KR102594453B1

KR102594453B1 - 남성 불임을 위한 바이오센서

Info

Publication number: KR102594453B1
Application number: KR1020217008528A
Authority: KR
Inventors: 쿠샤그르 푸느야니; 수드하 스리바스타바; 모하마드 타크와
Original assignee: 스페르모센스 에이비
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2023-10-25
Also published as: JP7168265B2; EP3768825A1; MX2021002145A; EA202190166A1; DK3768825T3; AU2019325300B2; JP2021535366A; ES2889973T3; CN112639078A; SG11202100358VA; US20210325370A1; ZA202100472B; US11782052B2; PL3768825T3; CA3109529A1; WO2020039064A1; BR112021001488A2; KR20210049134A; US20220026413A1; AU2019325300A1

Abstract

본 발명은 정자 기능의 정량화를 위한 바이오센서 및 이의 응용에 관한 것이다. 남성 불임의 진단을 위한 방법 및 수단들은 또한 본원에 개시된다.

Description

남성 불임을 위한 바이오센서

본 발명은 정자 기능의 정량화 및 남성 생식력 평가를 위한 바이오센서 및 이의 응용에 관한 것이다.

전 세계 인구의 약 15%가 불임의 영향을 받으며, 여기서 남성 불임은 전체 사례의 20-70%에 기여하는 것으로 알려져 있다(Reprod Biol Endocrinol. 2015, 13:37). 또한 모든 남성의 2.5 - 12%가 불임인 것으로 추정된다. 감소하는 출산율과 유럽 내의 다른 남성 불임 관련 요인으로 인해, 상황은 놀랍다. 남성 불임의 치료는 정확한 진단에 의존하기 때문에, 근본적인 원인을 분석하고 발견하는 것이 중요하다. 해부학 및 내분비 분석외에도 남성 불임의 실험실적 진단에 대한 현재 동향은 정자 및 정액 특성에 걸쳐 있다(Mayo Clinic). 남성 불임 사례의 30-40%는 알려지지 않은 남성 불임 관련 요인과 관련이 있다(European Association of Urology, 2015). 이것은 특발성 남성 불임으로 알려져 있으며, 이를 치료하려면 상세한 기능 분석을 탐구해야한다.

또한, 보조생식기술 (Assisted Reproductive Technology (ART))은 이 장애물에 맞닥뜨리는 표준 치료 옵션이다. 2015년에 미국 내 모든 유아의 1.6%가 ART를 통해 임신되어졌다. 비록 2015년에만 미국 내에서 231,936 번의 ART주기가 수행되었지만 60,778 명의 출산이 발생했다 (Centers for Disease Control and Prevention, 2016). 2017년에, 유럽 인간 생식 및 발생 학회(European Society of Human Reproduction and Embryology)는 ART 랩에 대한 핵심 성과 지표로서 일반 체외 수정 (In Vitro Fertilization (IVF)) 이후 난자의 수정실패율(FFR)을 5%의 매우 낮은 역량 수준으로 확인하였다 (Human Reprod Open. 2017, 2). 정자 형태는 IVF 성공/실패와 관련될 수 없지만, 수정 실패는 정자 기능의 문제로 인한 것임을 주목하는 것이 중요하다 (Human Reprod. 2000, 15(3): 702; Fertil Steril. 2003 Jan;79(1):74). 따라서 IVF의 생존력을 예측하고 적절한 ART 방법을 더 잘 선택하기 위해 정자 세포의 수정 능력을 진단하는 강력한 방법의 개발에 대한 요구가 있다.

ART 전에, 일반적으로 남성 불임 관련 인자는 정자 품질 분석, 정자 수, 농도, 형태 및 운동성, 정액 내 비정형 세포 유형 식별, 자가 면역 항체의 존재를 조사하고 포함한다. 추가적인 분석은 정자 세포와 자궁 경부 점액의 상호 작용, 첨체 반응, 보조 성기 기능에 대한 생화학적 분석, 및 활성 산소 종 및 DNA 손상의 측정이 포함될 수 있다 (World Health Organization, 2010). 특발성 남성 불임 및 IVF에서 수정 실패의 경우, 이들 값은 불임의 근본 원인에 대한 많은 정보를 제공하지 않는다. 세포질내 직접 정자 주입술 (ICSI)에 의지하는 것이 가장 흔하게 선호되는 방법이지만, IVF의 불필요한 단계는 건강한 난모세포의 낭비와 재정적인 부담으로 이어진다.

정자 세포의 형태학적 및 운동학적 특성은 생체 내 또는 IVF 수정에 중요하지만, 수정의 궁극적인 단계는 정자 세포와 난자의 융합이다. 반투명대측정 (Hemizona Assay), 인간 정자-난모세포 상호 작용 테스트 및 인간 투명대(zona pellucida) 결합 테스트와 같은 연구 방법은 이 단계의 일부를 모방 할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 쉽게 구할 수 없는 인간 난모세포 또는 그 일부에 의존하기 때문에 상용화 될 수 없다. Zona-free 햄스터 난모세포 침투 테스트는 인간 난모세포 대신 햄스터 난모세포를 사용하기 위해 개발되었다. 이 검사는 인간 난모세포에 대한 필요를 무효화하지만, 수정 농도에 관계없이 IVF 치료에서 수정 성공에 대한 예측 값이 낮기 때문에 이 검사의 사용이 상당히 제한적이다.

두 배우자 간의 주요 결합은 난자를 둘러싼 투명대(Zona pellucida(ZP)) 당 단백질의 세포외 층에 의해 매개된다 (Cell. 2017, 169 (7) : 1315; Reprod Biomed Online. 2003, 7 (6) : 641). 이 상호 작용은 정자 세포에서 첨체 반응(acrosomal reaction)을 유발한다. 또한 ZP를 만나기 전에 첨체 반응을 시작하지 않은 정자 세포는 난자를 수정시킬 수 없다. 다음으로, 첨체에서 방출된 가수분해효소는 ZP를 소화하는데 필요하고, 그렇게 함으로써 정자가 난소 막으로 이동할 수 있다.

이 결합의 중요한 단계는 2014 년에 발견되었다. 정자 표면 항원 IZUMO1은 이전에 폴레이트 수용체 4로 알려진, 여성 상대의 JUNO 단백질에 결합한다 Nature. 508: 483-487; Nature. 2016, 534(7608):566). 이 생화학적 사건은 두 배우자의 융합에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 어떤 생화학적 불일치는 수정 실패로 이어질 수 있다.

따라서 JUNO 단백질에 결합할 수 있는 정액 샘플에서 정자 세포의 양을 정량화할 수 있는 것은 생식력 평가에 중요하다.

바이오센서는 미생물, 효소, 항체, DNA, 및 RNA 등과 같은 생물학적 물질의 분자 식별 기능을 활용하고 분자 식별 요소로 생물학적 물질을 적용하는 센서이다. 즉, 바이오센서는 고정화된 생물학적 물질이 표적 기질, 미생물의 호흡에 의해 소비되는 산소, 효소 반응, 발광 등을 식별할 때 발생하는 반응을 활용한다. 바이오 센서 중 효소 센서의 실용화가 진행되고 있다. 예를 들어 포도당, 젖산, 요산 및 아미노산용 효소 센서는 의료 기기 및 식품 가공 산업에서 응용을 찾는다.

예를 들어 전극에 결합된 단백질과 정자와 같은 표적 종 사이의 상호 작용을 추적하기 위해 다른 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술 중 하나는 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance(SPR))에 의존한다. SPR에서, 단백질과 같은 하나의 분자 파트너가 금속 (칩)에 고정된다. 빛은 금속의 표면 플라즈몬을 여기시키며(excites); 결합 파트너가 고정된 분자에 결합하면 표면 플라즈몬 신호에 감지 가능한 변화가 발생한다. 이러한 기술 중 또 다른 기술은 생물학적 이벤트를 전자 신호로 직접 변환하여 생물학적 샘플의 내용물 내의 전기 화학적 변환을 분석하는 것을 이용한다. 전기화학적 바이오 센싱에서 가장 일반적인 기술은 나노와이어 또는 자기 나노입자-기반 바이오센싱과 함께 순환 전압전류법(cyclic voltammetry), 시간 전류법(chronoamperometry), 시간 전위 측정법(chronopotentiometry), 임피던스 분광법(impedance spectroscopy) 및 전계 효과 트랜지스터 기반 방법(field-effect transistor based methods)을 포함한다.

본 발명자들은 정자 세포의 수정 가능성을 식별하기 위해 JUNO 단백질 및 정자 표면 항원 IZUMO1 사이의 생화학적 반응을 이용한다. 게다가 불임의 근본적인 원인을 밝히는 것 외에도, 이는 적절한 ATR 기술의 선택, 즉 일반적인 IVF 및 ICSI 사이의 선택에 유용할 것이며, 난자의 소모를 최소화할 것이다. 본 발명자들은 남성 불임 진단을 위해 정자 세포의 수정 가능성을 조사하는 전기화학적 및/또는 광학 감지 플랫폼(들)의 개발 및 임상적 검증을 추가로 제안한다. 남성 불임을 진단하고 정자의 질을 확인하는 기존의 통상적인 방법은 정자 세포의 물리적 측면을 살펴보는 반면에, 수정 사건에 필수적인 생화학적 상호작용을 간과한다. 제안된 방법은 정자 세포의 생체수용체를 활용한 최초의 남성 생식력 분석을 위한 생체모방 분석 (bioinspired assay) 이고, 정자 세포에 의한 수정의 중요한 단계를 모방하여 수정 가능성에 대한 직접적인 이해를 제공하기 때문에 기존에 존재하는 진단 방법에 비해 장점을 가진다. 이전에는, 정자-난자 상호작용 검사가 개발되었지만, 모두 쉽게 구할 수 없는 인간 난모세포 및 투명대의 사용이 필요하거나, 검사 결과와 다양한 정액 파라미터 사이의 낮은 상관관계로 인해 신뢰할 수 없다. 본 발명은 난모세포를 모방하는 조건을 생성하고 특히 정자-난모세포 융합에 관여하는 하나 이상의 중요한 단백질 수용체를 사용하여 난모세포 가용성(availability)의 문제를 극복한다.

본 발명의 일 측면은 기질(substrate) 및 JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 JUNO 단백질 또는 이의 단편이 기질에 고정된 정자 기능의 정량화를 위한 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 개시 내용의 추가 측면은 기질 및 JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 JUNO 단백질 또는 이의 단편이 기질에 고정된 정자 기능의 검출을 위한 바이오센서를 제공하는 것이다.

