CN101173242A - 一种生产l-乳酸的方法及其专用凝结芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产L－乳酸的方法及其专用凝结芽孢杆菌。本发明所提供的凝结芽孢杆菌是凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184。培养凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184即可得到L－乳酸。该菌株的发酵培养基每升中含有以下五种氮源中的至少一种：酵母粉5～15克，蛋白胨5～15克，大豆肽5～15克，大豆蛋白胨5～15克，棉籽蛋白10～20克；另外每升发酵培养基中还含有：葡萄糖80～170克(初糖含量)，碳酸钙50～100克，余量为水；该发酵培养基的pH为5.5～7。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184以葡萄糖为底物，在45～60℃条件下以98～99％的糖酸转化率高效发酵生产光学纯度99％以上的L－乳酸，其中L－乳酸浓度最高可达190克/升，体积生产效率最高可达5.7克/升/小时。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产L-乳酸的方法及其专用凝结芽孢杆菌。
背景技术
乳酸(Lactic Acid)又名二羟基丙酸，是世界三大有机酸之一，广泛应用于食品、化妆、制药、纺织和化学工业上。由乳酸制成的聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性，可制成医用缓释材料、生物可降解纤维和生物可降解塑料等，并有望在不久的将来取代石油基塑料。近年来，由于石油资源的日渐短缺和人们环保意识的逐渐增强，围绕聚乳酸的研究也越来越多，作为聚乳酸单体的乳酸的需求也越来越迫切。乳酸是一种手性分子，可分为L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。在聚乳酸的生产过程中，聚乳酸的物理性质和稳定性主要受L-乳酸和D-乳酸的组成所影响，因此在聚合反应中需要高纯度的L-乳酸和D-乳酸。
乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和发酵法三种。其中，化学法直接合成的乳酸为DL-乳酸，若要得到D-乳酸或L-乳酸则需进行光学拆分，而且由于合成法所用的原料是乙醛和剧毒物氢氰酸，合成乳酸应用于食品不能被广泛接受，此外其生产成本也较高。酶法生产可以专一性地得到光学纯乳酸，但生产过程比较复杂，尚未广泛应用于工业化生产。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条件的选择而获得D-乳酸、L-乳酸或是两者一定比例的混合物，能以淀粉、纤维素等可再生资源为原料发酵生产乳酸，生产成本低，产品安全性高，是生产乳酸的主要方法。
目前成功应用于乳酸发酵的微生物主要有两类，一类是霉菌中的米根霉，另一类是细菌中的乳杆菌。米根霉生产乳酸是好氧发酵，而乳杆菌可厌氧或微好氧发酵生产乳酸，这两类菌株的共同特点是发酵生产乳酸的温度一般在30～42℃，容易污染DL-乳酸生产菌(如植物乳杆菌)，因此需要对发酵液进行灭菌，造成能量的浪费和营养成分的损失。
嗜热的芽孢杆菌是一种新的可用于L-乳酸发酵生产的微生物。由于具有较高的发酵温度(45～60℃)，大大减少了发酵过程中污染杂菌的机会，提高了L-乳酸的光学纯度。同时，以较高的温度进行发酵，可降低发酵液粘度，有利于后续处理步骤的操作，可以在培养基不灭菌的条件下进行发酵生产，降低了能耗和L-乳酸的生产成本，并为以淀粉为基质同步糖化发酵生产乳酸提供了基础。
在专利USP 5079164中曾经利用嗜热的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulansDSM5196)进行发酵，但发酵的转化率较低，19％的初糖仅得到14％的乳酸。专利USP7183088 B2和CN1498265 A提到利用另外一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulansSIM-7 DSM14043)进行L-乳酸生产，但产酸的速率较低，发酵98小时，产酸12.3％，转化率95.5％。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株产L-乳酸的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。
本发明所提供的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)菌株CASH从北京门头沟区的某牛奶厂附近土壤中筛选并诱变得到，已于2007年09月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC №2184。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184革兰氏阳性，长杆状细胞，细胞能运动，形成近端卵形内生孢子。其菌落为圆形、凸起、有光泽、透明、表面光滑、干燥、直径2～3mm。它可利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、***糖、糊精以及β-环糊精产酸不产气，不能利用木糖、乳糖、棉子糖、甘露醇和山梨醇，不能利用丙酸盐，接触酶阳性，不能水解明胶，不产生吲哚，可耐受0.02％的叠氮化物，在有0.01％的溶菌酶时不能生长，专性同型乳酸发酵生产L-乳酸。其16S rDNA序列(序列表中的序列1)与多株凝结芽孢杆菌的16S rDNA序列比对相似性达到99％。
本发明的第二个目的是提供一种利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASHCGMCC №2184生产L-乳酸的方法。
本发明所提供的生产L-乳酸的方法，是发酵凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASH CGMCC №2184得到L-乳酸。
所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184的发酵培养基每升中可含有以下五种氮源中的至少一种：酵母粉5～15克，蛋白胨5～15克，大豆肽5～15克，大豆蛋白胨5～15克，棉籽蛋白10～20克。另外每升发酵培养基中还含有：葡萄糖80～170克，用于调控发酵液pH的中和剂，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。该发酵培养基不需灭菌。
其中，所述中和剂为碳酸钙，所述发酵培养基中每升含有50～100克。
所述发酵培养基的pH具体可为5.5～6.5。
所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184的发酵条件具体可为45℃～60℃培养18～60小时，如50～55℃培养18～48小时。
所述方法中，还可将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184先接入如下种子培养基中，在45～60℃培养6～8小时，再接入所述发酵培养基；所述种子培养基每升中含有：葡萄糖60～80克，酵母粉10～15克，大豆蛋白胨5～8克，碳酸钙30～40克，余量为水；所述种子培养基的pH为5.5～6。
所述发酵的培养方式具体可为搅拌培养，搅拌转速为200～300转/分钟，旋转半径为33mm。
