CN101158686A - 一种用于检测血吸虫的电化学传感器及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明给出了一种用于检测血吸虫的电化学传感器，包括金电极，以及金电极上依次覆盖上的巯基乙胺自组装层、戊二醛交联层和血吸虫抗原固定层；本发明的优点是：检测灵敏度高，检测下限低检测速度快，特异性好，检测所需的试剂与仪器便携且价格低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种用于检测的电化学传感器。
背景技术
血吸虫病是一种由血吸虫引起的热带疾病。主要致病的血吸虫种类有5种，分别是埃及血吸虫，曼氏血吸虫，日本血吸虫，间插血吸虫，湄公血吸虫。根据WHO报道，每年有约二十亿人被感染上血吸虫病。日本血吸虫是主要在亚洲地区流行的一种由血吸虫寄生于人体所引起的危害性极大的一种寄生虫病。
诊断是治疗血吸虫病的一个关键环节。所以，快速、准确的诊断技术是一个有效控制血吸虫病的先决条件。目前对此疾病的经典检测方法是通过显微镜观察***物中是否存在有血吸虫卵，但是这种方法的灵敏度低，难以检测出轻微患者。血吸虫抗体与虫卵抗原的免疫反应在临床应用与流行病研究方面有很大的应用前景。目前用于血吸虫抗体的检测方法主要有环卵沉淀实验(COPT)、间接红细胞凝集实验(IHA)、尾蚴膜反应(CHR)、对流免疫电泳(CIE)、免疫酶测定(EIA)、间接荧光抗体实验(IFAT)、PEG沉淀实验(PEGPT)、放射免疫测定(RIA)等。但这些检测方法仍存在不同程度的问题，如耗时、检测灵敏度不够高等。
相对于以上方法，基于酶催化金属沉积放大检测血吸虫的电化学免疫分析技术具有免疫反应的特异性，又具有电化学检测的方便快捷，加上酶催化金属沉积的放大技术使得血吸虫病的检测更加灵敏、准确。即使将病人血清稀释上万倍，也可以检测出来。实验所需仪器简单，价格低廉，操作简便无需专业技术人员。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单、灵敏、利用酶催化金属沉积的放大技术检测血吸虫的电化学传感器及制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测血吸虫的电化学传感器，包括：金电极，以及金电极上依次覆盖上的巯基乙胺自组装层、戊二醛交联层和血吸虫抗原固定层。
一种制备上述用于检测血吸虫的电化学传感器的方法，包括以下步骤：
1、金电极的处理
金电极用氧化铝粉末打磨后分别用乙醇和水超声清洗，然后在氮气中干燥。
2、巯基乙胺的自组装
将上述预处理好的金电极浸泡在含巯基乙胺的乙醇溶液中，使其在金电极表面形成巯基乙胺的自组装单分子层(SAM)。
3、戊二醛的联接与血吸虫抗原的固定
将上述表面覆盖了巯基乙胺自组装单分子层的金电极置于戊二醛水溶液中，反应完成后，水洗，在金电极表面滴加含血吸虫抗原的磷酸缓冲溶液(PB溶液，pH7.3)，反应完成后，滴加BSA溶液封闭未反应的戊二醛，清洗金电极，这样传感器的界面就制备好了。
所述用于检测血吸虫的电化学传感器检测血吸虫抗体的方法，包括以下步骤：
1、免疫反应：将稀释后的受感染体的带有血吸虫抗体的血清滴于金电极表面，反应完成后，取出，清洗电极；
2、酶催化银沉积：在电极表面滴加碱磷酶标记羊抗兔或人抗体溶液(AH-ALP)，反应完成后，将电极充分清洗干净，然后将电极浸泡在甘氨酸缓冲液(pH9.08，内含1mMAgNO3，1mM抗坏血酸2-磷酸盐(AA-P))中，反应完成后，将电极清洗干净；
3、电化学检测：用线性扫描伏安法(LSV)进行检测，电位范围为0～0.8V(vs.SCE)，扫描速度为100mV/s，电化学实验的支持电解质为0.6M KNO3/0.1M HNO3，实验温度控制在室温即可，整个检测过程仅需1分钟。
4、数据分析：LSV峰电流信号与血清中血吸虫抗体浓度在动力学稀释范围1∶12500～1∶100内成良好线性关系，检测下限可达1∶10186。将所得LSV峰电流信号的数据与标准曲线进行对照，根据标准曲线可诊断出病体是否受到血吸虫感染及所受感染的程度。
本发明的优点：
1、耗材少。实验过程中，每个样品及所需试剂都是几个微升。配合芯片技术，本方法将实现高通量检测，非常适合疫区大规模样品的筛查。2、检测灵敏度高，检测下限低。传统的ELISA方法在将血清稀释300多倍后就无法测出信号了，而基于酶催化金属沉积放大的检测方法能将稀释比率提高到1.25×105。检测下限达到了1∶10186的稀释比。3、检测速度快。用LSV法将沉积在电极上的银溶出并读出峰电流仅需60秒的时间，比一般的检测手段都迅速很多。4、特异性好。该传感器对人体中所含其他蛋白质，如凝血酶、血红素、免疫球蛋白G等均无明显响应。5、检测所需的试剂与仪器便携且价格低廉。
具体实施方式
实施例1：用于检测血吸虫抗体的传感器制备
1、金电极的处理
金电极用0.3μm氧化铝粉末打磨后再用0.05μm氧化铝粉末打磨，然后分别用乙醇和二次蒸馏水超声清洗5分钟。用水清洗后在氮气中干燥。
2、巯基乙胺的自组装
将上述预处理好的金电极浸泡在含巯基乙胺的无水乙醇溶液中(10mM巯基乙胺)10h，使其在金电极表面形成巯基乙胺的自组装单分子层(SAM)。
3、戊二醛的联接与血吸虫抗原的固定
将上述表面覆盖上巯基乙胺的自组装单分子层的金电极置于2.5％(v/v)的戊二醛水溶液在37℃反应1h后，水洗，在电极表面滴加4μL含0.1μM血吸虫抗原的PB(pH7.3)溶液在37℃于恒温槽反应1h，滴加1mg/mL BSA溶液于37℃反应1h，封闭未反应的戊二醛。用1/15M PB和二次蒸馏水清洗电极数次。这样传感器的界面就制备好了。
实施例2：血吸虫感染兔血清样品的检测
