CN101128225B - 可植入生物材料和制造它的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可植入生物材料和制造它的方法。具体地，本发明涉及制造可植入生物材料的方法，该方法包括(a)将生物材料暴露于含醇溶液至少24小时。

Description

可植入生物材料和制造它的方法

技术领域

本发明涉及可植入生物材料和制造它的方法。具体地，本发明涉及处理含胶原的生物材料以降低和/或减轻钙化并改善生物材料寿命的方法，以及制造该生物材料的方法，该生物材料可在可植入装置上使用或者与该装置一起使用。

背景技术

存在许多在化学上改变和/或固定生物组织的胶原基质以使这些组织能被植入到活的哺乳动物体内的方法。改变和固定的可植入生物组织的例子包括心瓣膜、血管、心包膜、皮肤、硬膜、腱和韧带。

这些生物组织主要由胶原和弹性蛋白组成。大多数生物组织的刚性/弹性很大程度上由组织中的相对胶原和弹性蛋白含量和/或***框架的物理构造来确定。

每个胶原分子由相互缠绕形成卷曲三链螺旋的三个多肽链组成。用于保存生物组织的化学试剂通常在位于胶原分子内的多肽链上的氨基之间(分子内)以及在相邻胶原分子之间(分子间)形成交联。

当在不同的受体物种中用作可植入装置时，胶原基生物材料易于超急性排斥(hyperacute rejection)。这种超急性排斥是一种天然的免疫反应，由胶原基生物材料结构中存在的抗原触发。超急性排斥为一种快速退化(degenerative)过程，其影响这种可植入装置的功能和耐久性。

胶原基生物材料的抗原性可通过胶原的物理或化学交联来抑制。物理交联方法如紫外辐射或热脱水导致低密度交联。化学试剂如甲醛、戊二醛、二醛淀粉和某些聚环氧化合物已用作胶原基生物材料中的化学交联剂。

使胶原交联涉及交联剂与不同多肽链上的赖氨酸或羟基赖氨酸残基的胺基反应。使胶原交联的另一种已知方法是激活多肽链中的谷氨酸和天冬氨酸残基的羧基与另一多肽链的胺基反应形成酰胺键。

还可通过用二异氰酸酯桥接(bridging)相邻多肽链的胺基来进行交联，这导致脲键的形成。由于大多数二异氰酸酯的毒性和低溶解性，这种方法较不常用。

最近，戊二醛已成为优选的交联剂。戊二醛因为在5个碳的脂肪链的两端存在醛而被赋予双重功能(bifunctional)。除了固定组织外，戊二醛还是用于制备植入用生物组织的优秀灭菌剂。

具体地，已用戊二醛固定的可永久植入的生物材料包括猪生物修复心瓣膜、牛心包瓣和牛心包补片。

与植入和化学试剂交联的生物材料有关的问题在于这些材料尤其是这些材料中的胶原和弹性蛋白趋于钙化。这些材料的钙化可导致***，造成材料的降解和失效。已知外源性和内源性钙化都会造成交联的生物材料的钙化。

不幸地是，已知戊二醛能促进生物材料的钙化。醛和生物材料中的伯胺反应形成不稳定的亚胺(希夫碱(Schiff base))，其随后从生物材料中释放戊二醛。组织中存在的未结合的醛可导致植入后严重的组织刺激，如炎症反应。因此，需要除去或失活交联剂如戊二醛的钙化促进效应。

还没有完全理解交联生物材料的钙化机理。临床数据显示，因素如患者年龄、感染、宿主组织化学、脱水、畸变、饮食要素和不适当的初始抗凝治疗会促进植入的生物材料的钙化。

已进行了许多尝试来寻找减轻交联生物材料钙化的方法。对减轻生物材料钙化的研究主要集中在交联生物材料的处理上，并描述在但不限于：美国专利No.4553974(Dewanjee等)；美国专利No.4120649(Schechter)；美国专利No.4648881(Nashef等)；和美国专利No.4976733(Girardot)，Vyavahare等，1997，Circulation，95：479-488和Pathak等，2004，J.Biomed.Mater Res.，69A：140-144。这些出版物一般描述了在植入前用醇处理固定组织的方法。换句话说，在被暴露到醇前就已经使组织交联。即使在醇存在下预培养组织的情况下，暴露期也经常太短而没有用或缓冲剂和其它试剂的存在反面影响交联稳定性(参见例如Vyavahare等，1997，同上)。还描述了利用非戊二醛试剂固定生物材料的替代方法，这些方法包括但不限于聚缩水甘油醚的使用(Imamura等，(1988)，Jpn.J.Artif.Organs，17：1101-1103)；光氧化(Moore等，(1994)，J.Biomed.Mater.Res.，28：611-618)。

已证实用氨基-二-磷酸盐和表面活性剂处理交联的生物材料减少了植入后这些生物材料的钙化。但是，这些试剂往往在植入后从生物材料中洗掉，并只是延缓钙化过程。

在生物材料处理中使用醇是众所周知的，但它限于用作溶剂和/或灭菌剂。例如，醇在处理生物材料抵抗病理钙化的用途限于其在预先交联的胶原生物材料中的使用。美国专利No.5746775(Levy等)和国际专利No.WO84/01894。

因此，仍然需要一种制造对钙化具有长期抗性的生物材料的方法。

发明概述

发明人开发了利用含胶原可植入生物材料克服或至少减轻钙化问题的方法。

因此，在第一个方面中，本发明提供制造可植入生物材料的方法，其包括：

(a)将生物材料暴露于含醇溶液中至少24小时。

在第二个方面中，本发明提供处理含胶原的生物材料以产生抗钙化的生物材料的方法，其包括：

(a)将生物材料暴露于含醇溶液中至少24小时。

在一些实施方案中，第一和第二方面的方法还包括步骤：

(b)将步骤(a)中的所述材料暴露于交联剂；和

(c)将步骤(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；

其中步骤(b)和(c)与步骤(a)是连续的。

尽管优选进行步骤(a)至少24小时，更优选至少36小时，最优选至少48小时，但本领域技术人员能认识到，在一些情况下，步骤(a)可进行较短的时间。

因此，在第三个方面中，本发明提供制造可植入生物材料的方法，其包括：

(a)将生物材料暴露于含醇溶液；

(b)将步骤(a)中的所述材料暴露于交联剂；和

(c)将步骤(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；

其中步骤(b)和(c)与步骤(a)是连续的。

在第四个方面中，本发明提供处理含胶原的生物材料以产生抗钙化的生物材料的方法，其包括：

(a)将生物材料暴露于含醇溶液；

(b)将步骤(a)中的所述材料暴露于交联剂；和

(c)将步骤(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；

其中步骤(b)和(c)与步骤(a)是连续的。

在一些实施方案中，在本发明的方法的步骤(a)和(b)之间和/或步骤(b)和(c)之间，冲洗生物材料或含胶原材料以除去残留的醇和/或交联剂。优选地，在步骤(c)后进一步冲洗生物材料或含胶原材料以除去残留的酸性溶液。

本领域技术人员能认识到，本文公开的方法可用于处理任何生物材料。优选地，该生物材料包括胶原。

在一些实施方案中，生物材料为培养的组织、包含从动物得到的细胞外基质的假体(prosthesis)、重建的(reconstituted)组织(例如胶原基质)等。

还应认识到，生物材料可包括由合成聚合物、生物聚合物或两者形成的合成类似物，包括通常存在于自然组织基质中的那些。合适的合成聚合物包括例如聚酰胺和聚砜。生物聚合物可天然存在或通过例如发酵等在体外产生。

在一些实施方案中，生物材料天然存在并已从动物中分离。可从任何动物中分离生物材料，不管是从与受体相同的物种还是从与受体不同物种的动物。优选地，动物为哺乳动物的目即偶蹄目(Artiodactyla)、兔形目(Lagomorpha)、啮齿目(Rodentia)、奇蹄目(Perissodactyla)、食肉目(Carnivora)和有袋目(Marsupialia)中的一种。更优选地，动物选自绵羊、牛、山羊、马、猪、有袋动物和人。

生物材料可为任何类型的细胞组织。优选地，细胞组织选自心血管组织、心脏组织、心瓣膜、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织、***、硬膜、皮肤组织、血管组织、软骨组织、心包膜、韧带、腱、血管、脐带组织、骨组织、筋膜(fasciae)和粘膜下(submucosal)组织以及皮肤。

