CN101176786A - 增加胰岛素敏感性的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。本发明首次证明了SIRT1可用于提高胰岛素敏感性，揭示了SIRT1可下调胰岛素信号的负性调节因子PTP－1B，为胰岛素敏感性下降相关疾病的预防或治疗提供了有效的新靶点。

Description

增加胰岛素敏感性的方法和组合物

技术领域

本发明属于生物技术和药学领域，具体涉及一种增加胰岛素敏感性的方法和组合物。

背景技术

全世界糖尿病的人数目前已增加至1.7亿，预计至2030年这一数字将达到3.6亿，严重威胁人类健康。研究发现，胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)是II型糖尿病的主要病理特征，其原因是胰岛素分泌相对不足及胰岛素作用环节障碍所致。所以，通过增强胰岛素刺激的葡萄糖利用，减少脂肪酸氧化代谢，抑制肝糖输出而增加胰岛素的敏感性是一条有效的治疗II型糖尿病的途径。

目前，增强胰岛素敏感性的药物主要包括噻唑烷二酮类、胰高血糖素受体拮抗剂及双胍类降血糖药。噻唑烷二酮类是近年来发现的一类新型胰岛素增敏剂，代表药有曲格列酮(Troglitazone)，罗格列酮(Rosiglitazone)和吡格列酮(Pioglitazone)。该类药物的作用靶点是核过氧化物酶-增殖体活化受体(PPARγ)。但此类药物在有效地降低血糖、增强胰岛素敏感性的同时，往往会诱发低血糖、体重增加和肝功能受损等副作用(Yki-H.Thiazolidinediones.N Eng J Med 2004 351：1106-1118)。胰高血糖素是由29个氨基酸组成的多肽，生理作用为促进肝糖元分解、异生和脂肪分解，其受体拮抗剂可阻断其上述作用，从而增强胰岛素敏感性(Oureshi SA等，A novel glucagonsreceptor antagonist inhibits glucagons-mediated biological effects.Diabetes 200453：3267-3473)。目前研究发现胰高血糖素受体拮抗剂主要为钒类化合物，但该类药物在骨骼、肾脏和肝脏易产生蓄积，并引起呕吐、脱水等不良反应。双胍类口服降血糖药主要有二甲双胍，苯乙双胍和丁双胍，其作用机理主要通过加强***组织对胰岛素的敏感性，增加***组织对葡萄糖的摄取，减少肝中糖原异生。乳酸性中毒是双胍类药物主要的潜在不良反应，苯乙双胍和丁双胍就是由于这种严重的不良反应而停止销售。

因此，本领域还需要寻找新的具有更高的生物安全性的提高胰岛素敏感性的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂的新用途。

在本发明的第一方面，提供一种SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂的用途，其特征在于，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。

在本发明的另一优选例中，所述SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂用于制备胰岛素抵抗情况下提高胰岛素敏感性的组合物。

在本发明的另一优选例中，所述的SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂还用于制备抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1B转录或表达的组合物。

在本发明的另一优选例中，所述组合物用于治疗胰岛素敏感性下降相关的疾病。

在本发明的另一优选例中，所述的胰岛素敏感性下降相关的疾病包括(但不限于)：胰岛素抵抗、2型糖尿病、高胰岛素血症、糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷、乳酸性酸中毒。

在本发明的另一优选例中，所述的SIRT1蛋白的激动剂或上调剂选自：白藜芦醇或其类似物、紫铆因(Butein)、异甘草素(Isoliquiritigenin)、漆黄素(Fisetin)、或四羟反式芪(Piceatannol；3，4，3，5-羟基苯乙烯)。

在本发明的第二方面，提供一种筛选可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括：

将候选物质与表达SIRT1蛋白的体系接触，检测候选物质对SIRT1蛋白的影响；若所述候选物质可提高SIRT1蛋白的表达或促进SIRT1蛋白的活性，则表明该候选物质是可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在本发明的另一优选例中，所述方法还包括：观察体系中蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的表达情况或活性，若蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的表达或活性降低，则表明该候选物质是可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在本发明的另一优选例中，所述的体系选自：溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。

在本发明的另一优选例中，所述的方法包括以下步骤：

(a)在测试组中，在可以表达或已经表达SIRT1蛋白的体系中添加候选物质，并检测SIRT1蛋白的表达情况或活性，并且，在对照组中，在不添加所述候选物质的、在可以表达或已经表达SIRT1蛋白的体系中，检测SIRT1蛋白的表达情况或活性，

(b)将步骤(a)测试组中SIRT1蛋白的表达情况或活性与对照组中SIRT1蛋白的表达情况或活性进行比较，

如果测试组中SIRT1蛋白的表达或活性在统计学上高于(优选显著高于，如高15％；更优选的，高30％)对照组，就表明该候选物质是可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在本发明的第三方面，提供一种通过所述的方法获得的可用于提高胰岛素敏感性的物质。

在本发明的第四方面，提供一种组合物，所述的组合物含有：

(i)有效量(如0.00001-0.1克/60千克体重/天)的SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂；

(ii)有效量(如0.0005-0.1克/60千克体重/天)的选自下组的物质：双胍类糖尿病药物、磺酰脲类糖尿病药物、葡萄糖苷酶抑制剂类药物、胰岛素增敏类药物、醛糖还原酶抑制剂类药物、促胰岛素释放类药物；以及

(iii)药学上或食品学上可接受的载体。

在本发明的另一优选例中，所述的双胍类糖尿病药物包括(但不限于)：二甲双胍、或苯乙双胍。

在本发明的另一优选例中，所述的磺酰脲类糖尿病药物包括(但不限于)：格列本脲、格列吡嗪、格列齐持、格列波脲、格列美脲、或格列喹酮。

在本发明的另一优选例中，所述的葡萄糖苷酶抑制剂类药物包括(但不限于)：阿卡波糖(acarbose)、伏格利波糖(vokibose)、或米格列醇(migkitok)。

在本发明的另一优选例中，所述的胰岛素增敏类药物包括(但不限于)：环格列酮(cigktazone)、曲格列酮(trogkitazone)、罗格列酮(rosigkitazone)、或吡格列酮(piogkitazone)。

