CN105929001B - 特异性dna假结结构修饰的金电极及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种特异性DNA假结结构修饰的金电极及制备方法和应用。本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极表面通过金‑巯键的作用自组装修饰有末端带亚甲蓝氧化还原标签、茎环1含Nanog结合序列的DNA假结结构，该生物传感器利用功能化的DNA假结结构探针修饰的金电极与目标蛋白反应后，引起DNA假结结构构象改变，借助具有良好导电性的电信号分子MB，实现了对转录因子Nanog的灵敏检测，可以有效区分靶蛋白与其他对照蛋白。本方法操作简单，具有较高灵敏性和特异性，最小检测范围是170pM。

Description

特异性DNA假结结构修饰的金电极及制备方法和应用
技术领域
本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种特异性DNA假结结构修饰的金电极及制备方法和应用。
背景技术
细胞生物学的最有趣的问题之一是细胞多能性，细胞多能性受到严格的监管，调节异常可能会导致先天性缺陷、无法损伤修复甚至是癌症。Nanog是多能性相关的重要转录因子(transcription factors,TFs)之一，是一个近期引起大家极大兴趣的生物分子，它发挥功能是通过调控细胞增殖、死亡，决定细胞命运。已知，Nanog在大部分正常成年组织中不表达，但是高表达于胚胎干细胞和肿瘤细胞。研究已经揭示了Nanog在肿瘤中对于肿瘤细胞的干细胞样表型做出了贡献。升高的Nanog水平通常与肿瘤发生、细胞侵袭和转移有关。Nanog的强烈高表达通常预示了癌症恶性程度高、抗药性以及不良结局。因此，检测Nanog对于肿瘤评估、药物干预检测及临床预后具有重要意义。
传统的TF检测方法有如下几种：浓度检测(例如：western blots,immunohistochemistry or ELISA)，绑定活性检测(例如：electrophoresis mobilityshift assay,ChIP)和转录水平检测(例如：qPCR)。这些方法各有优点，但是也存在着耗时长、操作复杂，测定结果容易出现假阴性等弊端。近年来，电化学技术不断发展，在生命科学领域发挥了十分重要的作用。电化学DNA(E-DNA)传感器具有操作简单、灵敏性高、成本低廉等优势。目前，研究人员已发展了一些检测TF的E-DNA传感器，他们都具有相当的灵敏性和特异性，给TF检测提供了潜在的替换方法。但是这些方法尽管具有这些优势，他们在实际应用中仍然存在一些缺陷。例如，大部分报道的E-DNA体系是signal-off型，signal-off的体系结构容易出现假阳性(例如探针降解)和相对小的检测范围。相反，signal-on型传感器则能够降低背景信号，具有明显优势。因此，近期有研究投入到了开发signal-on的TF电化学传感器。然而这些方法仍然存在DNA链设计复杂、结合效率低等不足。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种特异性DNA假结结构修饰的金电极及其制备方法和对Nanog的定量检测。
为了达到解决上述问题的目的，本发明采用如下机理：DNA假结结构包含两个茎环结构(茎环1和2)，茎环1形成了茎环2的一部分。DNA假结结构序列为：ttttgaccgattatgtttag atcagttcat aatcggtctt tttttttttt ttctgatct。DNA假结结构3′端修饰了亚甲蓝氧化还原标签，5′端通过金-巯键修饰到电极表面(图1)。茎环1设计了Nanog结合序列。因为DNA假结结构具有相对刚性的结构，减少了氧化还原探针和电极的接触，信号背景将最小化。Nanog绑定后，由于Nanog分子相对较大，存在位阻效应，将打断茎环2，释放一个弹性的单链信号链，从而加强了电子传递效率，增加感应电流。
本发明的技术方案：