또한, 본 개시 내용의 한 측면은

a. 개체로부터 얻은 정액 샘플을 준비하는 단계로, 여기서 상기 정액 샘플은 하나 이상의 정자 세포를 포함하고,

b. 앞선 청구항들 중 어느 하나의 항에 따른 바이오센서를 상기 정액 샘플과 접촉시키는 단계,

c. 센서에 고정된 단백질에 대한 정자 세포의 결합을 결정하는 단계를 포함하며, 이를 통해 상기 샘플의 정자 기능을 검출(detecting) 및/또는 정량화(quantifying)하는, 정자 기능을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 개시 내용의 한 측면은

a. 개체로부터 얻은 정액 샘플을 준비하는 단계,

b. 정액 샘플을 본 개시 내용에 따른 바이오센서와 접촉시키는 단계,

c. 본 개시 내용의 방법에 따른 상기 샘플의 정자 기능을 정량화하는 단계,

d. 개체가 불임인지를 진단하기 위해 정자 기능을 사용하는 단계를 포함하는 남성 불임 진단 방법을 제공하는 것이다:

또한, 본 개시 내용의 한 측면은

a. 개체로부터 얻은 정자 샘플을 준비하는 단계,

b. 본 개시 내용에 따른 바이오센서와 정자 샘플을 접촉시키는 단계,

d. 개체가 불임인지를 진단하기 위해 정자 기능을 사용하는 단계를 포함하는 남성 불임 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 개시 내용의 한 측면은

a. 기질을 준비하는 단계,

b. JUNO 단백질을 준비하는 단계,

c. 기질에 JUNO 단백질을 고정하는 단계를 포함하여 JUNO 단백질을 포함하는 바이오센서를 제조하는, JUNO 단백질을 포함하는 바이오센서 제조 방법의 제공이다.

본 개시 내용의 추가 측면은

a. 개체로부터의 얻은 정액 샘플을 준비하는 단계로, 여기서 상기 정액 샘플은 하나 이상의 정자 세포를 포함하며,

b. 본 개시 내용에 따른 바이오센서와 정액 샘플을 접촉시키는 단계,

c. 현미경으로 바이오센서에 결합된 정자를 시각화하는 단계를 포함하여 상기 정자를 선택하는, 정자를 선택하는 방법을 제공하는 것이다.

본 개시 내용의 추가적인 측면은

a. 개체로부터 얻은 정자 샘플을 준비하는 단계,

b. 본 개시 내용에 따른 바이오센서를 정자 샘플과 접촉시키는 단계,

본 개시 내용의 또 다른 측면은,

a. 샘플 주입구;

b. JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 바이오센서로서, 여기서 JUNO 단백질이 바이오센서 상에 고정되고, 주입구가 샘플을 센서와 접촉시키도록 구성되는 것인 바이오센서;

c. 센서로부터 신호를 수신하여 사용자가 읽을 수 있는 형식으로 변환하도록 구성된 검출기;

d. 선택적으로 샘플에서 세포 성분을 분리하기 위한 수단을 포함하는, 정자 기능의 검출 및/또는 정량화를 위한 핸드-헬드(hand-held) 장치를 제공하는 것이다.

도 1은 a) 버퍼만 추가한 후 전극-금 나노입자 -BSA 블로킹 (실선) 및 버퍼에 1.67x10^-2X 희석 된 정액 샘플을 추가 한 후 전극-금 나노입자-BSA 블로킹(점선), b) 전극-금 나노입자-JUNO- BSA 블로킹 (대시(dash)점점선), 및 c) 버퍼에 1.67x10^-2X 희석 된 정액 샘플을 추가 한 후 전극-금 나노입자-ZP3-BSA 블로킹 반응(대시선)의 순환 전압전류법 반응(Cyclic voltammetric response)으로, 희석 계수는 초기 부피/최종 부피로 제공된다.
도 2는 세 가지 다른 희석액 (1.56x10^-5X (점선), 1.67x10^-2X (대시점점선) 및 2.5x10^-2X (대시선))의 6 개의 다른 정액 샘플의 추가 이후 전극-금 나노입자 -ZP3-BSA 블로킹의 순환 전압전류법 반응이며 (그림 2A-F), 실선은 버퍼만 있는 전극 반응을 보여준다 (정액 샘플 없음).
도 3은 세 가지 다른 희석액 (1.56x10^-5X (점선), 1.67x10^-2X (대시 점점선) 및 2.5x10^-2X (대시선))의 정액 샘플 S1, S2, S3, S4, S5 및 S6 을 추가 한 후 전극-금 나노입자-JUNO-BSA 블로킹의 순환 전압전류법 반응이며(각각 그림 3A-F), 실선은 버퍼만 있는 전극 반응을 보여준다 (정액 샘플 없음).

남성 불임을 평가하기 위한 정자 기능의 정량화를 위한 바이오센서 및 이의 응용이 본 명세서에 개시된다. 또한, 본 개시 내용은 개체로부터 수득된 샘플에서 정자 세포의 정자 기능을 결정하는 단계를 포함하는 개체에서 불임을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.

정자 기능

정자의 주요 기능은 난자와 융합하여 수정을 유도하여 두 개의 서브-세포 구조, (i) 유전 물질을 포함하는 남성 전핵(male pronucleus) 및 (ii) 미세관 세포골격(microtubule cytoskeleton)을 형성하는데 도움을 주는 구조인 중심소체(centrioles)를 전달하는 것이다. 따라서, 정자 기능은 난자에 도달하여 수정을 유도하는 정자의 능력으로 이해할 수 있다.

두 배우자 간의 1 차 결합은 난자를 둘러싼 투명대 (ZP) 당 단백질의 세포 외 층에 의해 매개된다 (Cell. 2017, 169 (7) : 1315; Reprod Biomed Online. 2003, 7 (6) : 641). 이 상호 작용은 정자 세포에서 첨체 반응을 유발한다. 또한 ZP를 만나기 전에 첨체 반응을 시작하지 않은 정자 세포는 난자를 수정시킬 수 없다. 다음으로, 첨체에서 방출된 가수분해효소는 ZP를 소화해야하는데, 그렇게 함으로써 정자가 난소 막으로 이동할 수 있다.

이 결합의 중요한 단계는 2014 년에 발견되었다. 정자 표면 항원 IZUMO1은 이전에 폴레이트 수용체 4로 알려진, 여성 상대의 JUNO 단백질에 결합한다 (Nature. 508: 483-487; Nature. 2016, 534(7608):566). 이 생화학적 사건은 두 배우자의 융합에 필수적인 것으로 밝혀졌다.

본 개시는 정자 기능의 정량화를 위한 바이오센서에 관한 것으로, 상기 바이오센서는 기질 및 JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 상기 JUNO 단백질 또는 이의 단편은 기질에 고정된다. 사실, JUNO 단백질을 포함하는 바이오센서에 정자 세포의 결합을 통해 정자 기능을 탐색하는 것은 실행 가능한 전략이 될 수 있으며 궁극적으로 인간 또는 동물 난모세포 또는 그 일부의 필요성을 극복하는 남성 불임 진단을 가능하게 할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서가 제공되며, 여기서 정자 기능은 센서에 고정된 단백질 또는 이의 단편에 정자의 적어도 일부의 결합으로부터 결정되며, 여기서 상기 단백질(들)은 JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3 및/또는 항 -IZUMO 항체 또는 이의 단편이다. 일부 실시 양태에서, 정자의 적어도 일부는 IZUMO1 표면 항원을 포함한다.

본 개시 내용의 한 측면은

b. 앞선 청구항들 중 하나의 항에 따른 바이오센서를 상기 정액 샘플과 접촉시키는 단계,

c. 센서에 고정된 단백질에 대한 정자 세포의 결합을 결정하는 단계를 포함하며, 이를 통해 상기 샘플의 정자 기능을 검출 및/또는 정량화하는, 정자 기능을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 개시 내용의 한 측면은

a. 개체로부터 얻은 정액 샘플을 준비하는 단계,

또한, 본 개시 내용의 한 측면은

a. 개체로부터 얻은 정자 샘플을 준비하는 단계,

본 명세서에서 사용되는 용어 "정자 기능(sperm function)"은 정자가 난자를 수용하고 수정하는 능력인 정자 건강을 의미한다. 정자 기능 검사는 정자 세포의 생화학적 또는 분자적 특성을 조사하는 진단 또는 연구 방법이다. 다음 참조에는 정자 기능 테스트의 몇 가지 예가 있다: Talwar and Hayatnagarkar 2015. J Hum Reprod Sci. 8(2): 61-69. 본 개시는 정자-난자 상호 작용 검사라고도하는 정자 기능 검사에 관한 것으로, 여기서 검사는 난모세포를 사용하는 대신에 정자-난자 융합에 관여하는 하나 이상의 중요한 단백질 수용체를 사용하여 정자-난자 상호 작용 조건을 모방한다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일 실시 양태에서, 정액 샘플은 하나 이상의 정자를 포함하거나 포함하는 것으로 의심된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일 실시 양태에서, 상기 샘플의 정자 기능은 센서에 고정된 단백질에 정자 세포의 결합을 결정하여 검출되며, 여기서 상기 단백질은 JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3 및/또는 항-IZUMO 항체, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되며 여기서 상기 결합은 현미경 분석, 전기 화학적 검출 및/또는 표면 플라즈몬 공명으로 검출된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일 실시 양태에서, 상기 샘플의 정자 기능은 센서에 고정된 단백질에 정자 세포의 결합을 결정하여 정량화되며, 여기서 상기 단백질은 JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3 및/또는 항-IZUMO 항체, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되며 여기서 상기 결합은 현미경 분석, 전기 화학적 검출 및/또는 표면 플라즈몬 공명으로 검출된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일 실시 양태에서, 상기 정자 기능은 현미경 분석에 의해 결합된 정자 대 비결합된 정자 세포의 백분율을 결정함으로써 단계 c)에서 정량화된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 한 실시 양태에서, 정자 기능은 전기 화학적 검출에 의해 결합된 정자 대 비결합된 정자 세포의 백분율을 결정함으로써 단계 c)에서 정량화된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 한 실시 양태에서, 정자 기능은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결합된 정자 대 비결합된 정자 세포의 백분율을 결정함으로써 단계 c)에서 정량화된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 한 실시 양태에서, 정자 기능은 현미경 분석에 의해 정액 샘플 및/또는 정자 샘플에서 정자 세포의 첨체 상태를 결정함으로써 단계 c)에서 정량화된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 한 실시 양태에서, 정자 기능은 전기 화학적 검출에 의해 정액 샘플 및/또는 정자 샘플에서 정자 세포의 첨체 상태를 결정함으로써 단계 c)에서 정량화된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 한 실시 양태에서, 정자 기능은 표면 플라즈몬 공명에 의해 정액 샘플 및/또는 정자 샘플에서 정자 세포의 첨체 상태를 결정함으로써 단계 c에서 정량화된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 한 실시 양태에서, 상기 방법은 결합된 정자 세포 대 비결합된 정자 세포의 백분율 및/또는 정자 세포의 첨체 상태를 각각의 참조값(reference values)과 비교하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 상기 참조값는 양성 참조값(기능성 정자를 나타냄) 및/또는 음성 참조값 (비-기능성 정자를 나타냄)일 수 있다. 상기 참조값는 대조 정액 샘플 및/또는 대조 정자 샘플을 테스트하여 얻을 수 있다. 상기 참조 값은 또한 과학 문헌에서 이용 가능한 데이터로부터 얻을 수 있다.

본 개시 내용의 방법에 따른 한 실시 양태에서, 샘플은 단계 b 전에 처리된다. 예를 들어, 정액 샘플 처리는 정자의 액화(liquefaction)를 포함 할 수 있다. 정액 샘플 처리는 선택적으로 수정능획득(capacitation)을 포함 할 수 있다. 정자 샘플 처리는 정자의 액화를 포함 할 수 있다. 정자 샘플 처리는 선택적으로 수정능획득을 포함 할 수 있다.

본 명세서에 개시된 바이오센서는 다양한 수준에서 정자 기능을 결정하는데 사용될 수있다.

