CN101200497A - 一种霞水母来源的类ⅱ型胶原及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明发明了一种霞水母来源的类II型胶原及其制备工艺，属天然生物活性物质及其制备技术领域。它提供了一种新型的天然海洋生物类II型胶原。按照本发明进行操作，能够获得0.5％wt.的纯度达到85％以上的类II型胶原。这种类II型胶原是一种白色粉末，有海腥味，其中含有85～99％wt.的蛋白质，几乎不含糖。该类II型胶原无毒，具有II型胶原所具有的口服诱导免疫耐受预防和治疗类风湿性关节炎的活性。
Description
技术领域
本专利涉及一种霞水母来源的类II型胶原及其制备工艺，属天然生物活性物质及其制备技术领域。
背景技术
霞水母(Cyanea nozakii)，俗称麻蜇，是一种大型海洋浮游生物，属刺胞动物门(Phylum Cnidaria)，钵水母纲(Class Scyphomedusae)，旗口水母目(Order Phylum cnidaria)，霞水母科(Family Cyanea)。我国沿海已发现的有白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、发形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferrugineaEschscholtz)，和紫色霞水母(Cyaneapurpurea Kishinouye)4个种，其中以白色霞水母数量最多、分布范围最广。霞水母通常以小型浮游动物为饵，其生殖腺发达，繁殖能力强，生长速度极快，目前我国霞水母的年产量已经高达千万吨，构成了一种新的天然海洋生物资源。
海洋来源的多糖、蛋白聚糖和胶原蛋白是十分重要的天然海洋食品资源，常常具有显著的生物活性，如海参多糖、海藻多糖等均有许多的研究报道，证实其具有显著的生物活性。
在美国已经有人进行了以水母中的一种，沙蜇(Stomolophus meleagris)为原料，分离提取制备类II型胶原的研究，并已申请专利[1]，但以霞水母为原料分离提取制备类II型胶原的研究国内外尚未见任何报道。[1]United States Patent：6,894,029
发明内容
本专利发明了一种霞水母来源的类II型胶原及其制备工艺。较为独特的是，它以一种新型的天然海洋生物资源-霞水母(Cyanea nozakii)-作为类II型胶原的制备原料进行加工，实现了对霞水母进行开发利用的目的。按照本专利进行操作，能够以极高的产率获得高纯度类II型胶原产品。这对于霞水母这一天然海洋生物资源的综合利用而言是至关重要的。
本专利发明的霞水母活性类II型胶原经初步的研究确认，基本无毒，具有II型胶原所具有的口服诱导免疫耐受预防和治疗类风湿性关节炎的活性，将作为新型的生物活性材料和医药与保健食品原料被广泛应用于食品工业和医药工业。
具体来说，首先，我们发现新鲜的、冷冻冷藏的或经过三矾腌制处理的市售麻蜇可以在经过脱盐处理之后用作类II型胶原的制备原料。其中所含的类II型胶原对水浸泡处理是稳定的，在我们所采取的浸泡工艺条件下，既不会因受到浸泡而被降解、被提取到水中流失，也不会因受过浸泡而影响其在后续的水解处理中的分散性，即经过冷冻冷藏或三矾腌制处理的市售麻蜇与刚捕捞上岸的新鲜的霞水母具有同等的可加工性，均可用作制备高纯度高生物活性类II型胶原的原料。由此奠定了以霞水母为原料加工制备高纯度高生物活性类II型胶原的基础。
其次，在对温度、压力等水解条件以及氢氧化钠、盐酸、胶原蛋白酶等各种常用的抽提剂进行了***的考察和对比后，我们发现，在适当的酶解条件下，霞水母中所含有的类II型胶原不经过变性处理，便可直接被溶解，分散到酸性溶液中，得到酶促溶酸性胶原。
我们发现，在浸泡溶剂、浸泡时间、抽提剂等水解工艺参数中，抽提剂的种类和抽提时所采用的温度对于抽提得率而言是最为重要的。其中，有效的抽提剂为常见的碱(如钠、钾、钙、钡的氢氧化物或碳酸盐、氨水等)、常见的酸(如盐酸、磷酸、硫酸等无机酸或甲酸、醋酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸等有机酸)或各种蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶等)中的一种或若干种。当选用氢氧化钠为抽提剂时，pH值应当在7.0-14.0范围之内，当选用盐酸为抽提剂时，pH值应当在0.5-6.8范围之内，当选用蛋白酶类为抽提剂时，pH值应当在所选酶的最适pH范围之内；当选用酸碱为抽提剂时，抽提温度应当在-30-200℃范围内，最好是在0-60℃的范围内，当选用蛋白酶类为抽提剂时，应当在蛋白酶类的最适温度下进行抽提。其他各项参数，浸泡脱盐需进行0-15次，每次浸泡所需的用水量为所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡温度在-50-98℃范围内，浸泡时间为0.5-12hr次-1。盐析可选用(NH4)2SO4或NaCl为盐析剂，饱和度为0.1～10molL-1。透析可选用pH调节为某一定值的自来水或去离子水进行，其pH值在2-12范围之内。用于调节pH的缓冲盐类可以是Tris-HCl、磷酸盐类、醋酸盐类、柠檬酸盐类，缓冲液的浓度为0.01～10molL-1。液体的干燥方式，可以是冷冻干燥，也可以是喷雾干燥。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例一
