CN101230403B - 解析染色体端粒g-末端序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解析染色体端粒G-末端序列的方法，包括以下步骤：1)设计动物连接子和/或植物连接子；2)采用常规方式制备动物和/或植物基因组DNA样品；3)分别将上述每份动物基因组DNA样品与动物连接子连接，和/或分别将上述每份植物基因组DNA样品与植物连接子连接；得连接后的DNA样品；4)分别将上述每份连接后的样品进行PCR扩增反应，得PCR产物；5)分别将上述每份PCR产物定量分析，记录分析结果。采用本发明的方法能有效解析染色体端粒G-末端序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种染色体DNA分子鉴定技术，特别是一种解析染色体端粒G-末端序列的方法。
背景技术
端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构。近年来，大量研究表明染色体端粒与细胞遗传稳定，细胞***力、细胞生活力、生命力密切相关。它的长度随细胞的***次数而缩减，但它也能在端粒酶催化下合成和延伸，保持一定的长度。研究发现90％以上的人类癌变细胞都具有端粒酶活性，且端粒长度比正常组织更短。端粒由典型的DNA简单重复序列(TTAGGG)n(动物)，或(TTTAGGG)n(植物)组成。其中，富含鸟嘌呤核苷酸(Guanine)的DNA单链称为G-链，另一条富含胞嘧啶核苷酸(Cytosine)称为C-链，通常G-链比C-链长24～72b。G-链是端粒酶维持和延伸端粒的唯一作用链，尤其是它的末端序列组成可能直接影响了端粒酶的表达水平、作用方式和作用效率；可见G-末端序列组成至关重要。然而，现有的DNA分析相关鉴定技术，诸如经典的DNA印迹杂交(Southern Hybridization)技术，专一的TRF(Telomere RestrictFragment)端粒内切酶片断技术，以及最新的STELA(Single Telomere LengthAnalysis)技术都只能分析端粒的平均长度，却无法解析G-末端序列组成。因此，时至今日还没有一种技术方法能有效、快速地解析G-末端序列组成。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能有效解析染色体端粒G-末端序列的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种解析染色体端粒G-末端序列的方法，包括以下步骤：
1)、设计动物连接子和/或植物连接子；
2)、采用常规方式制备动物和/或植物基因组DNA样品；
3)、分别将上述每份动物基因组DNA样品与动物连接子连接，和/或分别将上述每份植物基因组DNA样品与植物连接子连接；得连接后的DNA样品；
4)、分别将上述每份连接后的样品进行PCR扩增反应，得PCR产物；
5)、分别将上述每份PCR产物定量分析，记录分析结果。
作为本发明的解析染色体端粒G-末端序列的方法的改进：动物连接子由一条5’端磷酸化的18个碱基的连接链和一条22个碱基的动物选择链组成，动物选择链的3’端第7～22碱基与连接链5’端的第1～16个碱基互补；植物连接子由一条5’端磷酸化的18个碱基的连接链和一条23个碱基的植物选择链组成，植物选择链的3’端第8～23碱基与连接链5’端的第1～16个碱基互补。
作为本发明的解析染色体端粒G-末端序列的方法的进一步改进：动物选择链可选用表1左侧中的任一个动物选择链(hSS)，植物选择链可选用表1右侧中的任一个植物选择链(pSS)，连接链选用表1中的动植物通用的连接链(LS)。
表1、连接子寡核苷酸序列
| hSS1：5’gatgaatcctgagtgtccctaa 3’ | pSS1：5’gatgaatcctgagtgtccctaaa 3’ | |
| hSS2：5’gatgaatcctgagtgtcctaac 3’ | pSS2：5’gatgaatcctgagtgtaccctaa 3’ | |