在一些实施方案中，生物材料是和/或包括离散的(discrete)，即分离的胶原而不是天然存在的含胶原组织。离散胶原可以以其分离状态使用或被形成为本领域中已知的任何医疗装置或用品。

步骤(a)中使用的生物材料未被预先交联。

步骤(a)中使用的含醇溶液优选为液体，并且是水基的，即为大于约50％醇，并优选60％-80％醇(以体积计)的水溶液。可使用缓冲或非缓冲的含醇溶液；但是，优选使用非缓冲的含醇溶液，因为发现缓冲的含醇溶液对随后的交联过程有负面影响，产生发黄的生物材料。

本发明的方法可在含醇溶液中使用本领域中已知的任何醇。优选地，醇为在无缓冲剂的溶液中的C₁-C₆低级醇。甚至更优选地，醇选自下组：甲醇、乙醇、环己醇、异丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。

在一些实施方案中，含醇溶液包括两种或多种醇的混合物，条件是醇的总体积大于50％。例如，约70％的乙醇和约10％的异丁醇的混合物是有效的。

可将步骤(a)中的生物材料暴露于含醇溶液任意时间长度，只要能足以赋予生物材料对体内病原性钙化的抗性即可。优选地，生物材料保持与含醇溶液接触足够的时间，以能使醇扩散和渗透到生物材料内。更优选地，生物材料暴露于含醇溶液至少24小时，甚至更优选至少36小时，和最优选至少48小时。

在一些实施方案中，例如已将生物材料暴露于含醇溶液大于24小时的那些实施方案，可在下文公开的本发明的处理方法中直接使用该生物材料。

在一些实施方案中，生物材料在暴露于含醇溶液后被取出并暴露于一种或多种交联剂。可使用本领域中已知的任何形式的交联剂或其组合，只要它能使胶原交联即可。因此，应认识到，交联剂包括但不限于二乙烯砜(DVS)、聚乙二醇二乙烯砜(VS-PEG-VS)、甲基丙烯酸羟乙酯二乙烯砜(HEMA-DIS-HEMA)、甲醛、戊二醛、醛、异氰酸酯、烷基和芳基卤、亚胺酸酯、N-取代马来酰亚胺、酰化化合物、碳二亚胺、羟基氯化物、N-羟基琥珀酰亚胺、光(即蓝光和UV光)、pH、温度和它们的组合。优选地，交联剂为选自下组的化学交联剂：碳二亚胺、聚环氧醚、二乙烯砜(DVS)、多醛和叠氮化磷酸二苯酯(DPPA)。

在一些实施方案中，多醛为双-、三-或二-醛。戊二醛是尤其优选的。

在一些实施方案中，交联步骤(b)后是步骤(c)，有或没有中间洗涤步骤。步骤(c)中使用的酸性溶液包含能将步骤(b)后生物材料中存在的固定和/或非固定交联剂部分灭活和/或改变以除去或减少可用的钙结合部位的任何酸。可选地，或除此之外，步骤(c)中使用的酸性溶液包含能进一步使胶原上活化的羧基与活化的胺基交联形成酰胺键的任何酸。优选地，酸性溶液中的酸包括氨基羧酸。优选地，氨基羧酸为具有至少一个氨基和至少一个羧酸取代基的酸。更优选地，氨基羧酸选自下组：L-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸或L-天冬氨酸。

在一些实施方案中，公开方法的步骤(c)被抑制生物材料中存在的弹性蛋白分子上的金属蛋白酶形成的方法所代替或补充。具体地说，在组织如主动脉组织中，存在比在其它组织中更高百分比的弹性蛋白。这些弹性蛋白分子可提供形成金属蛋白酶的位点，因而这些位点需要减少、除去或失活。如下文中实施例1所示，可使用包含多价阳离子如镁、铁和铝盐的无缓冲剂的溶液来减少金属蛋白酶的形成。

使用无磷酸盐的0.9％盐水溶液进行冲洗生物材料的步骤。

在一种优选实施方案中，在步骤(c)后将生物材料进一步灭菌。更优选地，在冲洗后将生物材料灭菌。

尽管本领域技术人员能认识到进行本发明的每个步骤的温度不是关键性的，但能理解到，温度优选为2℃-40℃，更优选为4℃-30℃，最优选为5℃-25℃。

在一种实施方案中，醇、交联剂和酸性溶液、冲洗溶液和灭菌溶液都是无缓冲剂的。

本领域技术人员能认识到，本文公开的方法能产生抗钙化的生物材料，在体内植入后，其保持小于50μg钙/mg组织超过200天。换句话说，本发明的抗钙化生物材料能被植入多于200天而生物材料不会增加其钙含量超过50μg/mg组织。

因此，在第五个方面中，本发明提供包括交联胶原的抗钙化生物材料，其中所述生物材料的钙含量小于约50μg/mg生物材料，和其中所述生物材料能被植入至少200天而生物材料不会增加其钙含量超过50μg/mg生物材料。

不希望受任何理论或假设的约束，认为观察到的抗钙化是部分由于本文公开的制造生物材料的方法所带来的胶原中存在仲胺而引起的。

因此，在第六个方面中，本发明提供可植入的生物装置，其包括含有交联胶原的抗钙化生物材料，其中所述胶原包括仲胺。

在一些实施方案中，将抗钙化生物材料涂覆到医疗装置的表面上。在另一实施方案中，装置还包括至少第二涂层。

本领域技术人员能认识到，所述至少第二涂层可包括试剂如抗微生物剂、抗病毒剂、生长因子、抗脱水剂或防腐剂。

优选地，抗微生物剂选自下组：异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氯法齐明、利福布汀(rifabutin)、氟喹诺酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四环素、红霉素、环丙沙星、多西环素、氨苄西林、两性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、戊烷脒、阿托伐醌、巴龙霉素、地克珠利(diclazaril)、无环鸟苷、三氟尿苷、膦甲酸、青霉素、庆大霉素、更昔洛韦、伊曲康唑(iatroconazole)、咪康唑、吡硫锌、重金属包括但不限于金、铂、银、锌和铜、以及它们的组合形式，包括盐，如氯化物、溴化物、碘化物和高碘酸盐，以及与载体的复合物，和其它形式。

优选地，生长因子剂选自下组：羟基磷灰石、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素-样生长因子(insulin-like growth factor)1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生长因子(platelet derived growth factor)(PDGF)、肿瘤血管生成因子(TAF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、转化生长因子α和β(TGF-α和TGF-β)、白细胞介素-8(IL-8)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；白细胞介素，和干扰素。

在一些实施方案中，本发明的装置还包括选自下组的生物可吸收材料：聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，聚二氧杂环己酮(polydioxanone)，聚己内酯，多肽，聚碳酸酯，聚羟基丁酸酯，聚(亚烷基草酸酯)，醋酸乙烯酯与不饱和羧酸的共聚物，水溶性或可分散性纤维素衍生物，氧化乙烯聚合物，聚丙烯酰胺，胶原，明胶，聚(原酸酯)，氨基酸的聚酰胺，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚醚醚酮，磷酸三钙，和其混合物。

应认识到，本发明的装置可为需要抗钙化的任何装置。优选地，装置选自下组：人造心脏、心外压缩装置、血管内或血管外压缩装置、心瓣膜假体、瓣环(annuloplasty ring)、皮肤移植物(graft)、血管移植物、血管支撑架(stent)、结构支撑架、血管分流器、心脏血管分流器、硬膜移植物、软骨移植物、软骨植入物(implant)、心包膜移植物、韧带假体、腱假体、膀胱假体、小拭子、缝合线、永久留置经皮装置、外科补片、心血管支撑架、涂层支撑架和涂层导管。更优选地，装置为心瓣膜假体。

在一些实施方案中，装置进一步包括从动物上收获的组织碎片(tissuefragment)或组织的合成类似物。

优选地，组织碎片包括大量细胞，当在手术部位植入时，所述细胞将增殖并结合到周围组织内。

在第七个方面中，本发明提供一种生物相容的植入物，包括生物相容的支架(scaffold)，该支架包括含有交联胶原的抗钙化生物材料，其中所述生物材料的钙含量小于约50μg/mg生物材料，和其中所述生物材料能被植入至少200天而生物材料不会增加其钙含量超过50μg/mg生物材料。

