CN101148645A - 深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种深层与浅层偶联静态发酵高纤椰果的生产方法，该方法是在发酵培养基中接入木醋杆菌，进行深层静态发酵；当发酵液湿菌体浓度达到2.0～3.0g/L时，将发酵液分装到经过灭菌处理的浅层容器中，浅层容器的装液高度根据高纤椰果产品规格而定，在浅层容器中继续进行浅层静态发酵，可获得符合凝胶膜厚度要求的高纤椰果。本发明提供的高纤椰果生产方法，使高纤椰果浅层发酵周期缩短20～40％，可提高浅层发酵设备的生产效率，同时有利于降低浅层发酵过程中的杂菌污染率，应用于大规模工业生产中可产生巨大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法。
背景技术
醋酸菌在以椰子水为主要原料的培养液中静态发酵，液体表面形成富含纤维素的凝胶膜状物称为高纤椰果，英文名称为“nata de coco”。高纤椰果富含细菌纤维素，具有很高的持水性和弹性，口感爽滑，咀嚼性好，可作为一种优良的高纤维食品，具有减肥、清肠胃、防便秘等保健功能，在中国、日本、菲律宾和印度尼西亚等国家十分畅销。高纤椰果原产于菲律宾，现在东南亚各国均有生产，而我国海南省已有高纤椰果生产厂家近100家。
高纤椰果生产是产膜醋酸菌好氧发酵生产细菌纤维素的过程，国内外许多研究人员已对其发酵条件进行了大量研究。研究表明，在高纤椰果发酵过程中，气流与搅拌都会影响细菌纤维素凝胶膜的完整性。采用深层液体动态发酵(通气或搅拌等)，发酵液中易形成絮状菌团，深层发酵阶段的终点不易确定，且分装发酵浅盘时各盘菌体浓度不均匀，从而导致各发酵盘的发酵时间差别较大，难以应用于工业化生产。为了获取高相对分子量纤维素的椰果产品，并使凝胶膜完整而不分层，宜采用浅盘进行浅层液体静态发酵进行生产。但是，浅盘液体发酵存在发酵条件不易控制，占地面积大，单位面积厂房产能低，且现有浅盘发酵法的发酵周期较长，容易污染杂菌等缺点。缩短浅层液体静态发酵周期、提高发酵效率和防止杂菌污染等仍是高纤椰果发酵生产中急需解决的关键问题。
发明内容
针对现有高纤椰果发酵生产中存在浅层液体静态发酵周期长等问题，本发明的目的在于提供一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，该方法缩短了浅层液体静态发酵周期，提高单位面积厂房的发酵效率，并降低杂菌污染机会。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，包括如下步骤：
(1)深层静态发酵
将发酵培养基经过加热灭菌并冷却至28～32℃后，接入木醋杆菌，所述木醋杆菌接种量为0.025～10.0％(体积百分比)，在发酵罐中进行深层静态发酵，在发酵过程中，在发酵液面的空间连续通入无菌空气，并控制发酵温度为28～32℃，深层静态发酵终点为发酵液的湿菌体浓度达到2.0～3.0g/L。
(2)浅层静态发酵
将步骤(1)中得到的湿菌体浓度为2.0～3.0g/L的发酵液分装到经过灭菌处理的浅层容器中，进行浅层静态发酵，发酵过程中控制温度26～34℃，浅层容器中的凝胶膜厚度达到产品规格厚度(厚度为3～24mm)时结束发酵，即得到高纤椰果。
为了更好地实现本发明，步骤(1)中发酵培养基中包括椰子水(椰子破壳取水)，所述椰子水的体积百分比为20～100％；所述发酵培养基配制时需调节pH为3.5～5.5。
步骤(1)中无菌空气的通入量为(0.01×发酵容积)L/min以上，连续通入无菌空气使发酵罐内压力达到0.01～0.02MPa(表压)，以防杂菌污染。
步骤(1)深层静态发酵时间为84～132h，具体时间与接种量、终点湿菌体浓度有关。
步骤(2)中湿菌体浓度采用离心称重法测定：在100mL发酵液中加入0.1g纤维素酶(＞15υ/mg)，恒温50℃振荡2h，充分水解后，补充蒸馏水，使体积至100mL，得到水解液，然后将10mL水解液于4000r/min离心20min，对沉淀物进行称重，并计算出沉淀物浓度G1(g/L)；同时，称取0.1g纤维素酶(＞15υ/mg)加到100mL蒸馏水中，经振荡使其混合均匀，以同样方法测定出沉淀物浓度G2(g/L)；最后，可计算出湿菌体浓度为(G1-G2)(g/L)。
步骤(2)中浅层容器的装液高度为30mm以下，具体装液高度需根据产品规格而定。特别优选，步骤(2)中浅层静态发酵时间40～192h，则浅层容器中的凝胶膜厚度达到产品规格厚度，具体时间需根据产品规格而定，凝胶膜厚度愈大，浅层静态发酵周期愈长。