예를 들어, 개시된 바이오센서는 정액 샘플 및/또는 정자 샘플에서 정자 세포가 투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 결합하는 능력을 결정하는 데 사용될 수 있다.

개시된 바이오센서는 정액 샘플 및/또는 정자 샘플에서 정자 세포가 첨체 반응을 겪는 능력을 결정하는 데 사용될 수 있다.

투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 결합하는 것은 정자 세포가 첨체 반응을 수행하기 위해 필요한 단계이다. 따라서 투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 결합할 수 없는 정자 세포는 첨체 반응을 겪지 않을 것이다.

정자 세포가 투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 결합할 수 있는지와 첨체 반응을 할 수 있는지를 결정하는 것은 보조 생식 기술을 사용할 수 있는지 확인하는데 중요하다. 특히, 투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 결합 할 수 없고/없거나 첨체 반응을 겪지 않는 정자 세포는 난자에서 투명대 코트가 제거 된 경우라면 IVF에 적합 할 수 있다.

개시된 바이오센서는 JUNO 단백질에 결합하는 정액 샘플 및/또는 정자 샘플에서 정자 세포의 능력을 결정하는데 사용될 수 있다.

정자 세포는 상기 정자 세포가 투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 결합 할 수 없고/없거나 첨체 반응을 겪지 않더라도 JUNO 단백질에 결합 할 수 있다. 이는 정자 세포가 수정능력을 갖도록 유도되어질 수 있고 난모세포의 세포막에 결합하는 데 필요한 표면 항원을 노출하도록 유도 될 수 있기 때문이다.

일부 실시 양태에서, 정자 기능은 고정된 JUNO 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 정자의 능력에 의해 결정된다. 상기 결합은 예를 들어 정자에 위치한 IZUMO1 단백질 또는 이의 단편을 통해 발생할 수 있다. 상기 결합은 예를 들어 정자에 의해 발현되는 IZUMO1 단백질 또는 이의 단편을 통해 발생할 수 있다.

실제로, 수정능력을 갖는 정자는 표면에 IZUMO1 단백질 또는 이의 단편을 나타낼 수 있으며, 상기 IZUMO1 단백질 또는 이의 단편은 난자 수용체 대응물, 예를 들어 JUNO 단백질 또는 이의 단편, 또는 항-IZUMO 항체 또는 이의 단편과 결합 할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 정자 기능은 IZUMO1 단백질 또는 이의 단편이 고정된 JUNO 단백질 또는 이의 단편에 결합함으로써 결정된다.

특정 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 방법은 상기 남성 불임을 치료하는 단계를 추가로 포함한다.

본 개시 내용에 따른 방법의 특정 실시 양태에서, 치료는 치료학적 유효량으로 및/또는 인공 생식 기술 (ART)에 의한 약제의 투여를 포함한다. 예를 들어, 정자 기능 저하 진단을 받은 개체는 자궁 내 수정 (IUI), 체외 수정 (IVF) 또는 세포질내 직접 정자 주입술 (ICSI)을 통한 IVF와 같은 ART의 도움으로 생식을 경험할 수 있다.

예를 들어, 정자 기능 감소 진단을 받은 개체, 특히

- 투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 대한 결합 능력 감소,

- 첨체 반응을 겪는 능력 감소;

- JUNO 단백질에 결합하는 정상적인 능력을 특징으로 하는 정자 세포를 갖는 것으로 진단된 개체는 IVF의 도움으로 생식을 경험할 수 있다.

예를 들어, 정자 기능 감소 진단을 받은 개체, 특히

- 투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 대한 결합 능력 감소,

- 첨체 반응을 겪는 능력 감소;

- JUNO 단백질 결합 능력 감소를 특징으로 하는 정자 세포를 갖는 것으로 진단된 개체는 ICSI를 수반한 IVF의 도움으로 생식을 경험할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "감소된 능력(reduced capability)" 및 "정상 능력(normal capability)"이라는 용어는 양성 대조군일 수 있는 참조값과 관련된다. 참조값은 가임 개체의 정액 샘플에 대한 평균값을 계산하여 얻을 수 있다. 참조값은 가임 개체의 정자 샘플에 대한 평균값을 계산하여 얻을 수 있다. 참조값은 과학 보고서에서도 얻을 수 있다. 따라서 감소된 정자 기능을 갖는 개체 및/또는 남성 불임을 진단하기 위해, 정액 샘플 및/또는 정자 샘플로부터 얻은 정자 세포의 상기 개체의 투명대 단백질 ZP1, ZP2 및/또는 ZP3에 결합하는 능력 및/또는 첨체 반응을 겪는 능력은 양성 대조군 및/또는 음성 대조군과 같은 적어도 하나의 참조값과 비교된다.

통상의 기술자에게 알려진 남성 불임을 위한 어떤 치료법이든 사용될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 정자 기능의 검출 및/또는 정량화를 위해 구성된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 한 실시 양태에서, 상기 정자 기능은 정액 샘플 및/또는 정자 샘플에서 정자 세포의 첨체 상태를 결정함으로써 단계 c)에서 정량화되며, 이는 첨체 반응성의 정도를 정자 기능의 척도로 옮긴다. 특정 실시 양태에서, 형광단이 샘플에 첨가되고, 이어서 SPR 또는 현미경으로 상기 샘플을 분석하여 정자 세포의 첨체 상태 (즉 정자 세포가 "첨체-반응적"인지)를 결정하는 단계가 이어진다. 일부 실시 양태에서, 상기 형광단은 상기 샘플을 기질과 접촉시킨 후에 만 바이오 센서의 주입구에 있는 샘플에 추가된다. 일부 실시 양태에서, 형광단은 첨체 반응이 발생한 후에 만 바이오센서의 주입구에 있는 샘플에 추가된다. 형광단의 존재는 정자 세포의 첨체 상태를 결정하는 단계를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어 Pisum sativum (pea agglutinin) 또는 Arachis hypogaea (peanut lectin), 또는 첨체 항원 CD46에 대한 단일클론 항체와 같은 형광 표지된 렉틴은 정자 세포의 첨체 상태를 평가하는데 이용될 수 있다. 첨체 반응을 감지하는 방법은 인간 정액의 검사 및 처리를 위한 WHO 실험실 매뉴얼, WHO, 5^th Edition, 2010, ISBN 978 92 4 154778 9 (특히 4장 참조)에서 찾을 수 있다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일부 실시 양태에서, 상기 정자 기능은 정액 샘플 및/또는 정자 샘플에서 정자 세포의 첨체 상태를 결정함으로써 단계 c)에서 정량화되며, 이는 첨체 반응성의 정도를 정자 기능의 척도로 해석하며, 여기서 상기 정액 샘플 및/또는 정자 샘플의 첨체 반응성은 불임 남성 개체로부터 수집된 정자의 평균 첨체 반응성과 비교되며, 여기서 기능성 정자는 가임 남성 개체로부터 수집된 정자의 평균 첨체 반응성과 동일하거나 더 큰 첨체 반응성을 가질 수 있다. 가임 남성 개체로부터 수집된 정자의 평균 첨체 반응성에 대한 데이터는 과학 문헌 및 임상 보고서에서 찾을 수 있다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일부 실시 양태에서, 정자 기능은 첨체 반응성의 정도를 정자 기능의 척도로 해석함으로써 단계 c)에서 정량화되며, 여기서 15% 이상의 첨체 반응성은 기능성 정자를 나타내는 것일 수 있다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일부 실시 양태에서, 정자 기능은 첨체 반응성의 정도를 정자 기능의 척도록 해석함으로써 단계 c)에서 정량화되며, 여기서 10% 이하의 첨체 반응성은 비-기능성 정자를 나타내는 것일 수 있다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일부 실시 양태에서, 정자 기능은 첨체 반응성의 정도를 정자 기능의 척도록 해석함으로써 단계 c)에서 정량화되며, 여기서 10 내지 15%의 첨체 반응성은 비정상적인 정자 기능을 나타내는 것일 수 있다.

첨체 반응(Acrosome reaction)

수정하는 동안, 정자는 먼저 원형질막과 융합해야하고 그 다음 수정을 위해 여성의 난자를 통과해야한다. 난자의 딱딱한 껍질이나 세포외 기질을 통한 통과 이전에, 정자는 첨체 반응으로 알려진 과정을 겪는다. 첨체 반응은 정자가 투명대에 결합한 후 발생하는 세포외유출 과정으로 정자가 난자 의복을 뚫고 난자와 융합되기 전에 일어나야한다. 첨체는 정자 머리의 앞쪽 절반에 걸쳐있는 캡-유사 구조이다. 첨체 반응을 개시하는데 필요한, 난자의 투명대로 정자가 접근함으로써, 첨체를 둘러싼 막이 정자의 머리의 원형질막과 융합되어 첨체의 내용물이 노출된다. 내용물에는 난자의 세포막에 결합하는데 필요한 표면 항원과 난자의 단단한 코팅을 뚫고 수정이 일어나도록 하는 많은 효소들이 포함된다. 예를 들어, 첨체의 내용물은 IZUMO1 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.

바이오센서

본 개시 내용의 일 측면은 기질 및 JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 JUNO 단백질 또는 이의 단편이 기질에 고정된 정자 기능의 정량화를 위한 바이오센서를 제공하는 것이다.

또한, 본 개시 내용의 일 측면은 기질 및 JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 JUNO 단백질 또는 이의 단편이 기질에 고정된 정자 기능의 검출을 위한 바이오센서를 제공하는 것이다.

일 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 센서이다. 본 개시 내용의 센서 또는 바이오센서는 정자 기능의 검출 및/또는 정량화를 위해 구성된다.

본 명세서에서 사용 된 "바이오센서"는 때때로 "센서"로 지칭된다. 리간드/리셉터 상호작용을 검출하기 위한 다양한 장치가 알려져 있다. 이들 중 가장 기본적인 것은 검출 가능한 반응 생성물을 측정하거나 정량화하여 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 순수한 화학적/효소적 분석이다. 리간드/리셉터 상호작용은 또한 방사성 표지 분석에 의해 검출되고 정량화 될 수 있다.

이 유형의 정량적 결합 분석에는 두 가지 개별 구성요소, 예를 들어, 고체상 테스트 스트립, 디쉬, 칩 또는 전극과 같은 반응 기질(reaction substrate); 그리고 섬광 계수기(scintillation counter), 분광 광도계(spectrophotometer), 현미경(microscope), 또는 당 업계에 알려진 임의의 다른 검출기와 같은 별도의 판독기(reader) 또는 검출기 장치(detector device);가 포함된다. 기질은 일반적으로 소량의 체액 샘플로부터 여러 분석물 분석을 처리하기 위해 다중 분석 또는 소형화에 적합하지 않다.