在第八个方面中，本发明提供一种生物相容的植入物，包括生物相容的支架，该支架包括含有交联胶原的抗钙化生物材料，其中所述胶原包括仲胺。

优选地，本发明的植入物还包括合成聚合物、天然聚合物、可注射凝胶、陶瓷材料、同体组织、同种异体组织、异种组织和它们的组合。

在第九个方面中，本发明提供用于修复组织损伤的试剂盒，其包括：

(a)具有一种或多种含有交联胶原的抗钙化生物材料的无菌容器，其中所述胶原包括仲胺；和

(b)针对损伤受试者的说明书。

在第十个方面中，本发明提供一种处理活组织的方法，包括：

(a)提供含有交联胶原的抗钙化生物材料，其中所述胶原包括仲胺；和

(b)在需要处理的受试者中或其上植入生物材料。

处理方法可为任何处理，包括预防和治疗处理。优选地，处理方法选自下组：组织修复、深组织保护、组织填充(tissue bulking)、美容处理、治疗处理、组织增大和组织封口。

在第十一个方面中，本发明提供一种伤口敷料，其包括含有交联胶原的抗钙化生物材料，其中所述胶原包括仲胺。

优选地，生物材料中的胶原选自下组：绵羊胶原、牛胶原、山羊胶原、马胶原、猪胶原、有袋动物胶原和人胶原。

在一些实施方案中，伤口敷料还包括选自下组的硫酸化多糖：肝素、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸己糖醛酸基己糖氨基聚糖(hexuronyl hexosaminoglycan sulfate)、六硫酸肌醇和八硫酸蔗糖。优选地，伤口敷料还包括抗微生物剂、抗病毒剂、生长因子、抗脱水剂或防腐剂。

优选地，生物材料含有至少50％的胶原，更优选至少70％的胶原，甚至更优选至少90％的胶原，和最优选基本上由胶原组成。

附图简述

图1显示了用醇预处理然后戊二醛固定的袋鼠心包膜组织和戊二醛固定的组织(即没有醇预处理)和“新鲜”组织的比较。

图2显示了用醇预处理然后戊二醛固定的袋鼠主动脉组织和戊二醛固定的组织(即没有醇预处理)和“新鲜”组织的比较。

图3显示了(A)猪前尖(porcine cusp)和(B)主动脉壁组织对酶降解的抗性。

图4显示了皮下大鼠模型中八周后(A)外植的猪瓣膜前尖和(B)猪主动脉壁组织的定量的钙水平。

优选实施方案详述

在详细描述本发明前，应认识到本发明不限制于具体举例的制备方法，其当然是可变化的。还应认识到，本文使用的术语仅仅用于描述本发明的具体实施方案，而不意欲限制本发明，本发明仅受限于所附权利要求书。

本文(不管是上文还是下文)引用的所有出版物、专利和专利申请都全文引入作为参考。但是，引用本文提到的出版物用于描述和公开出版物中记载并可与本发明结合使用的实验规程(protocol)和试剂。本文中任何内容都不能被解释为，承认本发明无权依靠发明在先而在时间上先于这些公开。

此外，除非另外指明，本发明的实施利用本领域技术范围内的常规免疫技术、化学和药理学。这些技术对于本领域技术人员来说是众所周知的，并在文献中有充分说明。参见例如Coligan，Dunn，Ploegh，Speicher和Winfield“Current protocols in Protein Science”(1999)，第I和II卷(John Wiley&Sons Inc.)；以及Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，Biochemical EngineeringFundamentals，McGraw-Hill Book Company，NY，1986；ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，AcademicPress，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)。

必须注意，本文及所附权利要求中使用的单数形式“一种”和“所述”包括复数指代，除非文中另外明确指明。因此，例如，提到的“一种交联剂”包括这些试剂的复数，提到的“一种醇”是指一种或多种醇，等等。除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。尽管可使用类似或等价于本文所述的任何材料和方法来实施或试验本发明，但现在描述优选的材料和方法。

在最宽方面的一个方面中，本发明涉及一种制造可植入生物材料的方法。

本文使用的术语“生物材料”是指可能具有生物用途的任何材料，其中该材料包括一些胶原。胶原可为来自任何来源的任何类型的胶原，并可单独存在或与其它材料组合。因此，胶原可占生物材料总重量的少至1％w/w或多达100％。

本文使用的术语“胶原”是指以其刚性三链螺旋结构为特征的纤维蛋白的细胞外家族。三个胶原多肽链(“α-链”)彼此环绕形成这种螺旋分子。该术语还意指包括各种类型的胶原。

胶原螺旋部分的主要部分在哺乳动物物种之间差异很小。事实上，大量胶原类型具有高度核苷酸和氨基酸序列同源性。例如，当比较人、马和鼠科动物时，胶原αI型II的核苷酸序列同源性为至少88％。人和马在核苷酸水平上具有93％的序列同源性，而小鼠和马具有89％的序列同源性。人和小鼠的核苷酸序列同源性为88％(参见，NCBI登录号U62528(马)、NM033150(人)和NM031163(小鼠)，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。其它类型的胶原具有类似的氨基酸同源性水平。例如，猪胶原αI型I和绵羊胶原αI型I之间的核苷酸序列同源性为90％(参见，NCBI登录号AF29287(绵羊)和AF201723(猪)，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

考虑上述动物中大多数的常见谱系和生物学水平，大量物种如牛、羊、小鼠和猪上的胶原的高度氨基酸和核苷酸序列同源性，本领域的技术人员能认识到，本文公开的制造生物材料的方法适用于从所有哺乳动物中分离的胶原材料。

因此，在一些实施方案中，从哺乳动物的目即偶蹄目、兔形目、啮齿目、奇蹄目、食肉目和有袋目之一的动物中分离或收获生物材料。动物优选为绵羊、牛、山羊、马、猪、有袋动物或人。尽管优选从与受体相同的动物物种中分离生物材料，但可预料到，也可从与受体不同的物种中分离生物材料。

或者，在一些实施方案中，生物材料包括培养的组织、重建的组织等。

生物材料可为任何类型的细胞组织。例如，该细胞组织可为心血管组织、骨盆底组织、心脏组织、心瓣膜(heart valve)、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织、***、软或实质器官的基质、硬膜、皮肤组织、血管组织、硬膜、软骨、心包膜、韧带、腱、血管、脐带组织、骨组织、筋膜和粘膜下组织或皮肤，因为这些全部都包括一些胶原。

还应认识到，生物材料还可包括由合成聚合物、纯化生物聚合物或两者形成的合成类似物，包括天然组织基质中通常存在的那些。合适的合成聚合物包括例如聚酰胺和聚砜。生物聚合物可为天然存在的或通过例如发酵等在体外产生。

可通过技术如编织、针织、浇铸、模塑、挤出、细胞排列和磁性排列将纯化的生物聚合物适当地形成为底物。合适的生物聚合物包括而不限于胶原、弹性蛋白、丝、角蛋白、明胶、聚氨基酸、多糖(例如纤维素和淀粉)以及这些中任意的共聚物。例如，可通过各种技术(如编织和模塑)中的任何一种将胶原和弹性蛋白聚合物形成为合成的可植入材料。合成的组织类似物模拟天然组织基质。或者，合成底物可用于单独或与天然存在的底物一起形成组织类似物。非限制性例子包括聚丙烯、聚乳酸、聚酯、尼龙、有机硅等。

应认识到，尽管本文公开的方法可能对先前交联的生物材料有一定作用，但本文公开的方法意欲用在未交联的即“天然的”或“未加工的”材料上。

一旦获得生物材料，就准备用于植入。术语“植入”、“可植入的”和“植入物”在本文中可互换使用，并全部指本发明的生物材料、装置等被放置在动物活组织内或上而不会导致排斥、感染或毒性问题的能力。应认识到，术语“可植入的”可包括生物材料或装置的部分，还包括部分植入的装置等如隐形眼镜等。

在本发明的方法的初始步骤中，生物材料被暴露于含醇溶液。本文使用的术语“被暴露于(exposed)”“暴露(exposing)”是指使生物材料或含胶原材料接触这里或下文中所描述的含醇溶液的活性步骤，随后使生物材料与交联剂、酸性溶液或其它物质接触(containing)足够时间以产生所需的结果。将生物材料暴露于例如含醇溶液的方法在本领域中是众所周知的。例如，通常，可通过在包含醇的溶液中喷涂、浸涂或浸没生物材料而将生物材料“暴露”于醇。