| hSS3：5’gatgaatcctgagtgtctaacc 3’ | pSS3：5’gatgaatcctgagtgtaacccta 3’ |
| hSS4：5’gatgaatcctgagtgttaaccc 3’ | pSS4：5’gatgaatcctgagtgtaaaccct 3’ | |
| hSS5：5’gatgaatcctgagtgtaaccct 3’ | pSS5：5’gatgaatcctgagtgttaaaccc 3’ | |
| hSS6：5’gatgaatcctgagtgtacccta 3’ | pSS6：5’gatgaatcctgagtgtctaaacc 3’ | |
| pSS7：5’gatgaatcctgagtgtcctaaac 3’ | ||
| 动植物通用的连接链(LS)：5’acactcaggattcatcct 3’ | ||
作为本发明的解析染色体端粒G-末端序列的方法的进一步改进：动物选择链为：3’端1～7个碱基不能改变，其余碱基容许有一定变化；植物选择链为：3’端1～8个碱基不能改变，其余碱基容许有一定变化。
作为本发明的解析染色体端粒G-末端序列的方法的进一步改进：PCR扩增反应中的上游引物根据待测染色体的亚端粒区域设计，下游引物为对应连接子的选择链。
本发明的解析染色体端粒G-末端序列的方法：在步骤1)中共设计出6个动物连接子和7个植物连接子；在步骤2)中为了确保基因组DNA样品的纯度和完整性，选用通用试剂盒的制备方法；在步骤3)中的基因组DNA与连接子连接，该连接是单链的端粒G-链与具有选择性的连接子的连接，它即不同于单链DNA与单链的寡核苷酸的无选择性连接，又有别于双链DNA与双链接头的两条DNA链完全连接；考虑到端粒末端存在“T”环结构，需要对基因组DNA进行高温解环处理，以增加连接效率；在步骤4)中的PCR扩增反应，PCR的上游引物需要根据待测染色体的亚端粒区域设计出专一引物，这可通过公开的生物信息网获得相关染色体端粒附近的序列，并进行常规引物设计，其退火温度应该设计在57～59℃，以匹配下游引物的退火温度；PCR下游引物与连接子的选择链寡核苷酸序列一致，根据常规PCR反应规则，执行PCR扩增反应；在步骤5)中的PCR产物定量分析，为减少PCR反应液以及未反应引物对产物定量测定的干扰，能比较不同端粒G-末端序列之间的差异，先将同一组样品的PCR产物和DNA标量一道进行琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色，并在254nm紫外光下进行高清晰的数码照相；再根据图片定量分析，记录分析结果。
本发明的解析染色体端粒G-末端序列的方法，具有如下优点：1)、本发明能准确的获得某染色体端粒G-末端最末尾的重复序列的序列；2)、通过图像定量分析，能获得基因组DNA中，某(某些)端粒的G-末端最末尾的重复序列的序列数量比值，以满足需要。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是人血红细胞基因组中第5染色体长臂端粒G-末端的PCR扩增图，所示G-末端序列明显以5’-AGGGTT-3’结尾为主；
图2是水稻基因组中第1染色体短臂端粒G-末端的PCR扩增图，所示G-末端序列明显以5’-TAGGGTT-3’结尾为主；
图3是大鼠基因组第四染色体长臂端粒G-末端的PCR扩增图，图示G-末端序列明显以5’-AGGGTT-3’结尾为主；
图4是拟南芥基因组第1染色体短臂端粒G-末端的PCR扩增图，所示G-末端序列明显以5’-TAGGGTT-3’结尾为主。
具体实施方式
实施例1、一种解析染色体端粒G-末端序列的方法，以人血细胞为材料，依次进行以下步骤：
1)、基因组DNA样品的制备：
用宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)提供的Universal Genomic DNAExtraction Kit(ver.3.0)试剂盒，根据试剂盒说明书分别提取、制备人基因组DNA样品。