대조적으로, 바이오센서에서는 분석 기질과 검출기 표면이 단일 장치에 통합 될 수 있다. 한 가지 일반적인 유형의 바이오센서는 리간드-리셉터 결합 이벤트의 존재에 대한 응답으로 전류 또는 임피던스의 변화를 감지하기 위해 전류 또는 임피던스 측정 요소와 함께 전극 표면을 사용한다. 다른 유형의 바이오센서는 예를 들어 광학 검출기와 조합된, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명과 함께 조합된, 칩, 예를 들어 유리 칩을 사용할 수 있다. 다른 유형의 바이오센서는 현미경과 함께 조합된 디쉬를 사용할 수 있다. 추가 유형의 바이오센서는 예를 들어 라텍스 응집 테스트에 적합한, 광학적 또는 전기적 검출기와 조합된 마이크로비드를 사용할 수 있다. 추가 유형의 바이오 센서는 예를 들어 측면 흐름 테스트(lateral flow test)에 적합한 광학적 또는 전기적 검출기와 조합하여 셀룰로오스 또는 니트로셀룰로오스 페이퍼와 같은 중합체 기질을 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "디쉬(dish)"는 유리, 세라믹, 플라스틱, 셀룰로스, 니트로셀룰로스 또는 임의의 다른 재료로 만들어진 용기 또는 슬라이드를 지칭 할 수 있으며, 현미경 또는 거시적 광학 검출 및 선택을 위한 기질로 사용될 수있다. 예는 유리 슬라이드, 마이크로타이터 플레이트, 다중 웰 플레이트, 페트리 디쉬, 시계 유리(watchglasses) 등을 포함한다. 접시는 변형될 수 있는 물질로 만들어질 수 있으며, 예를 들어 금 층으로 코팅될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "마이크로비드"는 직경이 1mm 이하를 갖는 입자를 의미한다. 마이크로비드는 천연 또는 합성 고분자 재료로 만들어질 수 있다. 마이크로비드는 변형될 수 있는 표면을 갖는 것을 특징으로 하는 물질로 만들어 질 수 있으며, 예를 들어 금 나노입자와 같은 나노입자 및/또는 펩티드와 같은 분자에 접합될 수 있는 표면을 가질 수 있다.

바이오센서는 생물학적 요소를 포함하는 센서를 의미한다. 바이오센서는 지루하고 비용이 많이 들고 복잡하고 현장 감독에 적합하지 않을 수 있는 기존 분석 기술을 실질적으로 대체한다. 바이오센서는 변환기(transducer)로 생물학적 요소를 통합하는 화학적 분석 장치일 수 있다. 검출기로 추가로 전달되는 단일 분석물에 비례하는 신호를 생성하는 변환기 내부 또는 밀접한 접촉에 있는 생물학적 요소를 통합한다. 일부 실시 양태에서, 분석물의 결합으로부터 출력되는 신호는 현미경에 의해 시각화 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 분석물의 결합으로부터 출력되는 신호는 광학 검출기에 의해 시각화될 수 있다.

바이오센서는 바이오리셉터 (생물학적 요소), 변환기 및 전자 회로(electronic circuit)의 세 가지 기본 구성 요소를 포함한다. 바이오리셉터 또는 생물학적 요소는 효소, DNA, 단백질, 전체 세포, 항체 등과 같이 변환기에 내장된 생체 분자이다. 본 출원에서 바이오리셉터는 JUNO 단백질일 수 있다. 본 개시 내용의 일부 실시 양태에서, 바이오센서는 하나 이상의 유형의 바이오리셉터를 포함하고, 예를 들어 바이오 리셉터의 유형은 JUNO 단백질 또는 이의 단편일 수 있고, 다른 유형의 바이오 리셉터는 ZP1, ZP2, ZP3 및 항-IZUMO 항체로 이루어진 군으로부터 선택 될 수 있다.

본 개시 내용의 방법에 포함되는 검출기(detector)는 표면 플라즈몬 공명 검출기(surface plasmon resonance detector), 전기 화학적 검출기(electrochemical detectors) 및 측정 회로(measurement circuits)와 같은 광학 검출기이다. 전자 회로는 전기적 신호를 처리 가능한 신호로 변환하는 신호 처리 바이오 센서를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 검출기는 현미경일 수 있다.

표면 플라즈몬 공명 (SPR) 효과를 기반으로하는 바이오센서는 SPR 인터페이스에서 결합 이벤트와 같은 섭동(perturbations)과 함께 발생하는 SPR 표면 반사 각도의 변화를 활용한다. 마지막으로, 바이오센서는 바이오센서 표면에서 광학적 특성의 변화를 활용할 수도 있다.

전기 화학적 바이오센서는 일반적으로 전자 (산화 환원 효소)를 생성하거나 소비하는 반응의 효소 촉매 작용을 기반으로 한다. 센서 기질은 일반적으로 세 개의 전극인, 기준 전극(reference electrode), 작동 전극(working electrode) 및 상대 전극(counter electrode)을 포함한다. 표적 분석물은 활성 전극 표면에서 일어나는 반응에 관여하며, 반응은 이중층을 가로 질러 전자 이동 (전류 생성)을 유발하거나 이중층 전위에 기여할 수 있다(전압 생성). 양자 모두 전류가 측정될 수 있고, 전자의 흐름 속도는 고정 전위에서 분석물 농도에 비례하거나, 또는 제로 전류에서 전위(potential)가 측정될 수 있으며, 이것은 대수 반응(logarithmic response)을 제공한다. 또한 생체기능화된 이온에 민감한 전계-효과(field-effect) 트랜지스터를 사용하여 그들의 고유 전하를 통해 작은 펩타이드와 단백질의 라벨이 없고 직접적인 전기적 검출이 가능하다.

제로 전류(zero current)에서 전위가 생성되는 전위차 바이오센서(Potentiometric biosensor)는, 높은 동적 범위(high dynamic range)를 가진 대수 반응을 준다. 이러한 바이오센서는 종종 플라스틱 기질에 전극 패턴을 스크린 인쇄하고 전도성 고분자로 코팅한 다음 일부 단백질 (효소 또는 항체)을 부착하여 만들어진다. 전극이 두 개 뿐이며 매우 민감하고 견고하다. 이전에는 HPLC 및 LC/MS로만 달성할 수 있었던 수준에서 힘든 샘플 준비없이 분석 물질을 검출할 수 있다. 생물학적 센싱 구성요소가 관련 분석물에 대해 매우 선택적이기 때문에, 모든 바이오센서는 일반적으로 최소한의 샘플 준비만 포함한다. 신호는 센서 표면에서 발생하는 변화로 인해 전도성 고분자 층의 전기화학적 및 물리적 변화에 의해 생성된다. 이러한 변화는 이온 강도, pH, 수화 및 산화환원 반응에 기인할 수 있다. 게이트 영역이 효소 또는 항체로 개질된 전계 효과 트랜지스터 (FET)는, 분석 물질이 FET의 게이트 영역에 결합하여 드레인-소스 전류의 변화를 유발하므로 매우 낮은 농도의 다양한 분석 물질도 감지할 수 있다.

바이오센서는 별도의 반응 기질과 판독기 장치가 있는 결합 분석 시스템에 비해 많은 잠재적 이점이 있다. 한 가지 중요한 장점은 마이크로칩 제조방법을 사용하여 소규모이지만 재현성이 높은 바이오센서 유닛을 제조할 수 있다는 것이다.

다양한 유형의 바이오센서에 대한 많은 잠재적 응용이 있다. 연구 및 상업적 응용 측면에서 가치가 있는 바이오센서 접근 방식의 주요 요구 사항은 표적 분자의 식별, 적합한 생물학적 인식 요소의 가용성, 어떤 상황에서는 민감한 실험실 기반 기술보다 일회용 휴대 검출 시스템이 선호될 가능성이다.

일 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 투명대 1 (ZP1), 투명대 2 (ZP2), 투명대 3 (ZP3) 및/또는 항-IZUMO 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함하고, 여기서 ZP1, ZP2, ZP3, 및/또는 항-IZUMO 항체 또는 이의 단편이 기질 상에 고정된다.

일 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 단백질 JUNO 및 ZP3을 포함하고, 여기서 상기 단백질은 기질 상에 고정된다.

일 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 단백질 JUNO 및 ZP2를 포함하고, 여기서 상기 단백질은 기질 상에 고정된다.

일 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오 센서는 단백질 JUNO 및 ZP1을 포함하고, 여기서 상기 단백질은 기질 상에 고정된다.

일 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 단백질 JUNO 및 항-IZUMO 항체를 포함하고, 여기서 상기 단백질은 기질 상에 고정된다.

일 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 단백질 JUNO, ZP2 및 ZP3을 포함하고, 여기서 상기 단백질은 기질 상에 고정된다.

ZP1, ZP2, ZP3 및 항-IZUMO 항체 중 하나 이상과 조합된 JUNO의 존재는 바이오센서의 특이성을 개선할 수 있고 분석된 정액 샘플 및/또는 분석된 정자 샘플의 정자 기능의 더욱 정확한 결정을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, ZP1, ZP2, ZP3 및 항-IZUMO 항체 중 하나 이상과 조합된 JUNO의 존재는 정자가 투명대 단백질에 결합하고, 첨체 반응을 겪고, 난모세포에 결합하는 능력을 보다 정확하게 결정할 수 있게 한다.

한 실시 양태에서, 기질에 고정 될 수 있는 단백질 JUNO, ZP1, ZP2 및 ZP3은 포유류 단백질이다. 예를 들어, 단백질 JUNO, ZP1, ZP2 및 ZP3은 인간 단백질 또는 이의 단편 일 수 있다. 예를 들어, 단백질 JUNO, ZP1, ZP2 및 ZP3은 말 단백질 또는 이의 단편 일 수 있다. 예를 들어, 단백질 JUNO, ZP1, ZP2 및 ZP3은 개 단백질 또는 이의 단편 일 수 있다. 예를 들어, 단백질 JUNO, ZP1, ZP2 및 ZP3은 소 단백질 또는 이의 단편 일 수 있다.

추가 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 서열번호 1 또는 이의 상동체(orthologue), 또는 상기 단백질의 단편(fragment)에 적어도 95% 서열 상동성(sequence identity)을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 적어도 96% 서열 상동성, 예컨대 적어도 97 % 서열 상동성, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성, 예컨대 적어도 99% 서열 상동성 엔티티(entity), 예컨대 약 100% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나 폴리펩티드로 이루어진 JUNO 단백질을 포함한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서가 제공되며, 여기서 ZP1은 서열번호 2 또는 이의 상동체, 또는 상기 단백질의 단편에 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 적어도 96% 서열 상동성, 예컨대 적어도 97 % 서열 상동성, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성, 예컨대 적어도 99% 서열 상동성 엔티티, 예컨대 약 100% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나 폴리펩티드로 이루어진다.

추가 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서가 제공되며, 여기서 ZP2는 서열번호 3 또는 이의 상동체, 또는 상기 단백질의 단편에 적어도 95 % 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 적어도 96 % 서열 상동성, 예컨대 적어도 97 % 서열 상동성, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성, 예컨대 적어도 99% 서열 상동성 실체, 예컨대 약 100% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나 폴리펩티드로 이루어진다.

추가 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오 센서가 제공되며, 여기서 ZP3은 서열번호 4 또는 이의 상동체, 또는 상기 단백질의 단편에 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 적어도 96% 서열 상동성, 예컨대 적어도 97 % 서열 상동성, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성, 예컨대 적어도 99% 서열 상동성 실체, 예컨대 약 100% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나 폴리펩티드로 이루어진다.

일부 실시 양태에서, JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3, 및 항-IZUMO 항체 중 적어도 하나는 추가적인 모이어티에 연결된다. 예를 들어, 상기 추가적인 모이어티는 펩타이드 또는 표지(label)일 수 있다. 예를 들어, UNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3, 및 항-IZUMO 항체 중 적어도 하나는 폴리히스티딘-태그에 연결된다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서가 제공되고, 여기서 상기 기질은 마이크로비드(microbeads), 디쉬(dish), 칩(chip) 또는 전극(electrode)이다.

