活性、高稳定性及高重复使用性的固定化酶反应器一直是一个挑战。

氯过氧化物酶(CPO)是从海洋真菌分离出来的一种血红素糖蛋白酶。它具有过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素P-450的催化活性，能广泛地有效地催化卤化、氧化、过氧化、环氧化、羟化反应及高对映选择性的反应等。

介孔二氧化硅材料易于大规模合成，具有可调的孔径尺寸和结构，比表面积高，孔隙率高，热稳定性高，机械稳定性高，易在孔道表面或粒子表面进行选择性功能化。其中，树枝状多孔二氧化硅球形纳米粒子由于具有三维的开放性中心辐射状的树枝状超结构，因而具有更高的孔渗透性、更大的孔体积、更好的粒子内表面的可接触性等。

水凝胶(Hydrogel)是以水为分散介质的凝胶。具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物，是一种良好的包覆物。

海藻酸钠是一种从天然褐藻中提取出来的聚阴离子多糖(海藻酸)的钠盐，由β-D-甘露糖醛酸(M糖)和α-L-古洛糖醛酸(G糖)两种结构单元链链接而成。分子中含有大量的羟基和羧基，具有很强的亲水性，是一种理想的水凝胶材料，优点如下：(1)凝胶网络保证了含水的微环境，有利于生物大分子的存活；(2)包埋生物大分子条件温和，不需要有机溶剂，有助于生物大分子的生存；(3)具有比较高的凝胶孔径，有助于生物大分子的扩散；(4)可以通过不同的涂层方法控制凝胶的孔径；(5)在一般的生理条件下，海藻酸可以分解和生物降解。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种兼具高催化活性、高稳定性及高重复使用性的水凝胶包覆的树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器，以及该酶反应器的制备方法，并为该酶反应器提供新的应用。

解决上述技术问题所采用的二氧化硅固定氯过氧化物酶反应器由水凝胶包裹，其中二氧化硅为树枝状介孔二氧化硅。

上述的水凝胶为天然多糖或合成的亲水高分子化合物，其中所述的天然多糖包括香菇多糖、壳聚糖、透明质酸或其盐、海藻酸或其盐中任意一种，优选海藻酸钠。

上述二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器的制备方法由下述步骤组成：

1、将树枝状介孔二氧化硅加入到pH为2～3的PBS缓冲液中，然后加入氯过氧化物酶溶液，恒温震荡，离心分离，并用PBS缓冲液对固体进行清洗，以除去未固定的氯过氧化物酶，得到树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶。

2、将树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶加入pH为6～6.5的PBS缓冲液中，超声分散均匀，然后加入水凝胶溶液进行交联反应，反应完后离心分离，得到水凝胶包覆的树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器。

上述步骤1中，优选树枝状介孔二氧化硅与氯过氧化物酶溶液的质量-体积比为1mg:2～5μL，所述氯过氧化物酶溶液的pH为5～6，其中氯过氧化物酶的浓度为0.20～0.30nmol/L。