在本发明的另一优选例中，所述的醛糖还原酶抑制剂类药物包括(但不限于)：阿司他丁(akrestain)、依帕司他(epakrestat)、波拉司他(ponakrestat)、或托瑞司他(tokrestat)。

在本发明的另一优选例中，所述的促胰岛素释放类药物包括(但不限于)：瑞格列奈(repagkinide)、或那格列奈(nategkinide)。

另一方面，本发明还提供一种提高胰岛素敏感性的方法，所述的方法包括：上调受试者体内(更优选的为肌肉、肝脏或脂肪内)的SIRT1蛋白的活性或表达水平。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A显示了C2C12细胞经棕榈酸诱导后产生胰岛素抵抗；图1B显示了SIRT1蛋白在胰岛素抵抗的C2C12细胞中下降；图1C为B图数量化表示；图1D显示了HepG2细胞经葡萄糖胺诱导后产生胰岛素抵抗；图1E显示了SIRT1蛋白在胰岛素抵抗的HepG2细胞中下降；图1F显示了E图数量化表示；(^*p＜0.05；^**p＜0.01，Student’s Test；NS表示不显著)。

图2A显示了慢病毒(Lentivirus)感染HepG2细胞照片；图2B显示了慢病毒介导的SIRT1表达下降；图2C显示了SIRT1表达下降导致胰岛素受体磷酸化水平降低；图2D显示了SIRT1表达下降阻止了胰岛素诱导的糖元合成；图2E显示了SIRT1抑制剂Sirtinol阻止了胰岛素诱导的糖元合成。(^**，##p＜0.01，Student’sTest；NS表示不显著)。

图3A显示了正常情况下上调SIRT1蛋白水平对葡萄糖摄入没有影响；图3B显示了胰岛素抵抗情况下，上调SIRT1蛋白水平可促进葡萄糖的摄入；图3C显示了SIRT1蛋白水平上调对胰岛素激活信号的影响。(^*p＜0.05，与没加胰岛素和HSV-SIRT1病毒组相比；#p＜0.05，与单加胰岛素组相比；Student’s Test)

图4A显示了正常情况下白藜芦醇处理促进了葡萄糖摄入；图4B显示了胰岛素抵抗情况下白藜芦醇处理促进了葡萄糖的摄入；图4C显示了白藜芦醇处理对胰岛素激活信号的影响。(^*p＜0.05，与没加胰岛素和HSV-SIRT1病毒组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与单加胰岛素组相比。Student’s Test)。

图5显示了SIRT1RNAi病毒可以下调SIRT1蛋白水平(^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照病毒无白藜芦醇处理组相比.Student’s Test)。

图6A显示了胰岛素抵抗情况下SIRT1蛋白水平上调可降低PTP-1B蛋白水平；图6B显示了胰岛素抵抗情况下SIRT1蛋白水平上调可降低PTP-1B mRNA水平；图6C显示了白藜芦醇处理降低了PTP-1B蛋白水平；图6D显示了白藜芦醇处理降低了PTP-1B的mRNA水平；图6E为对图6B各PTP-1B mRNA检测条带的量化；图6F为对图6D各PTP-1B mRNA检测条带的量化(^*p＜0.05；^**p＜0.01，与单独胰岛素处理相比。Student’s Test)。

图7A显示了疱疹病毒(HSV)介导的PTP-1B蛋白水平上调；图7B显示了PTP-1B蛋白水平上调逆转了SIRT1蛋白水平上调导致的葡萄糖摄入升高(*p＜0.05，与无病毒无胰岛素处理组相比；##p＜0.01，与胰岛素和SIRT1病毒处理组相比。Student’s Test)。

图8A显示了白藜芦醇可以抑制高脂诱导的高胰岛素血症；图8B显示了白藜芦醇可以改善高脂诱导的葡萄糖耐受；图8C显示了白藜芦醇可以改善高脂诱导的胰岛素耐受；图8D显示了白藜芦醇可以降低高脂诱导的总胆固醇水平升高；图8E显示了白藜芦醇可以降低高脂诱导的低密度脂蛋白水平升高(*p＜0.05，**p＜0.01，与高脂组相比)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次论证了SIRT1(Sirtuin 1)能够提高胰岛素的敏感性，其可用于预防或治疗由蛋白酪氨酸磷酸酶-1B表达异常(特别是表达升高)或活性异常(特别是活性提高)、或胰岛素敏感性降低引起的相关疾病。基于此完成了本发明。

具体地，本发明人首次发现SIRT1能够降低蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)的表达，且能够提高胰岛素敏感性。更特别的，本发明人发现，SIRT1不增强正常情况下的胰岛素敏感性，仅当产生胰岛素抵抗时才可以增加胰岛素的敏感性。这样通过上调SIRT1蛋白的水平或活性来增强胰岛素的敏感性，不易产生胰岛素敏感性过高导致的低血糖等副作用，因此具有更高的生物安全性和更低的副作用。

同时，本发明人发现，SIRT1蛋白激动剂白藜芦醇(Resveratrol)，不仅可以激活SIRT1并且也可以上调SIRT1的蛋白水平。同时动物实验也显示白藜芦醇可以显著缓解糖尿病的症状，包括降低血糖、下调过高的胰岛素、胆固醇和低密度脂蛋白水平。白藜芦醇是一种食品中存在的天然化合物，安全性较高，可以直接添加在食品或饮料中口服。并且，本发明人对剂量的研究发现，白藜芦醇对于防治胰岛素敏感性降低相关疾病的有效浓度大大低于以往白藜芦醇用于防治肿瘤和心血管疾病的浓度。有效浓度的较低一方面大大降低产品成本，另一方面可以增加产品的安全性。

深入的研究发现，SIRT1和白藜芦醇对于胰岛素的主要靶组织脂肪、肌肉和肝脏都有增强胰岛素的敏感性的作用，作用范围较广，更加有利增强不同组织的胰岛素的敏感性。并且对于白藜芦醇来说，在增加胰岛素敏感性的同时不但不会增加体重，反而还有较好的减肥作用。

SIRT1(Sirtuin 1)