일 실시 양태에서, 상기 기질은 마이크로비드이다. 예를 들어, 상기 기질은 아가로스, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 또는 라텍스 마이크로비드일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 마이크로비드는 현미경, 광학 변환기, 또는 측정 회로에 결합될 수 있도록 구성된다.

일 실시 양태에서, 상기 기질은 플라스틱 디쉬, 세라믹 디쉬, 또는 유리 디쉬같은 디쉬이다. 추가 실시 양태에서, 상기 디쉬는 현미경 또는 광학 변환기에 결합될 수 있도록 구성된다.

일부 실시 양태에서, 상기 칩은 유리 칩이다.

본원에 사용 된 용어 "유리"는 SiO₂의 전체 화학 공식을 갖는 연속 프레임 워크에 실리콘 및 산소 원자를 포함하는 석영 또는 실리카와 동등하다.

특정 실시 양태에서, 전극은 탄소, 금 또는 백금 전극이다. 한 실시 양태에서, 전극은 스크린 인쇄된 전극이다.

일부 실시 양태에서, 기질은 변형된 표면을 갖는다. 일 실시 양태에서, 적어도 하나의 표면은 금 층으로 코팅된다. 일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 기질의 표면은 금, 은, 산화구리, 그래핀, 산화철 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 나노입자로 변형된다.

특정 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 기질이 현미경, 전기 화학 워크스테이션, 표면 플라즈몬 공명 검출기, 측정 회로 또는 광학 변환기에 결합될 수 있도록 구성된다.

일 실시 양태에서, 기질은 전극이고 전기 화학 워크 스테이션 또는 측정 회로에 결합 될 수 있도록 구성된다.

일 실시 양태에서, 기질은 칩이고 표면 플라즈몬 공명 검출기에 결합될 수 있도록 구성된다.

단백질의 고정

본 개시 내용은 바이오 센서에 관한 것이다.

정자 기능의 검출 및 정량화를 위해, 상기 바이오센서는 기질과 기질에 고정 된 JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.

센서 표면 (금속, 폴리머 또는 유리 등)에 관심있는 단백질과 같은 생물학적 요소를 고정하는 것은 바이오센서 설계에서 필수적이고 중요한 단계이다. 사용되는 기질에 따라 상이한 고정화 기술이 존재하며, 이러한 기술은 당업자에게 알려져있다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오 센서가 제공되며, 여기서 JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3 및 항-IZUMO 항체 중 적어도 하나가 추가 모이어티에 접합된다. 일부 실시 양태에서, 추가 모이어티는 펩타이드이다. 한 실시 양태에서, 추가 모이어티는 표지이다.

일부 실시 양태에서, 추가 모이어티는 펩타이드, 예를 들어 폴리히스티딘 태그 (His- 태그)이다.

일부 실시 양태에서, 추가 모이어티는 형광 태그 또는 프로브라고도하는 표지이다.

폴리히스티딘-태그는 예를 들어 금, 니켈 또는 코발트 코팅된 미세역가 플레이트 또는 단백질 어레이와 같은 금속 표면 같은 표면상의 단백질 고정화에 성공적으로 사용될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 제공되며, 여기서 JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3 및/또는 항-IZUMO 항체가 기질 상에 고정된다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 바이오센서는 제공되며, 여기서 JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3 및/또는 항-IZUMO 항체가 나노입자를 통해, 예를 들어 금 나노입자를 통해 기질 상에 고정된다. 기질과 단백질 사이에 나노입자가 존재하는 것은 단백질의 언폴딩(unfolding)을 방지하고 단백질이 올바른 형태를 유지하는 데 도움이되므로 유리하다.

방법

본 개시 내용의 한 측면은 본 명세서에 개시된 바이오 센서와 같은 JUNO 단백질을 포함하는 바이오 센서를 제조하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은

a. 기질을 준비하는 단계,

b. JUNO 단백질을 준비하는 단계,

c. JUNO 단백질을 기질에 고정화시키는 단계를 포함하며,

이로 인해 JUNO 단백질을 포함하는 바이오센서를 제조한다.

일부 실시 양태에서, 바이오센서를 제조하는 방법은 하나 이상의 ZP1, ZP2, ZP3 및 항-IZUMO 항체를 기질에 고정화하는 단계를 더 포함한다.

정자를 선택하는 방법을 제공하는 것이 본 개시 내용의 추가 측면이며, 상기 방법은

a. 개체로부터 얻은 정액 샘플을 준비하는 단계,

c. 현미경으로 바이오센서에 결합된 정자를 시각화하는 단계, 및

d. 바이오센서에 결합된 정자를 선택하는 단계를 포함한다.

a. 개체로부터 얻은 정자 샘플을 준비하는 단계,

c. 현미경으로 바이오센서에 결합된 정자를 시각화하는 단계,

d. 바이오센서에 결합된 정자를 선택하는 단계를 포함한다.

본 개시 방법에 따른 한 실시 양태에서, 정액 샘플은 하나 이상의 정자 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심된다.

가정용 기기

또한, 정자 기능의 검출 및/또는 정량화를 위한 핸드-헬드 장치를 제공하는 것이 본 개시 내용의 측면이며, 상기 장치는

a. 샘플 주입구;

b. JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 바이오센서로서, 여기서 상기 JUNO 단백질이 바이오센서 상에 고정되고, 여기서 주입구가 샘플이 센서와 접촉되도록 위치되도록 구성되며;

d. 선택적으로 샘플에서 세포 성분을 분리하기 위한 수단을 포함한다.

특정 실시 양태에서, 본 개시 내용에 따른 핸드-헬드 장치는 본 개시 내용의 실시 양태 중 임의의 하나에서 정의 된 바와 같은 바이오센서를 포함한다.

개체 (Subjects)

본 개시 내용에 따른 방법이 개시의 한 측면으로 제공되며, 여기서 상기 개체는 인간 개체이다. 특정 실시 양태에서, 상기 인간 개체는 어린이 또는 성인이다.

본 개시 내용에 따른 방법의 추가 실시 양태에서, 개체는 포유 동물이다. 본 개시 내용에 따른 방법의 추가 실시 양태에서, 개체는 말, 소, 버팔로, 양, 돼지, 염소, 고양이 또는 개이다.

본 개시 내용의 일부 실시 양태에서, 개체는 말이고, 바이오센서는 기질에 고정 된 JUNO 단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 JUNO 단백질은 서열번호 6의 말 JUNO 단백질에 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 서열을 가지며, 상기 서열번호 6의 말 JUNO 단백질에 예컨대 적어도 96% 서열 상동성, 예컨대 적어도 97% 서열 상동성, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성, 예컨대 적어도 99% 서열 상동성, 예컨대 약 100% 서열 상동성을 갖는다.

본 개시 내용의 일부 실시 양태에서, 개체는 개이고, 바이오센서는 기질상에 고정된 JUNO 단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 JUNO 단백질은 개 JUNO 단백질이다.

본 개시 내용의 일부 실시 양태에서, 대상체는 소이고, 바이오센서는 기질 상에 고정된 JUNO 단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 JUNO 단백질은 소 JUNO 단백질이다.

샘플(Sample)

본 개시 내용에 따른 방법의 특정 실시 양태에서, 샘플은 정액 샘플이고, 선택적으로 샘플은 분석 전에 처리되어진다.

본 개시 내용에 따른 방법의 특정 실시 양태에서, 샘플은 정자 샘플이고, 선택적으로 샘플은 분석 전에 처리된다.

본 개시 내용의 방법에 따른 일 실시 양태에서, 상기 정액 샘플 및/또는 정자 샘플을 하나 이상의 정자 세포를 포함하거나, 포함하는 것으로 의심된다.

일부 실시 양태에서, 정액 샘플은 분석 전에 처리되고 상기 처리는 정자의 액화를 포함한다.

정액 샘플은 정자 샘플 및 정액 액체(seminal fluid)와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 정액 샘플 및/또는 정자 샘플은 정자를 포함할 수 있는 정액 액체의 샘플로 정의된다. 정액 샘플은 추가로 본 개시 내용의 구체적인 실시 양태에서 정액/정자 샘플의 처리에 적합한 용매, 배지, 버퍼, 및/또는 유체, 예를 들어 희석물의 사용에 의해 희석되는 것과 같이 처리될 수 있다.

정액은 생식선(성선)과 수컷 또는 자웅동체 동물의 다른 생식 기관에 의해 분비되며 암컷 난자를 수정시킬 수 있다. 인간에서, 정액 액체는 장자외에 몇 가지 성분을 포함한다: 과당 뿐만 아니라 단백질 분해 효소 및 다른 효소들은 정자의 생존을 촉진하고 이동 또는 "수영"을 할 수 있는 매개체를 제공하는 정액 액체의 구성요소들이다. 정액은 골반에 위치한 정낭에서 생성되고 발생한다.

용어 "정자"는 남성 생식 세포를 지칭하는 것으로 사용되고, "정자 세포"와 동의어이다. 운동성이 있는 단편모성 정자 세포는 정자로 하고, 반면에 비운동성 정자 세포는 부동 정자(spermatium)라 한다. 본 개시 내용에서, 용어 "정자(sperm)" 및 "정자(spermatozoa)"는 상호교환적으로 사용된다.

탐지 기술(Detection technologies)

본 개시 내용에 따른 방법의 일부 실시 양태에서, 상기 정자 기능은 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 검출된다. 특정 실시 양태에서, 표면 플라즈몬 공명 판독은 하나 이상의 갑상선 호르몬의 농도를 결정하는데 사용된다.

표면 플라즈몬 공명은 입사광에 의해 자극된 음의 유전율(permittivity) 물질과 양의 유전율 물질 사이의 계면에서 전도 전자의 공명 진동(resonant oscillation)이다. SPR은 평면 금속 (금 또는 은과 같은) 표면 또는 금속 나노입자 표면의 물질 흡착을 측정하기 위한 많은 표준 수단들의 기본이다. 이것은 많은 색상 기반 바이오 센서 응용, 다양한 센서 및 규조류 광합성의 기본 원리이다. SPR은 생체 분자 결합 상호 작용을 감지하는 데 사용될 수 있다. SPR에서, 단백질과 같은 하나의 분자 파트너는 금속 필름에 고정된다. 빛은 금속의 표면 플라즈몬을 여기시키며(excites); 결합 파트너가 고정된 분자에 결합하면 이것은 표면 플라즈몬 신호에 감지 가능한 변화를 야기한다.

본 개시 내용에 따른 방법의 일부 실시 양태에서, 정자 기능은 전기 화학적 변환에 의해 검출 또는 정량화된다.

전기 화학적 변환을 사용하는 바이오센서라고도 하는 전기 화학적 바이오센서는 생물학적 이벤트를 전자 신호로 직접 변환하기 때문에 생물학적 샘플의 함량을 분석하는 매력적인 수단을 제공한다. 전기 화학적 바이오센싱에서 가장 일반적인 기술은 나노와이어 또는 자기 나노입자-기반 바이오센싱과 함께 순환 전압전류법(cyclic voltammetry), 시간 전류법(chronoamperometry), 시간 전위 측정법(chronopotentiometry), 임피던스 분광법(impedance spectroscopy) 및 전계 효과 트랜지스터 기반 방법(field-effect transistor based methods)을 포함한다. 전기 화학적 검출과 결합하는 유용한 추가 측정 기술은 전기화학적 버전의 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 광 도파관 광 모드 분광법(optical waveguide lightmode spectroscopy), 타원 측정법(ellipsometry), 석영 결정 마이크로 밸런스(quartz crystal microbalance) 및 스캐닝 프로브 현미경(scanning probe microscopy)을 추가로 포함 할 수 있다.