根据发酵罐具有占地面积小、发酵条件易控制、不易污染杂菌等优点，本发明巧妙地将发酵罐与浅层容器结合起来，采用了深层液体静态发酵和浅层液体静态发酵的偶联工艺进行生产高纤椰果。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明与深层液体动态发酵(通气或搅拌等)相比，本发明在发酵罐深层发酵阶段采用静态发酵工艺，解决了在动态发酵存在的问题，其发酵终点为发酵液的湿菌体浓度达到2.0～3.0g/L，且发酵过程中不需往发酵液中通气和搅拌，能耗低，操作简单。
(2)本发明与现有浅层静态发酵法相比，当浅层容器与装液高度相同时，本发明中浅层静态发酵的初始菌体浓度较大，且细胞已经处于代谢细菌纤维素阶段，在浅层静态发酵阶段形成凝胶膜的时间较早，因而生成同样厚度凝胶膜的发酵周期较短，其浅层静态发酵周期缩短了20～40％(不同规格产品缩短幅度不同)；浅层静态发酵周期缩短幅度显著，使浅层静态发酵设备的利用率大幅度提高，可显著提高单位空间发酵房的产能；在深层静态发酵过程中不易被杂菌污染，而浅层静态发酵周期明显缩短，有利于降低高纤椰果发酵生产的染菌率，从而有利于提高产品得率，降低生产成本。
附图说明
图1为本发明的工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
菌种：木醋杆菌Acetobacter Xylimum 1.1812(购于中科院微生物研究所)
(1)种子扩大培养
培养基配制：蔗糖2g，酵母膏0.4g，NH4Cl 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，CaCl2 0.02g，NaAC 0.01g，FeSO4 0.5mg，椰子水20mL(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至100mL，调节pH5.0，装入500mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入一环活化好的斜面菌种(用常规接种环接种)，置于振荡培养箱上恒温30℃、150r/min振荡培养12h，得到种子液。
(2)深层静态发酵
培养基配制：蔗糖3000g，酵母膏600g，NH4Cl 600g，MgSO4·7H2O 30g，CaCl2 30g，NaAC 15g，FeSO40.75g，椰子水30L(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至150L，调节pH3.5，装入200L发酵罐，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入上述三角瓶培养成熟的100mL种子液(接种量为0.067％)，进行深层静态发酵。发酵过程中，在发酵液面的空间连续通入无菌空气，无菌空气流量为4L/min左右，使发酵罐内压力为0.01～0.02MPa(表压)，以防杂菌污染；同时，温度控制为28～32℃。发酵108h，湿菌体浓度达到2.1g/L。
湿菌体浓度采用离心称重法测定：取发酵液100mL放入250mL三角瓶中，加入0.1g纤维素酶(＞15υ/mg)，恒温50℃振荡2h，充分水解后，补充蒸馏水，使体积恢复至100mL，然后准确吸取10mL水解液放入离心管，于4000r/min离心20min，弃去上清液，用滤纸吸干离心管壁水珠，对沉淀物进行称重，并计算出沉淀物浓度G1(g/L)；同时，称取0.1g纤维素酶(＞15υ/mg)加到100mL蒸馏水中，经振荡使其混合均匀，以同样方法测定出沉淀物浓度G2(g/L)；最后，可计算出湿菌体浓度为(G1-G2)(g/L)。
(3)浅层静态发酵
将上述深层静态发酵液分装到经过灭菌处理的浅层容器发酵盘(长度×宽度×高度＝300mm×220mm×65mm)中，装液高度为8mm，用无菌的、透气的防菌纸膜覆盖发酵盘口并扎好，置于洁净的发酵房内静止发酵。发酵过程中，控制发酵房温度为26～34℃，发酵40h可得厚度为3mm的高纤椰果。
实施例2
菌种：木醋杆菌Acetobacter Xylimum 1.1812
(1)种子扩大培养
培养基配制：蔗糖5g，酵母膏0.3g，NH4Cl 0.8g，MgSO4·7H2O 0.04g，CaCl2 0.04g，NaAC 0.02g，FeSO4 1.0mg，椰子水80mL(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至200mL，调节pH5.5，装入1000mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入一环活化好的斜面菌种(用常规接种环接种)，置于振荡培养箱上恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液。
