CN101209258B - 一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物 - Google Patents

Abstract

为了更好发挥中药多糖抑制体内、外病毒繁殖，保护细胞免于感染，提高感染动物的存活率的效果，本发明提供一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物。一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物，按重量份包含有效成分黄芪多糖1-9和板蓝根多糖1-9。按重量份由4-30的有效成分和70～96的载体组成。载体是无水葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钠中的至少一种。载体是注射用水。所述的任何一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物的应用，应用于畜禽、宠物的病毒性传染病的防治及免疫力低下。本发明主要从中药黄芪、板蓝根中提取多糖成分，将两种多糖混合使用使得效果好于单独任何一种，既能作为免疫增强剂又能作为抗病毒药物的尚属首次。

Description

一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物

技术领域

本发明涉及一种动物用药物及其制备方法，特别涉及一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物。

背景技术

一.畜禽传染病

畜禽传染病一直是畜牧业发展的克星，尤其是病毒病，迄今尚无有效的治疗方法，一旦发病，轻者部分死亡，重者全群覆没。一些病毒性疾病还是免疫抑制性疾病，例如鸡传染性法氏囊病、猪蓝耳病等，由于这些病引起感染动物的免疫力低下、发生免疫抑制，造成并发或继发感染，以及疫苗的免疫失败，造成鸡群、猪群极高的淘汰率和死亡率。目前，我国规模化养殖中，免疫失败招致了巨大的经济损失。

由于病毒自身缺乏酶***，只能在活细胞内严格寄生。因此，化学药物在杀伤病毒的同时，往往对宿主细胞造成一定程度的杀伤。化学药物存在抗药性、毒副残留等弊端，且对病毒性疾病目前尚无特效药物。加入WTO后，在我国出口型动物生产区，用于疾病控制的近百种药品已被列为禁用品。因此，人们把目光转向天然药物，国际上掀起了对天然药物研究的高潮。中药不但能直接杀伤病毒，还可以通过调整机体免疫功能，提高机体的抗病毒能力。研究发现，中药增强免疫的主要成分是其中的多糖成分。中药多糖在体、内外也都具有抗病毒作用，表现为抑制体内、外病毒繁殖，保护细胞免于感染，提高感染动物的存活率。

发明内容

为了更好发挥中药多糖抑制体内、外病毒繁殖，保护细胞免于感染，提高感染动物的存活率的效果，本发明提供一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物。

本发明是这样实现的，一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物，按重量份包含有效成分黄芪多糖1-9和板蓝根多糖1-9。

所述的一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物，其特征在于：按重量份由4-30的有效成分和70～96的载体组成。

所述的一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物，其特征在于：载体是无水葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钠中的至少一种。

所述的一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物，其特征在于：载体是注射用水。

所述的一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物，其特征在于：是5～7。

所述的任何一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物的应用，其特征在于：应用于畜禽、宠物的病毒性传染病的防治及免疫力低下。

本发明主要从中药黄芪、板蓝根中提取多糖成分，并将两种多糖按一定的比例配制成复合多糖，作为免疫增强剂和抗病毒药物使用。至今，国内外应用植物多糖作为免疫增强剂的产品虽然不少，但多为一种多糖或一种多糖与其他成分的混合物。将两种多糖混合使用使得效果好于单独任何一种，既能作为免疫增强剂又能作为抗病毒药物的尚属首次。