本文使用的术语“醇”是指本领域中已知的能除去或减少甘油三酸酯的量并且至少部分酯化胶原上存在的羧基的任何醇。优选地，醇为水溶性醇。更优选地，醇为在无缓冲剂的溶液中的C₁-C₆低级醇。甚至更优选地，醇选自下组：甲醇、乙醇、环己醇、异丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。

不希望受任何特定理论或假设的约束，本发明人认为含醇溶液有助于松散胶原三螺旋并因此暴露疏水部位(参见Karube &Nishida，1979，BiochimBiophys Acta.，23；581(1)；106-13)。我们还认为胶原中存在的羧基和胺基在含醇溶液存在下被酯化，从而它们可在后面的步骤中用于交联。因而，优选的醇溶液为包括至少50％v/v、更优选至少约70％v/v和最优选至少约80％v/v醇的无缓冲剂水溶液。在一种实施方案中，醇溶液为0.9％盐水中的70％v/v乙醇(包含0.5mM PMSF)。

在一种实施方案中，本发明的方法提供一种制造可植入生物材料的方法，其包括将生物材料暴露于含有少于100％醇的含醇无缓冲剂的溶液中至少24小时。

在一些实施方案中，含醇溶液以及其它溶液和试剂都是“无缓冲剂”的，因为假定包含醛的交联剂在固定过程中与缓冲剂反应，导致醛的解聚。

暴露生物材料到含醇溶液的步骤可进行任意时间长度，只要它足以赋予生物材料对体内病原性钙化的抗性并将胶原上存在的大部分(即高百分比)羧基和胺基酯化即可。优选地，生物材料保持与含醇溶液接触足够的时间以能使醇扩散和渗透到生物材料中。更优选地，将生物材料暴露于含醇溶液至少24小时，甚至更优选至少36小时，最优选至少48小时。

一旦将生物材料暴露于醇后，就除去醇。在一些实施方案中，在暴露于醇后在包括无磷酸盐的0.9％盐水溶液的冲洗溶液中冲洗生物材料。但是，可使用任何非缓冲的生理上可接受的溶液作为冲洗溶液。冲洗溶液的用途主要是除去多余的醇，因而不是关键性的。

在将生物材料或含胶原材料暴露于醇大于24小时后，可直接将它用于植入。尽管以前其它人也使用了醇预固定，但传统上将它用于组织灭菌，而不是酯化胶原中存在的羧基和胺基。因而，暴露于醇的时间相对较短，例如，少于24小时，并且不足以能使组织被醇完全渗透。因此，在本发明前，没有认识到，抗钙化生物材料(见下文定义)可通过长时间即大于24小时将生物材料暴露于含醇溶液来产生。这意味着在暴露于含醇溶液大于24小时后可将生物材料作为抗钙化生物材料直接植入(下文中描述)。但是，本领域技术人员能认识到，可通过步骤(a)后使生物材料交联来产生抗钙化生物材料的更好形式。

因此，在本发明的一些实施方案中，暴露于醇后将生物材料或含胶原材料暴露于一种或多种双官能交联剂中。本文使用的术语“双官能”是指在5碳链的两端处存在的双官能醛基。可通过本领域中已知的任何技术利用任何形式的交联剂进行交联，只要能使胶原交联即可。交联剂包括但不限于酰化化合物、己二酰氯、醛、烷基和芳基卤、双亚胺酸酯(bisimidate)、碳二亚胺、二乙烯砜(DVS)、甲醛、戊二醛、乙二醛、己二异氰酸酯、羟基氯化物、甲基丙烯酸羟乙酯二乙烯砜(HEMA-DIS-HEMA)、亚胺酸酯、异氰酸酯、光(如蓝光和UV光)、N-羟基琥珀酰亚胺、N-取代马来酰亚胺、pH、多醛、叠氮化磷酸二苯酯(DPPA)、包括17-25个碳的主链和4-5个环氧基的聚环氧化合物、聚环氧醚、聚乙二醇二乙烯砜(VS-PEG-VS)、聚甘油聚缩水甘油醚和温度以及它们的组合。

在一些实施方案中，交联剂为化学交联剂，如碳二亚胺、聚环氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平(genipin)、戊二醛、甲醛和叠氮化磷酸二苯酯(DPPA)。

还证实，包括17-25个碳的主链和4-5个环氧基的聚环氧化合物表现出使胶原交联的高效率(参见例如美国专利申请No.20040059430(S/N10/618447)。还表明，聚环氧化合物的毒性低于戊二醛的毒性，在与螺旋多肽分子如胶原反应的情况下，组织的抗原性或免疫响应诱导与反应时间成比例降低。自然地，它表现出相对好的生物相容性(参见例如Lohre等，(1992)，Artif.Organs，16：630-633；Uematsu等，(1998)，Artif.Organs，22：909-913)。因此，所述的聚环氧化合物为一种优选的交联剂。

在一些实施方案中，交联剂包括约1％的戊二醛，暴露时间为至少约24小时。应认识到，生物材料暴露于交联剂的时间长度取决于所用的试剂、浓度和温度。通常，暴露时间为24小时-28天。生物材料于交联剂的暴露时间精确量的确定完全在本领域技术人员的技能范围内。

同样，不希望受任何特定理论或假设约束，本发明人认为，通过使已暴露于醇的生物材料暴露于交联剂，可使生物材料中存在的胶原上的酯化的羧基和胺基交联。

尽管本领域的技术人员能认识到进行本发明的每个步骤的温度不是关键性的，但应认识到，温度优选在2℃和40℃之间，更优选在4℃和30℃之间，最优选在5℃和25℃之间。

同样，在交联步骤后，优选在冲洗溶液如醇暴露步骤(a)后使用的冲洗溶液中冲洗生物材料。但是，同样认识到，冲洗步骤仅仅是优选。

在交联步骤后，或交联步骤后采用冲洗步骤之后，可将生物材料暴露于包含能灭活和/或改变步骤(b)后生物材料中存在的固定和/或非固定交联剂部分的任何酸的酸性溶液，以除去或减少可用的钙结合部位。可选地，或除此之外，步骤(c)中使用的酸性溶液包含能进一步使胶原上的活化的羧基与活化的胺基交联形成酰胺键的任何酸。

优选地，酸性溶液包括至少一种氨基羧酸。本文使用的术语“氨基羧酸”为具有至少一个氨基和至少一个羧酸取代基的任何酸。本发明中使用的氨基羧酸的代表性例子包括但不限于L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸。酸性溶液的目的有两个方面：首先，氨基羧酸有助于固定和非固定交联剂部分的灭活和/或改性，从而减少或减弱任何负面生物影响。其次，氨基羧酸进一步使胶原上活化的羧基与活化的胺基交联形成酰胺键。

氨基羧酸的浓度将取决于实际的所用酸和其它参数如所用生物材料的总质量等。另外，氨基羧酸对生物材料的最小湿重量比(wet weight ratio)将为约1∶4。酸性溶液的最重要方面是pH。PH必须低于pH7，优选低于pH6，更优选低于pH5，最优选低于约pH4.6。

在一种实施方案中，酸性溶液为8mg氨基羧酸每毫升去离子水，其不含磷酸盐且为约pH4。

使生物材料暴露于氨基羧酸至少6小时，更优选至少24小时，甚至更优选超过48小时。尽管培育温度不是关键性的，但优选在5℃和55℃之间，更优选在10℃和45℃之间，最优选约45℃。

在一些实施方案中，公开方法的步骤(c)被抑制生物材料中存在的弹性蛋白分子上的金属蛋白酶形成的方法所代替或补充。具体地说，在组织如主动脉组织中，存在比在其它组织中更高百分比的弹性蛋白。这些弹性蛋白分子可提供形成金属蛋白酶的部位，因而这些部位需要减少、除去或失活。如下文中实施例1所示，可使用包含多价阳离子如镁、铁和铝盐的无缓冲剂的溶液以减少金属蛋白酶的形成。