本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184以葡萄糖为底物，在45～60℃条件下以98～99％的糖酸转化率高效发酵生产光学纯度99％以上的L-乳酸，其中L-乳酸浓度最高可达190克/升，体积生产效率最高可达5.7克/升/小时。
本发明的生产L-乳酸的方法，利用高温发酵过程的优势，污染杂菌的机率小，可不对发酵培养基进行灭菌，减少了能量的消耗和营养物质的损失。
附图说明
图1为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184发酵生产L-乳酸过程中葡萄糖和L-乳酸的变化曲线。
图2为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184发酵生产L-乳酸所得发酵液以及D-乳酸和L-乳酸标准品在液相手性柱下的色谱图。A为L-乳酸标准品，B为D-乳酸标准品，C为发酵液样品。
具体实施方式
本发明的利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184发酵生产L-乳酸方法中涉及的步骤顺序如下：
(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184菌种接种于含有1.5～2.0g/100ml的琼脂的固体斜面培养基上，培养温度45～60℃，培养时间8～12小时；
(2)种子培养：用步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种到种子培养基中，培养温度45～60℃，培养方式为利用漩涡式摇床培养，转速120转/分钟，培养时间6～8小时；
(3)发酵培养：以5～10％的体积比的接种量，将种子培养液接入发酵培养基，培养温度45～60℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速200～300转/分钟，培养时间18～60小时，制得含有L-乳酸的发酵培养液；
(4)处理样品：取发酵液先加热至80～100℃，再6,000转/分钟离心5分钟，取上清液；
(5)样品检测：取上清液稀释，检测葡萄糖含量和L-乳酸、D-乳酸含量；
其中，步骤(1)、(2)、(3)中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。
其中，步骤(1)中所述的菌体培养时间优选是9～10小时。
其中，步骤(2)中所述的菌体培养时间优选是6～7小时。
其中，步骤(3)中所述的菌体培养时间优选是18～48小时。
其中，步骤(2)、(3)中所述的菌体培养加入碳酸钙控制pH为5.5～6。
下面通过实施例进一步阐明本发明。
实施例1、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184的分离诱变筛选及鉴定
1、分离诱变筛选
该实施例中所用的培养基的组成如下：
营养液体培养基：葡萄糖150克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙50克/升，pH为6。
营养琼脂培养基：葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙20克/升，琼脂粉10克/升，pH为6。
发酵培养基：葡萄糖150克/升，酵母粉20克/升，碳酸钙90克/升，pH为6。
营养肉汤培养基：葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙10克/升，pH为6。
该实施例的具体操作过程如下：
从北京门头沟区的某牛奶厂附近取得土样，每2克土样放入50ml营养液体培养基中，55℃富集培养6～10小时。然后稀释涂布到含营养琼脂培养基的培养皿中，55℃培养24小时。待长出单菌落后，挑选菌落面积和透明圈面积大的菌落，接种到发酵培养基中，55℃静置培养48小时，测定L-乳酸的产量，挑选产量最高的菌株，用于下一步离子束诱变。
将初步挑选的菌株在营养琼脂培养皿上划线培养，挑出单菌落，接种于营养肉汤培养基中，55℃静置培养至对数中期，用生理盐水洗涤后悬浮，制成菌悬液。吸取100μL涂布于直径为3.5cm的无菌空白培养皿上，涂布直径约1.5cm，无菌风吹干制成菌膜后进行离子注入，离子能量30keV，注入剂量分别为1×1014ions/cm2、5×1014ions/cm2、10×1014ions/cm2、50×1014ions/cm2、100×1014ions/cm2。离子注入后的平皿用1mL生理盐水洗脱。各不同注入剂量分别吸取100μL，分别接入含5％(5g/100ml)L-乳酸钠的营养液体培养基中，55℃静置培养24小时，只有注入剂量为10×1014ions/cm2的培养液出现浑浊，稀释该培养液，涂布在营养琼脂培养皿中，待长出单菌落后，挑选菌落面积和透明圈面积大的菌落，接种到发酵培养基中，55℃静置培养48小时，测定L-乳酸的产量，挑选产量最高的菌株。最终得到产量最高的菌株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184。
2、菌株的鉴定
根据“伯杰***鉴定手册(第八版)”和“常见细菌***鉴定手册”(科学出版社)提供的鉴定方法对该菌株进行鉴定，鉴定结果表明凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASH CGMCC №2184为革兰氏阳性，长杆状细胞，细胞能运动，形成近端卵形内生孢子。其菌落为圆形、凸起、有光泽、透明、表面光滑、干燥、直径2～3mm。它可利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、***糖、糊精以及β-环糊精产酸不产气，不能利用木糖、乳糖、棉子糖、甘露醇和山梨醇，不能利用丙酸盐，接触酶阳性，不能水解明胶，不产生吲哚，可耐受0.02％的叠氮化物，在有0.01％的溶菌酶时不能生长，专性同型乳酸发酵生产L-乳酸。其16S rDNA序列(序列表中的序列1)与多株凝结芽孢杆菌的16S rDNA序列比对相似性达到99％。
基于以上特征，将本株L-乳酸生产菌鉴定为凝结芽孢乳杆菌(Bacilluscoagulans)，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC №2184。
实施例2、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在三角瓶中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基：葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
种子培养基：葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵培养基：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)170克/升，酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-013)15克/升，碳酸钙80克/升。该发酵培养基的初始pH为6.5。不灭菌。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184菌种接种于斜面培养基上，50℃条件下，静止培养10小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，50℃条件下，摇床培养6小时，转速120转/分钟(13mm旋转半径)，制得种子液；
