JP2001161364A - Ｐｎａ骨格テロメア認識プローブ及びそれを用いたテロメア長の測定方法 - Google Patents
Ｐｎａ骨格テロメア認識プローブ及びそれを用いたテロメア長の測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 テロメア長の測定を、少量のＤＮＡを用いて
迅速かつ正確に行い、皮膚の老化度も簡便に評価できる
ようにする。 【解決手段】 細胞から得たテロメアＤＮＡを泳動分離
し、ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを用いて検出し、
テロメア長を求める。このＰＮＡ骨格テロメア認識プロ
ーブとしては、ＰＮＡ骨格を有し、かつＮ末端−（ＣＣ
ＣＴＡＡ）n−Ｃ末端 または Ｎ末端−（ＴＴＡＧＧ
Ｇ）n−Ｃ末端 （ｎ＝３〜５）の塩基配列を有し、放射
線同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、または酵素で
標識されているものを使用する。
迅速かつ正確に行い、皮膚の老化度も簡便に評価できる
ようにする。 【解決手段】 細胞から得たテロメアＤＮＡを泳動分離
し、ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを用いて検出し、
テロメア長を求める。このＰＮＡ骨格テロメア認識プロ
ーブとしては、ＰＮＡ骨格を有し、かつＮ末端−（ＣＣ
ＣＴＡＡ）n−Ｃ末端 または Ｎ末端−（ＴＴＡＧＧ
Ｇ）n−Ｃ末端 （ｎ＝３〜５）の塩基配列を有し、放射
線同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、または酵素で
標識されているものを使用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、テロメア領域を含
むＤＮＡ断片の長さ（即ち、テロメア長）を特定のＰＮ
Ａ骨格のプローブを用いて測定する方法に関し、特に、
皮膚表皮細胞のテロメア長を測定し、さらには、得られ
た皮膚表皮細胞のテロメア長に基づいて皮膚の老化度を
評価する方法に関する。
むＤＮＡ断片の長さ（即ち、テロメア長）を特定のＰＮ
Ａ骨格のプローブを用いて測定する方法に関し、特に、
皮膚表皮細胞のテロメア長を測定し、さらには、得られ
た皮膚表皮細胞のテロメア長に基づいて皮膚の老化度を
評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物は加齢に伴い生理機能が低下し、老
化が起こる。同様に、生体を構成している個々の細胞に
おいても、細胞の形質の変化、機能の退行、それに続く
増殖の停止、細胞死という過程を踏む老化が起こる。
化が起こる。同様に、生体を構成している個々の細胞に
おいても、細胞の形質の変化、機能の退行、それに続く
増殖の停止、細胞死という過程を踏む老化が起こる。
【０００３】このような細胞の老化に関して、ヒト正常
細胞は、細胞の継代を重ねたときに、染色体の末端に位
置するテロメアが短縮し、この短縮化が細胞の寿命と関
連すること（Harley et al. 1990; Allsop et al. 199
2）、また、高い年齢のヒトから採取した細胞ほど、テ
ロメア長が短く、かつ、培養して細胞***できる残り回
数（***寿命）も少ないという傾向があることが報告さ
れている（Hastie et al. 1990; Lindsey et al. 199
1）。さらに、皮膚細胞のテロメア長は加齢とともに殆
ど短縮化の一途を辿るが、皮膚が過去に受けた細胞損傷
の度合いを忠実に反映することも報告されている（Seii
chi Y. et al., Fragrance Journal, (1999), 27, 69-7
5）。このため、皮膚細胞のテロメア長は、その測定時
の生理状態や気候条件に左右されない真の皮膚老化度
（肌年齢）を客観的に評価するための新しい指標として
注目されている。そこで、医療に加え、美容の分野でも
テロメア長を簡易かつ迅速に測定することへの要請が高
まってきている。
細胞は、細胞の継代を重ねたときに、染色体の末端に位
置するテロメアが短縮し、この短縮化が細胞の寿命と関
連すること（Harley et al. 1990; Allsop et al. 199
2）、また、高い年齢のヒトから採取した細胞ほど、テ
ロメア長が短く、かつ、培養して細胞***できる残り回
数（***寿命）も少ないという傾向があることが報告さ
れている（Hastie et al. 1990; Lindsey et al. 199
1）。さらに、皮膚細胞のテロメア長は加齢とともに殆
ど短縮化の一途を辿るが、皮膚が過去に受けた細胞損傷
の度合いを忠実に反映することも報告されている（Seii
chi Y. et al., Fragrance Journal, (1999), 27, 69-7
5）。このため、皮膚細胞のテロメア長は、その測定時
の生理状態や気候条件に左右されない真の皮膚老化度
（肌年齢）を客観的に評価するための新しい指標として
注目されている。そこで、医療に加え、美容の分野でも
テロメア長を簡易かつ迅速に測定することへの要請が高
まってきている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】これまでの皮膚表皮細
胞のテロメア長の測定手法は、100万個以上の皮膚表皮
細胞を必要とする大がかりな方法によっている。具体的
には、外科的手術あるいはバイオプシーにより皮膚組織
を摘出し、摘出した皮膚組織からＤＮＡを抽出して制限
酵素で断片化し、これに放射性同位体（ＲＩ）標識プロ
ーブをハイブリダイズさせ、デンシトメトリーでオート
ラジオグラムを検出する。この方法では、100万個以上
という相当量の細胞を必要とすることに加えて、標識と
してＲＩを使用するために、科学技術庁が承認した放射
能安全管理施設の特殊施設でしか行えないという制約も
あり、時間と手間がかかる。
胞のテロメア長の測定手法は、100万個以上の皮膚表皮
細胞を必要とする大がかりな方法によっている。具体的
には、外科的手術あるいはバイオプシーにより皮膚組織
を摘出し、摘出した皮膚組織からＤＮＡを抽出して制限
酵素で断片化し、これに放射性同位体（ＲＩ）標識プロ
ーブをハイブリダイズさせ、デンシトメトリーでオート
ラジオグラムを検出する。この方法では、100万個以上
という相当量の細胞を必要とすることに加えて、標識と
してＲＩを使用するために、科学技術庁が承認した放射
能安全管理施設の特殊施設でしか行えないという制約も
あり、時間と手間がかかる。
【０００５】そこで、本発明は少量の皮膚表皮細胞から
簡易迅速にかつ高感度にテロメア長を測定し、さらには
皮膚の老化度を簡便に評価できるようにすることを目的
とする。
簡易迅速にかつ高感度にテロメア長を測定し、さらには
皮膚の老化度を簡便に評価できるようにすることを目的
とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、特定のＰ