上述步骤1中，优选震荡的温度为10～20℃，震荡时间为40～70min。

上述骤2中，优选树枝状二氧化硅固定化的氯过氧化物酶与水凝胶、交联剂的质量比为1:0.4～2:0.5～2，其中优选水凝胶海藻酸钠，交联剂为CaCl₂。

本发明水凝胶包覆的树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器在降解左氧氟沙星中的应用。

本发明水凝胶包覆的树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器在降解利福昔明中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以树枝状二氧化硅作为载体，通过物理吸附的方式将CPO固载在了二氧化硅球形纳米粒子的孔道中，所制备的CPO固定化酶反应器兼具高催化活性、高稳定性及高重复使用性。原因在于：(1)与共价结合相比，采用物理吸附的方式固定酶可减小酶固定化过程中酶与载体之间的相互作用，因而减小酶分子表面氨基酸残基的构象以及活性位点的微环境的改变，这样就能使得更多的酶活性被保留下来；(2)本发明中制备的树枝状二氧化硅中的孔径处于介孔范围，更主要的是与CPO的尺寸相匹配，可实现酶分子的单阵列固定，从而避免了由于大量酶分子存在于孔道中迫于孔道内的限域压力而发生聚集，而这种聚集可导致酶分子中底物通道被堵而影响其催化活性；(3)树枝状二氧化硅具有三维的开放性中心辐射状的树枝状超结构，因而具有更高的孔渗透性、更大的孔体积、更好的粒子内表面可接触性等，因而与传统二氧化硅载体相比，酶的固载量有所提高，同时也有利于底物与酶分子的接触，即有利于催化活性；同时，本发明中在树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶的表面包覆一层水凝胶薄膜，解决了物理吸附法中由于酶与载体间的相互作用力较弱而导致的固定化酶容易泄露的问题，进一步提高了固定化酶的重复使用性。虽然这层膜的存在无异会增大底物的传质阻力从而导致部分催化活性的损失。但通过对香菇多糖、丙烯酸、聚丙烯酰胺及海藻酸钠等形成的水凝胶薄膜进行筛选，发现海藻酸钠水凝胶的效果是最好的。本发明中提供的海藻酸钠水凝胶的制备方法可达到水凝胶网络与树枝状二氧化硅的介孔孔径以及底物大小相匹配，从而最大程度上减小底物在跨跃水凝胶膜时的传质阻力，从而最大程度上保留固定化酶的催化活性。事实上，海藻酸钠水凝胶包覆后固定化酶的催化活性基本上与包覆前一致。。

本发明利用树枝状多孔二氧化硅球形纳米粒子作为载体固定CPO，所制备的CPO酶反应器兼具高催化活性、高稳定性及高重复使用性。固定化酶可保留游离酶催化活性的91.45％，重复使用10次后，残余催化活性为90％，使用20次后残余催化活性为50％。用此酶反应器降解左氧氟沙星效果显著，当左氧氟沙星含量达到100μg/mL时，降解率达到83.05％。

附图说明

图1是实施例1制备的SA@CPO@DMSNs的透射电镜图。

图2是游离CPO与SA@CPO@DMSNs转化MCD的催化活性对比图。

图3是SA@CPO@DMSNs的重复使用性图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

下面的树枝状介孔二氧化硅根据文献“Weston D E.Horizontal Refraction ina Three-dimensional Medium of Variable Stratification[J].Proceedings of thePhysical Society,2002,78(1):46.”中公开的方法制备而成，具体制备方法为：在100mL容量瓶中加入6g十六烷基三甲基氯化铵、0.16mL三乙醇胺以及36mL去离子水，在磁力搅拌器中60℃、150rpm转速下搅拌1h直至溶解，随后逐滴加入1mL正硅酸乙酯、19mL环己烷，得到的混合液在60℃、150rpm转速下水浴反应12h，反应完后冷却至室温，用移液枪移出上层油相，下层水相离心分离产物，并用乙醇清洗3次。之后将产物转移到坩埚中，在马弗炉中550℃条件下煅烧5h以除掉模板剂，得到树枝状介孔二氧化硅(DMSNs)。

实施例1

1.称取5mg DMSNs加入到1450μL pH＝2.5的PBS缓冲液中，并加入10μL游离CPO溶液(0.28nmol/L，pH＝4.0)，置于恒温震荡摇床中20℃震荡1h，然后以6000rmp的转速离心3min，将上清液和固体分离，并用pH＝2.5的PBS缓冲液对固体进行清洗2～3次，以除去DMSNs表面未固定的CPO，得到树枝状二氧化硅固定化的氯过氧化物酶(CPO@DMSNs)。

2.取5mg CPO@DMSNs加入到600μL 20mM pH＝6.5的PBS缓冲液中，超声分散20min，然后加入400μL 20mg/mL的海藻酸钠(SA)水溶液和500μL 0.1mol/L的CaCl₂水溶液，于室温下反应12h，反应完后以10000rmp的转速离心分离5min，得到海藻酸钠包覆的树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器(见图1)，记为SA@CPO@DMSNs。