(3)发酵培养：在装有100ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，50℃条件下，摇床培养39小时，结束发酵，该摇床的转速为120转/分钟(13mm旋转半径)。实验共设50次重复。每3个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸光学纯度。
其中，葡萄糖的测定方法为，发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院)测定。
L-乳酸和D-乳酸含量的测定方法为，采用Agilent 1100液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10 W(3μ)4.6ID×50mm，光学异体分离用)。具体操作条件为：0.002mol/L硫酸铜作为流动相，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用L-乳酸和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。
本发明中，作为标准品的D-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为L0625-25MG；作为标准品的L-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为L1750-10G。在如上色谱条件下，D-乳酸保留时间为10.150分钟，L-乳酸保留时间为12.293分钟。L-乳酸标准品、D-乳酸标准品和发酵液的色谱图见附图2。
光学纯度(optical purity)是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess)表示。本发明中L-乳酸的光学纯度按以下公式计算：(L-乳酸含量-D-乳酸含量)÷(L-乳酸含量+D-乳酸含量)×100％。
糖酸转化率定义为：L-乳酸产量(克/升)÷葡萄糖的消耗量(克/升)×100％。
体积生产效率定义为：L-乳酸产量(克/升)÷发酵时间(小时)。
发酵结束后，葡萄糖的浓度为2.3克/升±0.5克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度165.1克/升±1.0克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率98.5％±0.6％(平均值±标准差)，体积生产效率4.2克/升/小时±0.3克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度99.3％±0.3％(平均值±标准差)。
实施例3、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在三角瓶中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184的培养温度为55℃。发酵培养基的组成为：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)118克/升，大豆蛋白胨(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-004)15克/升，碳酸钙80克/升。该发酵培养基的初始pH为5.5。发酵时间是24小时。其它方法均与实施例2相同。
发酵结束，葡萄糖的浓度为3.2克/升±1.1克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度113.5克/升±1.9克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率98.9％±0.3％(平均值±标准差)，体积生产效率4.7克/升/小时±0.2克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度99.3％±0.2％(平均值±标准差)。
实施例4、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在三角瓶中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184的培养温度为60℃。发酵培养基的组成为：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)83克/升，大豆肽(哈尔滨乐能生物工程股份有限公司，乐能大豆蛋白肽3#粉)15克/升，碳酸钙80克/升。该发酵培养基的初始pH为5.5。发酵时间是24小时。其它方法均与实施例2相同。
发酵结束，葡萄糖的浓度为2.1克/升±0.5克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度79.0克/升±1.5克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率98.8％±0.3％(平均值±标准差)，体积生产效率3.3克/升/小时±0.2克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度99.1％±0.1％(平均值±标准差)。
实施例5、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在三角瓶中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184的培养温度为45℃。发酵培养基的组成为：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)120克/升，棉籽蛋白(北京康明威培养基技术有限责任公司)20克/升，碳酸钙80克/升。该发酵培养基的初始pH为6。发酵时间是27小时。其它方法均与实施例2相同。
发酵结束，葡萄糖的浓度为2.5克/升±0.6克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度116.0克/升±1.5克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率98.7％±0.4％(平均值±标准差)，体积生产效率4.3克/升/小时±0.3克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度99.2％±0.2％(平均值±标准差)。
实施例6、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在三角瓶中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184的发酵培养基的组成为：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)118克/升，蛋白胨(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-001-2)15克/升，碳酸钙80克/升。该发酵培养基的初始pH为7。发酵时间是28小时。其它方法均与实施例2相同。
发酵结束，葡萄糖的浓度为2.7克/升±0.3克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度113.5克/升±1.7克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率98.5％±0.4％(平均值±标准差)，体积生产效率4.1克/升/小时±0.2克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度99.3％±0.2％(平均值±标准差)。