SIRT1是一种广泛存在于生物体中、高度保守的、依赖于NAD⁺的组蛋白去乙酰化酶。以往，SIRT1因具有可延长果蝇、线虫寿命的活性而引起广泛关注(Blander，G.和Guarente，L.2004.THE SIR2FAMILY OF PROTEINDEACETYLASES.Annual Review of Biochemistry 73：417-435.)。

在本发明中，所用的SIRT1蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的SIRT1蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组SIRT1蛋白。优选的，本发明可采用重组的SIRT1蛋白。

任何适合的SIRT1蛋白均可用于本发明。所述的SIRT1蛋白包括全长的SIRT1蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的SIRT1蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号：NM 012238(PubMed)所示的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的SIRT1蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。SIRT1蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/CummingsPub.Co.P224。

任何一种SIRT1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，SIRT1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的SIRT1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长SIRT1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长SIRT1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的SIRT1蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的SIRT1蛋白。所述经过修饰或改良的SIRT1蛋白可以是一种SIRT1蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的SIRT1蛋白可以是与天然存在的SIRT1蛋白具有较小的共同点，但也能提高哺乳动物的胰岛素敏感性，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响SIRT1蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

SIRT1的用途

基于本发明人的新发现，本发明提供了SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物；或用于筛选提高胰岛素敏感性的物质。

优选的，所述的SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂还用于制备抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1B转录或表达的组合物。

优选的，所述SIRT1蛋白、其激动剂或上调剂、或含有上述成份的组合物可用于治疗胰岛素敏感性下降相关的疾病。更优选的，所述的胰岛素敏感性下降相关的疾病包括：胰岛素抵抗、2型糖尿病、高胰岛素血症以及胰岛素抵抗导致的其它相关疾病，如：糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷、乳酸性酸中毒。

例如，所述的SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂可用于：(i)制备降低蛋白酪氨酸磷酸酶-1B表达的药物或食物；(ii)制备增加胰岛素敏感性的药物或食物(更优选的，制备胰岛素抵抗情况下增加胰岛素敏感性的药物或食物)；或(iii)制备预防或治疗胰岛素抵抗或胰岛素抵抗相关代谢疾病的药物或食物。

为了论证SIRT1的上述用途，本发明人以C2C12细胞和HepG2细胞为细胞模型进行研究，发现①下调SIRT1水平可导致胰岛素抵抗的发生；②上调SIRT1蛋白水平对正常情况下的葡萄糖摄入量和胰岛素激活信号无影响，但可以显著增强胰岛素抵抗情况下葡萄糖摄入和胰岛素激活信号；③经过白藜芦醇处理(即：使SIRT1活性提高或表达增加)后，促进细胞对于葡萄糖的摄入，且增强了胰岛素激活信号；④白藜芦醇增强肝细胞糖原合成需要SIRT1的参与。这些结果均证明SIRT1蛋白能够增强胰岛素抵抗情况下胰岛素的敏感性，从而可用于预防或治疗胰岛素敏感性下降相关的疾病。

此外，本发明人还发现，在胰岛素抵抗情况下，上调SIRT1蛋白水平或白藜芦醇处理(即：使SIRT1活性提高或表达增加)可降低蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)蛋白和mRNA水平。而PTP-1B本身是一种胰岛素信号的负性调节因子，与肥胖症和2型糖尿病等代谢类疾病的发病及发展关系密切，对PTP-1B基因敲除小鼠的研究表明，缺失PTP-1B小鼠的胰岛素敏感性明显增加。因此证明，可通过采用SIRT1蛋白来下调PTP-1B蛋白的表达或活性，从而达到提高胰岛素敏感性的目的。

此外，本发明人用高脂诱导C57/BL6小鼠胰岛素抵抗模型，研究白藜芦醇的服用(即：使SIRT1活性提高或表达增加)对于胰岛素敏感性等糖尿病相关症状的影响。结果发现，白藜芦醇的服用可以抑制高脂诱导的高胰岛素血症、改善高脂诱导的葡萄糖耐受、改善高脂诱导的胰岛素耐受、降低高脂诱导的总胆固醇水平升高、以及降低高脂诱导的低密度脂蛋白水平升高。这些结果均证明，白藜芦醇的施用、或SIRT1表达水平或活性的提高均能够达到缓解胰岛素敏感性等糖尿病相关症状的目的。

SIRT1的激动剂或上调剂及其用途

任何可提高SIRT1蛋白的活性、维持SIRT1蛋白的稳定性、促进SIRT1蛋白的表达、延长SIRT1蛋白有效作用时间、或促进SIRT1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于提高胰岛素敏感性的有效物质。

优选的，所述的SIRT1蛋白的激动剂或上调剂包括(但不限于)：白藜芦醇及白藜芦醇类似物，如：紫铆因(butein)、异甘草素(isoliquiritigenin)、漆黄素(fisetin)、或四羟反式芪(Piceatannol；3，4，3，5-羟基苯乙烯)。

由于SIRT1的激动剂或上调剂可促进SIRT1的表达和/或提高SIRT1的活性，因此，所述的SIRT1的激动剂或上调剂也可通过对SIRT1的影响来调节胰岛素的敏感性，达到预防或治疗胰岛素敏感性下降相关疾病的目的。

组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.00001-0.01克/60于克体重/天；优选的，为0.0001-0.005克/60千克体重/天)的所述的SIRT1蛋白或其激动剂(如白藜芦醇)或上调剂，以及药学上或食品学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于胰岛素敏感性下降相关疾病的预防或治疗。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

优选的，所述的组合物中同时含有有效量的SIRT1蛋白和白藜芦醇。

优选的，所述的组合物还含有有效量(如0.0005-0.1克/60千克体重/天；优选的，为0.001-0.05克/60千克体重/天)的选自下组的物质：双胍类糖尿病药物、磺酰脲类糖尿病药物、葡萄糖苷酶抑制剂类药物、胰岛素增敏类药物、醛糖还原酶抑制剂类药物、促胰岛素释放类药物。

