CN101191141B - 用于生物合成7α,15α-二羟基雄烯醇酮的发酵培养基 - Google Patents
用于生物合成7α,15α-二羟基雄烯醇酮的发酵培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种以亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini AS3.4486)为菌种，生物合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮的发酵培养基，包含有机氮源、碳源、无机盐和金属离子，其特征在于，所述的有机氮源为蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏。采用本发明发酵培养基合成产物I时，底物投料浓度可以达到8g/L(底物重量/发酵液体积)，转化率可以到达85％。因此，可以很好地解决现有技术底物投料浓度低和转化率不高的缺点，从而降低I的工业生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物甾体转化培养基，具体涉及一种用于生物合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮的微生物发酵培养基。
背景技术
甾体类中间体往往可用于生产临床上各种药物。7α，15α-二羟基雄烯醇酮(其结构如下式I)
是一种重要的甾体中间体，可用于合成内酯类醛固酮受体拮抗剂、利尿剂和妇科药物等多种药物。例如，I是合成口服避孕药Yasmin活性成分屈螺酮的重要中间体。
微生物转化在甾体药物的合成中具有重要地位，几种重要的甾体微生物转化反应如羟化、脱氢和边链降解已成为工业上生产甾体激素及其类似物的重要方法。化合物I的制备很难用化学的方法合成，目前主要由微生物转化合成。
I可以由去氢表雄酮(其结构如下式II)经微生物转化合成。Kieslich(German Patent No.DE 2746298 1979-04-19)描述了以辣椒刺盘孢(Colletotrichum phomoides ifo 5257)为菌种将II转化为I的方法；而Petzoldt等(Angew.Chem.95(5)，413—414，1983；U.S.Patent No.44353271984-03-06)则描述了以亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini cbs112.21)为菌种将II转化为I的方法。但是两种方法底物的投料浓度很低，只有1g/L，所以转化效率很低，工业生产的成本很高。尚珂等(中国医学生物技术应用杂志.2，30～34，2004)报道亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini AS3.4486)可将II转化为I，但是底物投料浓度很低只有2g/L，收率低只有58.8％，转化率也较低，约为70％。可见已有的转工艺不能高效的合成I，急需更为有效的转化工艺，以提高底物的投料浓度和转化率，以降低生产成本。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种以亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini AS3.4486，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号AS3.4486)为菌种，生物合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮的发酵培养基，包含有机氮源、碳源、无机盐和金属离子，其特征在于，所述的有机氮源为蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏。
所述的有机氮源的含量为6g/L～30g/L，优选10g/L～15g/L，更优选12g/L。
优选地，所述的有机氮源为酵母提取物。
所述的碳源为多糖类碳源。
所述多糖类碳源为糊精、麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、玉米粉等，优选为麦芽糊精和可溶性淀粉，更优选麦芽糊精；其含量为20g/L～50g/L，优选为35g/L。
本发明的发酵培养基还可以含有天然油脂。
所述天然油脂可以为豆油、菜籽油、玉米胚胎油、葵花籽油和棉籽油等植物油，猪油、羊油、牛油和鱼油等动物油脂，以及卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酸等磷脂，其含量为0.5g/L～10g/L，较优为2g/L～5g/L，最优为3g/L。
培养基中还需加入钾盐、磷酸盐、铵盐和硝酸盐等无机盐和镁等金属离子。
不同有机氮源对转化的影响是很大的，实验考察了花生饼粉、豆饼粉、棉籽粉、豆粕、蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和酵母膏九种常用有机氮源，添加的浓度均为10g/L，底物的投料浓度相同，转化结束后HPLC检测各有机氮源发酵液中产物的浓度(见附图1)。从图可以看出有机氮源采用蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏是产物的含量高，其中又以酵母提取物最高。
不同碳源对转化也具有明显的影响，实验考察了糊精、麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖等碳源，添加的浓度均为30g/L，底物的投料浓度相同，转化结束后HPLC检测各碳源发酵液中产物的浓度(见附图2)。从图可以看出糊精、麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉和玉米粉等多糖类碳源作为碳源时菌种转化能力较强，而以蔗糖和麦芽糖等二糖，或葡萄糖和果糖等单糖碳源作为碳源时转化能力则较低。
在培养基中加入少量的天然油脂可以促进菌体的生长，同时更好的促进底物在发酵液中的转化，实验选取了豆油、菜籽油、玉米胚胎油、葵花籽油、猪油、鱼油、卵磷脂和磷脂酰甘油等多种天然油脂分别加入培养基，加入量度为3g/L，以没有加入天然油脂的培养基作为对照，底物的投料浓度相同，转化结束后HPLC检测各培养基中产物的浓度(见附图3)。从图可以看出加入各类天然油脂后，转化率都有明显的提高。
采用本发明发酵培养基合成产物I时，底物投料浓度可以达到8g/L(底物重量/发酵液体积)，转化率可以到达85％。而采用现有技术的发酵培养基合成产物I时，底物投料浓度只有2g/L，转化率约为70％左右。因此，通过本发明经过组分优化的发酵培养基来进行I的转化合成可以很好地解决现有技术底物投料浓度低和转化率不高的缺点，从而降低I的工业生产成本。
附图说明
图1表示不同有机氮源对转化反应的影响；