ＮＡ骨格のプローブを使用することにより、著しく簡便
にかつ高感度にテロメアＤＮＡを検出し、テロメア長を
測定できることを見出し、本発明を完成させた。
ＮＡ骨格のプローブを使用することにより、著しく簡便
にかつ高感度にテロメアＤＮＡを検出し、テロメア長を
測定できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】即ち、本発明は、細胞から得たテロメアＤ
ＮＡとハイブリダイズするＰＮＡ骨格のプローブであっ
て、Ｎ末端−（ＣＣＣＴＡＡ）n−Ｃ末端 または Ｎ末
端−（ＴＴＡＧＧＧ）n−Ｃ末端 （ｎ＝３〜５）の塩基
配列を有し、放射線同位体、蛍光化合物、化学発光化合
物、または酵素で標識されているＰＮＡ骨格テロメア認
識プローブを提供する。
ＮＡとハイブリダイズするＰＮＡ骨格のプローブであっ
て、Ｎ末端−（ＣＣＣＴＡＡ）n−Ｃ末端 または Ｎ末
端−（ＴＴＡＧＧＧ）n−Ｃ末端 （ｎ＝３〜５）の塩基
配列を有し、放射線同位体、蛍光化合物、化学発光化合
物、または酵素で標識されているＰＮＡ骨格テロメア認
識プローブを提供する。
【０００８】また、細胞から得たテロメアＤＮＡを泳動
分離し、泳動分離したテロメアＤＮＡを、上述のＰＮＡ
骨格テロメア認識プローブを用いて検出し、テロメア長
を求めることを特徴とするテロメア長の測定方法を提供
する。
分離し、泳動分離したテロメアＤＮＡを、上述のＰＮＡ
骨格テロメア認識プローブを用いて検出し、テロメア長
を求めることを特徴とするテロメア長の測定方法を提供
する。
【０００９】さらに、上述のテロメア長の測定方法によ
り皮膚表皮細胞のテロメア長を求め、得られたテロメア
長に基づき、皮膚の老化度を評価する皮膚老化度の評価
方法を提供する。
り皮膚表皮細胞のテロメア長を求め、得られたテロメア
長に基づき、皮膚の老化度を評価する皮膚老化度の評価
方法を提供する。
【００１０】また、上述のＰＮＡ骨格テロメア認識プロ
ーブと、皮膚表皮屑片採取用器具とを含むテロメア長測
定キットを提供する。
ーブと、皮膚表皮屑片採取用器具とを含むテロメア長測
定キットを提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】本発明のＰＮＡ骨格テロメア認識プローブ
は、ＰＮＡ骨格を有し、かつ特定の塩基配列を有するこ
とにより、皮膚表皮細胞、真皮繊維芽細胞等から得たテ
ロメアＤＮＡと安定にハイブリダイズするものである。
は、ＰＮＡ骨格を有し、かつ特定の塩基配列を有するこ
とにより、皮膚表皮細胞、真皮繊維芽細胞等から得たテ
ロメアＤＮＡと安定にハイブリダイズするものである。
【００１３】ここで、ＰＮＡはPeptide Nucleic Acidま
たはPolyamide Nucleic Acidの略で、ＰＮＡ骨格構造と
は、次式のように、核酸のリン酸ジエステル結合による
糖−リン酸骨格が、N-（2-aminoethyl）glycine誘導体
のペプチド結合による鎖に置き換わった構造をいう。
たはPolyamide Nucleic Acidの略で、ＰＮＡ骨格構造と
は、次式のように、核酸のリン酸ジエステル結合による
糖−リン酸骨格が、N-（2-aminoethyl）glycine誘導体
のペプチド結合による鎖に置き換わった構造をいう。
【００１４】
【化１】
【００１５】ＰＮＡにおいては、核酸を構成するＡ、
Ｔ、Ｇ、Ｃの塩基(Base)がメチレンカルボニルを介して
その骨格構造に結合している。また、ＰＮＡではペプチ
ドと同様に、左側をＮ末端そして右側をＣ末端と表し、
このＮ末端が核酸の5'末端に相当し、Ｃ末端が3'末端に
相当する。
Ｔ、Ｇ、Ｃの塩基(Base)がメチレンカルボニルを介して
その骨格構造に結合している。また、ＰＮＡではペプチ
ドと同様に、左側をＮ末端そして右側をＣ末端と表し、
このＮ末端が核酸の5'末端に相当し、Ｃ末端が3'末端に
相当する。
【００１６】本発明で使用するＰＮＡ骨格テロメア認識
プローブとしては、Ｎ末端−（ＣＣＣＴＡＡ）n− Ｃ末
端 または Ｎ末端−（ＴＴＡＧＧＧ）n− Ｃ末端 の塩
基配列の繰り返し数ｎが３〜５のものが好ましい。この
ようなＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを使用すること
により、テロメア検出の精度、感度、および操作性を向
上させることができる。
プローブとしては、Ｎ末端−（ＣＣＣＴＡＡ）n− Ｃ末
端 または Ｎ末端−（ＴＴＡＧＧＧ）n− Ｃ末端 の塩
基配列の繰り返し数ｎが３〜５のものが好ましい。この
ようなＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを使用すること
により、テロメア検出の精度、感度、および操作性を向
上させることができる。
【００１７】また、塩基配列が Ｎ末端−（ＣＣＣＴＡ
Ａ）n− Ｃ末端 または Ｎ末端−（ＴＴＡＧＧＧ）n−
Ｃ末端 の２種のＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを使
用するにあたり、これら２種のプローブはいずれか一方
を用いることが好ましく、特に、Ｎ末端−（ＣＣＣＴＡ
Ａ）3− Ｃ末端がより好ましい。
Ａ）n− Ｃ末端 または Ｎ末端−（ＴＴＡＧＧＧ）n−
Ｃ末端 の２種のＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを使
用するにあたり、これら２種のプローブはいずれか一方
を用いることが好ましく、特に、Ｎ末端−（ＣＣＣＴＡ
Ａ）3− Ｃ末端がより好ましい。
【００１８】また、かかる塩基配列を有するＰＮＡ骨格
テロメア認識プローブの製造方法は、P.E.Nielsenらの
方法（Nielsen et al. Science, (1991), 254, 1497-15
00; Egholm et al. J Am Chem Soc., (1992), 114, 189
5-1897; Egholm et al. Nature, (1993), 365, 566-56
8）によることができる。
テロメア認識プローブの製造方法は、P.E.Nielsenらの
方法（Nielsen et al. Science, (1991), 254, 1497-15
00; Egholm et al. J Am Chem Soc., (1992), 114, 189
5-1897; Egholm et al. Nature, (1993), 365, 566-56
8）によることができる。
【００１９】ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブは種々の
標識部分を有することができる。例えば、ＰＮＡ骨格は
アミノ酸の誘導体であるので放射性標識に大きな適応性
があり、放射性同位体を標識として使用することによ
り、高い放射活性を有する高標識率のＰＮＡ骨格プロー