作为优选方式，所述的双胍类糖尿病药物包括(但不限于)：二甲双胍、或苯乙双胍；或者，所述的磺酰脲类糖尿病药物包括(但不限于)：格列本脲、格列吡嗪、格列齐持、格列波脲、格列美脲、或格列喹酮；或者，所述的葡萄糖苷酶抑制剂类药物包括(但不限于)：阿卡波糖(acarbose)、伏格利波糖(vokibose)、或米格列醇(migkitok)；或者，所述的胰岛素增敏类药物包括(但不限于)：环格列酮(cigktazone)、曲格列酮(trogkitazone)、罗格列酮(rosigkitazone)、或吡格列酮(piogkitazone)或者，所述的醛糖还原酶抑制剂类药物包括(但不限于)：阿司他丁(akrestain)、依帕司他(epakrestat)、波拉司他(ponakrestat)、或托瑞司他(tokrestat)；或者，所述的促胰岛素释放类药物包括(但不限于)：瑞格列奈(repagkinide)、或那格列奈(nategkinide)。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明的组合物含有安全有效量的SIRT1蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明的组合物还可作为一种食物或膳食添加剂，直接服用或添加到其它食品中服用。优选的，所述的“食品上学可接受的载体”选自：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、赋形剂、或缓/控释剂。

提高胰岛素敏感性的方法以及给药方式

本发明提供了一种提高胰岛素敏感性(如预防或治疗胰岛素敏感性下降相关疾病)的方法，包括给予受试者有效量的SIRT1蛋白或可表达SIRT1蛋白的***(如细胞或病毒)。当用于治疗人的胰岛素敏感性下降相关疾病时，优选采用重组的SIRT1蛋白。

应理解，当用于治疗哺乳动物胰岛素敏感性下降相关疾病时，所用的SIRT1的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。

在得知了所述的SIRT1蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的SIRT1蛋白或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将SIRT1蛋白通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带SIRT1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的SIRT1蛋白。

作为本发明的一种实施方式，可将所述的SIRT1蛋白直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码SIRT1蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述SIRT1蛋白的细胞中，使所述的细胞表达SIRT1蛋白。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现体内SIRT1蛋白的表达。

优选的，可将编码SIRT1的基因或携带所述基因的载体通过常规的方法引入到靶细胞或靶组织中实现SIRT1蛋白的表达。所述的靶细胞包括但不限于：肌肉细胞、肝脏细胞、脂肪细胞等；所述细胞可以转移入哺乳动物身体的适当部位中。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含SIRT1蛋白编码基因的序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

所述的基因在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法

在得知了所述的SIRT1蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选提高胰岛素敏感性的物质。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选提高胰岛素敏感性的物质的方法，所述的方法包括：

将候选物质与表达SIRT1蛋白的体系接触，检测候选物质对SIRT1蛋白的影响；若所述候选物质可提高SIRT1蛋白的表达或促进SIRT1蛋白的活性，则表明其是可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质。

更优选的，所述方法还包括：观察体系中蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的表达情况或活性，若蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的表达或活性降低，则表明该候选物质是可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在本发明中，所述的体系包括(但不限于)：溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。所述的体系中可含有SIRT1，用于在其中加入候选物质，观察候选物质对SIRT1的影响；或者，所述的体系中可同时含有SIRT1以及PTP-1B，用于在其中加入候选物质，同时观察候选物质对于SIRT1以及PTP-1B的影响。

这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于提高胰岛素的敏感性有用的物质。

因此，本发明还包括通过所述的筛选方法获得的物质，所述的物质可用于提高胰岛素的敏感性。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次证明了SIRT1可用于提高胰岛素敏感性，揭示了SIRT1可下调胰岛素信号的负性调节因子PTP-1B，为胰岛素敏感性下降相关疾病的预防或治疗提供了有效的新靶点。

(2)本发明还证实，SIRT1不增强正常情况下的胰岛素敏感性，仅当产生胰岛素抵抗时才可以增加胰岛素的敏感性，因此具有更高的生物安全性和更低的副作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，纽约：冷泉港实验室出版社)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

I.通用材料和方法

1、细胞培养

C2C12细胞(购自美国ATCC)用DMEM培养基(高糖，内含10％胎牛血清)培养，培养条件为37℃，5％CO₂。当细胞长至50-60％时种板，长满后换含2％马血清的DMEM培养基诱导分化4天，即分化为成熟的肌肉细胞，用于以下实验。

HepG2细胞(购自美国ATCC公司)用DMEM培养基(高糖，内含10％胎牛血清)培养，培养条件为37℃，5％CO₂。长至70-80％时用胰酶消化种板，备用。

2、胰岛素抵抗诱导

C2C12细胞用内含棕榈酸(7.5mM)的高糖DMEM培养液诱导18h，使之产生胰岛素抵抗；HepG2细胞用内含葡萄糖胺(18mM)的低糖无血清培养液诱导16h，使之产生胰岛素抵抗。

3、葡萄糖转运测定

将分化好的C2C12细胞培养于含有低糖无血清DMEM培养液的24孔板(购自美国Corning公司)中，饥饿3h，100nM胰岛素刺激20min，每孔加0.5μCi³H标记的脱氧葡萄糖，孵育5min，吸掉培养液，将细胞板置于冰上，PBS洗涤3次。

每孔加200μl 0.2M NaOH，收集细胞裂解液，采用液闪仪测定放射强度。

4、糖原合成测定

HepG2细胞培养于24孔板，低糖无血清DMEM培养基饥饿16h，加100nM胰岛素和/或0.5μCi³H标记的葡萄糖培养3h，吸掉培养液，PBS洗涤2次，每孔加200μl 30％NaOH，收集细胞裂解液80℃裂解30min，离心，加2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃静置过夜。

静置后冷冻离心，弃上清，加无水乙醇洗涤，离心，重复二次。将最后沉淀晾干，0.1N HCl溶解沉淀，采用液闪仪测定放射强度。

5、蛋白Western印迹

向细胞培养板中加入适量裂解液，100℃裂解5min，离心备用。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE分离蛋白。并将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，再用含5％脱脂奶粉的TBS封闭1h，加各种相应抗体(分别是抗Sirt1抗体(购自美国Upstate公司)和抗Tubulin抗体(购自美国Sigma公司))，4℃过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温轻摇1h，充分洗涤后用化学发光反应试剂盒(购自美国PIERCE公司)反应2min，即刻与X光片曝光，洗片后用激光扫描仪进行定量分析。

6、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)