남성 불임(Male infertility)

남성 불임은 남성이 가임 여성에서 임신을 유발할 수 없음을 의미한다. 인간의 경우 불임의 40-50 %를 차지한다. 모든 남성의 약 7%에 영향을 미친다. 남성 불임은 일반적으로 정액의 부족으로 인한 것이며, 정액의 질은 남성 생식력의 대리 척도로 사용된다.

남성 불임은 남성 개인이 가임 여성 개인에게 임신을 유발할 수 없는 것으로 정의된다. 남성 불임의 원인은 기능이 없는 정자의 생산 일 수 있다.

남성 불임의 진단은 기능 테스트의 배터리, 예를 들어 여기에 개시된 정자 기능 테스트 중 하나에 기반 할 수 있다. 테스트는 업계의 통상의 기술자에게 알려진 가이드라인에 따라 측정될 수 있으며, 예를 들어 인간 정액의 검사 및 처리를 위한 WHO 실험실 매뉴얼(WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen), WHO, 5^th Edition, 2010, ISBN 978 92 4 154778 9 (특히 4 장 참조)에 설명된 바와 같이 측정할 수 있다.

서열

실시예들

실시예1. 순환 전압전류법을 이용한 정자 결합용 전기 화학적 바이오센서

바이오센서는 스크린 인쇄된 금 전극에서 제작되었다. 간단히 말해서, 10μL의 2 mg/mL 시스테아민 하이드로클로라이드를 금 전극에 첨가하고 실온에서 암실에서 건조시켰다. 전극을 탈이온수로 세척 한 다음 10μL의 시트레이트로 덮힌 금 나노입자로 변형하였다. 탈이온수로 건조 및 세척한 후, 10μL의 50 mM 니트릴로트리아세트산을 첨가하고 실온에서 밤새 배양하였다. 이어서 pH 7.4에서 0.01 M 인산염 완충 식염수 중 1 % 소 혈청 알부민으로 블로킹하였다. 10μL의 10mM 황산 니켈을 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 배양 하였다. pH 7.4에서 0.01 M 인산염 완충 식염수로 전극을 세척 한 후, 0.5μg의 폴리히스티딘 태그를 포함하는 JUNO 또는 ZP3을 바이오 센서에 고정시켰다.

정액 샘플을 표준 절차에 따라 액화시키고 정액 준비 배지 (#1070/1069, Origio A/S Denmark, https://origio.marketport.net/MarketingZone/MZDirect/Source/510e96f4-075b-4684-9a99-d472c1e3d31b )에서 다른 희석물로 희석하도록 허용했다. 바이오센서를 전기 화학 스테이션에 연결하고, 희석된 정액 샘플을 바이오센서에 추가하고, 고정된 단백질과 정액 샘플에 존재하는 정자 간의 상호 작용에 대한 순환 전압전류 반응을 기록했다.

결과는 도 1 내지 도 3에서 보여주며, 여기서 도 1은 a) 버퍼만 첨가한 후 전극-금 나노입자-BSA 블로킹 (실선) 및 버퍼에 1.67x10^-2X 희석된 정액 샘플을 첨가한 후 전극-금 나노입자-BSA 블로킹 (점선), b) 전극-금 나노입자-JUNO-BSA 블로킹 (대시(dash)점점선) 및 c) 버퍼에 1.67x10^-2X 희석된 정액 샘플을 추가한 후 전극-금 나노입자-ZP3-BSA 블로킹 (대시선)의 순환 전압전류법 반응(Cyclic voltammetric response)을 보여주며, 희석 계수는 초기 부피/최종 부피로 제공된다.

도 2는 세 가지 다른 희석액 (1.56x10^-5X (점선), 1.67x10^-2X (대시(dash)점점선) 및 2.5x10^-2X (점선))의 6 개의 다른 정액 샘플을 추가 한 후, 전극-금 나노입자-ZP3-BSA 블로킹의 순환 전압전류 반응을 보여주며(도 2A-F), 실선은 버퍼만 사용한 전극 반응을 보여준다 (정액 샘플 없음).

도 3은 세 가지 다른 희석액 (1.56x10^-5X (점선), 1.67x10^-2X (대시(dash)점점선) 및 2.5x10^-2X (점선))의 정액 샘플 S1, S2, S3, S4, S5 및 S6 (각각 도 3A-F)의 추가 후, 전극-금 나노입자-JUNO-BSA 블로킹의 순환 전압전류 반응을 보여주며, 반면에 실선은 완충액만 사용한 전극 반응을 보여준다 (정액 샘플 없음).

결론:

도 1에서 보듯이 정자는 JUNO 또는 ZP3가 고정되지 않은 상태에서 바이오센서에 결합하지 않는다. JUNO 또는 ZP3의 존재에서 정자는 바이오센서와 상호작용한은데, 이는 순환 전압 전류 곡선에서 뚜렷한 환원 및/또는 산화 피크로 보아 분명하다. 또한, 결합은 순환 전압 전류 법을 사용하여 정량화 할 수 있다. ZP3- 정자 및 JUNO-정자 상호 작용 모두에 대해, 환원 및 산화 피크는 각각 도 2 및 도 3에서 보여지는 것과 같이, ZP3 및 JUNO와의 결합에 사용할 수 있는 정자의 수와 일치하는 추세로 이동한다. 또한, 음성 대조군에 대해서 아무 가치가 없고(null) 및 0이 아닌 정자 농도 사이에 신호가 변화하지 않고 유지되기 때문에, 즉 결합 단백질이 없기 때문에, 프로브된 상호작용은 단백질 특이적이다.

실시예 2. 전기 임피던스 분광법을 사용하여 분석한 정자 결합용 전기 화학적 바이오센서

스크린 인쇄된 금 전극은 10μl의 2mg/ml 시스테아민 하이드로클로라이드 (CyHCl)를 통해 기능화되고 실온에서 2-4 시간 동안 어두운 곳에서 배양된다. 탈 이온수로 전극을 세척한 후, 5μl의 Asn-AuNP를 기능화된 전극에 분배한다. 전극을 실온에서 5 시간 동안 배양한 다음 탈이온수로 세척한다. 5μl PB (10mM, pH 7.4)에 5μl의 160μg/ml JUNO 및 160μg/ml ZP3를 추가하고 4 °C에서 밤새 배양한다. 마지막으로 전극은 4 °C에서 5 시간 동안 PBS에서 10μl의 1% BSA로 차단한다.

변형된 전극은 전기 화학 워크 스테이션에 연결된다.

5-50 uL의 전처리 된 정액 샘플을 작동 전극에 추가하거나 전극을 샘플 바이알에 담근다. 정자 세포를 변형된 전극에 1-10 분 동안 결합시킨 다음, 탈 이온수로 세척한다. 결합은 적절한 농도의 산화 환원 매개체의 존재하에 전기 임피던스 분광법을 통해 분석된다.

유사한 실험은 JUNO 단독, ZP2 및 ZP2, ZP3, JUNO의 조합을 사용하여 수행된다.

이 실시예와 다음의 모든 실시예에서 정액 샘플은 다음 절차에 따라 분석 전에 전처리 (액화)된다:

- 실험실이나 클리닉에서 채취한 정액 샘플은 실온에서 액화하거나 37 °C 인큐베이터에서 15-60 분 동안 액화한다. 이것은 이질적으로(heterogeneously) 액화된 정액 샘플을 방지하기 위해 부드러운 회전 또는 교반에 의해 도움받을 수 있다.

- 이 액화 정액 샘플은 적절한 정액 준비 배지로 세척, 재구성 또는 희석 될 수 있다.

결론:

JUNO 또는 JUNO와 ZP2 및 ZP3 중 하나 또는 이들의 조합으로 기능화되고 변형된 스크린 인쇄된 금 전극을 포함하는 센서를 사용하여 전기 화학 워크 스테이션을 통해 정자 기능을 감지하고 정량화 할 수 있다.

실시예 3. 첨체 반응을 위한 전기 화학적 바이오 센서

스크린 인쇄된 금 전극은 10μl의 2mg/ml 시스테아민 하이드로클로라이드 (CyHCl)를 통해 기능화되고 실온에서 2-4 시간 동안 어두운 곳에서 배양된다. 탈이온수로 전극을 세척 한 후, 5μl의 Asn-AuNP를 기능화된 전극에 분배한다. 전극을 실온에서 5 시간 동안 배양한 다음 탈이온수로 세척한다. 5μl PB (10mM, pH 7.4)에 5μl의 160μg/ml JUNO 및 160μg/ml ZP3를 추가하고 4 °C에서 밤새 배양한다. 마지막으로 전극은 4 °C에서 5 시간 동안 PBS에서 10μl의 1% BSA로 차단된다.

변형된 전극은 전기 화학 워크 스테이션에 연결된다.

5-50 uL의 전처리 된 정액 샘플을 작동 전극에 추가하거나 전극을 샘플 바이알에 담근다. 정자 세포는 변형된 전극에 결합할 수 있으며 결합은 전기 임피던스 분광법 또는 전류 측정법을 통해 전기 화학적으로 분석된다.

ZP2와 JUNO, ZP3, ZP2의 조합을 사용하여 유사한 실험이 수행된다.

결론:

JUNO 또는 JUNO와 ZP2 및 ZP3 중 하나 또는 이들의 조합으로 기능화되고 변형된 스크린 인쇄된 금 전극을 포함하는 센서를 사용하여 전기 화학 워크 스테이션을 통해 정자 기능을 감지하고 정량화할 수 있다.

실시예 4. 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 통한 검출/정자 기능의 정량화

SPR 칩은 ZP2, ZP3 및 JUNO 중 하나 또는 이들의 조합으로 화학적으로 기능화되고 변형된다. 그런 다음 칩을 탈이온수로 세척하고 코팅되지 않은 영역을 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단한다. 칩은 SPR 검출기와 함께 사용된다. 전처리된 정액 샘플의 흐름이 칩 표면 위에 놓인다. 단백질 코트와 정자 세포 사이의 상호 작용은 결합 역학 및 친화성 측면에서 질량 변화로 분석된다. 따라서 정자 기능이 탐지되고 정량화된다.

결론:

SPR 칩을 포함하는 센서는 화학적으로 기능화되고 ZP2, ZP3 및 JUNO 중 하나로 변형되거나 이들의 조합을 사용하여 SPR 검출기를 통해 정자 기능을 검출하고 정량화 할 수 있다.

실시예 5. 광학 변환기를 통한 정자 결합의 검출/정량

유리 디쉬의 전체 또는 일부는 먼저 AuNP로 화학적 기능화되고 변형된 다음 ZP2, ZP3 및 JUNO 중 하나 또는 이들의 조합으로 변형된다. 디쉬를 탈이온수로 세척하고 코팅되지 않은 부분은 BSA로 차단한다. 전처리된 정액 샘플 한 방울을 코팅 된 영역에 추가하고 명시야(bright field) 또는 암시야(dark field) 현미경과 같은 광학 변환기 하에서 결합을 위해 시각화한다. 따라서 정자 기능이 탐지되고 정량화된다.