ブとすることができる。即ち、［γ-32Ｐ］ＡＴＰとＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼなどによって５'末端標識
された従来の標識プローブ(Harley C.B.ら)の比活性が
１〜３×１０6 counts per minute／p mol であるのに
比べて、放射性同位体で標識されたＰＮＡ骨格プローブ
は、比活性が２〜７×１０7 counts per minute／p mo
l と高いため、少量の皮膚表皮屑片から抽出したＤＮＡ
からでも精度良くテロメア長を測定することができる。
標識部分を有することができる。例えば、ＰＮＡ骨格は
アミノ酸の誘導体であるので放射性標識に大きな適応性
があり、放射性同位体を標識として使用することによ
り、高い放射活性を有する高標識率のＰＮＡ骨格プロー
ブとすることができる。即ち、［γ-32Ｐ］ＡＴＰとＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼなどによって５'末端標識
された従来の標識プローブ(Harley C.B.ら)の比活性が
１〜３×１０6 counts per minute／p mol であるのに
比べて、放射性同位体で標識されたＰＮＡ骨格プローブ
は、比活性が２〜７×１０7 counts per minute／p mo
l と高いため、少量の皮膚表皮屑片から抽出したＤＮＡ
からでも精度良くテロメア長を測定することができる。
【００２０】放射性標識の具体例としては、"Kemptide"
ペプチドを含むＰＮＡは、キナーゼでリン酸化されるた
め、［γ-32Ｐ］ＡＴＰをあげることができる。また、
Ｎ末端に［125Ｉ］をもつチロシンを結合させて標識と
することができる。その他、ＰＮＡは、その末端にリジ
ン（アミノ基）やシステイン（チオール基）を結合し、
標準的な放射活性ラベルの導入方法を用いることによ
り、［3Ｈ］、［32Ｐ］、［125Ｉ］、［14Ｃ］などで標
識することができる。
ペプチドを含むＰＮＡは、キナーゼでリン酸化されるた
め、［γ-32Ｐ］ＡＴＰをあげることができる。また、
Ｎ末端に［125Ｉ］をもつチロシンを結合させて標識と
することができる。その他、ＰＮＡは、その末端にリジ
ン（アミノ基）やシステイン（チオール基）を結合し、
標準的な放射活性ラベルの導入方法を用いることによ
り、［3Ｈ］、［32Ｐ］、［125Ｉ］、［14Ｃ］などで標
識することができる。
【００２１】ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブの標識部
分には、非放射性標識を使用することもできる。非放射
性標識プローブとすることにより、放射能安全管理施設
以外における操作が可能となり、テロメアＤＮＡの検
出、テロメア長の測定あるいは皮膚の老化度の評価を簡
便に行うことができる。
分には、非放射性標識を使用することもできる。非放射
性標識プローブとすることにより、放射能安全管理施設
以外における操作が可能となり、テロメアＤＮＡの検
出、テロメア長の測定あるいは皮膚の老化度の評価を簡
便に行うことができる。
【００２２】非放射性標識としては、蛍光化合物、化学
発光化合物等を用いることができる。ＰＮＡにおいて
は、従来の核酸からなる標識プローブの5'末端標識のよ
うな一箇所の標識ではなく、二箇所以上に標識を導入す
ることができるため、蛍光強度または発光強度を高くす
ることができるので好ましい。
発光化合物等を用いることができる。ＰＮＡにおいて
は、従来の核酸からなる標識プローブの5'末端標識のよ
うな一箇所の標識ではなく、二箇所以上に標識を導入す
ることができるため、蛍光強度または発光強度を高くす
ることができるので好ましい。
【００２３】ここで、蛍光化合物としては、フルオレセ
インイソチオシアネート（FITC）、赤色系のテトラメチ
ルローダミンイソチオシアネート（TRITC）などを使用
することができ、化学発光化合物としては、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ
（AP）、ルシフェラーゼなどを使用することができる。
インイソチオシアネート（FITC）、赤色系のテトラメチ
ルローダミンイソチオシアネート（TRITC）などを使用
することができ、化学発光化合物としては、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ
（AP）、ルシフェラーゼなどを使用することができる。
【００２４】また、本発明のＰＮＡ骨格テロメア認識プ
ローブにおいては、そのＰＮＡ骨格を酵素標識ヌクレオ
チドで標識してもよい。これにより、少量のテロメアＤ
ＮＡを高感度で検出することができる。酵素標識ヌクレ
オチドとしては、ビオチン標識ｄＣＴＰ、ジゴキシゲニ
ン標識ｄＵＴＰ、ＦＩＴＣ標識ｄＧＴＰ、ＴＲＩＴＣ標
識ｄＣＴＰなどの蛍光標識ヌクレオチド、［α−3Ｈ］
ｄＮＴＰ、［γ−32Ｐ］ｄＮＴＰもしくは［α−14Ｃ］
ｄＮＴＰなどの放射性標識ヌクレオチド、または西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識ヌクレオチド、ルシフェラー
ゼ標識ヌクレオチド、アルカリフォスファターゼ標識ヌ
クレオチドなどをあげることができる。
ローブにおいては、そのＰＮＡ骨格を酵素標識ヌクレオ
チドで標識してもよい。これにより、少量のテロメアＤ
ＮＡを高感度で検出することができる。酵素標識ヌクレ
オチドとしては、ビオチン標識ｄＣＴＰ、ジゴキシゲニ
ン標識ｄＵＴＰ、ＦＩＴＣ標識ｄＧＴＰ、ＴＲＩＴＣ標
識ｄＣＴＰなどの蛍光標識ヌクレオチド、［α−3Ｈ］
ｄＮＴＰ、［γ−32Ｐ］ｄＮＴＰもしくは［α−14Ｃ］
ｄＮＴＰなどの放射性標識ヌクレオチド、または西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識ヌクレオチド、ルシフェラー
ゼ標識ヌクレオチド、アルカリフォスファターゼ標識ヌ
クレオチドなどをあげることができる。
【００２５】以上の標識プローブのうち、標識部分が蛍
光化合物からなる場合には、プローブの検出時に増感剤
を使用すると一層高感度の検出が可能となるので好まし
い。例えば、標識プローブとしてビオチン標識ｄＣＴＰ
を用いる場合には、ストレプトアビジン結合西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識プローブに結合さ
せ、ついで過酸化水素と増感剤とを用いると蛍光強度が
増大する。増感剤としては、フルオレセイン−チラミ
ド、ビオチン、フロレスチンなどを好適に使用すること
ができる。
光化合物からなる場合には、プローブの検出時に増感剤
を使用すると一層高感度の検出が可能となるので好まし
い。例えば、標識プローブとしてビオチン標識ｄＣＴＰ
を用いる場合には、ストレプトアビジン結合西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識プローブに結合さ