6.1引物设计及合成：引物由上海生工生物工程公司合成。

Actin(片段大小为444bp)：

正链：5’ATCACTGCCACCCAGAAGAC’3(SEQ ID NO：1)，

反链：5’ATGAGGCCACCACCCTG’3(SEQ ID NO：2)；

PTP-1B(片段大小为384bp)：

正链：5’CTGACACCTGCCTCTTACTG’3(SEQ ID NO：3)，

反链：5’CACTTGACTGGGCTCTGC’3(SEQ ID NO：4)。

6.2总RNA的提取和反转录：取适量细胞用常规的Trizol Reagent进行总RNA提取及反转录。

6.3PCR扩增：反应体系为50μl，10mmol/L 1dNTP 1μl；25mmol/L MgCl₂4μl，10x buffer 5μl，3’primer 0.5μl，5’primer 0.5μl，cDNA 4μl，Taq酶2U，去离子水补足至50μl，反应条件：95℃预变性5min，进入循环，(95℃变性45s，按PTP1B：65℃；Actin：57℃的温度退火45s，72℃延伸45s)，其中PTP1B行30个循环，GAPDH行25个循环。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，紫外透射仪下观察扩增产物特异条带。产物经凝胶成像及分析***进行图像分析，以Actin作为内参照，用PTP1B条带的吸光度与Actin比值表示其表达的相对水平。

7、SIRT1及PTP-1B过表达

7.1PTP-1B基因克隆

设计引物：

正链(SEQ ID NO：5)：

5’GGATACGCGTATGGAGATGGAGAAGGAGTTCGAG  3’；

反链(SEQ ID NO：6)：

5’GGAAGTCGACAGTGCTCCCAGTCTGTCAGTGAA  3’

总RNA的提取和反转录：取适量C2C12细胞用Trizol Reagent进行总RNA提取及反转录。

PCR扩增：反应体系为50μl，10mmol/L 1dNTP 1μl；25mmol/L MgCl₂ 4μl，10x buffer 5μl，3’primer 0.5μl，5’primer 0.5μl，cDNA 4μl，Taq酶2U，去离子水补足至50μl，反应条件：95℃预变性5min，进入循环，(95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s)，30个循环。扩增产物切胶回收，经MluI和SalI酶切，与经过同样酶切的pHSVPrPUC载体(购自美国Clontech公司)连接，连接产物涂板，挑取克隆鉴定。

7.2PTP-1B疱疹病毒(HSV)的包装

病毒包装用2-2细胞(购自哈佛大学医学院)完成，过程如下：

取适量7.1步骤获得的含PTP1B的载体用脂转法(Lipofactamine 2000)导入2-2细胞，培养24h后加入病毒包装所需的辅助病毒helper(购自哈佛大学医学院)，继续培养，待细胞变圆，用低渗法收取病毒，将初次收取的病毒加入2-2细胞扩增培养，同样方法收取病毒(HSV-PTP-1B)，-80℃冻存，备用。

7.3SIRT1基因克隆

SIRT1 cDNA片段是从质粒pBabepuro-SIRT1(购自哈佛大学医学院)经BamHI酶切得到，并将其***到pCMV-Tag 3A(购自美国Stratagene公司)质粒中的BamHI酶切位置。

7.4SIRT1疱疹病毒的包装

SIRT1疱诊病毒的包装过程与PTP-1B疱疹病毒的包装过程相同，取适量7.3步骤获得的含SIRT1的载体用脂转法(Lipofactamine 2000)导入2-2细胞，培养24h后加入病毒包装所需的辅助病毒helper，继续培养，待细胞变圆，用低渗法收取病毒，将初次收取的病毒加入2-2细胞扩增培养，同样方法收取病毒(HSV-SIRT)，-80℃冻存，备用。

7.5SIRT1及PTP-1B过表达检测

将上述HSV病毒加入到C2C12细胞，36h感染后Western检测过表达效率。

8、SIRT1RNA干预(RNAi)

参照文献(Picard F et al.Sirt1 promotes fat mobilization in white adipocytesby repressing PPAR-gamma.Nature 200417：771-776)所提供的方法，合成以下两段寡核苷酸用以制备SIRT1 RNAi：

5’-GATCCGATGAAGTTGACCTCCTCATTCAAGAGATGAGGAGGTCAACTTCATCTT TTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO：7)；

5’-AGCTTTTCCAAAAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATCTCTTGAATGAGGAGGTCAACTTCATCG-3’(SEQ ID NO：8)。

将以上两段寡核苷酸混合退火后与慢病毒表达载体pLentiLox 3.7-H1(购自哈佛大学医学院)连接(通过BamHI和XhoI酶切位点)，所获质粒与HIV-1包装质粒Δ8.9及VSVG质粒(均购自哈佛大学医学院)外共转导入293T细胞(购自美国ATCC公司)，48h后收取含有慢病毒(lentivirus)的上清，-80℃冻存，备用。

用以制备对照病毒荧光素酶RNAi(Luc RNAi)寡核苷酸序列如下：

5’-GATCCGTAGCGCGGTGTATTATACTTCAAGAGAGTATAATACACCGCGCTACTTTTTTGGAAG-3’(SEQ ID NO：9)；

5’-TCGACTTCCAAAAAAGTAGCGCGGTGTATTATACTCTCTTGAAGTATAATACACCGCGCTACG-3’(SEQ ID NO：10)。

其包装过程与SIRT1 RNAi过程相同。

SIRT1 RNAi干预实验在HepG2细胞完成，用上述所制备的慢病毒感染细胞，Western检测。

9、SIRT1抑制剂处理

SIRT1抑制剂Sirtinol(50μM)处理HepG2细胞12h，通过前述的方法测定糖原合成。

10、动物实验

C57/BL6小鼠用高脂诱导胰岛素抵抗模型造模，在饲喂高脂饲料的同时白藜芦醇(Resveratrol)给药(浓度为2.5mg/kg/day)。

四周后测定小鼠糖耐量(GTT)、胰岛素耐量(ITT)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL)水平。