取1000g冷冻保藏的新鲜霞水母，化冻，洗净，室温下用高速组织匀浆机在10000rpm处理10分钟，得匀浆。向匀浆中加入2倍体积的0.1mol/L的NaOH，在4℃条件下，搅拌24小时，然后用高速冷冻离心机，4℃，8000rpm离心10min，弃去上清，收集沉淀。重复上述对匀浆的提取操作3次。将离心后的沉淀，用蒸馏水反复冲洗至中性，然后加入0.5mol/L的醋酸，在4℃条件下，搅拌48小时，然后用冷冻离心机，4℃，8000rpm离心20min，弃去上清，收集沉淀。重复上述提取操作2次。将离心得到的沉淀加入2倍体积的0.5mol/L的醋酸，加入水母重量5‰的胃蛋白酶，搅拌至少48小时，然后用冷冻离心机，4℃，8000rpm离心20min，弃去沉淀，收集上清。向所得到的上清液中加入NaCl固体，至NaCl的浓度达到2mol/L，搅拌至NaCl全部溶解，然后在4℃下放置过夜。用冷冻离心机，4℃，8000rpm离心20min，弃去上清，将沉淀在0.02mol/LNa2HPO4缓冲液中透析48小时，用AgNO3检测透析外液，无Cl-检出。将得到的透析液，冷冻干燥，既得5g霞水母类II型胶原产品。
实例二
取1000g三矾腌制处理的市售麻蜇，沥水后，室温下浸没于2-5倍量的去离子水中浸泡，并每2-3小时换一次水，直至浸泡水中氯化钠的含量低于1.5ppm为止(氯离子检测呈阴性)，得到980g脱盐霞水母。脱盐霞水母室温下用高速组织匀浆机在10000rpm处理10分钟，得匀浆。向匀浆中加入2倍体积的0.1mol/L的NaOH，在4℃条件下，搅拌24小时，然后用高速冷冻离心机，4℃，8000rpm离心30min，弃去上清，收集沉淀。重复上述对匀浆的提取操作3次。将离心后的沉淀，用蒸馏水反复冲洗至中性，然后加入0.5mol/L的醋酸，在4℃条件下，搅拌48小时，然后用冷冻离心机，4℃，8000rpm离心60min，弃去上清，收集沉淀。重复上述提取操作2次。将离心得到的沉淀加入2倍体积的0.5mol/L的醋酸，加入水母重量5‰的胃蛋白酶，搅拌至少48小时，然后用冷冻离心机，4℃，8000rpm离心30min，弃去沉淀，收集上清。向所得到的上清液中加入NaCl固体，至NaCl的浓度达到2mol/L，搅拌至NaCl全部溶解，然后在4℃下放置过夜。用冷冻离心机，4℃，8000rpm离心20min，弃去上清，将沉淀在0.02mol/L Na2HPO4缓冲液中透析48小时，用AgNO3检测透析外液，无Cl-检出。将得到的透析液，冷冻干燥，既得5g霞水母类II型胶原产品。
实例三
对一份类II型胶原液体样品进行了蛋白含量的测定，总糖含量的测定以及氨基酸组成的测定。测定结果表明，该样品中含98％的蛋白质，基本不含糖。所含氨基酸的组成见表1。
表1供试样品的氨基酸组成
| 氨基酸 | 含量(mg/g) | ％ |
| 天冬氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸甘氨酸苏氨酸 | 7.078835.804463.526081.172883.918962.30857 | 11.669.565.81.936.463.8 |
| 精氨酸丙氨酸酪氨酸半胱氨酸缬氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸羟脯氨酸脯氨酸 | 3.226972.123223.286751.453432.648050.4724422.883793.297033.419243.115568.073912.900960.71107 | 5.323.55.412.394.360.784.755.435.635.1313.34.7899.99 |
实例四
以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18-22g，由无锡市惠山江南实验动物场提供【批准号：SCXK(苏)2002-0006】)为实验动物，对所得到的霞水母类II型胶原进行急性毒性试验，所得结果如下：
表2供试样品对小鼠体重的影响
| 天数/组别 | 空白对照 | 试验组 |
| 1d2d3d4d5d6d7d | 22.806g22.985g24.300g24.688g25.146g26.084g26.180g | 22.66723.07523.63523.76624.56625.06625.966 |