对制备的SA@CPO@DMSNs进行性能测试，具体试验如下：

1.催化活性实验

SA@CPO@DMSNs的催化活性通过催化2-氯-5,5-二甲基-1,3-环己二酮(MCD)生成2,2-二氯-5,5-二甲基-1,3-环己二酮(DCD)的氯化反应来测定，具体步骤如下：25℃下，取两个石英比色皿，分别加入5μL游离CPO溶液(0.28nmol/L)和5mg SA@CPO@DMSNs，加入1420μL0.1mol·L^-1pH＝2.75的PBS缓冲液、50μL0.1mol·L^-1MCD水溶液，然后加入30μL 0.1mol·L^-1H₂O₂水溶液引发反应，反应总体系体积为1.5mL。用紫外分光光度计测定278nm处吸光度值的变化以确定游离CPO和SA@CPO@DMSNs的催化活性。

MCD的转换率由下述公式计算：

式中A_t：加酶后上清液在t时刻的吸光度值；A₀：未加酶时反应体系的吸光度值。结果见图2。

由图2可见，以游离CPO的催化活性为100％计，SA@CPO@DMSNs保留有较高的催化活性，约为91.45％。

2.重复使用性实验

通过MCD模型反应来表征催化，具体步骤如下：25℃下，在石英比色皿中加入5mgSA@CPO@DMSNs、1420μL 0.1mol·L^-1pH＝2.75的PBS缓冲液、50μL0.1mol·L^-1MCD水溶液，然后加入30μL 0.1mol·L^-1H₂O₂水溶液引发反应，反应总体系体积为1.5mL。用紫外分光光度计测定278nm处吸光度值。

每次反应结束后，将反应液在6000rpm转速下离心1min以分离上清液，吸取出上清液后，继续加入等量的PBS缓冲液、MCD水溶液和H₂O₂水溶液以开始下一次的反应。将第一次使用SA@CPO@DMSNs的活性视为100％，将之后每一次SA@CPO@DMSNs的催化活性与第一次对比，以残余活性来表示。结果见图3。

由图3可见，重复使用10次后，SA@CPO@DMSNs的残余活性仍高达90％，重复使用20次后，残余活性达到50％。

实施例2

采用实施例1制备的SA@CPO@DMSNs降解左氧氟沙星

在10mL离心管中加入5mg SA@CPO@DMSNs、2480μL PBS缓冲液液(0.1mol·L^-1，pH＝2.75)、500μL不同浓度左氧氟沙星的标准溶液(10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，最后加入20μL0.1mol·L^-1H₂O₂水溶液启动反应。在磁力搅拌下室温反应25min，反应结束后用乙酸乙酯萃取3次。最后用旋转蒸发仪将萃取液全部蒸发、去除，然后用色谱纯乙腈溶解样品，得到粗样。粗样经0.22μm的有机相过滤膜过滤后用于高效液相色谱(HPLC-15C)分析测定，高效液相色谱测定条件为：等梯度模式下采用乙腈-KH₂PO₄溶液(V/V＝20:70)为流动相，流速1.0mL/min，检测波长294nm，柱温40℃，进样量20μL。

降解率(η)的计算根据公式

η＝(A₀-A_t)/A₀×100％

式中A_t：加酶后上清液在t时刻的吸光度值；A₀：未加酶时反应体系的吸光度值。

实验结果显示，左氧氟沙星浓度为10μg/mL时，SA@CPO@DMSNs对盐酸左氧氟沙星的降解率为95.00％；左氧氟沙星浓度为20μg/mL时，SA@CPO@DMSNs对盐酸左氧氟沙星的降解率为93.50％；左氧氟沙星浓度为50μg/mL时，SA@CPO@DMSNs对盐酸左氧氟沙星的降解率为92.50％；左氧氟沙星浓度为100μg/mL时，SA@CPO@DMSNs对盐酸左氧氟沙星的降解率为83.05％。

实施例3

采用实施例1制备的SA@CPO@DMSNs降解利福昔明

(1)配制流动相

称量KH₂PO₄ 3.4g，溶解并在250mL容量瓶中定容，称量NaAc 2.05g，溶解并在250mL容量瓶中定容，然后将二者等体积混合。用0.1mol·L^-1柠檬酸水溶液调节溶液pH为2.6，此溶液为缓冲液。以乙腈、甲醇、缓冲液体积比＝44:16:40为流动相。