결론:

ZP2 및 ZP3 중 어느 하나 또는 이들의 조합이 AuNPs 또는 AuNPs로 변형된 유리 또는 플라스틱 디쉬와 결합된 것을 포함하는 센서를 사용하여 광학 변환기를 통해 정자 기능을 감지하고 정량화 할 수 있다.

실시예 6. 광학 변환기를 통한 첨체 반응의 검출/정량

전처리된 정액 샘플은 이전에 AuNP와 결합된 ZP2 및 ZP3 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 배양된다. 정자는 5-60 분 동안 단백질과 상호 작용하도록 허용한 다음, 원심 분리를 통해 세척한다. 정자는 플루오레세인이소티오시안산염(FITC)으로 표지된 피솜사티부아글루틴(PSA) (PSA-FITC)와 첨체 반응을 위해 염색한 다음, 형광 현미경 또는 유세포 분석기와 같은 광학 변환기로 시각화한다(http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/44261/9789241547789_eng.pdf;jsessionid=2EF9F9030760BB60B84C83708999AF64?sequence=1 의 섹션 4.4.1 참조.). 따라서 정자 기능이 탐지되고 정량화된다.

대안적으로, 전처리 된 정액 샘플은 이전에 AuNP 개질된 유리 또는 플라스틱 디쉬와 결합된 ZP2 및 ZP3 중 어느 하나 또는 이들의 조합과 함께 5-60 분 동안 배양된다. 정자를 표면에서 제거한 다음 PSA-FITC와의 첨체 반응을 위해 염색한 다음 형광 현미경 또는 유세포 분석기와 같은 광학 변환기로 시각화한다. 따라서 정자 기능이 탐지되고 정량화된다.

대안적으로, 전처리된 정액 샘플은 이전에 AuNP 개질된 유리 또는 플라스틱 디쉬와 결합된 ZP2 및 ZP3 중 어느 하나 또는 이들의 조합과 함께 5-60 분 동안 배양된다. 정자는 제자리에서(in situ) 또는 기질에서 제거된 후 항-CD46 항체로 표지되어 첨체 반응을 겪은 정자를 검출한다. 검출은 형광 현미경 또는 유세포 분석기와 같은 광학 변환기를 통해 수행된다. 따라서 정자 기능이 탐지되고 정량화된다.

결론:

AuNPs 또는 AuNPs 개질된 유리 또는 플라스틱 디쉬와 결합된 ZP2, ZP3 및 JUNO 중 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 센서를 사용하여 광학 변환기를 통해 정자 기능을 검출하고 정량화 할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Spermosens AB <120> Biosensor for Male Infertility <130> P4957PC00 <150> EP 18190720.5 <151> 2018-08-24 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Cys Trp Trp Pro Leu Leu Leu Glu Leu Trp Thr Val Met Pro 1 5 10 15 Thr Trp Ala Gly Asp Glu Leu Leu Asn Ile Cys Met Asn Ala Lys His 20 25 30 His Lys Arg Val Pro Ser Pro Glu Asp Lys Leu Tyr Glu Glu Cys Ile 35 40 45 Pro Trp Lys Asp Asn Ala Cys Cys Thr Leu Thr Thr Ser Trp Glu Ala 50 55 60 His Leu Asp Val Ser Pro Leu Tyr Asn Phe Ser Leu Phe His Cys Gly 65 70 75 80 Leu Leu Met Pro Gly Cys Arg Lys His Phe Ile Gln Ala Ile Cys Phe 85 90 95 Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Pro Val Gly Ser 100 105 110 Leu Gly Trp Glu Val Ala Pro Ser Gly Gln Gly Glu Arg Val Val Asn 115 120 125 Val Pro Leu Cys Gln Glu Asp Cys Glu Glu Trp Trp Glu Asp Cys Arg 130 135 140 Met Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp Arg Gly Gly Trp Asp Trp Ser 145 150 155 160 Gln Gly Lys Asn Arg Cys Pro Lys 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Ser Gly Leu Glu Thr Cys Ser Thr 530 535 540 Ala Cys Ser Thr Gly Thr Thr Arg Gln Arg Arg Ser Ser Gly His Arg 545 550 555 560 Asn Asp Thr Ala Arg Pro Gln Asp Ile Val Ser Ser Pro Gly Pro Val 565 570 575 Gly Phe Glu Asp Ser Tyr Gly Gln Glu Pro Thr Leu Gly Pro Thr Asp 580 585 590 Ser Asn Gly Asn Ser Ser Leu Arg Pro Leu Leu Trp Ala Val Leu Leu 595 600 605 Leu Pro Ala Val Ala Leu Val Leu Gly Phe Gly Val Phe Val Gly Leu 610 615 620 Ser Gln Thr Trp Ala Gln Lys Leu Trp Glu Ser Asn Arg Gln 625 630 635 <210> 3 <211> 745 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Cys Arg Gln Arg Gly Gly Ser Trp Ser Pro Ser Gly Trp Phe 1 5 10 15 Asn Ala Gly Trp Ser Thr Tyr Arg Ser Ile Ser Leu Phe Phe Ala Leu 20 25 30 Val Thr Ser Gly Asn Ser Ile Asp Val Ser Gln Leu Val Asn Pro Ala 35 40 45 Phe Pro Gly Thr Val Thr Cys Asp Glu Arg Glu Ile Thr Val Glu Phe 50 55 60 Pro Ser Ser Pro Gly Thr Lys Lys Trp His Ala Ser Val Val Asp Pro 65 70 75 80 Leu Gly Leu Asp Met Pro Asn Cys Thr Tyr Ile Leu Asp Pro Glu Lys 85 90 95 Leu Thr Leu Arg Ala Thr Tyr Asp Asn Cys Thr Arg Arg Val His Gly 100 105 110 Gly His Gln Met Thr Ile Arg Val Met Asn Asn Ser Ala Ala Leu Arg 115 120 125 His Gly Ala Val Met Tyr Gln Phe Phe Cys Pro Ala Met Gln Val Glu 130 135 140 Glu Thr Gln Gly Leu Ser Ala Ser Thr Ile Cys Gln Lys Asp Phe Met 145 150 155 160 Ser Phe Ser Leu Pro Arg Val Phe Ser Gly Leu Ala Asp Asp Ser Lys 165 170 175 Gly Thr Lys Val Gln Met Gly Trp Ser Ile Glu Val Gly Asp Gly Ala 180 185 190 Arg Ala Lys Thr Leu Thr Leu Pro Glu Ala Met Lys Glu Gly Phe Ser 195 200 205 Leu Leu Ile Asp Asn His Arg Met Thr Phe His Val Pro Phe Asn Ala 210 215 220 Thr Gly Val Thr His Tyr Val Gln Gly Asn Ser His Leu Tyr Met Val 225 230 235 240 Ser Leu Lys Leu Thr Phe Ile Ser Pro Gly Gln Lys Val Ile Phe Ser 245 250 255 Ser Gln Ala Ile Cys Ala Pro Asp Pro Val Thr Cys Asn Ala Thr His 260 265 270 Met Thr Leu Thr Ile Pro Glu Phe Pro Gly Lys Leu Lys Ser Val Ser 275 280 285 Phe Glu Asn Gln Asn Ile Asp Val Ser Gln Leu His Asp Asn Gly Ile 290 295 300 Asp Leu Glu Ala Thr Asn Gly Met Lys Leu His Phe Ser Lys Thr Leu 305 310 315 320 Leu Lys Thr Lys Leu Ser Glu Lys Cys Leu Leu His Gln Phe Tyr Leu 325 330 335 Ala Ser Leu Lys Leu Thr Phe Leu Leu Arg Pro Glu Thr Val Ser Met 340 345 350 Val Ile Tyr Pro Glu Cys Leu Cys Glu Ser Pro Val Ser Ile Val Thr 355 360 365 Gly Glu Leu Cys Thr Gln Asp Gly Phe Met Asp Val Glu Val Tyr Ser 370 375 380 Tyr Gln Thr Gln Pro Ala Leu Asp Leu Gly Thr Leu Arg Val Gly Asn 385 390 395 400 Ser Ser Cys Gln Pro Val Phe Glu Ala Gln Ser Gln Gly Leu Val Arg 405 410 415 Phe His Ile Pro Leu Asn Gly Cys Gly Thr Arg Tyr Lys Phe Glu Asp 420 425 430 Asp Lys Val Val Tyr Glu Asn Glu Ile His Ala Leu Trp Thr Asp Phe 435 440 445 Pro Pro Ser Lys Ile Ser Arg Asp Ser Glu Phe Arg Met Thr Val Lys 450 455 460 Cys Ser Tyr Ser Arg Asn Asp Met Leu Leu Asn Ile Asn Val Glu Ser 465 470 475 480 Leu Thr Pro Pro Val Ala Ser Val Lys Leu Gly Pro Phe Thr Leu Ile 485 490 495 Leu Gln Ser Tyr Pro Asp Asn Ser Tyr Gln Gln Pro Tyr Gly Glu Asn 500 505 510 Glu Tyr Pro Leu Val Arg Phe Leu Arg Gln Pro Ile Tyr Met Glu Val 515 520 525 Arg Val Leu Asn Arg Asp Asp Pro Asn Ile Lys Leu Val Leu Asp Asp 530 535 540 Cys Trp Ala Thr Ser Thr Met Asp Pro Asp Ser Phe Pro Gln Trp Asn 545 550 555 560 Val Val Val Asp Gly Cys Ala Tyr Asp Leu Asp Asn Tyr Gln Thr Thr 565 570 575 Phe His Pro Val Gly Ser Ser Val Thr His Pro Asp His Tyr Gln Arg 580 585 590 Phe Asp Met Lys Ala Phe Ala Phe Val Ser Glu Ala His Val Leu Ser 595 600 605 Ser Leu Val Tyr Phe His Cys Ser Ala Leu Ile Cys Asn Arg Leu Ser 610 615 620 Pro Asp Ser Pro Leu Cys Ser Val Thr Cys Pro Val Ser Ser Arg His 625 630 635 640 Arg Arg Ala Thr Gly Ala Thr Glu Ala Glu Lys Met Thr Val Ser Leu 645 650 655 Pro Gly Pro Ile Leu Leu Leu Ser Asp Asp Ser Ser Phe Arg Gly Val 660 665 670 Gly Ser Ser Asp Leu Lys Ala Ser Gly Ser Ser Gly Glu Lys Ser Arg 675 680 685 Ser Glu Thr Gly Glu Glu Val Gly Ser Arg Gly Ala Met Asp Thr Lys 690 695 700 Gly His Lys Thr Ala Gly Asp Val Gly Ser Lys Ala Val Ala Ala Val 705 710 715 720 Ala Ala Phe Ala Gly Val Val Ala Thr Leu Gly Phe Ile Tyr Tyr Leu 725 730 735 Tyr Glu Lys Arg Thr Val Ser Asn His 740 745 <210> 4 <211> 424 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Leu Ser Tyr Arg Leu Phe Ile Cys Leu Leu Leu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Thr Glu Leu Cys Tyr Pro Gln Pro Leu Trp Leu Leu Gln Gly Gly Ala 20 25 30 Ser His Pro Glu Thr Ser Val Gln Pro Val Leu Val Glu Cys Gln Glu 35 40 45 Ala Thr Leu Met Val Met Val Ser Lys Asp Leu Phe Gly Thr Gly Lys 50 55 60 Leu Ile Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu Gly Pro Glu Ala Cys Glu Pro 65 70 75 80 Leu Val Ser Met Asp Thr Glu Asp Val Val Arg Phe Glu Val Gly Leu 85 90 95 His Glu Cys Gly Asn Ser Met Gln Val Thr Asp Asp Ala Leu Val Tyr 100 105 110 Ser Thr Phe Leu Leu His Asp Pro Arg Pro Val Gly Asn Leu Ser Ile 115 120 125 Val Arg Thr Asn Arg Ala Glu Ile Pro Ile Glu Cys Arg Tyr Pro Arg 130 135 140 Gln Gly Asn Val Ser Ser Gln Ala Ile Leu Pro Thr Trp Leu Pro Phe 145 150 155 160 Arg Thr Thr Val Phe Ser Glu Glu Lys Leu Thr Phe Ser Leu Arg Leu 165 170 175 Met Glu Glu Asn Trp Asn Ala Glu Lys Arg Ser Pro Thr Phe His Leu 180 185 190 Gly Asp Ala Ala His Leu Gln Ala Glu Ile His Thr Gly Ser His Val 195 200 205 Pro Leu Arg Leu Phe Val Asp His Cys Val Ala Thr Pro Thr Pro Asp 210 215 220 Gln Asn Ala Ser Pro Tyr His Thr Ile Val Asp Phe His Gly Cys Leu 225 230 235 240 Val Asp Gly Leu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Phe Lys Val Pro Arg Pro 245 250 255 Gly Pro Asp Thr Leu Gln Phe Thr Val Asp Val Phe His Phe Ala Asn 260 265 270 Asp Ser Arg Asn Met Ile Tyr Ile Thr Cys His Leu Lys Val Thr Leu 275 280 285 Ala Glu Gln Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Ala Cys Ser Phe Ser Lys 290 295 300 Pro Ser Asn Ser Trp Phe Pro Val Glu Gly Ser Ala Asp Ile Cys Gln 305 310 315 320 Cys Cys Asn Lys Gly Asp Cys Gly Thr Pro Ser His Ser Arg Arg Gln 325 330 335 Pro His Val Met Ser Gln Trp Ser Arg Ser Ala Ser Arg Asn Arg Arg 340 345 350 His Val Thr Glu Glu Ala Asp Val Thr Val Gly Pro Leu Ile Phe Leu 355 360 365 Asp Arg Arg Gly Asp His Glu Val Glu Gln Trp Ala Leu Pro Ser Asp 370 375 380 Thr Ser Val Val Leu Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Val Val Ser Leu 385 390 395 400 Thr Leu Thr Ala Val Ile Leu Val Leu Thr Arg Arg Cys Arg Thr Ala 405 410 415 Ser His Pro Val Ser Ala Ser Glu 420 <210> 5 <211> 350 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gly Pro His Phe Thr Leu Leu Cys Ala Ala Leu Ala Gly Cys Leu 1 5 10 15 Leu Pro Ala Glu Gly Cys Val Ile Cys Asp Pro Ser Val Val Leu Ala 20 25 30 Leu Lys Ser Leu Glu Lys Asp Tyr Leu Pro Gly His Leu Asp Ala Lys 35 40 45 His His Lys Ala Met Met Glu Arg Val Glu Asn Ala Val Lys Asp Phe 50 55 60 Gln Glu Leu Ser Leu Asn Glu Asp Ala Tyr Met Gly Val Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Thr Leu Gln Lys Gly Ser Trp Ser Leu Leu Lys Asp Leu Lys Arg 85 90 95 Ile Thr Asp Ser Asp Val Lys Gly Asp Leu Phe Val Lys Glu Leu Phe 100 105 110 Trp Met Leu His Leu Gln Lys Glu Thr Phe Ala Thr Tyr Val Ala Arg 115 120 125 Phe Gln Lys Glu Ala Tyr Cys Pro Asn Lys Cys Gly Val Met Leu Gln 130 135 140 Thr Leu Ile Trp Cys Lys Asn Cys Lys Lys Glu Val His Ala Cys Arg 145 150 155 160 Lys Ser Tyr Asp Cys Gly Glu Arg Asn Val Glu Val Pro Gln Met Glu 165 170 175 Asp Met Ile Leu Asp Cys Glu Leu Asn Trp His Gln Ala Ser Glu Gly 180 185 190 Leu Thr Asp Tyr Ser Phe Tyr Arg Val Trp Gly Asn Asn Thr Glu Thr 195 200 205 Leu Val Ser Lys Gly Lys Glu Ala Thr Leu Thr Lys Pro Met Val Gly 210 215 220 Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Arg Cys Glu Leu Gly Ser Val Asn Ser 225 230 235 240 Ser Pro Ala Thr Ile Ile Asn Phe His Val Thr Val Leu Pro Lys Met 245 250 255 Ile Lys Glu Glu Lys Pro Ser Pro Asn Ile Val Thr Pro Gly Glu Ala 260 265 270 Thr Thr Glu Ser Ser Ile Ser Leu Gln Pro Leu Gln Pro Glu Lys Met 275 280 285 Leu Ala Ser Arg Leu Leu Gly Leu Leu Ile Cys Gly Ser Leu Ala Leu 290 295 300 Ile Thr Gly Leu Thr Phe Ala Ile Phe Arg Arg Arg Lys Val Ile Asp 305 310 315 320 Phe Ile Lys Ser Ser Leu Phe Gly Leu Gly Ser Gly Ala Ala Glu Gln 325 330 335 Thr Gln Val Pro Lys Glu Lys Ala Thr Asp Ser Arg Gln Gln 340 345 350