II.实施例

实施例1 SIRT1蛋白水平在胰岛素抵抗情况下降低

1.以C2C12为细胞模型

根据前述方法，制备经棕榈酸诱导后产生胰岛素抵抗的C2C12细胞，测定细胞中SIRT1蛋白的表达情况。结果见图1A-图1C。

图1A为通过前述的葡萄糖转运测定方法，测定C2C12细胞的葡萄糖转运情况(相对葡萄糖摄入量)，结果显示，C2C12细胞经棕榈酸诱导后产生胰岛素抵抗(即：在胰岛素不存在和存在下，相对葡萄糖摄入量变化不显著)。

图1B为采用前述的Western Blot法测定SIRT1蛋白表达情况的结果，SIRT1蛋白在胰岛素抵抗的C2C12细胞中下降；图1C为图1B的数量化表示。图中，tubulin(微管蛋白)为电泳上样量对照。

因此可见，SIRT1蛋白在胰岛素抵抗的C2C12细胞中表达量下降。

2.以HepG2为细胞模型

根据前述方法，制备经葡萄糖胺诱导后产生胰岛素抵抗的HepG2细胞，测定细胞中SIRT1蛋白的表达情况。结果见图1D-1F。

图1D为通过前述的糖原合成测定方法，测定C2C12细胞的糖原合成情况，显示了细胞经葡萄糖胺诱导后产生胰岛素抵抗(即：在胰岛素不存在和存在下，糖原合成变化不显著)。

图1E显为采用前述的Western Blot法测定SIRT1蛋白表达情况的结果，显示了SIRT1蛋白在胰岛素抵抗的HepG2细胞中下降；图1F为图1E的数量化表示。

因此可见，SIRT1蛋白在胰岛素抵抗的HepG2细胞中表达量下降。

实施例2下调SIRT1可导致胰岛素抵抗

根据前述方法，用前述制备的慢病毒感染HepG2细胞，对细胞内的SIRT1进行RNA干扰，从而导致SIRT1蛋白表达下降。

对HepG2细胞进行慢病毒感染72h，对照病毒和SIRT1 RNA干扰病毒均可表达荧光蛋白，因此通过观察荧光蛋白的表达情况来判断所用慢病毒感染效率。慢病毒感染HepG2细胞后荧光照片如图2A，结果表明慢病毒感染HepG2细胞效率很高，其中的对照病毒是Luc RNA干扰。

图2B是对RNA干扰后细胞内SIRT1蛋白的Western Blot检测结果。由图2B可知，慢病毒介导RNA干扰导致SIRT1蛋白表达发生显著下降。

图2C是对RNA干扰后细胞磷酸化胰岛素受体(该过程采用的胰岛素受体的抗体及磷酸化胰岛素受体的抗体均购自美国Cell Signaling公司)的Western Blot检测结果。Western检测结果表明，SIRT1表达下降导致胰岛素受体磷酸化水平降低。

由图2D可知，SIRT1表达下降组在胰岛素存在和不存在情况下糖原合成的变化不显著。因此，SIRT1表达下降阻止了胰岛素诱导的糖元合成(图2D中，白色柱体表示没有处理的细胞，灰色柱体表示Luc-RNAi细胞，黑色柱体表示SIRT1-RNAi细胞)。

然后，使用SIRT1抑制剂Sirtinol(50μM)处理HepG2细胞12h，测定糖原合成情况。结果如图2E，可见采用SIRT1抑制剂Sirtinol抑制SIRT1后，阻止了胰岛素诱导的糖元合成。

上述结果均说明，SIRT1下降导致胰岛素敏感性下降。

实施例3 上调SIRT1蛋白水平对于正常和胰岛素抵抗情况下葡萄糖摄入量和胰岛素激活信号的影响

根据前述的方法制备病毒HSV-SIRT1，用HSV-SIRT1处理C2C12细胞，从而在C2C12细胞内上调SIRT1蛋白水平，测定其对于正常和胰岛素抵抗情况下葡萄糖摄入量和胰岛素激活信号的影响。结果如图3A-图3C所示。

由图3A可知，在正常情况下，上调SIRT1蛋白水平对葡萄糖摄入没有显著的影响。图中，白色柱体表示不加胰岛素和HSV-SIRT1组，黑色柱体表示单加胰岛素组，灰色柱体表示单加HSV-SIRT1组，黑点白底柱体表示加入胰岛素和HSV-SIRT1组。

由图3B可知，在胰岛素抵抗情况下，上调SIRT1蛋白水平可显著促进葡萄糖的摄入。图中，白色柱体表示不加胰岛素和HSV-SIRT1组，黑色柱体表示单加胰岛素组，灰色柱体表示单加HSV-SIRT1组，黑点白底柱体表示加入胰岛素和HSV-SIRT1组。

图3C是采用常规Western Blot法检测SIRT1蛋白水平对于一些胰岛素激活信号的影响。对胰岛素信号途径蛋白进行Western Blot检测，结果表明过表达SIRT1蛋白可促进胰岛素抵抗情况下胰岛素受体、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3β(Gsk3β)及磷酸肌醇依赖蛋白激酶(PDK1)的磷酸化水平(以上胰岛素受体或激酶的相应的抗体均购自美国Cell signaling公司)。由图3C可知，SIRT1蛋白水平上调可增强胰岛素激活信号。

综上可知，上调SIRT1蛋白水平对正常情况下的葡萄糖摄入量和胰岛素激活信号无影响，但可以显著增强胰岛素抵抗情况下葡萄糖摄入和胰岛素激活信号。

实施例4  白黎芦醇处理对于葡萄糖摄入和胰岛素激活信号的影响

用白藜芦醇(浓度分别为0.01，0.1，1.0μM)处理C2C12细胞，从而在C2C12细胞内促进SIRT1的表达或活性，测定其对于正常和胰岛素抵抗情况下葡萄糖摄入量和胰岛素激活信号的影响。结果如图4A-图4C所示。

由图4A可见，正常情况下白藜芦醇处理促进了葡萄糖摄入。图中，白色柱体表示不加胰岛素和白藜芦醇组，黑色柱体表示单加胰岛素组，灰色柱体表示单加白藜芦醇组，黑点白底柱体表示加入胰岛素和白藜芦醇组。

由图4B可见，胰岛素抵抗情况下白藜芦醇处理促进了葡萄糖的摄入。图中，白色柱体表示不加胰岛素和白藜芦醇组，黑色柱体表示单加胰岛素组，灰色柱体表示单加白藜芦醇组，黑点白底柱体表示加入胰岛素和白藜芦醇组。