(2)降解利福昔明

以蒸馏水为溶剂，配制不同浓度的利福昔明标准液(10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)的样品；取五个10mL离心管分别加入500μL利福昔明标准液、2400μLPBS缓冲溶液(pH＝2.75)、5mg SA@CPO@DMSNs、100μL质量分数为30％的H₂O₂溶液，室温反应30min。反应后用磁铁除去固体材料，用乙酸乙酯萃取产物(3mL×3次)，利用旋转蒸发将产物提取出来，然后用流动相溶解样品，得到粗样。粗样经0.22μm有机相过滤膜过滤后用于高效液相色谱(HPLC-15C)分析测定。

高效液相色谱测定条件为：等梯度模式下采用乙腈-甲醇-缓冲液体积比＝44:16:40为流动相，流速1.0mL·min^-1，检测波长254nm，柱温为室温，进样量20μL。

实验结果显示，利福昔明浓度为10μg/mL时，SA@CPO@DMSNs对利福昔明的降解率为87.00％；利福昔明浓度为20μg/mL时，SA@CPO@DMSNs对盐利福昔明的降解率为88.50％；利福昔明浓度为50μg/mL时，SA@CPO@DMSNs对利福昔明的降解率为85.70％。

实施例4

采用实施例1制备SA@CPO@DMSNs的方法，考察不同SA含量对CPO酶反应器催化效果的影响(以MCD的催化转化率为活性评价指标)，如表1。

表1

SA:CPO@DMSNs(质量比)	2:5	4:5	6:5	8:5	10:5
						CPO酶反应器的催化活性	90.01％	90.73％	91.05％	92.01％	89.77％

当SA与CPO@DMSNs的质量比达到8:5时，形成的膜厚度适宜，能达到最佳的催化活性。在SA/CPO@DMSNs(质量比)2:5至10:5的范围内，酶反应器都能保持较高活性。

实施例5

采用实施例1制备SA@CPO@DMSNs的方法，考察不同水凝胶对CPO酶反应催化效果的影响，如表2。

表2

水凝胶类型	海藻酸钠	壳聚糖	透明质酸	香菇多糖
					CPO酶反应器的催化活性	92.01％	91.77％	91.40％	90.33％

实施例6

采用实施例1制备SA@CPO@DMSNs的方法，考察不同海藻酸盐的金属离子种类对CPO酶反应器催化效果的影响，如表3。

表3

金属离子

Na+

K+

Ca2+

Zn2+

Mg2+

Al3+

CPO酶反应器的催化活性

92.01％

90.84％

90.88％

85.30％

72.84％

70.25％

需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。

Claims

1.一种二氧化硅固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：所述二氧化硅固定化的氯过氧化物酶由水凝胶包裹，其中二氧化硅为树枝状介孔二氧化硅。

2.根据权利要求1所述二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器，其特征在于：所述水凝胶为天然多糖或合成的亲水高分子化合物。

3.根据权利要求2所述二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器，其特征在于：所述水凝胶为天然多糖，包括香菇多糖、壳聚糖、透明质酸或其盐、海藻酸或其盐中任意一种。

4.根据权利要求3所述二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器，其特征在于：所述水凝胶为海藻酸钠。

5.一种根据权利要求1～4任意一项所述的二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器的制备方法，其特征在于它由下述方法制备得到：

(1)将树枝状介孔二氧化硅加入到pH为2～3的PBS缓冲液中，然后加入氯过氧化物酶溶液，恒温震荡，离心分离，并用PBS缓冲液对固体进行清洗，以除去未固定的氯过氧化物酶，得到树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶；

(2)将树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶加入pH为6～6.5的PBS缓冲液中，超声分散均匀，然后加入水凝胶与交联剂交联反应，反应完后离心分离，得到水凝胶包覆的树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述树枝状介孔二氧化硅与氯过氧化物酶溶液的质量-体积比为1mg:2～5μL。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述氯过氧化物酶溶液的pH为5～6，其中氯过氧化物酶的浓度为0.20～0.30nmol/L。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，震荡的温度为10～20℃，震荡时间为40～70min。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述树枝状二氧化硅固定化氯过氧化物酶与水凝胶、交联剂的质量比为1:0.4～2:0.5～2。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的水凝胶为海藻酸钠，交联剂为CaCl₂。

11.根据权利要求1～4所述的任一二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器在降解左氧氟沙星中的应用。

12.根据权利要求1～4所述的任一二氧化硅固定化氯过氧化物酶反应器在降解利福昔明中的应用。