实施例7、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在5升发酵罐中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基：葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
种子培养基：葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵培养基：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)125克/升，酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-013)9.8克/升，大豆蛋白胨(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-004)5克/升，碳酸钙100克/升。该发酵培养基的初始pH为6.5。不灭菌。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184菌种接种于斜面培养基上，50℃条件下，静止培养10小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有100ml种子培养基的300ml三角瓶中，50℃条件下，摇床培养6小时，转速120转/分钟(13mm旋转半径)，制得种子液；
(3)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)5升发酵罐中加入3升发酵培养基。在发酵培养基中接入300ml种子培养液，发酵罐搅拌转速200转/分钟(33mm旋转半径)，50℃条件下发酵21小时。实验共设10次重复。按照实施例2的方法每3个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸光学纯度。
发酵结束后，葡萄糖的浓度为3.4克/升±0.6克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度120克/升±1.8克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率99.0％±0.5％(平均值±标准差)，体积生产效率5.7克/升/小时±0.4克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度99.2％±0.1％(平均值±标准差)。
实施例8、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在5升发酵罐中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基：葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
种子培养基：葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵初始培养基：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)122克/升，蛋白胨(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-001-2)5克/升，大豆肽(哈尔滨乐能生物工程股份有限公司，乐能大豆蛋白肽3#粉)12.8克/升，碳酸钙100克/升。该发酵培养基的初始pH为6.5。不灭菌。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184菌种接种于斜面培养基上，55℃条件下，静止培养10小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有100ml种子培养基的300ml三角瓶中，55℃条件下，摇床培养6小时，转速120转/分钟(13mm旋转半径)，制得种子液；
(3)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)5升发酵罐中加入3升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入300ml种子培养液，发酵罐搅拌转速200转/分钟(33mm旋转半径)，55℃条件下共发酵39小时。其中，发酵到15小时(经检测，此时发酵液中葡萄糖的浓度为30克/升)，按照每升发酵液中补加42克葡萄糖的量补加葡萄糖，即每个发酵罐中再加入126克葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)。实验共设10次重复。按照实施例2的方法取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸光学纯度。
结果表明发酵结束后，葡萄糖的浓度为4.6克/升±0.7克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度160克/升±3.2克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率98.5％±0.4％(平均值±标准差)，体积生产效率4.1克/升/小时±0.3克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度99.2％±0.2％(平均值±标准差)。
实施例9、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在5升发酵罐中发酵生产L-乳酸
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184的培养温度为60℃，发酵培养基的配方为：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)83克/升，酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-013)10克/升，大豆肽(哈尔滨乐能生物工程股份有限公司，乐能大豆蛋白肽3#粉)5克/升，碳酸钙80克/升。该发酵培养基的初始pH为7。发酵时间是18小时。其它方法均与实施例7相同。
结果表明发酵结束后，葡萄糖的浓度为3.2克/升±0.4克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度为78.5克/升±0.9克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率为98.4％±0.3％(平均值±标准差)，体积生产效率4.4克/升/小时±0.1克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度为99.2％±0.1％(平均值±标准差)。
实施例10、利用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184在5升发酵罐中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基：葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，七水合硫酸镁0.58克/升，四水合硫酸锰0.25克/升，碳酸钙15克/升，琼脂粉15克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