せ、ついで過酸化水素と増感剤とを用いると蛍光強度が
増大する。増感剤としては、フルオレセイン−チラミ
ド、ビオチン、フロレスチンなどを好適に使用すること
ができる。
【００２６】本発明のテロメア長の測定方法は、皮膚表
皮細胞、真皮繊維芽細胞等からテロメアＤＮＡを含む試
料を調製し、その試料からテロメアＤＮＡを、サザンブ
ロット法、その他各種電気泳動を用いた手法で泳動分離
し、分離したテロメアＤＮＡをＰＮＡ骨格テロメア認識
プローブを用いて検出することにより行う。例えば、長
さが既知のＤＮＡをマーカーとし、皮膚表皮細胞から抽
出したＤＮＡの制限酵素処理物とマーカーとを同時に泳
動分離し、次いで、ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを
用いてテロメアＤＮＡを検出し、マーカーの移動距離を
標準にしてテロメアＤＮＡの移動距離を測ることにより
テロメア長を求める。
皮細胞、真皮繊維芽細胞等からテロメアＤＮＡを含む試
料を調製し、その試料からテロメアＤＮＡを、サザンブ
ロット法、その他各種電気泳動を用いた手法で泳動分離
し、分離したテロメアＤＮＡをＰＮＡ骨格テロメア認識
プローブを用いて検出することにより行う。例えば、長
さが既知のＤＮＡをマーカーとし、皮膚表皮細胞から抽
出したＤＮＡの制限酵素処理物とマーカーとを同時に泳
動分離し、次いで、ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを
用いてテロメアＤＮＡを検出し、マーカーの移動距離を
標準にしてテロメアＤＮＡの移動距離を測ることにより
テロメア長を求める。
【００２７】なお、皮膚表皮細胞、真皮繊維芽細胞等か
らテロメアＤＮＡを含む試料を得る方法には特に制限は
ない。例えば、皮膚表皮の擦過、粘着テープを用いた皮
膚表皮の剥離等により皮膚表皮屑片を採取し、その皮膚
表皮屑片から常法にしたがってＤＮＡを抽出し、そのＤ
ＮＡを制限酵素処理してテロメア領域を含むＤＮＡ断片
に切断すればよい。
らテロメアＤＮＡを含む試料を得る方法には特に制限は
ない。例えば、皮膚表皮の擦過、粘着テープを用いた皮
膚表皮の剥離等により皮膚表皮屑片を採取し、その皮膚
表皮屑片から常法にしたがってＤＮＡを抽出し、そのＤ
ＮＡを制限酵素処理してテロメア領域を含むＤＮＡ断片
に切断すればよい。
【００２８】本発明の皮膚の老化度の評価方法は、上述
した本発明のテロメア長の測定方法にしたがって求めた
皮膚表皮細胞のテロメア長を求め、得られたテロメア長
に基づいて皮膚の老化度を評価する方法である。より具
体的には、例えば、予め、種々の年齢の複数の被験者か
ら所定の部位の皮膚表皮屑片を採取してそのテロメア長
を求め、年齢とテロメア長との関係を求めておき、その
関係に基づいて、老化度を評価すべき当該皮膚のテロメ
ア長からその皮膚の老化度を評価する。
した本発明のテロメア長の測定方法にしたがって求めた
皮膚表皮細胞のテロメア長を求め、得られたテロメア長
に基づいて皮膚の老化度を評価する方法である。より具
体的には、例えば、予め、種々の年齢の複数の被験者か
ら所定の部位の皮膚表皮屑片を採取してそのテロメア長
を求め、年齢とテロメア長との関係を求めておき、その
関係に基づいて、老化度を評価すべき当該皮膚のテロメ
ア長からその皮膚の老化度を評価する。
【００２９】なお、この方法で美容上の皮膚の老化度を
評価する場合、皮膚表皮の採取部位としては、頬骨頂部
上、あるいは図１に示したように、起立位または座位で
の目尻の鉛直線Ｌ1と小鼻上端の水平線Ｌ2との交叉部位
の皮膚等を選択することが好ましい（特願平１０−１５
７７７３号明細書参照）。
評価する場合、皮膚表皮の採取部位としては、頬骨頂部
上、あるいは図１に示したように、起立位または座位で
の目尻の鉛直線Ｌ1と小鼻上端の水平線Ｌ2との交叉部位
の皮膚等を選択することが好ましい（特願平１０−１５
７７７３号明細書参照）。
【００３０】また、皮膚の老化度の評価方法としては、
同一被験者について顔等のように日光に曝されることが
多い部位と、臀部等のように日光に曝されることが少な
い部位とから皮膚を採取し、採取した皮膚のテロメア長
から、それぞれの部位の皮膚の老化度を対比してもよ
い。
同一被験者について顔等のように日光に曝されることが
多い部位と、臀部等のように日光に曝されることが少な
い部位とから皮膚を採取し、採取した皮膚のテロメア長
から、それぞれの部位の皮膚の老化度を対比してもよ
い。
【００３１】本発明のテロメア長測定キットは、上述の
テロメア長の測定方法の実施に使用されるキットであ
り、少なくとも本発明のＰＮＡ骨格テロメア認識プロー
ブと、皮膚表皮屑片採取用器具とを含む。
テロメア長の測定方法の実施に使用されるキットであ
り、少なくとも本発明のＰＮＡ骨格テロメア認識プロー
ブと、皮膚表皮屑片採取用器具とを含む。
【００３２】ここで、皮膚表皮屑片採取用器具として
は、皮膚表皮屑片を出血しない程度に薄く採取できる限
り特に制限はなく、市販のセロハン粘着テープ等を使用
することができる。また、尖端が鋭角な短繊維が台座に
縦横に植え込まれているヤスリ状あるいはブラシ状の皮
膚表皮屑片採取用器具（ラスプ）も好ましく使用するこ
とができる（特願平１０−１５７７７３号明細書参
照）。
は、皮膚表皮屑片を出血しない程度に薄く採取できる限
り特に制限はなく、市販のセロハン粘着テープ等を使用
することができる。また、尖端が鋭角な短繊維が台座に
縦横に植え込まれているヤスリ状あるいはブラシ状の皮
膚表皮屑片採取用器具（ラスプ）も好ましく使用するこ
とができる（特願平１０−１５７７７３号明細書参
照）。
【００３３】この他、テロメア長測定キットには、皮膚
表皮屑片採取用器具として粘着テープを含めた場合に、
皮膚表皮細胞を粘着テープの粘着面から剥離するために
使用するSodium-N-lauroylsarcosinate等の界面活性剤
や、採取した皮膚表皮細胞からＤＮＡを抽出するための
Iso Quick Kit（ORCA Research製）のsolusion A等を含
めてもよい。
表皮屑片採取用器具として粘着テープを含めた場合に、
皮膚表皮細胞を粘着テープの粘着面から剥離するために
使用するSodium-N-lauroylsarcosinate等の界面活性剤
や、採取した皮膚表皮細胞からＤＮＡを抽出するための
Iso Quick Kit（ORCA Research製）のsolusion A等を含
めてもよい。
【００３４】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説
明する。
明する。
【００３５】実施例１：アルカリフォスファターゼ（A
P）標識ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブの作製
P）標識ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブの作製
【００３６】化学発光化合物を標識とするＰＮＡ骨格テ