在将生物材料或含胶原材料暴露于酸性溶液和/或包含多价阳离子的无缓冲剂的溶液的步骤后，同样优选将生物材料在冲洗溶液中冲洗。在一些实施方案中，还对生物材料进行灭菌。

对生物材料灭菌的步骤可通过本领域中已知的用于含胶原材料的任何灭菌方法。例如，可使生物材料经受灭菌剂(例如，液体灭菌剂，如0.2-2.0wt％的戊二醛溶液)一段灭菌时间。可将0.625％戊二醛溶液与热(即升温超过室温，但低于导致生物材料损坏的温度)组合使用作为灭菌剂。或者，合适的灭菌剂溶液可包括单独的渗透平衡水溶液或与灭菌的非接触源(例如辐射、电子束、UV或其它类似手段)组合，或包括戊二醛的水溶液连同磷酸盐缓冲的盐水。在使用0.625％戊二醛溶液作为灭菌剂的情况下，灭菌时间在37℃下可为1-6天，或在50℃下为1-2天。这种最终的灭菌步骤可在将生物材料包装到其最终容器后进行，从而消除了在直到植入时间时对生物材料的任何后续处理的需要。

在一种优选实施方案中，通过将生物材料暴露于在包含9.07g/l磷酸二氢钾缓冲剂的去离子水中的0.25％戊二醛来对生物材料进行灭菌。

灭菌步骤可进行任意时间长度，并可包括贮存。灭菌温度优选40-50℃，并进行超过60分钟。

用本文公开的方法处理后的生物材料具有高的抗钙化水平，即它是“抗钙化生物材料”。本文使用的术语“钙化”是指与传统产生的包括***蛋白(即胶原和弹性蛋白)的生物材料有关的主要病理问题之一。以前表明，这些材料在植入到体内后可变为钙化的。这种钙化可导致生物材料不合需要的***或降解。已知在固定胶原生物材料中发生两种(2)型的钙化：内源性(intrinsic)和外源性(extrinsic)，但这种钙化发生的确切机理是未知的。内源性钙化特征在于将固定生物修复组织(bioprosthetic tissue)包括胶原基质和残余细胞内的钙和磷酸盐离子沉淀。外源性钙化特征在于将粘附血栓包括粘附细胞(例如血小板)内的钙和磷酸盐离子沉淀到生物材料上并在生物材料上形成包含磷酸钙的表面斑块。

因此，当应用于本发明的生物材料时，短语“高的抗钙化水平”或“抗钙化”是指生物材料在体内植入至少200天后表现出小于50μg、优选小于20μg和甚至更优选小于10μg钙每mg除去生物材料后的干组织。

优选地，本发明的生物材料还抗酶降解。本文使用的术语“抗酶降解”是指本发明的生物材料承受酶降解至与传统固定组织相当水平的能力。

一旦形成，本发明的可植入生物材料或含胶原材料则可用于治疗大量病症和/或疾病。

通常，术语“治疗”等在本文中用于指对个体或动物、它们的组织或细胞施加影响以获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果在病症和/或疾病的部分或完全治愈方面尤其有治疗作用(therapeutic)。本文使用的“治疗”覆盖了脊椎动物、哺乳动物尤其是人中的病症和/或疾病的任何治疗，并包括：(a)抑制病症和/或疾病，即阻止它的发展；或(b)减轻或改善病症和/或疾病的症状，即引起酶降解/病症和/或疾病的症状消退。

术语“病症”和/或“疾病”在本文中可互换使用，并指影响动物包括人的异常状况(condition)，其可使用本发明的生物材料来治疗。因此，伤口、损伤、组织降解、微生物感染、烧伤、溃疡、皮肤病的治疗都包括在本发明内。此外，还包括心瓣膜、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织、***、硬膜、皮肤组织、血管组织、软骨组织、心包膜、韧带、腱、血管、脐带组织、骨组织、筋膜和粘膜下组织的置换。

本发明的抗钙化生物材料还可应用于各种医疗装置接触表面中的任何一种。接触表面包括但不限于意欲接触动物尤其包括人的血液、细胞或其它体液或组织的表面。合适的接触表面包括意欲接触血液或其它组织的医疗装置的一个或多个表面。医疗装置包括动脉瘤卷曲(aneurysm coil)、人造血管、人造心脏、人造瓣膜、人造肾、人造腱和韧带、血袋、血充氧器、骨和心血管置换物、骨修复物、骨蜡、心血管移植物、软骨置换装置、导管、隐形眼镜、用于细胞和组织培养和再生的容器、栓塞颗粒、过滤***、移植物、导向槽(guide channel)、内置导管、实验室仪器、微珠、神经生长导向装置、眼植入物、整形植入物、起搏器导联、探针、修复材料、分流器、支撑架、用于肽的载体、手术器械、缝合线、注射器、尿道置换物、伤口覆盖物、伤口敷料、伤口愈合装置和本领域中已知的其它医疗装置。

能从本发明的应用中受益的医疗装置的其它例子对于手术和医疗过程领域的那些技术人员来说是显而易见的，并因此被本发明所包括。接触表面可包括网眼、卷曲、导线(wire)、充气气球或能在目标位置被植入的任何其它结构，目标位置包括血管内位置、内腔内位置、实质组织内的位置等。可植入装置可用于永久或临时植入。这些装置可被输送或结合到血管内的导管和其它医疗导管内。

可通过等离子涂覆技术(plasma coating technique)进行这些装置的表面涂覆过程，如国际专利申请WO96/24392中所述。

在一种优选的实施方案中，本发明的生物材料直接用作伤口敷料。例如，如上文所述，可将生物材料干燥并直接用作伤口敷料。

本发明的伤口敷料优选为连续片状形式，类似于本领域中已知的伤口敷料。但是，本发明也可采取其它特定的构造。例如，可通过由上述生物材料的备料片(stock sheet)切割所需的设计图案来制造本发明的伤口敷料。例如，可由生物材料的备料片压膜切割(die-cut)所述的片。

使用时，本发明的伤口敷料优选用作直接接触伤口基层(wound bed)的主敷料，或近到实际紧靠伤口基层。敷料可用作填充材料，如果需要，可用任何合适的第二伤口敷料或装置如包裹材料、带、纱布、垫、缝合线或夹子紧固(secure)到位置内。敷料可为临时性或永久性的，并可被永久结合到愈合的组织内。必要时，通过首先除去任何过度敷裹的材料(over-dressingmaterial)然后除去敷料来更换伤口敷料，从而移开任何积聚的坏死组织和渗出物。本发明的临时伤口敷料可被新敷料或其它合适伤口覆盖物置换。

敷料可以其整体放置到伤口内。可将本发明的敷料切割、成型和改变，以适应大量用途和应用。

本发明的生物材料的另一用途在于输送上述应用中任何一种中包括的治疗活性剂。治疗活性剂可参与并改进伤口愈合过程，并可包括抗微生物剂，包括但不限于抗真菌剂、抗细菌剂、抗病毒剂和抗寄生物剂，生长因子，血管生成因子，抗炎剂，抗血栓形成剂，麻醉剂，粘多糖，金属和其它伤口愈合剂。

本发明中可使用的抗微生物剂的例子包括但不限于异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氯法齐明、利福布汀、氟喹诺酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四环素、红霉素、环丙沙星、多西环素、氨苄西林、两性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、戊烷脒、阿托伐醌、巴龙霉素、地克珠利(diclazaril)、无环鸟苷、三氟尿苷、膦甲酸、青霉素、庆大霉素、更昔洛韦、伊曲康唑(iatroconazole)、咪康唑、吡硫锌、重金属包括但不限于金、铂、银、锌和铜、以及它们的组合形式，包括盐，如氯化物、溴化物、碘化物和高碘酸盐，以及与载体的复合物，和其它形式。

可被结合到本发明的伤口敷料装置内的生长因子剂包括但不限于碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素-样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤血管生成因子(TAF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、转化生长因子α和β(TGF-α和TGF-β)、白细胞介素-8(IL-8)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；白细胞介素，和干扰素。

可被结合到本发明的伤口敷料内的其它药剂为酸性粘多糖，包括但不限于肝素、硫酸肝素、类肝素、硫酸皮肤素、多硫酸戊聚醣、纤维素、琼脂糖、壳多糖、葡聚糖、角叉胶、亚油酸和尿囊素。