(2)深层静态发酵
培养基配制：蔗糖20kg，酵母膏1.2kg，NH4Cl 3.2kg，MgSO4·7H2O 160g，CaCl2 160g，NaAC 80g，FeSO4 4g，椰子水320L(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至799.8L，调节pH5.5，装入1000L发酵罐，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入上述三角瓶培养成熟的200mL种子液(接种量为0.025％)，进行深层静态发酵。发酵过程中，在发酵液面的空间连续通入无菌空气，无菌空气流量为20L/min左右，使发酵罐内压力为0.01～0.02MPa(表压)，以防杂菌污染；同时，温度控制为28～32℃。发酵132h，湿菌体浓度达到3.0g/L。
(3)浅层静态发酵
将上述深层静态发酵液分装到经过灭菌处理的浅层容器发酵盘(长度×宽度×高度＝300mm×220mm×65mm)中，装液高度为8mm，用无菌的、透气的防菌纸膜覆盖发酵盘口并扎好，置于洁净的发酵房内静止发酵。发酵过程中，控制发酵房温度为26～34℃，发酵52h可得厚度为5mm的高纤椰果。
实施例3
菌种：木醋杆菌Acetobacter Xylimum 1.1812
(1)种子扩大培养
种子培养采用“斜面→三角瓶→种子罐”的扩大培养流程，具体如下：
(a)培养基配制：NH4Cl 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，CaCl2 0.02g，椰子水100mL(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，调节pH5.5，装入500mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入一环活化好的斜面菌种(用常规接种环接种)，置于振荡培养箱上恒温30℃、150r/min振荡培养12h，得到种子液。
(b)培养基配制：NH4Cl 30g，MgSO4·7H2O 1.5g，CaCl2 1.5g，椰子水7.5L(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，调节pH5.0，装入10L发酵罐(种子罐)，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入步骤(a)中三角瓶培养成熟的100mL种子液，进行通气搅拌培养。培养过程中，温度控制为28～30℃，搅拌转速控制为300r/min，通气量控制为0.15～0.25vvm，培养12h，得到种子液。
(2)深层静态发酵
培养基配制：NH4Cl 2.8kg，MgSO4·7H2O 140g，CaCl2 140g，椰子水700L(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，调节pH4.5，装入1000L发酵罐，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入步骤(b)中种子罐培养成熟的7.5L种子液(接种量为1.06％)，进行深层静态发酵。发酵过程中，在发酵液面的空间连续通入无菌空气，无菌空气流量为20L/min左右，使发酵罐内压力为0.0 1～0.02MPa(表压)，以防杂菌污染；同时，温度控制为28～32℃。发酵124h，湿菌体浓度达到3.0g/L。
(3)浅层静态发酵
将上述深层静态发酵液分装到经过灭菌处理的浅层容器发酵盘(长度×宽度×高度＝300mm×220mm×65mm)中，装液高度为14mm，用无菌的、透气的防菌纸膜覆盖发酵盘口并扎好，置于洁净的发酵房内静止发酵。发酵过程中，控制发酵房温度为26～34℃，发酵84h可得厚度为10mm的高纤椰果。
实施例4
菌种：木醋杆菌Acetobacter Xylimum 1.1812
(1)种子扩大培养