由图4C可见，白藜芦醇处理可增强胰岛素激活信号，并且白藜芦醇可显著促进SIRT1蛋白的表达水平。对胰岛素信号途径蛋白进行Western Blot检测，结果表明过白黎芦醇处理可促进正常及胰岛素抵抗情况下胰岛素受体、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3β(Gsk3β)及磷酸肌醇依赖蛋白激酶(PDK1)的磷酸化水平(以上胰岛素受体及个激酶的相应的抗体均购自美国Cell signaling公司)。

综上可知，白藜芦醇(Resveratrol)处理在正常和胰岛素抵抗情况下均可促进葡萄糖摄入，增强胰岛素激活信号。

实施例5  白藜芦醇与SIRT1可增强肝细胞糖原合成

用前述制备的慢病毒感染(即Sirt RNAi病毒)HepG2细胞，对细胞内的SIRT1进行RNA干扰，从而导致SIRT1蛋白表达下降。对照为采用Luc RNAi病毒(即对照病毒)感染HepG2细胞。

分别采用胰岛素和白藜芦醇处理细胞。结果见图5。

由结果可见，白藜芦醇增强肝细胞糖原合成需要SIRT1的参与。

实施例6  上调SIRT1蛋白水平或白藜芦醇处理对于PTP-1B的影响

根据前述的方法，采用HSV-SIRT1上调SIRT1蛋白水平，采用Western Blot测定对于PTP-1B蛋白(PTP-1B抗体购自美国Upstate公司)的影响，以Tubulin为对照；采用前述材料和方法中第6部分所述的RT-PCR方法测定PTP-1B mRNA水平，以Actin为对照。结果如图6A-图6B。

如图6A所示，发现在胰岛素抵抗情况下，SIRT1蛋白水平上调可降低PTP-1B蛋白水平，且SIRT1蛋白水平越高，PTP-1B蛋白水平越低。

如图6B所示，发现在胰岛素抵抗情况下，SIRT1蛋白水平上调可降低PTP-1B的mRNA水平。图6E为对图6B各PTP-1B mRNA检测条带的量化。

接着，本发明人还用白藜芦醇(浓度分别是0.01，0.1和1.0μM)处理细胞，在C2C12细胞内促进SIRT1的活性和表达水平，采用Western Blot测定对于PTP-1B蛋白的影响，以Tubulin为对照；采用前述材料和方法中第6部分所述RT-PCR方法测定PTP-1B mRNA水平。结果如图6C和图6D所示。

如图6C所示，发现白藜芦醇处理在正常和胰岛素抵抗情况下均可显著降低PTP-1B蛋白水平。

如图6D所示，发现白藜芦醇处理在正常和胰岛素抵抗情况下均可显著降低PTP-1B的mRNA水平。图6F为对图6D各PTP-1B mRNA检测条带的量化。

综上可知，上调SIRT1蛋白水平(胰岛素抵抗情况下)或白藜芦醇处理(正常或胰岛素抵抗情况下)可降低PTP-1B蛋白和mRNA水平。

实施例7

上调PTP-1B蛋白水平对于上调SIRT1导致的胰岛素敏感性升高的影响

根据前述的方法，在C2C12细胞中分别采用HSV-SIRT1和HSV-PTP-1B上调SIRT1蛋白水平和PTP-1B蛋白水平。

采用前述的Western Blot方法检测，HSV介导的PTP-1B和SIRT1蛋白水平上***况如图7A所示。

如图7B所示，PTP-1B蛋白水平上调逆转了SIRT1蛋白水平上调导致的葡萄糖摄入升高。在不上调PTP-1B蛋白水平的情况下，SIRT1蛋白水平上调导致葡萄糖摄入升高，而在逐渐上调PTP-1B蛋白水平的情况下，SIRT1蛋白水平上调导致葡萄糖摄入逐渐下降。其中，白色柱体表示不加入胰岛素且不上调SIRT1和PTP-1B，黑色柱体表示加入胰岛素和上调SIRT1且不上调PTP-1B，灰色柱体表示加入胰岛素和上调SIRT1且上调PTP-1B。

因此可见，上调PTP-1B蛋白水平可以逆转上调SIRT1导致的胰岛素敏感性升高，说明本发明中发现的SIRT1提高胰岛素敏感性的作用是通过抑制PTP-1B来实现的。

实施例8  白藜芦醇对于胰岛素敏感性等糖尿病相关症状的影响作用

如前述方法，用高脂诱导C57/BL6小鼠胰岛素抵抗模型，在饲喂高脂饲料的同时白藜芦醇(Resveratrol)给药(2.5mg/kg/d)。四周后，采用血糖仪测定小鼠糖耐量(GTT)、胰岛素耐量(ITT)，采用自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL)水平，采用放射免疫法测定血清胰岛素水平。结果如图8A-图8E所示。

由图8A可知，在低脂组，动物体内的血清胰岛素水平较低；在高脂组，动物体内的血清胰岛素水平很高；而在高脂组给予白藜芦醇后，血清胰岛素水平显著低于高脂组。因此可见，白藜芦醇可以抑制高脂诱导的高胰岛素血症。

给饥饿过夜小鼠注射一定剂量的葡萄糖，然后在不同时间点测定小鼠血糖浓度(GTT)。由图8B可知，在各个时间段中，高脂组的血糖水平明显高于低脂组和高脂+白藜芦醇组。因此可见，白藜芦醇可以改善高脂诱导的葡萄糖耐受。

给饥饿过夜小鼠注射一定剂量的胰岛素，然后在不同时间点测定小鼠血糖浓度(ITT)。由图8C可知，在各个时间段中，高脂组的血糖水平明显高于低脂组和高脂+白藜芦醇组。因此可见，白藜芦醇可以改善高脂诱导的胰岛素耐受。

由图8D可知，在低脂组，动物体内的总胆固醇含量较低；在高脂组，动物体内的总胆固醇含量很高；而在高脂组给予白藜芦醇后，总胆固醇含量低于高脂组。因此可见，白藜芦醇可以降低高脂诱导的总胆固醇水平升高。