抗炎药和抗血栓形成剂的例子包括endomethycin、肝素、消炎痛、布洛芬、阿司匹林、水杨酸胆碱、二氟尼柳、水杨酸镁、水杨酸胆碱镁、双水杨酯、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬、萘普生、甲氧萘丙酸钠、奥沙普秦、双氯酚酸钠、双氯酚酸米索前列醇、依托度酸、吲哚美辛、酮咯酸、natumetone、舒林酸、托美丁、磺吡酮、双嘧达莫、噻氯匹定、伐地考昔、罗非考昔、吡罗昔康、美洛昔康、甲氧胺苯酸钠、甲芬那酸、环磷酰胺、环孢霉素、micromulsion、苯丁酸氮芥、阿那格雷、氯吡格雷和西洛他唑；抗血栓形成剂可为选自下组的抗凝血剂：肝素、阿地肝素、依诺肝素、亭扎肝素、达那肝素、elpiruden和水蛭素。

可通过本领域中众所周知的方法将治疗活性剂以物理或化学方式结合于本发明的生物材料。

“包含”指包括但不限于，措词“包含”后面所跟随的任何事物。因此，使用术语“包含”表示列举的要素是必需的或强制性的，而其它要素是任选的，且可以存在或可以不存在。术语“由…组成”指包括但限于，短语“由…组成”后面所跟随的事物。因此短语“由…组成”表示列举的要素是必需的或强制性的，并且不存在其它要素。“基本由…组成”指包括短语后列举的任何要素，并限于对列举的要素没有干扰或有助于公开中详明的活性或作用的其它要素。因此，术语“基本由…组成”表示列举的要素是必需的或强制性的，但其它要素是任选的，并可依据它们是否影响所列举要素的活性或作用可以存在或不存在。

现在仅通过参考以下非限制性实施例来进一步描述本发明。但是，应认识到，下面的实施例仅仅是说明性的，不应以任何方式视为对上述发明一般性的限制。特别地，尽管本发明详细描述有关来自牛、猪和有袋动物来源的心包膜、带瓣主动脉根、瓣膜小叶和主动脉壁组织的处理，但应清楚认识到，本文的发现不限于这些具体的组织或动物来源。

实施例1  生物材料的基本加工

在西澳大利亚通过职业袋鼠射手收获来自成年西部灰袋鼠的袋鼠心脏，并在死亡4-6小时内在冰袋上运送到实验室。在冰冷的0.9％盐水溶液中洗涤心脏两次。取下心包膜，并从粘连脂肪和松散***上仔细清洗。将带有主动脉瓣的主动脉根从心脏上切开，并放在包含0.5mM苯基-甲基-磺酰基-氟化物(PMSF)的冰冷0.9％盐水中。将心包膜在包含0.5mM PMSF的冰冷0.9％盐水中在4℃存放过夜，并将带瓣主动脉根在包含PMSF的0.9％盐水溶液中洗涤20分钟。

制备60-80％v/v乙醇的水溶性含醇溶液。将心包膜在4℃下存放过夜后浸没到醇溶液中。将带瓣主动脉根在冰冷0.9％盐水(包含0.5mM PMSF)中最终洗涤后，立即浸没在相同的醇溶液中。将心包膜和带瓣主动脉根在醇溶液中在约5℃保持最少24小时。

从醇溶液中取出心包膜和带瓣主动脉根，并用0.9％盐水冲洗约10分钟。在冲洗期间，保持冲洗溶液的温度在大约10℃。

将心包膜和带瓣主动脉根浸没在于无菌去离子水中包含9.07g/l磷酸二氢钾缓冲剂的0.625％戊二醛溶液中。用氢氧化钠将戊二醛溶液的pH调节到7.4。在戊二醛溶液中在1-5℃将心包膜和带瓣主动脉根固定最少24小时以使组织胶原中存在的蛋白质交联。

从戊二醛溶液中取出心包膜和带瓣主动脉根，并在无菌0.9％氯化钠中冲洗约15分钟。在冲洗期间，保持冲洗溶液的温度在大约10℃。

然后通过两种交替的过程处理心包膜和带瓣主动脉根。在第一个过程中，将心包膜和带瓣主动脉根浸没在每1ml去离子水体积包含8mg二羧酸的无缓冲剂的溶液中。用一定体积的稀盐酸将溶液的pH调节到pH 4.5。在约45℃的温度下将心包膜和带瓣主动脉根在溶液中浸没约48小时。

在第二个过程中，将心包膜和带瓣主动脉根在包含溶解在去离子水中的多价阳离子如镁、铁和铝盐的在pH 3.5的无缓冲剂的溶液中浸没大约60分钟。

然后通过将组织浸入在无菌去离子水包含9.07g/l磷酸二氢钾缓冲剂的0.25％戊二醛溶液中来对生物材料进行灭菌。用氢氧化钠将醛溶液的pH调节到7.4。灭菌过程在大约45℃的温度下进行约120分钟。

或者，将生物材料在37℃在包括2wt％环氧丙烷连同20wt％乙醇的水溶液中灭菌约24小时。然后将灭菌的组织存放在含0.2％缓冲的戊二醛加15％异丙醇中。

实施例2  温度对生物材料的影响

变性温度是交联稳定性的重要量度，它反映材料强度、耐久性和完整性。

从西澳大利亚的当地屠宰场(abattoir)得到牛心包膜，并在冰上运送到实验室。按实施例1所述清洗心包膜。

将根据实施例1所述方法制备的牛心包膜的交联程度和在0.625％缓冲的戊二醛中固定的牛心包膜(对照心包膜)进行比较。

将每组中的代表性心包样品条(5×10mm)连接到等长测力传感器(isometric force transducer)(MLT0500，AD Instruments，澳大利亚)上，传感器与PowerLab数据获取***和台式个人计算机连接。用90±5g的负荷将样品保持恒定的伸展，并浸没到开口的控温的装有0.9％盐水的水浴中。以大约1.5℃/min将水浴的温度从25℃逐渐升高到95℃。当胶原材料变性时，在恒定伸展状态的尖拐点(reflection point)处指示收缩温度。结果(以摄氏温度表示的收缩温度)总结在表I中。

表I

实施例3  生物材料的酶法降解

将按照实施例1所述方法制备的牛心包膜(处理的心包膜)的抗酶降解水平和在0.625％缓冲的戊二醛中固定的牛心包膜(对照心包膜)进行比较。

通过在包含0.1M甘氨酸的200ml HEPES缓冲溶液(0.01M，pH7.4)中溶解100mg链霉蛋白酶(灰色链霉菌(Streptomyces griseus))和100mg氯化钙来制备链霉蛋白酶溶液。将固定的组织样品在去离子水中冲洗3分钟，进行印迹，在70℃下干燥过夜并称重。将这些样品在50℃的链霉蛋白酶溶液中温育24小时。将剩余的组织样品在去离子水中冲洗，在70℃下干燥过夜并称重。通过剩余组织的质量确定对链霉蛋白酶消化的抗性，表示为消化前(pre-digested)组织质量的百分比。结果总结在表II中。

表II

实施例4  生物材料的拉伸强度(tensile strength)

拉伸强度为材料强度的重要量度，反映交联组织的耐久性。

将按照实施例1所述方法制备的牛心包膜(处理的心包膜)的拉伸强度和在0.625％缓冲的戊二醛中固定的牛心包膜(对照心包膜)进行比较。

用装备有10千牛顿测力传感器(load-cell)的液压Zwick/Roell(2010型)拉伸试验机在50mm/min的恒定拉伸速度下测量两组组织的代表性心包条(8×80mm)的拉伸强度。由记录的负荷/伸长率(load/elongation)曲线评价拉伸强度和断裂伸长率(elongation at break)。结果总结在表III中。

表III

实施例5  生物材料的钙化曲线(calcification profile)

在小动物和大动物模型中进行实验研究以评价上述方法对减轻处理的含胶原生物材料钙化的效力(effectiveness)。

在第一个动物研究中，将通过仅在0.625％缓冲的戊二醛中标准固定而制备的袋鼠瓣膜小叶和袋鼠主动脉壁组织(未处理组织)和根据实施例1中所述方法处理的袋鼠瓣膜小叶和袋鼠主动脉壁组织(处理过的组织)进行比较。