附图说明

图1正常PK-15细胞对照(×100)；

图2PRV感染的PK-15细胞对照(×100)；

图3中药多糖作用于感染PRV的PK-15细胞(抑制作用显著)(×100)；

图4PK-15中药多糖作用于感染PRV的PK-15细胞(抑制作用不显著)(×100)。

具体实施方式

中药多糖的抗病毒作用研究

中药多糖的抗病毒作用是多方面的，表现为抑制体内、外病毒繁殖，保护细胞免于感染；诱生机体产生干扰素，增强机体免疫功能，提高感染动物的存活率。

干扰素(IFN)是在特定诱生剂(如病毒)作用下，由细胞基因编码控制产生的一种低分子量可溶性蛋白质。它具有强大的抗病毒作用，一种IFN即可抑制多种RNA病毒又可抑制多种DNA病毒，其抗病毒作用是通过诱导细胞产生“抗病毒蛋白”，抑制病毒蛋白质的合成完成的，也是中性粒细胞和NK细胞的强力激活因子。黄芪多糖具有明显的免疫活性，能促进病毒在机体诱生IFN的能力，刺激人白细胞IFN，增加IFN诱生的产量，使NK细胞功能增强。黄芪本身无诱生IFN的能力，但可促进小鼠对I型副流感病毒和鸡新城疫病毒产生IFN的能力。黄芪提高患者细胞诱生IFN的能力可能是黄芪抗病毒感染的原因之一，APS的抗病毒作用机理可能也与其相同。

文献报道将不同浓度的黄芪多糖、板蓝根多糖、淫羊藿多糖、蜂胶多糖、当归多糖和新城疫病毒以3种方式(先加入中药后接种病毒、先接种病毒后加入中药、中药与病毒混合感作后)加入到体外培养的鸡胚成纤维细胞(CEF)中，通过测定CEF OD570值的变化评价各中药成分对病毒的感染细胞能力的影响。结果表明，几乎所有中药成分均能一定程度地抑制病毒感染细胞能力，且与其浓度有一定的相关性。

对于生物活性多糖抗病毒作用的机制，除了多糖可直接与病毒结合，使病毒结构破坏，起到直接灭活作用外，一般认为与多糖激活机体免疫***有关，如多糖激活巨噬细胞、NK细胞，使其吞噬能力增强；促进淋巴细胞分泌抗病毒干扰素以及IL-1、IL-2等细胞因子，促进病毒抗体提前产生，从而发挥抗病毒作用。

黄芪多糖的提取：黄芪粉碎，加5倍量的水浸泡1小时，煮沸后小火维持1小时，过滤；滤渣再加5倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；滤渣再加3倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；三次滤液合并浓缩，最终浓度每毫升药液含1克生药。3000rpm离心20分钟，沉渣弃去，上清液加95％乙醇沉淀，使乙醇终浓度为70％。静置过夜，次日抽滤，沉淀用适量水溶解，4℃静置过夜，3000rpm离心20分钟，上清液加乙醇沉淀，乙醇终浓度70％，静置后抽滤，沉淀依次用80％、90％、100％的乙醇脱水，抽滤，60℃干燥。

板蓝根多糖的提取：提取过程同上，三次加水量分别为8倍、5倍、5倍。

两种多糖混合：将两种多糖按表1混合为有效成分，该混合多糖可按表2制成粉剂按表3制成注射剂使用。

表1黄芪多糖与板蓝根多糖组合为有效成分实施例

表2将有效成分制成粉剂实施例

表3将有效成分制成注射剂实施例，含有用于调节ph值的微量碳酸氢钠

下面实例和试验例对本发明作进一步阐述，但这些实施例和试验例绝不是对本发明的任何限制。

实例1

一种动物用免疫增强剂和抗病毒药物，其特征是由以下组分按重量份数配制而成：黄芪多糖10g，板蓝根多糖20g，氯化钠70g。

一种动物用免疫增强剂和抗病毒药物的制备方法，其特征是按如下步骤进行：

(1)黄芪多糖的提取：黄芪粉碎，加5倍量的水浸泡1小时，煮沸后小火维持1小时，过滤；滤渣再加5倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；滤渣再加3倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；三次滤液合并浓缩，最终浓度每毫升药液含1克生药。3000rpm离心20分钟，沉渣弃去，上清液加95％乙醇沉淀，使乙醇终浓度为70％。静置过夜，次日抽滤，沉淀用适量水溶解，4℃静置过夜，3000rpm离心20分钟，上清液加乙醇沉淀，乙醇终浓度70％，静置后抽滤，沉淀依次用80％、90％、100％的乙醇脱水，抽滤，60℃干燥。