表3急性毒性实验结果
| 组别 | 小鼠数量 | 给药剂量 | 一周体重增长 | 增长率 | 死亡数 |
| 空白对照试验组 | 1010 | 0.5ml/只7500mg/kg | 3.374g3.299g | 14.79％14.55％ | 00 |
通过观察，给药后1h内小鼠活动均减少，4h后逐渐恢复正常活动。试验组7d内进食量逐渐增加，且小鼠食欲、精神、毛色均正常；7d后，脱颈处死，肉眼尸检未见心、肝、脾、肺、肾等主要脏器病变和中毒现象。观察期7d内每天称重，试验组小鼠的体重不断增加。研究结果表明，在供试样品大剂量灌胃的情况下，未出现小鼠死亡，也未有明显毒性反应。说明其无毒性或毒性很小，其最大安全剂量在7500mg/Kg以上。
实例五
以健康SD大鼠(全雄，体重150±20g，由无锡市惠山江南实验动物场提供【许可证号：SCXK(浙)2003-0001】)为实验动物，对所得到的霞水母类II型胶原进行用于治疗大鼠佐剂型关节炎的生理活性试验，所得结果如下：
1，通过灌胃霞水母类II型胶原14天后，发现给药组大鼠双后肢关节较模型组明显减小，两周后，效果有所减弱。证明高中低剂量的霞水母类II型胶原对佐剂型关节炎均有一定的治疗效果。详见表4。
表4供试样品对大鼠佐剂型关节炎关节肿胀的影响(，n＝3)
| 组别 | Dose(mg/kg) | 灌胃前 | 灌胃完 | 灌完一周 | 灌完二周 |
| 模型组胶原空白组治疗阳性组 | 51020泼尼地松25 | 0.96±0.050.98±0.090.97±0.091.00±0.150.78±0.02§0.89±0.07 | 0.95±0.080.86±0.03*0.79±0.05*0.85±0.05**0.83±0.05*0.86±0.02 | 1.01±0.080.88±0.04**0.86±0.05**0.84±0.05§0.85±0.05**0.94±0.05 | 0.90±0.040.87±0.020.88±0.070.87±0.060.83±0.03**0.95±0.04 |
各组数据均与对应时间的模型组比较§P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05
2，通过灌胃霞水母类II型胶原14天后，发现给药组大鼠血清中NO较模型组明显减小，且效果持续稳定，证明口服高中低剂量的霞水母类II型胶原可以有效抑制佐剂型关节炎大鼠体内的NO含量的升高。详见表5。
表5供试样品对大鼠佐剂型关节炎血清NO的影响(
，n＝3)
| 组别 | Dose(mg/kg) | 灌胃前 | 灌胃完 | 灌完一周 | 灌完二周 |
| 模型组胶原空白组治疗阳性组 | 51020泼尼地松25 | 11.65±1.3811.65±3.7710.57±3.519.21±1.015.96±1.01*10.98±0.40 | 13.82±0.665.96±1.67*6.77±2.33*8.94±1.14*5.15±1.53*10.56±5.69 | 16.26±1.55.96±3.13*5.96±1.67*7.86±0.38*4.34±1.67*8.94±0.81 | 19.24±2.337.58±1.01**8.67±1.38**6.77±1.01**5.69±1.76**13.01±1.62 |
各组数据均与对应时间的模型组比较§P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05
3，通过灌胃霞水母类II型胶原14天后，发现给药组大鼠血清中SOD较模型组明显活性提高，且效果持续稳定，证明口服高中低剂量的霞水母类II型胶原可以有效提高佐剂型关节炎大鼠的血清SOD活性。详见表6。
表6供试样品对大鼠佐剂型关节炎血清SOD的影响(
，n＝3)
| 组别 | Dose(mg/kg) | 灌胃前 | 灌胃完 | 灌完一周 | 灌完二周 |
| 模型组胶原空白组治疗阳性组 | 51020泼尼地松25 | 117.10±3.41126.59±5.02128.53±7.20123.57±4.01134.57±13.21113.33±20.70 | 108.48±3.46130.04±2.56*135.32±5.95*124.76±7.49138.99±10.70*114.14±10.83 | 118.29±2.91149.66±6.34*129.93±0.81*150.31±10.32*133.27±2.97*118.83±12.94 | 121.95±0.40129.18±2.35*134.14±3.51*138.45±4.42*143.52±3.59*151.82±5.17 |
各组数据均与对应时间的模型组比较§P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05