将两组的主动脉壁组织样品(10×5mm大小)和主动脉瓣膜小叶在0.9％盐水中冲洗5分钟。在生长的(6周龄)雄性Wistar大鼠的中央背壁区域(central dorsal wall area)中产生的皮下袋(subcutaneous pocket)中通过手术植入冲洗的组织(每个大鼠每组一个样品)。60天后，将外植的组织从周围的宿主组织中剖出，并在Biotherm温育器(Selby Scientific，Perth，WA)中在90℃干燥48小时。称量干燥的样品，在75℃的5.0ml 6N超纯盐酸(Merck，Perth，WA)中提取钙含量24小时。然后使用原子吸收分光光度计(VarianAA1275)测量可提取的钙含量，并表示为μg钙/mg组织(干重)。这些数据总结在表IV中。

表IV

减轻钙化的新方法的效力在表IV中是显而易见的。处理过的组织中的钙水平可与正常存在于未固定组织中的水平相比较，由此表明新方法与仅仅标准戊二醛固定相比具有优越性。

实施例6   在羊(sheep)中的进一步钙化研究

在另一动物研究中，将根据实施例1中所述在0.625％缓冲的戊二醛中固定的袋鼠带瓣主动脉管道(处理过的组织)和实施例1中提取的带瓣主动脉根(未处理的组织)进行比较。将主动脉根在0.9％盐水中冲洗5分钟，并通过手术植入到幼年(4月龄)Merino-Dorset杂交羊的肺动脉位置处。200天后取出这些带瓣的植入物，并如上所述通过原子吸收分光光度法测定瓣膜小叶和主动脉壁组织的钙含量。

结果(μg钙/mg干组织)总结在表V中。

表V

实施例7  利用得自猪的组织的进一步钙化研究

在另一动物研究中，将在缓冲的0.625％戊二醛中固定的未处理的猪主动脉带瓣管道(未处理的组织)和按照实施例1中所述方法制备的猪带瓣管道(处理的组织)进行比较。将猪带瓣管道在0.9％盐水中冲洗5分钟，并通过手术植入到幼年(4月龄)Merino-Dorset杂交羊的肺动脉位置处。200天后取出这些带瓣的植入物，并如上文所述通过原子吸收分光光度法测定瓣膜小叶和主动脉壁组织的钙含量。

结果(μg钙/mg干组织)总结在表VI中。

表VI

实施例8  牛心包膜的钙化

在另一动物研究中，将在0.625％缓冲的戊二醛中固定的牛心包膜(对照心包膜)的钙化潜力(calcification potential)与按照实施例1所述方法制备的牛心包膜(处理的心包膜)的钙化潜力进行比较。将每组的代表性样品修剪至1×1cm大小，并在0.9％盐水中冲洗5分钟。在生长的(6周龄)雄性Wistar大鼠的中央背壁区域中产生的皮下袋中通过手术植入这些样品。60天后，取出这些组织，除去宿主组织，并通过原子吸收分光光度法测定钙含量。结果(μg钙/mg干组织)总结在表VII中。

表VII

实施例9  去细胞化的(decellularized)袋鼠心包膜的钙化

在另一动物研究中，将在0.625％缓冲的戊二醛中固定的袋鼠心包膜(对照心包膜)的钙化潜力与已经去细胞并按照实施例1所述方法制备的袋鼠心包膜(处理的心包膜)的钙化潜力进行比较。

将每组的代表性样品修剪至1×1cm大小，并在0.9％盐水中冲洗5分钟。在生长的(6周龄)雄性Wistar大鼠的中腹部背壁区域中产生的皮下袋中通过手术植入这些样品。60天后，取出这些组织，除去宿主组织，并通过标准步骤利用原子吸收分光光度法测定钙含量。结果(μg钙/mg干组织)总结在表VIII中。

表VIII

实施例10  去细胞化的袋鼠心包膜的重新细胞化(recellularization)

在第六个动物研究中，将在0.625％缓冲的戊二醛中固定的去细胞化的袋鼠心包膜(对照心包膜)的重新细胞化潜力和按照实施例1中所述方法制备的去细胞化的袋鼠心包膜(处理的心包膜)的重新细胞化潜力进行比较。将袋鼠心包膜在0.25％Triton x-100和0.25％十二烷基硫酸钠中在室温下脱细胞24小时，并在培养基中冲洗20分钟。将每组心包膜的代表性样品(n＝5)修剪至2×2cm大小，并在0.9％盐水中冲洗5分钟。在无菌条件下用从人隐静脉(saphenous vein)收获的3.0×10⁵人成纤维细胞/cm²接种这些样品。在37℃在标准静态细胞培养条件下将接种的心包膜培育21天。每7天用显微镜评价细胞生长，并按照下面的视觉等级分类：

1)基质表面上不存在活的成纤维细胞；

2)小于50％的基质表面被成纤维细胞覆盖(+)；

3)超过50％的基质表面被成纤维细胞覆盖(++)；

4)基质被多层成纤维细胞完全覆盖(+++)。

在21天时利用快速比色分析MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltertra-zolium bromide)试验确认在对照心包膜上不存在活的成纤维细胞而在处理过的心包膜上存在活的成纤维细胞(对于MTT方法，参见例如，Zund等，1999，Eur J CardiothoracSurg.，5(4)：519-24)。结果总结在表IX中。

表IX

实施例11  袋鼠组织的交联稳定性

使用实施例1中直到并包括步骤(b)所列出的过程，即醇溶液预处理然后戊二醛交联来处理两类袋鼠组织—主动脉壁组织和袋鼠心包膜。然后将这些处理过的组织与戊二醛固定的组织即没有醇预处理的和“新鲜”的组织进行比较。图1和图2显示了心包膜(图1)和主动脉壁组织(图2)的交联稳定性。可以看出，利用乙醇的预处理对于在～85℃-86℃的交联稳定性有明显影响。这些数据还可在表X中看到。

表X

交联稳定性—袋鼠心包膜

收缩温度(℃)：n＝5

新鲜的                66.55±1.200

戊二醛固定的          80.74±1.047

醇+戊二醛固定         84.62±0.465

P＝0.016(戊二醛固定相对于醇+戊二醛固定)

交联稳定性—袋鼠DESC主动脉壁

收缩温度(℃)：n＝5

新鲜的                65.00±1.423

戊二醛固定的          80.11±1.281

醇+戊二醛固定         86.21±0.449

P＝0.002(戊二醛固定相对于醇+戊二醛固定)

实施例12  皮下大鼠模型中的交联稳定性和钙化行为

这个研究旨在比较用实施例1公开的方法处理的猪组织(前尖(cusp)和壁)与戊二醛固定的组织对照物和商业制备的Freestyle和PrimaPlus

生物修复组织相比的交联稳定性和钙化行为。

收获新鲜的猪带瓣主动脉根并在4℃在磷酸盐缓冲的盐水(PBS；0.1M，pH7.4)中运送。从主动脉根取下代表性主动脉瓣前尖(n＝30)和主动脉壁样品(n＝30；10mm×15mm)并分成两组。组I包括存放在0.25％缓冲的戊二醛中的瓣前尖(n＝15)和代表性主动脉壁样品(n＝15；10mm×15mm)。组II包括暴露于实施例1公开的方法并存放在0.25％缓冲的戊二醛中的瓣前尖(n＝15)和代表性主动脉壁样品(n＝15；10mm×15mm)。为了比较，第三组(III)由来自Freestyle

生物修复物的瓣前尖(n＝10)和主动脉壁样品(n＝10；10mm×15mm)组成，而组IV由来自PrimaPlus

生物修复物的瓣前尖(n＝10)和主动脉壁组织(n＝10；10mm×15mm)组成。

收缩温度测量用于评价组织的胶原交联的稳定性(Levy等，1986，Am.J.Pathol.，122：71-82)。将每组中的前尖和主动脉壁样品组织条(5×10mm；n＝10)连接到等长测力传感器(MLT0500，AD Instruments，澳大利亚)上，传感器与PowerLab数据获取***和台式个人计算机连接。

用90±5g的负荷将样品保持恒定伸展，并浸没到开口的控温的装有0.9％盐水的水浴中。以大约1.5℃/min逐渐将水浴的温度从25℃升高到95℃。当胶原材料变性时，恒定伸展中的尖拐点指示收缩温度。