本发明所述一种特异性DNA假结结构修饰的金电极的表面通过金-巯键的作用自组装修饰有末端带亚甲蓝氧化还原标签、茎环1含Nanog结合序列的DNA假结结构，该DNA假结结构序列为：ttttgaccga ttatgtttag atcagttcat aatcggtctt ttttttttttttctgatct。
本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极的制备方法由以下步骤构成：(1)将金电极(3.0mm直径)浸泡于水虎鱼溶液(H2SO4:30％H2O2＝3:1)15分钟，以消除吸附的物质，并用超纯水漂洗；(2)分别用1μm和0.3μm的氧化铝打磨，并且依次在乙醇和超纯水中超声10分钟，用氮气吹干；(3)取水虎鱼溶液滴加到金电极表面反应5分钟，用超纯水冲洗干净，吹干；(4)将处理过的金电极置于0.5M H2SO4中，在0～1.6V电压范围内进行伏安扫描，扫速为100mV/s,直至达到稳定；(5)金电极用超纯水冲洗并吹干后，浸没在含DNA假结结构的电极修饰溶液中，室温下孵育1.5h，再浸没在1mM巯基乙醇溶液中1h，用超纯水冲洗，吹干，即得到DNA假结结构修饰的金电极。上述含DNA假结结构的电极修饰溶液为10mM Tris–HCl pH7.0的Tris–HCl中含有浓度为0.2μM的DNA假结结构、140mM NaCl,1mM MgCl2,5mM KCl和1mMTCEP。
本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极对转录因子Nanog的电化学检测方法，采用本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，具体步骤为：
(1)取Nanog加入到10mM Tris–HCl,140mM NaCl,1mM MgCl2,and 5mM KCl,1.0％Tween 20，pH 7.0的缓冲液中形成一系列含Nanog浓度在0～45nM范围内的反应体系；将工作电极***到该反应体系中，在37℃反应1h；
(2)将经步骤(1)处理的工作电极放置于10mM Tris–HCl,PH 7.0缓冲液中，利用三电极***，以方波伏安法(SWV)检测，并在5～25nM范围内，得到电流与Nanog浓度的线性关系曲线，其线性系数为0.99；
(3)利用步骤(2)所得标准曲线法对待测样进行分析检测，分析Nanog的含量。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明所述特异性DNA假结结构检测转录因子的金电极，其制作成本低廉、工艺简单、操作简易；
(2)本方法制备的电化学传感器能够成功检测转录因子Nanog，而且灵敏度、特异性高，具有很好的重复性；
(3)由于Nanog本身可以作为一种的检测靶标，用于细胞多能性分析、肿瘤耐药性及预后诊断，对疾病的临床检测提供技术支持，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明的方法原理图。
图2为不同浓度0～45nM Nanog存在情况下电化学信号的变化图。其中内嵌图为蛋白浓度在5～25nM范围内与电化学信号变化值之间的线性关系图。
图3修饰有DNA假结结构底物的金电极分别与空白、25nM血红蛋白、BSA、NF-κB、Nanog反应1h的电化学信号。
具体实施方式
实施例一：利用特异性DNA假结结构修饰的金电极检测不同浓度Nanog。
步骤一，将金电极(3.0mm直径)浸泡于水虎鱼溶液(H2SO4:30％H2O2＝3:1)15分钟，以消除吸附的物质，并用超纯水漂洗。接着，分别用1μm and 0.3μm的氧化铝打磨，并且依次在乙醇和超纯水中超声10分钟，用氮气吹干。然后取水虎鱼溶液滴加到金电极表面反应5分钟，用超纯水冲洗干净，吹干。
步骤二，将处理过的金电极置于0.5M H2SO4中，在0～1.6V电压范围内进行伏安扫描，扫速为100mV/s,直至达到稳定；金电极用超纯水冲洗并吹干后，浸没在含DNA假结结构的电极修饰溶液中，室温下孵育1.5h，再浸没在1mM巯基乙醇溶液中1h，用超纯水冲洗，吹干，即得到DNA假结结构修饰的金电极。