(2)板蓝根多糖的提取：提取过程同上，三次加水量分别为8倍、5倍、5倍。

(3)称取黄芪多糖10g，板蓝根多糖20g，将两者混合均匀。

(4)称取氯化钠70g，与(3)中成分混合均匀。

实例2

一种动物用免疫增强剂和抗病毒药物一种动物用免疫增强剂和抗病毒药物，其特征是由以下组分按重量份数配制而成：黄芪多糖2g，板蓝根多糖3g，注射用水100ml。

一种动物用免疫增强剂和抗病毒药物的制备方法，其特征是按如下步骤进行：

(1)黄芪多糖的提取：黄芪粉碎，加5倍量的水浸泡1小时，煮沸后小火维持1小时，过滤；滤渣再加5倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；滤渣再加3倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；三次滤液合并浓缩，最终浓度每毫升药液含1克生药。3000rpm离心20分钟，沉渣弃去，上清液加95％7醇沉淀，使乙醇终浓度为70％。静置过夜，次日抽滤，沉淀用适量水溶解，4℃静置过夜，3000rpm离心20分钟，上清液加乙醇沉淀，乙醇终浓度70％，静置后抽滤，沉淀依次用80％、90％、100％的乙醇脱水，抽滤，60℃干燥。

(2)板蓝根多糖的提取：提取过程同上，三次加水量分别为8倍、5倍、5倍。

(3)称取黄芪多糖2g，板蓝根多糖3g。

(4)将(3)中成分加注射用水100ml，加热溶解。

(5)用碳酸氢钠调节ph值5～7。

(6)滤器滤过，灌封，100℃灭菌30min。

试验1复合黄芪多糖和板蓝根多糖体外对鸡胚成纤维细胞和鸡新城疫病毒的影响

本发明可将两种多糖设为不同的比例，如将黄芪多糖和板蓝根多糖按1∶1，1∶2，2∶1比例加入到培养24h的鸡胚成纤维细胞(CEE)中，再培养12h后接种NDV IV系，于接种后72h用中性红染料吸收法测定CEF活性，以此评价本发明药物对细胞增殖及其抵抗病毒感染的影响。测定结果说明，用本发明药物在不同比例均可显著促进CEE增殖，效果好于单一多糖，但差异不显著；而不同比例混合多糖均可显著促进CEF抵抗NDV的感染，较单一多糖差异显著。另外将混合多糖(黄芪多糖和板蓝根多糖比例为1∶2)与NDV IV系以3种顺序加入到培养24h的CEF中：先加混合多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、病毒和多糖混合后一起加入，于病毒接种后72h测定NDVI系的半数组织培养感染剂量(TCID50)，以评价药物对NDV感染细胞的影响。结果表明：本药物在先于病毒加入时对NDV有良好的抑制作用。

试验2复合黄芪多糖和板蓝根多糖对体外培养猪脾脏淋巴细胞增殖的影响

材料与方法

1.猪脾脏淋巴细胞悬液的制备无菌取猪脾脏，分离淋巴细胞，稀释成细胞含量为4×106mL-1的悬液，

2.淋巴细胞培养及检测将细胞液分成两等份，分别加入ConA(终浓度为5μg.mL-1)或LPS(终浓度为20μg.mL-1)，加样96孔板，每孔100μL，再分别加入不同浓度的多糖各100μL，每个浓度重复4孔。另设ConA或LPS的对照孔和无细胞的调零孔。置37℃、5％CO2条件下培养72h，试验结束前4h各孔加入20μL的MTT液，弃上清液，加入DMSO 100μL，震荡10min，测570nm下的吸光度值(OD值)，作为淋巴细胞增殖的指标。