ロメア認識プローブとして、アルカリフォスファターゼ
（AP）標識ＰＮＡ骨格プローブを作製した。
ロメア認識プローブとして、アルカリフォスファターゼ
（AP）標識ＰＮＡ骨格プローブを作製した。
【００３７】この場合、ＰＮＡ骨格プローブとしては、
P.E.Nielsenらの方法（Nielsen etal. Science, (199
1), 254, 1497-1500; Egholm et al. J Am Chem Soc.,
(1992), 114, 1895-1897; Egholm et al. Nature, (199
3), 365, 566-568）によって（ＣＣＣＴＡＡ）3を作製
した。
P.E.Nielsenらの方法（Nielsen etal. Science, (199
1), 254, 1497-1500; Egholm et al. J Am Chem Soc.,
(1992), 114, 1895-1897; Egholm et al. Nature, (199
3), 365, 566-568）によって（ＣＣＣＴＡＡ）3を作製
した。
【００３８】合成した（ＣＣＣＴＡＡ）3のＰＮＡ骨格
プローブを架橋剤（bifunctional reagent）であるホル
ムアルデヒドで処理し、アルカリフォスファターゼを化
学的に直接結合させて標識した。
プローブを架橋剤（bifunctional reagent）であるホル
ムアルデヒドで処理し、アルカリフォスファターゼを化
学的に直接結合させて標識した。
【００３９】このアルカリフォスファターゼによる標識
には、AlkPhos Direct（Pharmacia製）を使用して次の
ように行った。まず、２０μＬホルムアルデヒド架橋剤
溶液に８０μＬの滅菌水を加えて（作業）溶液を準備し
た。標識する（ＣＣＣＴＡＡ）3のＰＮＡ骨格プローブ
に滅菌水を加えて１０ｎｇ／μＬに調整した。この希釈
したＰＮＡ骨格プローブをマイクロチューブに１０μＬ
を入れ、マイクロチューブを沸騰水中に入れて５分間加
熱し、熱変性させた。その後、速やかにマイクロチュー
ブを氷上で冷やした。冷えたＰＮＡ骨格プローブに１０
μＬの反応バッファーを加え、混ぜ合わせた。さらに、
標識試薬としてアルカリフォスファターゼ（Pharmacia
製 AlkPhos Direct）を２μＬ加え、混ぜ合わせた。さ
らに、調整したホルムアルデヒド架橋剤溶液を１０μＬ
加えて混ぜ合わせ、３０分間３７℃で反応させ、ＡＰ標
識ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを得た。
には、AlkPhos Direct（Pharmacia製）を使用して次の
ように行った。まず、２０μＬホルムアルデヒド架橋剤
溶液に８０μＬの滅菌水を加えて（作業）溶液を準備し
た。標識する（ＣＣＣＴＡＡ）3のＰＮＡ骨格プローブ
に滅菌水を加えて１０ｎｇ／μＬに調整した。この希釈
したＰＮＡ骨格プローブをマイクロチューブに１０μＬ
を入れ、マイクロチューブを沸騰水中に入れて５分間加
熱し、熱変性させた。その後、速やかにマイクロチュー
ブを氷上で冷やした。冷えたＰＮＡ骨格プローブに１０
μＬの反応バッファーを加え、混ぜ合わせた。さらに、
標識試薬としてアルカリフォスファターゼ（Pharmacia
製 AlkPhos Direct）を２μＬ加え、混ぜ合わせた。さ
らに、調整したホルムアルデヒド架橋剤溶液を１０μＬ
加えて混ぜ合わせ、３０分間３７℃で反応させ、ＡＰ標
識ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブを得た。
【００４０】このアルカリフォスファターゼによる標識
は、CDP-Star（Pharmacia製）と反応させて化学発光を
生じさることにより確認した。
は、CDP-Star（Pharmacia製）と反応させて化学発光を
生じさることにより確認した。
【００４１】実施例２：フルオレセインイソチオシアネ
ート（FITC）標識ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブの作
製
ート（FITC）標識ＰＮＡ骨格テロメア認識プローブの作
製
【００４２】蛍光化合物で標識したＰＮＡ骨格テロメア
認識プローブとして、フルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）標識ＰＮＡ骨格プローブを作製した。
認識プローブとして、フルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）標識ＰＮＡ骨格プローブを作製した。
【００４３】この場合、ＰＮＡ骨格プローブは実施例１
と同様に（ＣＣＣＴＡＡ）3を作製した。
と同様に（ＣＣＣＴＡＡ）3を作製した。
【００４４】このＰＮＡ骨格プローブをＦＩＴＣで標識
するために、まず、ＦＩＴＣ １．５ｍｇをＤＭＦ１５
μＬに溶解した。また、ＰＮＡ骨格プローブを０．５Ｍ
Ｎａ2ＣＯ3／ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．３）３００
μＬに溶解し、これと上述のＦＩＴＣ溶液とを混合し、
遮光して一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応
のＦＩＴＣを除去し、東ソー製カラムを使用し、逆相高
速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。逆相高
速液体クロマトグラフに用いた条件は、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１０ｍＭ ＥＤＴＡであ
り、２６０ｎｍの吸収で検出した。分取したピークの吸
収スペクトルを測定し、２６０ｎｍの吸収と４９５ｎｍ
のＦＩＴＣの吸収を確認した。
するために、まず、ＦＩＴＣ １．５ｍｇをＤＭＦ１５
μＬに溶解した。また、ＰＮＡ骨格プローブを０．５Ｍ
Ｎａ2ＣＯ3／ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．３）３００
μＬに溶解し、これと上述のＦＩＴＣ溶液とを混合し、
遮光して一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応
のＦＩＴＣを除去し、東ソー製カラムを使用し、逆相高
速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。逆相高
速液体クロマトグラフに用いた条件は、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１０ｍＭ ＥＤＴＡであ
り、２６０ｎｍの吸収で検出した。分取したピークの吸
収スペクトルを測定し、２６０ｎｍの吸収と４９５ｎｍ
のＦＩＴＣの吸収を確認した。
【００４５】実施例３：サザンブロット法によるアルカ
リフォスファターゼ（AP）標識ＰＮＡ骨格プローブを用
いたテロメア長の測定
リフォスファターゼ（AP）標識ＰＮＡ骨格プローブを用