2)、寡核苷酸合成及连接子准备：
通过上海生物工程公司合成表1所列的6个动物选择链(hSS)和1个动植物通用的连接链(LS)的寡核苷酸，并用去离子灭菌水分别溶解成20mM的寡核苷酸溶液。
将上述25u1动物选择链(hSS1～hSS6)溶液分别与等体积的连接链(LS)溶液混合均匀；再分别加热至95℃/3min后，自然冷却到室温；接着重复一次上述加热和冷却步骤；从而形成6种动物连接子，并将其对应地标识为：hLK1～hLK6。
3)、基因组DNA与连接子连接：
用去离子灭菌水将人基因组DNA样品稀释为200ng ul-1，加热到95℃/4min，立刻冰浴冷却15分钟；得人基因组DNA溶液。
制备含有不同连接子的反应液：
每10ul的反应液中含有：2ul 10x缓冲液、2ul 5U ul-1T4DNA连接酶、5ul去离子灭菌水和1ul动物连接子。动物连接子分别选用上述加热冷却后的hLK1～hLK6，从而形成6种反应液。
对上述6种反应液分别进行如下处理：
在10ul人基因组DNA溶液中加入10ul反应液混合均匀，16℃保温3小时；然后，65℃加热15分钟后冷却；接着加入80ul去离子灭菌水稀释；分别得到6种连接后的DNA样品，待用。
4)、样品PCR扩增反应：
对上述6种连接后的DNA样品分别进行如下处理：
在5ul连接后的DNA样品中加入对应的15ul PCR反应混合液均匀混合。该15ul PCR反应混合液由2ul 10x缓冲液、0.2ul 5U ul-1Taq DNA聚合酶、1.2ul 25mM MgCl2、1.6ul dNTP、0.2ul 20mM人基因组第五染色体长臂亚端粒区域特异引物(5’-gtaacacccaaaatatgatatcc-3’)、0.2ul 20mM对应的动物选择链(即与配对样品中的反应液所含的动物连接子相吻合)和9.6ul去离子灭菌水组成。再执行94℃/45sec，57℃/45sec and 72℃/70sec的PCR循环36次，接着72℃/5min延伸反应，4℃存放待用。
将所得的基因组的6个不同连接子的一组PCR产物和0.5ug(6ul)DNA标样(SMO311，MBI Fermentas)，在同一片1％琼脂糖凝胶上分离；然后，用0.1％溴化乙锭染色，并用GeneGenius Bio-imaging System(SYNGENE，Synoptics Ltd，Cambridge，UK)，254nm紫外光下拍照。
5)、图片定量分析：
利用GeneGenius tool(SYNGENE，Synoptics Ltd，Cambridge，UK)图像定量分析工具，根据DNA标样(SMO311，MBI Fermentas)说明书，6ul标样的750bp dsDNA条带含有21.5ng dsDNA，以此为标准，分别对PCR产物进行总量测定，获得人基因组第五染色体长臂端粒G-末端最末尾的重复序列的序列结果，具体如图1所示。这一结果清晰显示，本实验的人基因组样品中，第五染色体长臂端粒G-末端以5’-AGGGTT-3’结尾为主。
为了进一步验证这一结果，对扩增的PCR产物(图1中第5列)进行了常规的回收、克隆、测序，其结果与上述结论一致。
实施例2、一种解析染色体端粒G-末端序列的方法，以水稻幼苗为材料，依次进行以下步骤：
1)、基因组DNA样品的制备：
用宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)提供的Universal Genomic DNAExtraction Kit(ver.3.0)试剂盒，根据试剂盒说明书分别提取、制备水稻基因组DNA样品。
2)、寡核苷酸合成及连接子准备：
通过上海生物工程公司合成表1所列的7个植物选择链(pSS)和1个动植物通用的连接链(LS)的寡核苷酸，并用去离子灭菌水分别溶解成20mM的寡核苷酸溶液。