结果：从表一和表二可以看出，两种比例的混合多糖均能协同ConA和LPS促进体外培养猪脾脏淋巴细胞的增殖，说明混合多糖体外均能提高猪脾T淋巴细胞和B淋巴细胞的转化率，促进猪细胞免疫和体液免疫功能，与单一多糖相比差异显著。

表1混合多糖协同ConA对体外培养猪脾淋巴细胞增殖的影响(OD值)

注：a，b，…。同一种中药多糖中同行数据标有不同字母者表示差异显著(P＜0.05)。混合多糖1为黄芪多糖和板蓝根多糖比例1∶1，混合多糖2为黄芪多糖和板蓝根多糖比例1∶2

表2四种中药多糖协同LPS对体外培养猪脾淋巴细胞增殖的影响(OD值)

注：a，b，…。同一种中药多糖中同行数据标有不同字母者表示差异显著(P＜0.05)。混合多糖1为黄芪多糖和板蓝根多糖比例1∶1，混合多糖2为黄芪多糖和板蓝根多糖比例1∶2

上述参照实施例对一种动物用免疫增强剂和抗病毒药物及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

下面是本发明有关的试验

板蓝根黄芪复合多糖临床治疗鸡新城疫的试验报告

试验动物：河南省某养鸡场自然发病病例790例(通过临床诊断和实验室诊断确诊)，分为治疗组(395例)、未治疗组(395例)。

药物与方法：板蓝根多糖、黄芪多糖和氯化钠按10∶10∶3的比例混匀，取10g上述混合物加入到1kg水中，每只5mL饮水，连饮4天，观察15d，统计死亡病例，计算死亡率。

临床治疗试验结果见下表。经统计学分析，治疗组与对照组(未治疗组)的死亡率差异极显著(P＜0.01)，表明本复方对鸡新城疫自然发病病例有良好的治疗效果。

^**治疗组与未治疗组比较P＜0.01

组别	数量	死亡数	死亡率％
				治疗组	395	85**	21**
对照组	395	240	60.8

板蓝根黄芪复合多糖体外抗伪狂犬病毒的试验研究

摘要：本试验利用猪肾细胞(PK-15)体外培养***，通过观察细胞病变效应(CPE)与中性红染料吸收法来综合评价黄芪多糖(APS)与板蓝根多糖(IRPS)体外抑制伪狂犬病毒(PRV)对细胞的感染作用，并通过改变加药方式(先加药物后接种病毒、先接种病毒后再加药物、病毒和药物感作后同时加入)，初步探讨中药活性提取物的抗病毒机制。结果表明：在安全浓度范围内，三个复方对于PRV的阻断作用和抑制作用明显大于任一单个多糖，显示出两种多糖的协同作用，但复方体外对于PRV的直接杀灭作用不如单个多糖。

目前，国内外有关抗病毒中药的研究日益增多，从中筛选出有效成份已成为抗病毒新药研发的一个热点^[1]，许多研究表明，多糖、黄酮和皂甙类成份是中药的关键活性成份，具有促进细胞生长、增强免疫和抗病毒等多种作用^[2，3]。然而有关中药活性提取物体外抗伪狂犬病毒(PRV)的试验未曾报道，本试验通过对板蓝根、黄芪等中药活性提取物成份体外对PRV作用的研究，旨在筛选出抗病毒效果较好的中药成份，为研制新型抗病毒制剂提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1中药多糖

中药多糖：黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)、板蓝根多糖(Isatisrootpolysaccharide，IRPS)，按照常规水提醇沉法进行提取，硫酸-蒽酮法测得黄芪多糖含量为65％，板蓝根多糖含量为56％，使用前配制成1mL含多糖0.05g，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

中药多糖复方：将黄芪多糖与板蓝根多糖分别按1∶1(复方I)、1∶2(复方II)、2∶1(复方III)混合，用双蒸水配制成1mL含多糖0.05g，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