いたテロメア長の測定
【００４６】（1）試料の調製 ０〜７７歳の２０名を被験者とし、各被験者の顔の皮膚
からラスプを用いて皮膚擦過屑片を採取し、Iso Quick
Kit（ORCA Research製）を用いて、各皮膚擦過屑片から
それぞれＤＮＡの抽出を行った。
からラスプを用いて皮膚擦過屑片を採取し、Iso Quick
Kit（ORCA Research製）を用いて、各皮膚擦過屑片から
それぞれＤＮＡの抽出を行った。
【００４７】抽出したＤＮＡはＴＥ(10mM Tris-HCl, 1m
M EDTA, pH8.0)またはIso Quick KitのReagent 5に溶解
させ４℃で保存した。
M EDTA, pH8.0)またはIso Quick KitのReagent 5に溶解
させ４℃で保存した。
【００４８】この皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡ溶液
のＤＮＡ濃度を、該ＤＮＡ溶液を、１００ｎｇ／μＬに
調整したλＤＮＡ（Promega製）をマーカーとして、
０．３５％アガロースゲル（type H, Nippon Gene製）
電気泳動し、２μｇ／ｍＬエチジウムブロマイドで染色
することにより求めた。
のＤＮＡ濃度を、該ＤＮＡ溶液を、１００ｎｇ／μＬに
調整したλＤＮＡ（Promega製）をマーカーとして、
０．３５％アガロースゲル（type H, Nippon Gene製）
電気泳動し、２μｇ／ｍＬエチジウムブロマイドで染色
することにより求めた。
【００４９】次に、２μＬの１０×Ｈバッファー（宝酒
造製）、皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡ溶液のＤＮＡ
２μｇ相当量、および滅菌水を総量１９μＬとなるよう
に加え、最後に制限酵素として６ユニット／μＬのＨｉ
ｎｆ I（宝酒造製）を加えた。これを３７℃で３〜４時
間反応し、テロメアＤＮＡの測定試料とした。この反応
により得た試料は、反応後直ちに次のようにして電気泳
動にかけた。また、反応後直ちに電気泳動にかけない試
料については４℃で保存した。
造製）、皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡ溶液のＤＮＡ
２μｇ相当量、および滅菌水を総量１９μＬとなるよう
に加え、最後に制限酵素として６ユニット／μＬのＨｉ
ｎｆ I（宝酒造製）を加えた。これを３７℃で３〜４時
間反応し、テロメアＤＮＡの測定試料とした。この反応
により得た試料は、反応後直ちに次のようにして電気泳
動にかけた。また、反応後直ちに電気泳動にかけない試
料については４℃で保存した。
【００５０】（2）アガロースゲル電気泳動 アガロースゲル（type I, Sigma製）は、ブリッジ部分
のゲル濃度が１％、ベッド部分が０．８％になるように
作製した（マリソルKS-8405, 20cm×14cm）。泳動用バ
ッファーとしては、１×Boyerバッファーを使用した。
のゲル濃度が１％、ベッド部分が０．８％になるように
作製した（マリソルKS-8405, 20cm×14cm）。泳動用バ
ッファーとしては、１×Boyerバッファーを使用した。
【００５１】マーカーとしては、０．５μｇ／レーンに
調整した１ＫｂのDNA Ladder（GIBCO BRL製）と０．３
μｇ／レーンに調整したλDNA/HindIII digest（Nippon
Gene製）とを使用した。
調整した１ＫｂのDNA Ladder（GIBCO BRL製）と０．３
μｇ／レーンに調整したλDNA/HindIII digest（Nippon
Gene製）とを使用した。
【００５２】２０μＬのＤＮＡ試料とマーカーにローデ
ィングバッファーを３μＬずつ加え、上記のように調整
した０．８％のアガロースゲルにアプライし、８５ボル
トで引き込んだ後に、３５ボルトで泳動を行った。
ィングバッファーを３μＬずつ加え、上記のように調整
した０．８％のアガロースゲルにアプライし、８５ボル
トで引き込んだ後に、３５ボルトで泳動を行った。
【００５３】（3）サザントランスファー 電気泳動終了後、アガロースゲルを切り出し、２μｇ／
ｍＬのエチジウムブロマイドで１５分間染色し、ＵＶト
ランスイルミネーターにのせてスケールとともに写真撮
影を行った。
ｍＬのエチジウムブロマイドで１５分間染色し、ＵＶト
ランスイルミネーターにのせてスケールとともに写真撮
影を行った。
【００５４】写真撮影の後に、ゲルを０．２５ＭのＨＣ
ｌに浸して室温で１５分間振盪し、次いで蒸留水で２回
洗浄した。
ｌに浸して室温で１５分間振盪し、次いで蒸留水で２回
洗浄した。
【００５５】次いで、０．２ＭのＮａＯＨと０．６Ｍの
ＮａＣｌとを含む変性（Denaturalization）溶液にゲル
を浸して室温で２５分間振盪し、その後に蒸留水で３回
洗浄した。
ＮａＣｌとを含む変性（Denaturalization）溶液にゲル
を浸して室温で２５分間振盪し、その後に蒸留水で３回
洗浄した。
【００５６】このゲルを０．６ＭのＮａＣｌを含む０．
２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の中和（Neutra
lization）溶液に浸して室温で３０分間振盪し、蒸留水
で軽く１回洗浄した。この後、再び中和溶液に浸して室
温で３０分間振盪した。
２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の中和（Neutra
lization）溶液に浸して室温で３０分間振盪し、蒸留水
で軽く１回洗浄した。この後、再び中和溶液に浸して室
温で３０分間振盪した。
【００５７】６×ＳＳＣを満たしたブロッティング装置
にセットした３ＭＭろ紙上に空気が入らないように、ゲ
ル、３×ＳＳＣに浸しておいたHybond TM N＋（Amersha
m製）、６×ＳＳＣに浸しておいた３ＭＭろ紙、ペーパ
ータオル、ガラス板、重り（２ｋｇ）の順に乗せ、一晩
ブロッティングを行った。
にセットした３ＭＭろ紙上に空気が入らないように、ゲ
ル、３×ＳＳＣに浸しておいたHybond TM N＋（Amersha
m製）、６×ＳＳＣに浸しておいた３ＭＭろ紙、ペーパ
ータオル、ガラス板、重り（２ｋｇ）の順に乗せ、一晩
ブロッティングを行った。
【００５８】ブロッティングの終了後、メンブレンフィ
ルターを３×ＳＳＣに浸し、軽く水分を切ってからＵＶ
トランスイルミネーター上でウェルの位置を記入した。
ルターを３×ＳＳＣに浸し、軽く水分を切ってからＵＶ
トランスイルミネーター上でウェルの位置を記入した。
【００５９】ろ紙にはさみ、８０℃で一晩加熱（ベーキ
ング（baking））した。
ング（baking））した。
【００６０】（4）ＤＮＡハイブリダイゼーション ベーキングしたメンブレンは５５℃で予備加熱したAlkP
hos Directハイブリダイゼーションバッファー（0.5M N
aCl、12 %(w/v)尿素を含む）に浸し、５５℃で少なくと