步骤三，取Nanog加入到10mM Tris–HCl,140mM NaCl,1mM MgCl2,and 5mM KCl,1.0％Tween 20，pH 7.0的缓冲液中形成一系列含Nanog浓度在0～45nM范围内(0nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、45nM)的反应体系；将工作电极***到该反应体系中，在37℃反应1h；将探针修饰的工作电极放置于10mM Tris–HCl,PH 7.0缓冲液中，利用三电极***，以方波伏安法(SWV)检测氧化还原电信号。
如图2所示，测得各溶液的峰电流随着Nanog浓度升高而升高，这是由于Nanog与DNA假结结构结合位点结合后，由于Nanog分子相对较大，绑定之后存在位阻效应，将打开茎环2，释放MB分子到电极表面，增强电信号。Nanog浓度在5–25nM与SWV峰值响应线性相关，最小检测范围是170pM，说明本发明的检测方法具有较高的灵敏性。
实施例二：生物传感器特异性研究。
为验证本发明检测Nanog的特异性，本发明用了不同的蛋白，如人血红蛋白,牛血清白蛋白(BSA)和转录因子NF-κB，按照实施例一的操作过程处理来验证该生物传感器的特异性。如图3所示，当没有Nanog或者用其他非特异蛋白替代时，则几乎没有峰值，只有当加入Nanog时，检测到明显峰信号。实验证实，此方法具有很好的特异性，本生物传感器检测具有高度选择性。

Claims (4)

1.一种特异性DNA假结结构修饰的金电极，其特征在于该电极的表面通过金-巯键的作用自组装修饰有末端带亚甲蓝氧化还原标签、茎环1含转录因子nanog结合序列的DNA假结结构，该DNA假结结构序列为：ttttgaccga ttatgtttag atcagttcat aatcggtctttttttttttt ttctgatct。
2.根据权利要求1所述一种特异性DNA假结结构修饰的金电极的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
(1)将直径3.0mm的金电极浸泡于H2SO4:30％H2O2＝3:1的水虎鱼溶液中15分钟，以消除吸附的物质，并用超纯水漂洗；
(2)分别用1μm和0.3μm的氧化铝打磨，并且依次在乙醇和超纯水中超声10分钟，用氮气吹干；
(3)取水虎鱼溶液滴加到金电极表面反应5分钟，用超纯水冲洗干净，吹干；
(4)将处理过的金电极置于0.5M H2SO4中，在0～1.6V电压范围内进行伏安扫描，扫速为100mV/s,直至达到稳定；
(5)金电极用超纯水冲洗并吹干后，浸没在含DNA假结结构的电极修饰溶液中，室温下孵育1.5h，再浸没在1mM巯基乙醇溶液中1h，用超纯水冲洗，吹干，即得到DNA假结结构修饰的金电极，上述含DNA假结结构的电极修饰溶液为10mM Tris–HCl pH 7.0的Tris–HCl中含有浓度为0.2μM的DNA假结结构、140mM NaCl,1mM MgCl2,5mM KCl和1mM TCEP。
3.一种特异性DNA假结结构修饰的金电极对转录因子Nanog的电化学检测方法，其特征是采用权利要求1所述的特异性DNA假结结构修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，具体检测步骤为：
(1)取Nanog加入到10mM Tris–HCl,140mM NaCl,1mM MgCl2,and 5mM KCl,1.0％Tween20，pH 7.0的缓冲液中形成一系列含Nanog浓度在0～45nM范围内的反应体系，将工作电极***到该反应体系中，在37℃反应1h；
(2)将经步骤(1)处理的工作电极放置于10mM Tris–HCl,PH 7.0缓冲液中，利用三电极***，以方波伏安法检测，并在5～25nM范围内，得到电流与Nanog浓度的线性关系曲线，其线性系数为0.99；
(3)利用步骤(2)所得标准曲线法对待测样进行分析检测，分析Nanog的含量。
4.权利要求1所述特异性DNA假结结构修饰的金电极在细胞多能性分析或肿瘤耐药性检测中的应用。
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