1.1.2毒株、细胞

PRV与PK-15传代细胞均由河南农业大学微生物实验室提供。

1.1.3试剂

1640培养基(GIBCO公司产品)、小牛血清(HyClone公司产品)、细胞生长液(含10％小牛血清)、细胞维持液(含5％小牛血清)、胰蛋白酶(0.25％)、PBS缓冲液、7.4％NaHCO₃、双抗(青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL)

1.1.4仪器

二氧化碳培养箱(NUAIR/UN-4500E型)、倒置显微镜(Leica/DXP-1型)、细胞培养瓶、96孔细胞培养板(Coring/Costar产品)，SP-DJ系列垂直净化工作台(上海浦东物理光学仪器厂)。

1.2方法

1.2.1病毒毒力测定-TCID₅₀

按常规方法^[8]将PK-15细胞进行消化传代，细胞数调整至1×10⁶个/mL后，加至96孔细胞培养板中，0.1mL/孔，37℃5％CO₂培养箱中培养。待细胞长成单层后，接种稀释度分别为10^-1~10^-11的病毒液，0.1mL/孔，每个稀释度接种4孔，37℃5％CO₂培养72h，每天观察CPE情况。按Reed-Muench公式计算TCID₅₀ ^[9，10]。

1.2.2中药多糖与复方对PK-15细胞安全浓度的测定(CPE法)

将中药多糖与复方分别用细胞维持液作连续的倍比稀释后，加到长成单层PK-15的96孔细胞培养板上，0.1mL/孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照，置37℃5％CO₂培养箱中培养72h，每天观察CPE情况。

1.2.3中药多糖与复方对PRV的阻断作用测定(先加多糖后加病毒)

在安全浓度的基础上将中药多糖与复方分别倍比稀释成5个稀释度，加到长成单层PK-15的96孔细胞培养板上，0.1mL/孔，每个稀释度重复4孔。37℃作用4h，弃去药液，每孔加入100TCID₅₀病毒液0.1mL，37℃吸附1.5h，弃去病毒液，用PBS液洗2次，加入维持液，另设细胞对照和病毒对照。37℃、5％CO₂培养箱中培养，每日观察CPE，当病毒对照CPE达到70~80％，记录CPE情况。

1.2.4中药多糖与复方对PRV的抑制作用测定(先加病毒后加多糖)

将100TCID₅₀病毒液接种至长成单层PK-15的96孔细胞培养板上，0.1mL/孔，37℃吸附1.5h，弃去病毒液，用PBS液洗2次，分别加入倍比稀释的中药多糖与复方，0.1mL/孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照和病毒对照。37℃、5％CO₂培养箱中培养，记录方法同1.2.3。

1.2.5中药多糖与复方对PRV的直接杀灭作用测定(病毒和多糖体外作用)

将4个稀释度的中药多糖与复方药液分别与等体积100TCID₅₀病毒液混合，37℃作用2h，加到长成单层PK-15的96孔细胞培养板上，0.1mL/孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照和病毒对照。37℃、5％CO₂培养箱中培养，记录方法同1.2.3。

1.2.6中性红染料吸收法^[5]测定细胞活性

测定前2h每孔加入50μL中性红染液，测定时倒掉孔内液体，用PBS洗细胞3次，每孔加入150μL脱色液，置微量振荡器上震荡5min，然后在酶联免疫检测仪上测定570nm下的吸光(OD)值。

1.3数据统计

数据以Means±SD表示，用SPSS 11.0软件进行Duncan’s多重分析。分别统计比较病毒-中药组与病毒对照组OD值的差异性，以评价各中药成分对病毒感染细胞能力。

2结果

2.1PRV TCID₅₀测定结果

72h测得PRV TCID₅₀为10^-5.5/0.1mL

2.2中药多糖与复方对PK-15细胞安全浓度测定结果

表1APS、IRPS与多糖复方对PK-15细胞的最大安全浓度

2.3细胞培养与细胞病变(CPE)