も１５分以上振盪し、プレハイブリダイゼーションを行
った。
hos Directハイブリダイゼーションバッファー（0.5M N
aCl、12 %(w/v)尿素を含む）に浸し、５５℃で少なくと
も１５分以上振盪し、プレハイブリダイゼーションを行
った。
【００６１】プレハイブリダイゼーションが終了した後
に、シールドバッグにメンブレンフィルターを入れ、実
施例１の方法で調製したＡＰ標識ＰＮＡ骨格プローブ
１００ｎｇを加えたAlkPhos Directハイブリダイゼーシ
ョンバッファー２ｍＬを加え、泡が入らないようにシー
ルした。
に、シールドバッグにメンブレンフィルターを入れ、実
施例１の方法で調製したＡＰ標識ＰＮＡ骨格プローブ
１００ｎｇを加えたAlkPhos Directハイブリダイゼーシ
ョンバッファー２ｍＬを加え、泡が入らないようにシー
ルした。
【００６２】５５℃で一晩振盪し、ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。
ョンを行った。
【００６３】（5）洗浄及び検出 ハイブリダイゼーションをした後、トランスブロット用
メンブレンを５５℃で予備加熱した洗浄バッファー（2M
尿素、0.1 % SDS、50mM リン酸ナトリウム、150mM NaC
l、10mM MgCl2を含む）に浸し、５５℃で１０分間振盪
した。この操作を２回繰り返した後に、メンブレンを洗
浄バッファー（0.05M Tris Base、0.1MNaClを含む）に
浸し、室温で５分間振盪し、この操作を２回繰り返し
た。
メンブレンを５５℃で予備加熱した洗浄バッファー（2M
尿素、0.1 % SDS、50mM リン酸ナトリウム、150mM NaC
l、10mM MgCl2を含む）に浸し、５５℃で１０分間振盪
した。この操作を２回繰り返した後に、メンブレンを洗
浄バッファー（0.05M Tris Base、0.1MNaClを含む）に
浸し、室温で５分間振盪し、この操作を２回繰り返し
た。
【００６４】メンブレンの水分をよく切り、CDP-Star
（Pharmacia製）の検出溶液をかけ、２〜５分間放置し
た。
（Pharmacia製）の検出溶液をかけ、２〜５分間放置し
た。
【００６５】Hyperfilm TM ECL（Amersham製）と共にハ
イパーカセット（Amersham製）にメンブレンとフィルム
をセットし、室温で一晩放置し、現像を行った （6）データ解析 現像したフィルムとメンブレンの位置を合わせ、マジッ
クインキでウェルの位置を記入した。テロメア領域を含
むＤＮＡはスメアとしてメンブレン上に現れるので、こ
のスメアの濃さのピークをデンシトメトリー（Ultra Sc
an XL Laser Densitometer, Pharmacia製）で検出し
た。
イパーカセット（Amersham製）にメンブレンとフィルム
をセットし、室温で一晩放置し、現像を行った （6）データ解析 現像したフィルムとメンブレンの位置を合わせ、マジッ
クインキでウェルの位置を記入した。テロメア領域を含
むＤＮＡはスメアとしてメンブレン上に現れるので、こ
のスメアの濃さのピークをデンシトメトリー（Ultra Sc
an XL Laser Densitometer, Pharmacia製）で検出し
た。
【００６６】ウェルからピークまでの距離を移動度と
し、その移動度を求めた。マーカーの移動度から検量線
を作成し、各試料中のテロメア領域を含むＤＮＡの長さ
を求めた。その結果、テロメア領域を含むＤＮＡは０歳
の１１．７ｋｂから次第に短縮化し、７７歳までほぼ直
線的に短縮化していることが確認できた。
し、その移動度を求めた。マーカーの移動度から検量線
を作成し、各試料中のテロメア領域を含むＤＮＡの長さ
を求めた。その結果、テロメア領域を含むＤＮＡは０歳
の１１．７ｋｂから次第に短縮化し、７７歳までほぼ直
線的に短縮化していることが確認できた。
【００６７】実施例４：フルオレセインイソチオシアネ
ート（FITC）標識ＰＮＡ骨格プローブを用いたテロメア
長の測定
ート（FITC）標識ＰＮＡ骨格プローブを用いたテロメア
長の測定
【００６８】（1）試料の調製、（2）アガロースゲル電
気泳動、及び（3）サザントランスファーを実施例３と
同様にして行った。
気泳動、及び（3）サザントランスファーを実施例３と
同様にして行った。
【００６９】（4）ＤＮＡハイブリダイゼーション ベーキングしたメンブレンは５５℃で予備加熱したDenh
artハイブリダイゼーションバッファー（変性サケ***D
NAを含む）に浸し、５５℃で少なくとも１５分以上振盪
し、プレハイブリダイゼーションを行った。
artハイブリダイゼーションバッファー（変性サケ***D
NAを含む）に浸し、５５℃で少なくとも１５分以上振盪
し、プレハイブリダイゼーションを行った。
【００７０】プレハイブリダイゼーションが終了した後
に、シールドバッグにメンブレンフィルターを入れ、実
施例２の方法で調製したＦＩＴＣ標識ＰＮＡ骨格プロー
ブ１００ｎｇを加えたDenhartハイブリダイゼーション
バッファー２ｍＬを加え、泡が入らないようにシールし
た。
に、シールドバッグにメンブレンフィルターを入れ、実
施例２の方法で調製したＦＩＴＣ標識ＰＮＡ骨格プロー
ブ１００ｎｇを加えたDenhartハイブリダイゼーション
バッファー２ｍＬを加え、泡が入らないようにシールし
た。
【００７１】５５℃で一晩振盪し、ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。
ョンを行った。
【００７２】（5）洗浄及び検出 ハイブリダイゼーションしたメンブレンを実施例３と同
様にして洗浄し、これを４８８ｎｍのアルゴンイオンレ
ーザー光で励起し、ＦＩＴＣ標識ＰＮＡ骨格プローブと
ハイブリダイズしたメンブレン上のテロメアＤＮＡによ
って生じる５３０ｎｍの蛍光を検出した（Falk at al.,
J. Immunol., (1988), 140, 2652-2560）。
様にして洗浄し、これを４８８ｎｍのアルゴンイオンレ
ーザー光で励起し、ＦＩＴＣ標識ＰＮＡ骨格プローブと
ハイブリダイズしたメンブレン上のテロメアＤＮＡによ
って生じる５３０ｎｍの蛍光を検出した（Falk at al.,
J. Immunol., (1988), 140, 2652-2560）。
【００７３】（6）データ解析 蛍光強度の定量はメンブレンの各レーン毎にエリア分割
して浜松ホトニクス製のARGUS−100 / VIM超高感度イメ
ージング画像解析装置で行ないＮＩＨイメージでヒスト
グラム化し最大値ピークと半値幅を求めた。
して浜松ホトニクス製のARGUS−100 / VIM超高感度イメ
ージング画像解析装置で行ないＮＩＨイメージでヒスト
グラム化し最大値ピークと半値幅を求めた。
【００７４】ウェルの位置（原点）からマーカーとした
ＤＮＡのヒストグラムのピーク値（最大値）までの距離
に基づいて検量線を作成し、各試料中のテロメアＤＮＡ
の長さを求めた。その結果、実施例３と同様に、テロメ