培养基配制：蔗糖50g，NH4Cl 8g，MgSO4·7H2O 0.8g，CaCl2 0.8g，NaAC0.2g，椰子水1600mL(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至2000mL，调节pH5.0，分装到10个1000mL三角瓶中，每个三角瓶装200mL培养基，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入一环活化好的斜面菌种(用常规接种环接种)，置于振荡培养箱上恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液。
(2)深层静态发酵
培养基配制：蔗糖20kg，NH4Cl 3.2kg，MgSO4·7H2O 160g，CaCl2 160g，NaAC 80g，椰子水638L(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至798L，调节pH5.0，装入1000L发酵罐，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入上述三角瓶培养成熟的2000mL种子液(接种量为0.25％)，进行深层静态发酵。发酵过程中，在发酵液面的空间连续通入无菌空气，无菌空气流量为2L/min左右，使发酵罐内压力为0.01～0.02MPa(表压)，以防杂菌污染；同时，温度控制为28～32℃。发酵100h，湿菌体浓度达到2.2g/L。
(3)浅层静态发酵
将上述深层静态发酵液分装到经过灭菌处理的浅层容器发酵盘(长度×宽度×高度＝300mm×220mm×65mm)中，装液高度为19mm，用无菌的、透气的防菌纸膜覆盖发酵盘口并扎好，置于洁净的发酵房内静止发酵。发酵过程中，控制发酵房温度为26～34℃，发酵120h可得厚度为15mm的高纤椰果。
实施例5
菌种：木醋杆菌Acetobacter Xylimum 1.1812
(1)种子扩大培养
种子培养采用“斜面→三角瓶→种子罐”的扩大培养流程，具体如下：
(a)培养基配制：蔗糖14g，酵母膏0.1g，NH4Cl 0.8g，MgSO4·7H2O 0.04g，CaCl2 0.04g，NaAC 0.02g，FeSO4 1.0mg，椰子水100mL(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至200mL，调节pH5.5，装入1000mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入一环活化好的斜面菌种(用常规接种环接种)，置于振荡培养箱上恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液。
(b)培养基配制：蔗糖5586g，酵母膏40g，NH4Cl 320g，MgSO4·7H2O16g，CaCl2 16g，NaAC 8g，FeSO4 0.4g，椰子水39.9L(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至79.8L，调节pH5.5，装入100L发酵罐，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入上述三角瓶培养成熟的200mL种子液(接种量为0.25％)，进行通气搅拌培养。培养过程中，温度控制为30℃，搅拌转速控制为300r/min，通气量控制为0.10～0.25vvm，培养12h，得到种子液。
(2)深层静态发酵
培养基配制：蔗糖50.4kg，酵母膏0.36kg，NH4Cl 2.88kg，MgSO4·7H2O144g，CaCl2 144g，NaAC 72g，FeSO4 3.6g，椰子水360L(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至720L，调节pH5.5，装入1000L发酵罐，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入上述种子罐培养成熟的80L种子液(接种量为10％)，进行深层静态发酵。发酵过程中，在发酵液面的空间连续通入无菌空气，无菌空气流量为20L/min左右，使发酵罐内压力为0.01～0.02MPa(表压)，以防杂菌污染；同时，温度控制为28～32℃。发酵84h，湿菌体浓度达到2.0g/L。
(3)浅层静态发酵
将上述深层静态发酵液分装到经过灭菌处理的浅层容器发酵盘(长度×宽度×高度＝300mm×220mm×65mm)中，装液高度为30mm，用无菌的、透气的防菌纸膜覆盖发酵盘口并扎好，置于洁净的发酵房内静止发酵。发酵过程中，控制发酵房温度为26～34℃，发酵192h可得厚度为24mm的高纤椰果。
对比实施例：现有的浅层静态发酵法