PK-15传代细胞加入96孔板，24～36h后可长成致密的单层，正常细胞呈三角形、多角形、等多种形态，细胞轮廓清晰(见图-1).接种PRV 48-72h后，细胞脱落，出现“拉网”现象，(见图-2).中药多糖对PRV的体外作用时对CPE的影响(见图-3、4)

2.3中药多糖与多糖复方对PRV的阻断作用效果(见表2)

试验结果表明，黄芪多糖和板蓝根多糖单独使用体外均能阻断PRV的增殖，与对照组相比差异显著；由黄芪多糖和板蓝根多糖组成的三个复方体外也均能阻断PRV的增殖，与对照组相比差异显著，而且随着多糖稀释度的增加，三个复方对于PRV的阻断作用明显大于任一单个多糖，显示出两种多糖的协同作用。

表2中药多糖与PK-15作用后对PRV引起CPE的阻断作用

注：①②③④⑤表示各药物在安全浓度的基础上作2倍倍比稀释的5个稀释度；同行数据没有相同字母者差异显著(P＜0.05)

2.4中药多糖与多糖复方对PRV的抑制作用效果(见表3)

从表3可以看出，单独黄芪多糖和板蓝根多糖体外对PRV的增殖有一定的抑制作用，在某些浓度(黄芪多糖为浓度②③，板蓝根多糖为浓度④⑤)差异显著。两种多糖组成的三个复方体外均能抑制PRV的增殖，而且五个稀释度与对照组相比均差异显著。

表3中药多糖与PK-15作用后对PRV引起CPE的抑制作用

注：同表1

2.5中药多糖与多糖复方对PRV的直接杀灭作用效果(见表4)

从表4可以看出，黄芪多糖和板蓝根多糖体外对PRV均有直接杀灭作用，差异显著；而三个复方体外对PRV的直接杀灭作用并不明显(除了复方III在浓度①②差异显著)，差异不显著。

表4与中药多糖作用后的PRV对PK-15细胞CPE影响作用

注：同表1

Claims (2)

1.一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物，按重量份由4-30的有效成分和70-96的载体组成；按重量份包含有效成分黄芪多糖1-9和板蓝根多糖1-9，载体是无水葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钠中的至少一种；

其中黄芪多糖由下属方法提取：

黄芪粉碎，加5倍量的水浸泡1小时，煮沸后小火维持1小时，过滤：滤渣再加5倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；滤渣再加3倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；三次滤液合并浓缩，最终浓度每毫升药液含1克生药；3000rpm离心20分钟，沉渣弃去，上清液加95％乙醇沉淀，使乙醇终浓度为70％；静置过夜，次日抽滤，沉淀用适量水溶解，4℃静置过夜，3000rpm离心20分钟，上清液加乙醇沉淀，乙醇终浓度70％，静置后抽滤，沉淀依次用80％、90％、100％的乙醇脱水，抽滤，60℃干燥。

2.一种动物用免疫增强剂和抗病毒的组合物，按重量份由4-30的有效成分和70-96的载体组成；按重量份包含有效成分黄芪多糖1-9和板蓝根多糖1-9，载体是注射用水，ph值是5～7；

其中黄芪多糖由下属方法提取：

黄芪粉碎，加5倍量的水浸泡1小时，煮沸后小火维持1小时，过滤：滤渣再加5倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；滤渣再加3倍量水，煮沸后小火维持半小时，过滤；三次滤液合并浓缩，最终浓度每毫升药液含1克生药；3000rpm离心20分钟，沉渣弃去，上清液加95％乙醇沉淀，使乙醇终浓度为70％；静置过夜，次日抽滤，沉淀用适量水溶解，4℃静置过夜，3000rpm离心20分钟，上清液加乙醇沉淀，乙醇终浓度70％，静置后抽滤，沉淀依次用80％、90％、100％的乙醇脱水，抽滤，60℃干燥。

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