滴加4μL稀释后的血吸虫感染兔血清于电极表面。置于37℃恒温槽中反应1h，取出，用1/15M PB和二次蒸馏水清洗电极。在电极表面滴加4μL碱磷酶标记羊抗兔抗体溶液(AR-ALP)(用含有1mg/mL BSA的1/15M，pH7.3的PB将1mg/mL碱磷酶标记羊抗兔抗体溶液作50倍稀释)在37℃反应1h。将电极用PB、去离子水充分清洗干净，然后将电极浸泡在现配的50mM甘氨酸缓冲液(pH9.08，内含1mM AgNO3，1mM抗坏血酸2-磷酸盐(AA-P))中在37℃于暗处反应30min。反应后将电极用超纯水清洗干净。用线性扫描伏安法(LSV)进行检测，电位范围为0～0.8V(vs.SCE)，扫描速度为100mV/s。电化学实验的支持电解质为0.6M KNO3/0.1M HNO3。实验温度都控制在室温。结果表明，LSV峰电流信号与血清中血吸虫抗体浓度在动力学稀释范围1∶12500～1∶100内成良好线性关系，检测下限可达1∶10186。将所得LSV峰电流信号的数据与标准曲线进行对照，根据标准曲线可诊断出病体受到血吸虫感染及所受感染的程度。10例兔血清样品中，5例为阳性，说明是血吸虫感染兔血清，5例为阴性，说明是未感染血吸虫的兔血清。基于酶催化金属沉积放大的血吸虫抗体检测技术可以对血吸虫感染兔血清样品进行准确、灵敏的检测。
实施例3：血吸虫感染人血清样品的检测
利用该酶催化金属沉积放大检测技术对20例疫区可疑病人的血清样品进行检测。将可疑病人的血清样品滴加到固定有血吸虫抗原的金电极传感器上37℃孵育60min，未反应的位点用1mg/mL BSA封闭60min后，用PB(pH7.3)缓冲液清洗传感器表面，再将其与ALP标记的羊抗人IgG于37℃孵育60min。将电极用PB、去离子水充分清洗干净，然后将电极浸泡在现配的50mM甘氨酸缓冲液(pH9.08，内含1mM AgNO3，1mM抗坏血酸2-磷酸盐(AA-P))中在37℃于暗处反应30min。反应后将电极用超纯水清洗干净。最后，在电化学工作站上，用线性扫描伏安法测出峰电流与工作曲线相比较。20例可疑病人的血清样品中，5例为阴性，说明是血吸虫未感染血清，15例为阳性，说明是血吸虫感染血清。结果表明，基于酶催化金属沉积放大的血吸虫抗体检测技术可以对血吸虫感染的人血清样品进行快速、准确的测定。
Claims (3)
1.一种用于检测血吸虫的电化学传感器，其特征在于包括金电极，以及金电极上依次覆盖上的巯基乙胺自组装层、戊二醛交联层和血吸虫抗原固定层。
2.一种制备权利要求1所述用于检测血吸虫的电化学传感器的方法，包括以下步骤：
a、金电极用氧化铝粉末打磨后清洗干净，然后在氮气中干燥；
b、将上述预处理好的金电极浸泡在含巯基乙胺的乙醇溶液中，使其在金电极表面形成巯基乙胺的自组装单分子层；
c、将上述表面覆盖了巯基乙胺自组装单分子层的金电极置于戊二醛水溶液中，反应完成后，水洗，在金电极表面滴加含血吸虫抗原的磷酸缓冲溶液，反应完成后，滴加BSA溶液封闭未反应的戊二醛，清洗金电极，制得本发明传感器。
3.权利要求1所述的电化学传感器用于检测血吸虫抗体。
Priority Applications (1)
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| CNA2007100360651A CN101158686A (zh) | 2007-11-07 | 2007-11-07 | 一种用于检测血吸虫的电化学传感器及制备方法和应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CNA2007100360651A CN101158686A (zh) | 2007-11-07 | 2007-11-07 | 一种用于检测血吸虫的电化学传感器及制备方法和应用 |
Publications (1)
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| CN101158686A true CN101158686A (zh) | 2008-04-09 |
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| CNA2007100360651A Pending CN101158686A (zh) | 2007-11-07 | 2007-11-07 | 一种用于检测血吸虫的电化学传感器及制备方法和应用 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN101158686A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103197054A (zh) * | 2013-04-07 | 2013-07-10 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种抗原共组装的传感界面 |
| CN105891465A (zh) * | 2014-11-11 | 2016-08-24 | 中南大学 | 一种诊断日本血吸虫循环抗原的方法 |
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2007
- 2007-11-07 CN CNA2007100360651A patent/CN101158686A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103197054A (zh) * | 2013-04-07 | 2013-07-10 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种抗原共组装的传感界面 |
| CN105891465A (zh) * | 2014-11-11 | 2016-08-24 | 中南大学 | 一种诊断日本血吸虫循环抗原的方法 |
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