Claims

정자 결합 기능의 검출 또는 정량화를 위한 바이오센서로, 상기 바이오센서는 기질 및 JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하며, 여기서 상기 단편은 정자 또는 IZUMO1에 결합할 수 있으며, 여기서 상기 JUNO 단백질 또는 상기 단편은 기질에 고정되고, 여기서 기질은 디쉬, 마이크로비드, 또는 전극이고, 여기서 상기 바이오센서는 기질에 고정된 단백질에 정자 세포의 결합을 결정하도록 구성된 바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 투명대 1 (ZP1), 투명대 2 (ZP2), 투명대 3 (ZP3) 또는 항-IZUMO 항체 또는 이의 단편을 더 포함하며, 여기서 상기 단편은 정자 또는 IZUMO1에 결합할 수 있으며, 여기서 상기 ZP1, ZP2, ZP3, 또는 항-IZUMO 항체 또는 이의 단편은 기질에 고정된 바이오센서.
제2항에 있어서, 여기서 JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3, 및 항-IZUMO 항체 중 적어도 하나는 펩티드 및 표지(label)로 이루어진 군으로부터 선택된 추가적인 모이어티에 결합되거나, 또는
상기 정자 결합 기능은 기질에 고정된 단백질에 상기 정자세포의 적어도 일부의 결합으로 결정되며, 여기서 상기 단백질은 JUNO 단백질, ZP1, ZP2, ZP3 또는 항-IZUMO 항체, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 단편은 정자 또는 IZUMO1에 결합할 수 있는,
바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 기질은 디쉬이며 여기서 상기 디쉬는 현미경 또는 광학 변환기에 결합될 수 있도록 구성되거나, 또는
상기 기질은 마이크로비드이고, 여기서 상기 마이크로비드는 현미경, 광학 변환기, 또는 측정 회로에 결합될 수 있도록 구성되거나, 또는
상기 기질은 전극이고 여기서 상기 전극은 전기 화학적 워크 스테이션 또는 측정 회로에 결합될 수 있도록 구성된, 바이오센서.
a. 개체로부터 얻은 정액 샘플을 준비하는 단계로, 여기서 상기 정액 샘플은 하나 이상의 정자 세포를 포함하고,
b. 제1항에 따른 바이오센서를 상기 정액 샘플과 접촉시키는 단계,
c. 기질에 고정된 단백질에 대한 정자 세포의 결합을 결정하는 단계를 포함하며,
이를 통해 상기 샘플의 정자 결합 기능을 검출 또는 정량화하는, 정자 결합 기능을 검출 또는 정량화하는 방법.
a. 개체로부터 얻은 정액 샘플을 준비하는 단계,
b. 제1항에 따른 바이오센서와 상기 정액 샘플을 접촉시키는 단계, 및
c. 제5항의 방법에 따른 상기 샘플의 정자 결합 기능을 정량화하는 단계를 포함하는 남성 불임 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 여기서 상기 샘플의 정자 결합 기능은 현미경 분석 또는 전기화학적 검출에 의해 결합된 정자 세포 대 비결합된 정자 세포의 백분율을 결정함으로써 정량화하거나; 또는
상기 샘플의 정자 결합 기능은 현미경 분석 또는 전기화학적 검출에 의해 정액 샘플 내의 정자 세포의 첨체(acrosomal) 상태를 결정함으로써 정량화되는, 남성 불임 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
a. 개체로부터 얻은 정액 샘플을 준비하는 단계로, 여기서 상기 정액 샘플은 하나 이상의 정자 세포를 포함하며,
b. 제1항에 따른 바이오센서와 정액 샘플을 접촉시키는 단계,
c. 현미경으로 바이오센서에 결합된 정자 세포를 시각화하는 단계, 및
d. 바이오센서에 결합된 적어도 하나의 정자 세포를 선택하는 단계를 포함하는 정자를 선택하는 방법.
a. 디쉬, 마이크로비드 또는 전극인 기질을 준비하는 단계,
b. JUNO 단백질을 준비하는 단계, 및
c. 기질에 JUNO 단백질을 고정하는 단계,
d. 기질에 고정된 단백질에 정자 세포의 결합을 결정하기 위한 수단을 준비하는 단계, 및
e. 선택적으로(optionally) ZP1, ZP2, ZP3 및 항-IZUMO 항체 중 하나 이상을 기질 상에 고정화하는 단계를 포함하며,
이를 통해 JUNO 단백질을 포함하는 바이오센서를 제조하는 방법으로,
제1항에 따른 JUNO 단백질을 포함하는 바이오센서를 제조하는 방법.
a. 샘플 주입구;
b. JUNO 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 바이오센서로, 여기서 상기 단편은 정자 또는 IZUMO1에 결합할 수 있으며, 여기서 상기 JUNO 단백질이 기질 상에 고정되고, 여기서 기질은 디쉬, 마이크로비드 또는 전극이고, 여기서 상기 바이오센서는 기질에 고정된 단백질에 정자 세포의 결합을 결정하기 위해 구성되며, 여기서 상기 주입구가 샘플을 기질과 접촉시키도록 구성되며;
c. 기질로부터 신호를 수신하여 사용자가 읽을 수 있는 형식으로 변환하도록 구성된 검출기; 및
d. 선택적으로 샘플에서 세포 성분을 분리하기 위한 수단을 포함하는, 정자 결합 기능의 검출 또는 정량화를 위한 핸드-헬드(hand-held) 장치.
제5항에 있어서, 상기 샘플의 정자 결합 기능은 현미경 분석 또는 전기화학적 검출에 의해, 결합된 정자 세포 대 비결합된 정자 세포의 백분율을 결정함으로써 정량화되거나; 또는 상기 샘플의 정자 결합 기능은 현미경 분석 또는 전기화학적 검출에 의해 정액 샘플에서 정자 세포의 첨체(acrosomal) 상태를 결정함으로써 정량화되는, 정자 결합 기능을 검출 또는 정량화하는 방법.
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