菌种：木醋杆菌Acetobacter Xylimum 1.1812
(1)种子扩大培养
培养基配制：蔗糖14g，酵母膏0.1g，NH4Cl 0.8g，MgSO4·7H2O 0.04g，CaCl2 0.04g，NaAC 0.02g，FeS04 1.0mg，椰子水100mL(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至200mL，调节pH5.0，装入1000mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至28～32℃后接入一环活化好的斜面菌种(用常规接种环接种)，置于振荡培养箱上恒温30℃、150r/min振荡培养12h，然后置于培养箱中恒温30℃静止培养24h，得到种子液。
(2)浅层静态培养
培养基配制：蔗糖125g，酵母膏0.9g，NH4Cl 7.1g，MgSO4·7H2O 0.36g，CaCl2 0.36g，NaAC 0.18g，FeSO4 8.9mg，椰子水890mL(海南文昌的新鲜椰子，破壳取水)，用自来水定容至1780mL，调节pH4.0，121℃灭菌20min，趁热装入无菌的发酵盘(长度×宽度×高度＝300mm×220mm×65mm)，用无菌的、透气的防菌纸膜覆盖发酵盘口并扎好，冷却至26～34℃后接入上述三角瓶培养成熟的200mL种子液(接种量为10.1％)，接种后发酵盘装液高度为30mm，置于洁净的发酵房内静止发酵。发酵过程中，控制发酵房温度为26～34℃，发酵288h可得厚度为24mm的高纤椰果。
本实施例与实施例5对比，说明采用本发明的方法，浅层发酵周期缩短了96h，缩短幅度为33.3％。
Claims (7)
1.一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)深层静态发酵
将发酵培养基经过加热灭菌并冷却至28～32℃后，接入木醋杆菌，所述木醋杆菌接种量为0.025～10.0％，在发酵罐中进行深层静态发酵，在发酵过程中，在发酵液面的空间连续通入无菌空气，并控制发酵温度为28～32℃，深层静态发酵终点为发酵液的湿菌体浓度达到2.0～3.0g/L；
(2)浅层静态发酵
将步骤(1)中得到的湿菌体浓度为2.0～3.0g/L的发酵液分装到经过灭菌处理的浅层容器中，进行浅层静态发酵，发酵过程中控制温度26～34℃，浅层容器中的凝胶膜厚度达到3～24mm时结束发酵，即得到高纤椰果。
2.根据权利要求1所述的一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，其特征在于：所述步骤(1)中发酵培养基中包括椰子水，所述椰子水的体积百分比为20～100％；所述发酵培养基配制时调节pH为3.5～5.5。
3.根据权利要求1所述的一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，其特征在于：所述步骤(1)中连续通入无菌空气使发酵罐内压力达到0.01～0.02MPa。
4.根据权利要求1所述的一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，其特征在于：所述步骤(1)深层静态发酵时间为84～132h。
5.根据权利要求1所述的一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，其特征在于：所述步骤(2)中湿菌体浓度采用离心称重法测定：在100mL发酵液中加入0.1g纤维素酶，恒温50℃振荡2h，充分水解后，补充蒸馏水，使体积至100mL，得到水解液，然后将10mL水解液于4000r/min离心20min，对沉淀物进行称重，并计算出沉淀物浓度G1(g/L)；同时，称取0.1g纤维素酶加到100mL蒸馏水中，经振荡使其混合均匀，以同样方法测定出沉淀物浓度G2(g/L)；最后，计算出湿菌体浓度为(G1-G2)(g/L)。
6.根据权利要求1所述的一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，其特征在于：所述步骤(2)中浅层容器的装液高度为30mm以下。
7.根据权利要求1所述的一种深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，其特征在于：所述步骤(2)中浅层静态发酵时间为40～192h，。
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