将25ul的植物选择链(pSS1～pSS7)溶液分别与等体积的连接链(LS)溶液混合均匀；再分别加热至95℃/3min后，自然冷却到室温；接着重复一次上述加热和冷却步骤；从而形成7种植物连接子，并将其对应地标识为：pLK1～pLK7。
3)、基因组DNA与连接子连接：
用去离子灭菌水将水稻基因组DNA样品稀释为200ng ul-1，加热到95℃/4min，立刻冰浴冷却15分钟；得水稻基因组DNA溶液。
制备含有不同连接子的反应液：
每10ul的反应液中含有：2ul 10x缓冲液、2ul 5U ul-1T4DNA连接酶、5ul去离子灭菌水和1ul植物连接子。植物连接子分别选用上述加热冷却后的pLK1～pLK7，从而形成7种反应液。
对上述7种反应液分别进行如下处理：
在10ul水稻基因组DNA溶液中加入10ul的反应液混合均匀，16℃保温3小时；然后，65℃加热15分钟后冷却；接着再加入80ul去离子灭菌水稀释，得到7种连接后的DNA样品，待用。
4)、样品PCR扩增反应：
对上述7种连接后的DNA样品分别进行如下处理：
在5ul连接后的DNA样品中加入对应的15ul PCR反应混合液均匀混合。该15ul的PCR反应混合液由2ul 10x缓冲液、0.2ul 5U ul-1Taq DNA聚合酶、1.2ul 25mM MgCl2、1.6ul dNTP、0.2ul 20mM水稻基因组第一染色体短臂亚端粒区域特异引物(5’-attctgtctctcttgagttact-3’)、0.2ul 20mM对应的植物选择链(即与配对样品中的反应液所含的植物连接子相吻合)和9.6ul去离子灭菌水组成。再执行94℃/45sec，57℃/45sec and 72℃/70sec的PCR循环36次，接着72℃/5min延伸反应。
将所得的基因组的7个不同连接子的一组PCR产物和0.5ug(6ul)DNA标样(SMO311，MBI Fermentas)，在同一片1％琼脂糖凝胶上分离；然后，用0.1％溴化乙锭染色，并用GeneGenius Bio-imaging System(SYNGENE，Synoptics Ltd，Cambridge，UK)，254nm紫外光下拍照。
5)、图片定量分析：
利用GeneGenius tool(SYNGENE，Synoptics Ltd，Cambridge，UK)图像定量分析工具，根据DNA标样(SMO311，MBI Fermentas)说明书，6ul标样的750bp dsDNA条带含有21.5ng dsDNA，以此为标准，分别对PCR产物进行总量测定，获得水稻基因组第一染色体短臂端粒G-末端最末尾的重复序列的序列结果，具体如图2所示。这一结果清晰显示，本实验的水稻基因组样品中，第一染色体短臂端粒则以5’-TAGGGTT-3’结尾为主。
为了进一步验证这一结果，对扩增的PCR产物(图2中第3列)进行了常规的回收、克隆、测序，结果与上述结论一致。
实施例3、一种解析染色体端粒G-末端序列的方法，以大鼠血细胞为材料，依次进行以下步骤：
1)、基因组DNA样品的制备：
等同于实施例1，根据试剂盒说明书分别提取、制备大鼠基因组DNA样品。
2)、寡核苷酸合成及连接子准备：
等同于实施例1。
3)、基因组DNA与连接子连接：
等同于实施例1。
4)、样品PCR扩增反应：
将PCR反应混合液中的人基因组第五染色体长臂亚端粒区域特异引物5’-gtaacacccaaaatatgatatcc-3’改成：大鼠基因组第四染色体长臂亚端粒区域特异引物5’-ttacttggacatcgaatcaca-3’。其余等同于实施例1。
5)、图片定量分析：
等同于实施例1分别对PCR产物进行总量测定，获得大鼠基因组第四染色体长臂端粒G-末端最末尾的重复序列的序列结果，具体如图3所示。这一结果清晰显示，本实验的大鼠基因组样品中，第四染色体长臂端粒G-末端仍以5’-AGGGTT-3’结尾为主。
为了进一步验证这一结果，对扩增的PCR产物(图3中第5列)进行了常规的回收、克隆、测序，其结果与上述结论一致。
实施例4、一种解析染色体端粒G-末端序列的方法，以拟南芥幼苗为材料，依次进行以下步骤：
1)、基因组DNA样品的制备：