图2表示不同碳源对转化反应的影响；
图3表示加了天然油脂的培养基对转化反应的促进作用。
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步阐明本发明，但这些实施例不构成对本发明的限制。其中，酵母提取物为湖北安琪酵母股份有限公司生产，蛋白胨为上海东海制药厂生产，牛肉膏为成都市华西生化制品厂生产，酵母膏、糊精、淀粉、可溶性淀粉、卵磷脂为中国医药集团上海化学试剂公司生产，花生饼粉为北京康明威培养基技术有限责任公司生产，麦芽糊精为海盐六和淀粉化工有限公司生产，玉米粉为诸城裕丰制粉有限公司生产，葵花籽油为青岛嘉里植物油有限公司生产，豆油为上海嘉里粮油工业有限公司生产。
实施例1
培养基
斜面培养基：PDA培养基(200g土豆煮汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g)，121℃灭菌20min。
种子培养基：花生饼粉10g/L；糊精30g/L；KCl 1g/L；(NH4)2HPO41g/L；K2HPO41g/L；MgSO4·6H2O1g/L。pH5.5，121℃灭菌20min。
发酵培养基：酵母提取物10g/L；麦芽糊精35g/L；葵花籽油5g/L；KCl1g/L；(NH4)2HPO41g/L；K2HPO41g/L；MgSO4·6H2O1g/L。pH5.5，121℃灭菌20min。
转化过程：将接种菌种的斜面置于28℃恒温培养箱中，培养6天，得到成熟的孢子，然后成熟的孢子接种于装有30ml种子培养基的250ml摇瓶中，在30℃、230rpm摇床上培养3天，得到成熟的种子，得到的种子以10％的接种量接入装有100ml发酵培养基的750ml摇瓶中，置于30℃、230r/min摇床继续培养20小时，以每升发酵液8g底物的量加入底物，置于28℃、240r/min摇床继续转化至48小时时放瓶，取发酵液2ml加入8ml甲醇浸泡过夜，离心取上清用HPLC进行分析，采用外标法对样品进行定量，计算转化率为86.5％。HPLC条件为色谱仪：Waters510型高效液相色谱仪；色谱柱：C18柱；检测器：Waters996Photodiode Array Detector；流动相：甲醇:水＝50:50；流速：0.8ml/min；进样量：5μl；柱温：室温。
实施例2
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：蛋白胨20g/L；麦芽糊精30g/L；猪油5g/L；KCl1g/L；(NH4)2HPO41g/L；K2HPO41g/L；MgSO4·6H2O1g/L。pH5.5，121℃灭菌20min。
转化过程同实施例1，最后的转化率为85.1％。
实施例3
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：牛肉膏30g/L；糊精20g/L；卵磷脂1g/L；KCl1g/L；(NH4)2HPO41g/L；K2HPO41g/L；MgSO4·6H2O1g/L。pH5.5，121℃灭菌20min。
转化过程同实施例1，最后的转化率为85.3％。
实施例4
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：酵母提取物6g/L；玉米粉50g/L；卵磷脂2g/L；KCl1g/L；(NH4)2HPO41g/L；K2HPO41g/L；MgSO4·6H2O1g/L。pH5.5，121℃灭菌20min。
转化过程同实施例1，最后的转化率为84.3％。
实施例5
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：酵母提取物12g/L；麦芽糊精35g/L；豆油0.5g/L；KCl1g/L；(NH4)2HPO41g/L；K2HPO41g/L；MgSO4·6H2O1g/L。pH5.5，121℃灭菌20min。
转化过程同实施例1，最后的转化率为84.1％。
实施例6
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：酵母提取物12g/L；可溶性淀粉35g/L；豆油5g/L；KCl1g/L；(NH4)2HPO41g/L；K2HPO41g/L；MgSO4·6H2O1g/L。pH5.5，121℃灭菌20min。
转化过程同实施例1，最后的转化率为86.1％。
实施例7
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：酵母提取物12g/L；麦芽糊精35g/L；豆油10g/L；KCl1g/L；(NH4)2HPO41g/L；K2HPO41g/L；MgSO4·6H2O1g/L。pH5.5，121℃灭菌20min。
转化过程同实施例1，最后的转化率为87.1％。
实施例8
7.5L发酵罐转化合成I
各培养基同实施例4
转化过程：将接种菌种的斜面置于28℃恒温培养箱中，培养6天，得到成熟的孢子，然后成熟的孢子接种于装有100ml种子培养基的750ml摇瓶中，在30℃、230rpm摇床上培养3天，得到成熟的种子，得到的种子以10％的接种量接入4.5L的发酵培养基中(装于7.5L发酵罐中)，温度30℃，通气量0.4VVM，转速180rpm进行培养。培养20小时后，以每升发酵液8g底物的量加入底物，然后温度调至28℃开始转化，在转化过程中通过增加转速和通气量控制溶氧在20％饱和度以上。转化过程中用薄层层析法确定转化程度，分析方法：取少量转化液于离心管中，加入等体积乙酸乙酯，经超声波细胞破碎后于4000r/min、25℃离心6min，取少量上清点板，展开剂为：三氯甲烷:无水乙醇＝10：1(V/V)，以10％硫酸溶液喷洒后加热显色，观察斑点情况，确定转化程度。到48小时时产物停止积累，结束转化放罐，HPLC分析转化率为85.4％。
Claims (3)
1.一种以亚麻刺盘孢AS 3.4486为菌种，生物合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮的发酵培养基，包含有机氮源、碳源、无机盐、金属离子和天然油脂，其特征在于，所述的有机氮源为酵母提取物；
所述的有机氮源的含量为10g/L～15g/L；
所述的碳源为多糖类碳源，所述多糖类碳源为糊精、淀粉或玉米粉；其含量为20g/L～50g/L；
所述天然油脂为豆油、菜籽油、玉米胚胎油、葵花籽油、棉籽油、猪油、羊油、牛油、鱼油、卵磷脂、磷脂酰甘油或磷脂酸；
所述天然油脂的含量为0.5g/L～10g/L。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述多糖类碳源为为麦芽糊精或可溶性淀粉，其含量为35g/L。
3.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述天然油脂的含量为2g/L～5g/L。
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