アＤＮＡは０歳から７７歳までほぼ直線的に短縮化して
いることがわかった。また、２５歳（女性）の頬骨頂部
上の皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡに含まれるテロメ
アＤＮＡは、９．０ｋｂであった。
ＤＮＡのヒストグラムのピーク値（最大値）までの距離
に基づいて検量線を作成し、各試料中のテロメアＤＮＡ
の長さを求めた。その結果、実施例３と同様に、テロメ
アＤＮＡは０歳から７７歳までほぼ直線的に短縮化して
いることがわかった。また、２５歳（女性）の頬骨頂部
上の皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡに含まれるテロメ
アＤＮＡは、９．０ｋｂであった。
【００７５】
【発明の効果】本発明のＰＮＡ骨格テロメア認識プロー
ブを用いたテロメア長の測定方法によれば、少量のＤＮ
Ａを用いて迅速かつ正確に、テロメア長を測定すること
ができ、それにより、皮膚の老化度を測定することが可
能となる。
ブを用いたテロメア長の測定方法によれば、少量のＤＮ
Ａを用いて迅速かつ正確に、テロメア長を測定すること
ができ、それにより、皮膚の老化度を測定することが可
能となる。
【図１】 皮膚の老化度を評価する場合の顔面の皮膚表
皮の採取部位の説明図である。
皮の採取部位の説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 阿萬 芳和 静岡県志太郡大井川町上泉132−１ 株式 会社ソニーシーピーラボラトリーズ内 (72)発明者 杉本 美穂 静岡県志太郡大井川町上泉132−１ 株式 会社ソニーシーピーラボラトリーズ内 (72)発明者 三羽 信比古 広島県庄原市西本町１−10−５ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 CB09 DA13 FB02 FB07 FB08 FB12 FB13 4B024 AA11 CA05 CA09 HA14 4B063 QA12 QA19 QQ02 QQ42 QR32 QR56 QR58 QS03 QS10 QS14 QS34 QS36 QS39 QX02
Claims (4)
- 【請求項１】 細胞から得たテロメア領域を含むＤＮＡ
断片（以下、テロメアＤＮＡという）とハイブリダイズ
するＰＮＡ骨格のプローブであって、Ｎ末端−（ＣＣＣ
ＴＡＡ）n−Ｃ末端 または Ｎ末端−（ＴＴＡＧＧＧ）n
−Ｃ末端 （ｎ＝３〜５）の塩基配列を有し、放射線同
位体、蛍光化合物、化学発光化合物、または酵素で標識
されているＰＮＡ骨格テロメア認識プローブ。 - 【請求項２】 細胞から得たテロメアＤＮＡを泳動分離
し、泳動分離したテロメアＤＮＡを、請求項１記載のＰ
ＮＡ骨格テロメア認識プローブを用いて検出し、テロメ
アＤＮＡの長さ（以下、テロメア長という）を求めるこ
とを特徴とするテロメア長の測定方法。 - 【請求項３】 請求項２記載の方法により皮膚表皮細胞
のテロメア長を求め、得られたテロメア長に基づき、皮
膚の老化度を評価する皮膚老化度の評価方法。 - 【請求項４】 請求項１記載のＰＮＡ骨格テロメア認識
プローブと、皮膚表皮屑片採取用器具とを含むテロメア
長測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34553999A JP2001161364A (ja) | 1999-12-03 | 1999-12-03 | Ｐｎａ骨格テロメア認識プローブ及びそれを用いたテロメア長の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34553999A JP2001161364A (ja) | 1999-12-03 | 1999-12-03 | Ｐｎａ骨格テロメア認識プローブ及びそれを用いたテロメア長の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001161364A true JP2001161364A (ja) | 2001-06-19 |
Family
ID=18377283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34553999A Pending JP2001161364A (ja) | 1999-12-03 | 1999-12-03 | Ｐｎａ骨格テロメア認識プローブ及びそれを用いたテロメア長の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001161364A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100631338B1 (ko) | 2004-06-16 | 2006-10-09 | 진주산업대학교 산학협력단 | 염색체 텔로미어의 상대적 함량 분석법 |
| US7820972B2 (en) | 2005-09-02 | 2010-10-26 | Pola Chemical Industries Inc. | Method of evaluating skin conditions and method of estimating skin thickness |
| CN101230403B (zh) * | 2008-02-21 | 2010-12-29 | 浙江理工大学 | 解析染色体端粒g-末端序列的方法 |
| JP2017070453A (ja) * | 2015-10-06 | 2017-04-13 | 株式会社リガク | 骨塩密度の解析装置、解析方法および解析プログラム |
| WO2019098194A1 (ja) | 2017-11-14 | 2019-05-23 | 国立大学法人広島大学 | 老化状態の評価方法、情報の提示方法、及び老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法 |
-
1999
- 1999-12-03 JP JP34553999A patent/JP2001161364A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100631338B1 (ko) | 2004-06-16 | 2006-10-09 | 진주산업대학교 산학협력단 | 염색체 텔로미어의 상대적 함량 분석법 |
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| WO2019098194A1 (ja) | 2017-11-14 | 2019-05-23 | 国立大学法人広島大学 | 老化状態の評価方法、情報の提示方法、及び老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法 |
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