4，通过灌胃霞水母类II型胶原14天后，发现给药组大鼠血清中MDA含量较模型组明显减少，证明口服高中低剂量的霞水母类II型胶原可以有效降低佐剂型关节炎大鼠的血清MDA含量。详见表7。
治疗大鼠佐剂型关节炎的生理活性试验结果表明，通过灌胃霞水母类II型胶原14天后，发现给药组大鼠双后肢关节较模型组明显减小，大鼠血清中NO较模型组明显减小，血清中SOD较模型组明显活性提高，且效果持续稳定，血清中MDA含量较模型组明显减少。
本试验结果证明，霞水母类II型胶原对佐剂型关节炎有一定的治疗效果。
表7供试样品对大鼠佐剂型关节炎血清MDA的影响(
，n＝3)
| 组别 | Dose(mg/kg) | 灌胃前 | 灌胃完 | 灌完一周 | 灌完二周 |
| 模型组胶原空白组治疗阳性组 | 51020泼尼地松25 | 7.63±0.456.57±1.576.92±1.516.48±1.223.22±0.76*7.87±0.46 | 6.70±0.333.17±1.35*3.44±1.10*2.91±1.31*2.69±1.02*7.87±0.42 | 6.44±0.593.88±0.16*3.70±0.28*4.50±0.49**4.06±0.22*7.87±2.58 | 6.53±0.415.42±0.60*5.34±0.33**4.72±41*3.83±0.29**4.37±0.26 |
各组数据均与对应时间的模型组比较§P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05
Claims (10)
1.一种自霞水母中分离提取得到的类II型胶原。
所宣称的霞水母，俗称麻蜇，系指霞水母科海洋生物白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、发形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferruginea Eschscholtz)或紫色霞水母(Cyaneapurpurea Kishinouye)的新鲜捕捞品，冷冻冷藏品或经过三矾腌制的腌制品，可供用作原料的部位可以是霞水母的头和须，也可以是霞水母的伞盖或是霞水母整体。
所宣称的类II型胶原，为自霞水母中提取得到的一种产物。它是一种白色粉末，有海腥味，其中含有85～99％wt.的蛋白质，几乎不含糖。该类II型胶原无毒，具有II型胶原所具有的口服诱导免疫耐受预防和治疗类风湿性关节炎的活性。
2.如权利要求1所述的类II型胶原的制备工艺。该工艺由下列步骤组成：
1)以水为溶剂对霞水母进行浸泡，适当脱除原料霞水母中所含有的盐分。
2)对脱除了盐分的霞水母进行破碎处理，得到一白色或黄褐色的匀浆。
3)对所得到的匀浆进行抽提，从中分离提取酶促溶酸性胶原，得到酶促溶酸性胶原的溶液。
4)对所得到的溶液进行盐析处理，得到粗胶原沉淀物。
5)对所得到的粗胶原沉淀物进行透析，得到透析液。
6)对所得到的透析液进行干燥，得到白色粉末，即为类II型胶原产品。
3.权利要求2中宣称的水系指pH调节为某一定值的自来水或去离子水，其pH值在2-12范围之内。
4.权利要求2中宣称的浸泡，进行0-15次，每次浸泡所需的用水量为所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡温度在-50-98℃范围内，浸泡时间为0.5-12hr次-1。
5.权利要求2中宣称的破碎，可以用匀浆机，也可以用研钵进行，破碎的温度在-50-98℃范围内，匀浆机的转速为1-20000rpm匀浆时间为1-100分钟。
6.权利要求2中宣称的抽提，分若干个阶段进行，每个阶段所用抽提溶剂可以相同，也可以不相同。
7.权利要求2中宣称的抽提，可供选用的抽提溶剂为0.01～10molL-1的碱(如钠、钾、钙、钡的氢氧化物或碳酸盐、氨水等)、0.01～10molL-1的酸(如盐酸、磷酸、硫酸等无机酸或甲酸、醋酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸等有机酸)或各种蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶等)中的一种或若干种。
8.权利要求2中宣称的盐析，可供选用的盐为(NH4)2SO4或NaCl，盐析的饱和度为0.1～10molL-1。
9.权利要求2中宣称的透析，可供选用的透析液为pH调节为某一定值的自来水或去离子水，其pH值在2-12范围之内。用于调节pH的缓冲盐类可以是Tris-HCl、磷酸盐类、醋酸盐类、柠檬酸盐类，缓冲液的浓度为0.01～10molL-1。
10.权利要求2中宣称的干燥，可以是冷冻干燥，也可以是喷雾干燥。
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2007
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080618 |