由图8E可知，在低脂组，动物体内的低密度脂蛋白含量较低；在高脂组，动物体内的低密度脂蛋白含量很高；而在高脂组给予白藜芦醇后，低密度脂蛋白含量低于高脂组。因此可见，白藜芦醇可以降低高脂诱导的低密度脂蛋白水平升高。

综上，白藜芦醇可以改善胰岛素敏感性等糖尿病相关症状，降低高脂饮食小鼠体内总胆固醇及低密度脂蛋白含量。

实施例9  筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法

方法1：

以SIRT1蛋白为靶点，利用对胰岛素响应的肌肉细胞(如本发明中所用的C2C12)或肝细胞(如HepG2细胞)筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质。

测试组：在前述的胰岛素响应细胞中加入候选物质。

对照组：在前述的胰岛素响应细胞中不加入候选物质。

检测测试组细胞中的SIRT1蛋白活性或表达情况，并且与对照组细胞中的SIRT1蛋白活性或表达情况相比较，如果测试组中SIRT1蛋白活性或表达在统计学上高于(如高20％或以上)对照组，就表明该候选物是可用于提高胰岛素敏感性的物质。

方法2：

以PTP-1B为靶点，利用对胰岛素响应的肌肉细胞(如本发明中所用的C2C12)或肝细胞(如HepG2细胞)筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质。

测试组：在前述的胰岛素响应细胞中加入候选物质。

对照组：在前述的胰岛素响应细胞中不加入候选物质。

检测测试组细胞中的PTP-1B的蛋白表达情况或mRNA水平，并且与对照组细胞中的PTP-1B的蛋白表达情况或mRNA水平相比较，如果测试组中PTP-1B的蛋白表达情况或mRNA水平在统计学上低于(如高20％或以上)对照组，就表明该候选物是可用于提高胰岛素敏感性的物质。

实施例10  含有适量SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂的组合物

所述的食物组合物的配方如表1：

表1

功能性饮料1(克/升)	白藜芦醇0.002，低聚糖10，柠檬酸1.8，柠檬香精1，氯化钠0.6，氯化钾0.1，磷酸二氢钠0.1，碳酸氢钠0.1
		功能性饮料2(wt％)	白藜芦醇0.02，柑桔16，杏子泥8，桃子泥8，香蕉泥6
功能性饮料3(wt％)	紫铆因0.1，白砂糖6，甜蜜素0.06，柠檬酸0.16，柠檬酸钠0.03，食盐0.02，苯甲酸钠0.02
		功能性饼干	白藜芦醇0.002g/kg；奶油150g/kg；酥油100g/kg；白砂糖120g/kg；盐10g/kg；鸡蛋1个；低筋面粉360g/kg；牛奶25ml
功能性饼干	异甘草素0.1g/kg；奶油170g/kg；酥油80g/kg；白砂糖100g/kg；盐7g/kg；鸡蛋1个；低筋面粉250g/kg；高筋面粉60g/kg；牛奶40ml

将上述各种功能性食品喂食高脂诱导胰岛素抵抗的C57/BL6小鼠，测试对于小鼠胰岛素敏感性的影响。在服用一定时期后，对小鼠进行检测，结果发现，发现这些食品对于高脂诱导的高胰岛素血症、高脂诱导的葡萄糖耐受等指标均有显著改善。

实施例11药物组合物

所述的药物组合物配制如表2：

表2

药物组合物1	每剂100mg，其中含有白藜芦醇5mg，罗格列酮2mg
		药物组合物2	每剂80mg，其中含有白藜芦醇2mg，格列本脲2.5mg，格列吡嗪2mg，格列波脲2mg
药物组合物3	每剂1000mg，其中含有白藜芦醇1mg，二甲双胍500mg，苯乙双胍25mg
		药物组合物4	每剂200mg，其中含有白藜芦醇50mg，阿卡波糖50mg，米格列醇20mg

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>增加胰岛素敏感性的方法和组合物

<130>065774

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

atcactgcca cccagaagac                             20

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<210>3

<211>20

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<220>

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

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<212>DNA

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<220>

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<400>5

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<210>6

<211>33

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<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ggaagtcgac agtgctccca gtctgtcagt gaa                                 33

<210>7

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>7

gatccgatga agttgacctc ctcattcaag agatgaggag gtcaacttca tcttttttgg    60

aaa                                                                  63

<210>8

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>8

agcttttcca aaaaagatga agttgacctc ctcatctctt gaatgaggag gtcaacttca    60

tcg                                                                  63

<210>9

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>9

gatccgtagc gcggtgtatt atacttcaag agagtataat acaccgcgct acttttttgg    60

aag                                                                  63

<210>10

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>10

tcgacttcca aaaaagtagc gcggtgtatt atactctctt gaagtataat acaccgcgct    60

acg                                                                  63

Claims (10)

1.一种SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂的用途，其特征在于，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂还用于制备抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1B转录或表达的组合物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物用于治疗胰岛素敏感性下降相关的疾病。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的胰岛素敏感性下降相关的疾病包括：胰岛素抵抗、2型糖尿病、高胰岛素血症、糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷、乳酸性酸中毒。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的SIRT1蛋白的激动剂或上调剂选自：白藜芦醇、紫铆因、异甘草素、漆黄素、或四羟反式芪。

6.一种筛选可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括：

将候选物质与表达SIRT1蛋白的体系接触，检测候选物质对SIRT1蛋白的影响；若所述候选物质可提高SIRT1蛋白的表达或促进SIRT1蛋白的活性，则表明该候选物质是可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：

观察体系中蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的表达情况或活性，

若蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的表达或活性降低，则表明该候选物质是可用于提高胰岛素敏感性的潜在物质。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的体系选自：溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。

9.一种通过权利要求6所述的方法获得的可用于提高胰岛素敏感性的物质。

10.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

(i)有效量的SIRT1蛋白或其激动剂或上调剂；

(ii)有效量的选自下组的物质：双胍类糖尿病药物、磺酰脲类糖尿病药物、葡萄糖苷酶抑制剂类药物、胰岛素增敏类药物、醛糖还原酶抑制剂类药物、促胰岛素释放类药物；以及

(iii)药学上或食品学上可接受的载体。

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