种子培养基：葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸钙30克/升。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵初始培养基：葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)122克/升，酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-013)5克/升，棉籽蛋白(北京康明威培养基技术有限责任公司)20克/升，碳酸钙100克/升。该发酵培养基的初始pH为6.5。不灭菌。
该发酵生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184菌种接种于斜面培养基上，55℃条件下，静止培养10小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有100ml种子培养基的300ml三角瓶中，55℃条件下，摇床培养6小时，转速120转/分钟(13mm旋转半径)，制得种子液；
(3)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)5升发酵罐中加入3升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入300ml种子培养液，发酵罐搅拌转速300转/分钟(33mm旋转半径)，55℃条件下共发酵48小时。其中，发酵到18小时(经检测，此时发酵液中葡萄糖的浓度为16克/升)，按照每升发酵液中补加76克葡萄糖的量补加葡萄糖、按照每升发酵液中补加3克酵母粉的量补加酵母粉、按照每升发酵液中补加6克棉籽蛋白的量补加棉籽蛋白和按照每升发酵液中补加30克碳酸钙的量补加碳酸钙；即每个发酵罐中再加入228克葡萄糖(淄博虹宇工业糖有限公司)、9克酵母粉(北京奥博星生物技术责任有限公司，商品目录号01-013)、18克棉籽蛋白(北京康明威培养基技术有限责任公司)和90克碳酸钙。实验共设10次重复。按照实施例2的方法取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000转/分钟离心5分钟，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、体积生产效率和L-乳酸光学纯度。
结果表明凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184发酵生产L-乳酸过程中葡萄糖和L-乳酸的变化曲线如图1所示，表明通过补料葡萄糖可迅速转化为高浓度的L-乳酸。发酵结束后，葡萄糖的浓度为5.0克/升±0.8克/升(平均值±标准差)，L-乳酸浓度190克/升±5.2克/升(平均值±标准差)，糖酸转化率98.2％±0.3％(平均值±标准差)，体积生产效率4.0克/升/小时±0.4克/升/小时(平均值±标准差)，L-乳酸光学纯度99.5％±0.2％(平均值±标准差)。
序列表
<160>1
<210>1
<211>612
<212>DNA
<213>凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
<400>1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgtgc 60
ggacctttta aaagcttgct tttaaaaggt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc 120
aacctgcctg taagactggg ataacgccgg gaaaccgggg ctaataccgg atcgtttttt 180
cctccgcatg gaggaaaaag gaaaggcggc ttcggctgcc acttacagat gggcccgcgg 240
cgcattagct agttggcggg gtaacggccc accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag 300
agggtgatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta 360
gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ctgcgtgagt gaagaaggcc 420
ttcgggtcgt aaaactctgt tgccggggaa gaacaagtgc cgttcgaaca gggcggcgcc 480
ttgacggtac ccggccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540
aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg cttcttaagt 600
ctgatgtgaa at 612
Claims (10)
1.凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH，其保藏号为CGMCC №2184。
2.一种生产L-乳酸的方法，是发酵凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASHCGMCC №2184得到L-乳酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASH CGMCC №2184的发酵培养基每升中含有以下五种氮源中的至少一种：酵母粉5～15克，蛋白胨5～15克，大豆肽5～15克，大豆蛋白胨5～15克，棉籽蛋白10～20克；所述发酵培养基每升中还含有：葡萄糖80～170克，用于调控发酵液pH的中和剂，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～7。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述中和剂为碳酸钙，所述发酵培养基中每升含有50～100克。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基不灭菌。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASH CGMCC №2184的发酵条件为45℃～60℃培养18～60小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述培养温度为50～55℃。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述培养时间为18～48小时。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述方法中，将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC №2184先接入如下种子培养基中，在45～60℃培养6～8小时，再接入所述发酵培养基；所述种子培养基每升中含有：葡萄糖60～80克，酵母粉10～15克，大豆蛋白胨5～8克，碳酸钙30～40克，余量为水；所述种子培养基的pH为5.5～6。
10.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵的培养方式为搅拌培养，搅拌转速为200～300转/分钟，旋转半径为33mm。
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