等同于实施例2，根据试剂盒说明书分别提取、制备拟南芥基因组DNA样品。
2)、寡核苷酸合成及连接子准备：
等同于实施例2。
3)、基因组DNA与连接子连接：
等同于实施例2。
4)、样品PCR扩增反应：
将PCR反应混合液中的水稻基因组引物5，-attctgtctctcttgagttact-3’(第一染色体短臂)改成：5’-ccatccatagctaagtgaag-3’(第1染色体短臂亚端粒区域特异引物)。其余等同于实施例2。
5)、图片定量分析：
等同于实施例2分别对PCR产物进行总量测定，获得拟南芥基因组第1染色体短臂端粒G-末端最末尾的重复序列的序列结果，具体如图4所示。这一结果清晰显示，本实验的拟南芥基因组样品中，第1染色体短臂端粒G-末端以5’-TAGGGTT-3’结尾为主。
为了进一步验证这一结果，对扩增的PCR产物(图4中第3列)进行了常规的回收、克隆、测序，其结果与上述结论一致。
对照例：经对照实验显示，应用现有的DNA印迹杂交技术，专一的TRF端粒内切酶片断技术，以及最新的STELA技术，都无法对上述样品的端粒G-末端序列实施解析。
以上实验证明：使用本发明的方法能清晰地鉴定出染色体端粒G-末端序列，达到目的。而现有方法则不行。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO：1
5’gatgaatcctgagtgtccctaa 3’
SEQ ID NO：2
5’gatgaatcctgagtgtcctaac 3’
SEQ ID NO：3
5’gatgaatcctgagtgtctaacc 3’
SEQ ID NO：4
5’gatgaatcctgagtgttaaccc 3’
SEQ ID NO：5
5’gatgaatcctgagtgtaaccct 3’
SEQ ID NO：6
5’gatgaatcctgagtgtacccta 3’
SEQ ID NO：7
5’gatgaatcctgagtgtccctaaa 3’
SEQ ID NO：8
5’gatgaatcctgagtgtaccctaa 3’
SEQ ID NO：9
5’gatgaatcctgagtgtaacccta 3’
SEQ ID NO：10
5’gatgaatcctgagtgtaaaccct 3’
SEQ ID NO：11
5’gatgaatcctgagtgttaaaccc 3’
SEQ ID NO：12
5’gatgaatcctgagtgtctaaacc 3’
SEQ ID NO：13
5’gatgaatcctgagtgtcctaaac 3’
SEQ ID NO：14
5’acactcaggattcatcct 3’
Claims (2)
1.一种解析染色体端粒G-末端序列的方法，其特征是包括以下步骤：
1)、设计一套动物连接子和/或一套植物连接子；
所述的一套动物连接子为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所述的选择链分别与SEQ ID NO：14所述的连接链组成的6种动物连接子；
所述的一套植物连接子为：SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：13所述的选择链分别与SEQ ID NO：14所述的连接链组成的7种植物连接子；
2)、采用常规方式制备动物和/或植物基因组DNA样品；
3)、每份动物基因组DNA样品与步骤1)所述的6种动物连接子分别连接，和/或每份植物基因组DNA样品与步骤1)所述的7种植物连接子分别连接；得连接后的DNA样品；
4)、分别将上述每份连接后的样品进行PCR扩增反应，得PCR产物；
5)、分别将上述每份PCR产物定量分析，记录分析结果。
2.根据权利要求1所述的解析染色体端粒G-末端序列的方法，其特征是：所述PCR扩增反应中的上游特异引物根据待测染色体的亚端粒区域设计，下游引物为对应连接子的选择链。
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