瓣前尖和主动脉壁组织的收缩温度列在表XI中。在对照、实施例1的试验过程(“试验”)、Freestyle

和Prima Plus前尖之间没有发现显著差异。与对照、Freestyle

和Prima Plus

壁组织相比，试验过程-处理的主动脉壁组织表现出显著(p＜0.05)较高的收缩温度。

表XI

瓣前尖和主动脉壁组织的收缩温度(℃)

(n＝10/组)

值为平均值±SE。

^*p＜0.05(试验相对于对照、Freestyle、Prima Plus)。

对于蛋白水解酶消化的抗性基于Girardot & Girardot的方法(J.HeartValve Dis.，1996，122：71-82)。通过在包含0.1M甘氨酸的200ml HEPES缓冲溶液(0.01M，pH7.4)中溶解10mg链霉蛋白酶E(来自灰色链霉菌的XIV型；Sigma)和100mg氯化钙来制备链霉蛋白酶溶液。将固定的组织样品在去离子水中冲洗3分钟，进行印迹，在70℃下干燥过夜并称重。然后在50℃的链霉蛋白酶溶液中将这些样品培育24小时。将剩余的组织样品在去离子水中冲洗，在70℃下干燥过夜并称重。通过剩余组织的质量确定对于链霉蛋白酶消化的抗性，表示为消化前组织质量的百分比。

对酶降解的抗性在图3中图示。与对照相比，试验过程、Freestyle

和Prima Plus

前尖组织显示对蛋白水解消化的抗性显著(p＜0.0001)增加(图3A)。在试验过程、Freestyle

和Prima Plus

前尖组织之间没有观察到显著差异。

试验过程-处理的主动脉壁组织显示与对照组织相同的对蛋白水解消化的抗性(p＝NS)，和比Freestyle

和Prima Plus

壁组织显著(p＜0.01)较高的抗性(图3B)。

将年幼雄性Wistar大鼠(体重150-200g)分成两组；一组(n＝10)接受前尖植入物，第二组(n＝10)接受主动脉壁植入物。每个动物都接受四组组织中每组的一个样品，总计80个植入物。

用戊巴比妥(pentobarbital)(Nembutal

；45mg/kg，腹膜内)麻醉大鼠。刮净背肌区域，并用15％稀释的葡萄糖酸洗必泰(chlorhexidine gluconate)(ICIPharmaceuticals，Perth，WA)和乙醇(Merck Chemicals，Perth，WA)消毒。

将植入物在去离子水中充分冲洗2分钟以消除残余固定剂，然后通过背肌壁内的2.5cm切口植入到皮下袋(subcutaneous pouches)内。用5-0聚丙烯纺织纤维缝合线(Prolene suture)封闭切口。

8周后用过剂量的巴比妥酸盐(barbiturate)(Euthenase

)宰杀大鼠，取出包含皮下植入物的背肌壁用于定量和定性组织钙分析。将每个收回的样品分成两个解剖学上对称的二等份(halve)。一半用于原子吸收分光光度法分析，另一半被固定在10％缓冲的甲醛中并进行处理用于组织学分析(histology)。

将固定样品嵌入石蜡中，在3μm处切开，并用Von Kossa染色剂处理用于定性钙分析。使用Olympus BHS光学显微镜进行组织学检查。

将来自所有组的外植组织样品剖离而不含周围的宿主组织，在Biotherm培育器(Selby Scientific，Perth，WA)中在90℃干燥48小时。称量干燥的样品，在75℃在5.0ml 6N超纯盐酸(Merck，Perth，WA)中提取钙含量24小时。然后使用原子吸收分光光度计(Varian AA1275)测量可提取的钙含量，并表示为μg钙/mg组织(干重)。

组织学检查表明在外植的对照前尖样品中存在严重的内源性钙化(数据未示出)。在ADAPT、Freestyle或Prima Plus瓣前尖中没有表现出可见的钙化(数据未示出)。

在对照样品中外植的主动脉壁组织显示介质的几种钙化(数据未示出)。在外植的试验主动脉壁组织中没有表现出可见的钙化(数据未示出)。在外植的Freestyle(数据未示出)和Prima Plus(数据未示出)主动脉壁组织中表现出介质的中度钙化。

外植的前尖的定量组织钙水平在图4A中图示。仅仅在戊二醛中固定的对照样品在这种模型中显示出最高的钙水平(92.37±7.9μg/mg)。通过用实施例1的方法处理的组织的钙水平为2.09±0.22μg/mg组织，而Freestyle为2.03±0.29μg/mg和Prima Plus

为1.54±0.17μg/mg。这意味着经过处理的前尖与对照样品相比显著降低了钙水平(p＜0.001)。在八周后的实施例1、Freestyle

和Prima Plus

前尖的组织钙水平之间没有显著的差异。

外植的主动脉壁样品的定量组织钙水平在图4B中图示。实施例1处理的主动脉壁样品的钙含量(4.86±0.12μg/mg组织)比对照样品的钙含量(120.11±7.48μg/mg组织)显著(p＜0.001)降低(95.9％)。Freestyle

和Prima Plus

主动脉壁样品分别表现出47.8％和51.95％的钙化降低。

这些数据表明，实施例1中公开的方法在减少皮下大鼠模型中猪前尖和壁组织两者中的钙化方面是有效的。这些数据还表明，增强的交联在减少主动脉壁钙化方面起了重要作用。

Claims (76)

1.一种制造抗钙化的可植入生物材料的方法，其包括：

(a)将生物材料暴露于含醇溶液中至少24小时。

(b)将步骤(a)中的所述材料暴露于交联剂；和

(c)将步骤(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；

其中在步骤(a)之后依次进行步骤(b)和(c)。

2.一种处理含胶原的生物材料产生抗钙化的生物材料的方法，其包括：

(a)将生物材料暴露于含醇溶液中；

(b)将步骤(a)中的所述材料暴露于交联剂；和

(c)将步骤(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；

其中在步骤(a)之后依次进行步骤(b)和(c)。

3.根据权利要求1或2的方法，在步骤(a)和(b)之间和/或步骤(b)和(c)之间还包括冲洗步骤。

4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，还包括在步骤(c)后的冲洗步骤。

5.根据权利要求4的方法，其中冲洗生物材料的步骤是使用不含磷酸盐的0.9％盐水溶液进行的。

6.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中生物材料包括胶原。

7.根据权利要求1-6中任何一项的方法，其中生物材料是从动物分离的。

8.根据权利要求7的方法，其中动物选自绵羊、牛、山羊、马、猪、有袋动物和人。

9.根据权利要求1-6中任何一项的方法，其中生物材料为培养的组织、包含从动物得到的细胞外基质的假体或再生的组织。

10.根据权利要求1-8中任何一项的方法，其中生物材料为选自以下的细胞组织：心血管组织、骨盆底组织、心脏组织、心瓣膜、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织、***、软或实质器官的基质、硬膜、皮肤组织、血管组织、硬膜、软骨组织、心包膜、韧带、腱、血管、脐带组织、骨组织、筋膜和粘膜下组织或皮肤。

11.根据权利要求1-10中任何一项的方法，其中步骤(a)中使用的含醇溶液包括一种或多种水溶性醇。

12.根据权利要求11的方法，其中水溶性醇为C₁-C₆低级醇。

13.根据权利要求12的方法，其中C₁-C₆低级醇选自甲醇、乙醇、环己醇、异丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇或它们的组合。

14.根据权利要求1-13中任何一项的方法，其中含醇溶液在非缓冲含水溶剂中包括小于100％的醇。

15.根据权利要求1-14中任何一项的方法，其中进行步骤(a)至少24小时。

16.根据权利要求1-14中任何一项的方法，其中进行步骤(a)至少36小时。

17.根据权利要求1-14中任何一项的方法，其中进行步骤(a)至少48小时。

18.根据权利要求1-17中任何一项的方法，其中交联剂选自碳二亚胺、聚环氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、多醛和叠氮化磷酸二苯酯(DPPA)或它们的组合。

19.根据权利要求18的方法，其中多醛为戊二醛。

20.根据权利要求1-19中任何一项的方法，还包括在步骤(c)后的灭菌步骤。

21.根据权利要求1-20中任何一项的方法，其中在2℃和40℃之间的温度下进行每个步骤。

22.根据权利要求21的方法，其中温度在4℃和30℃之间。

23.根据权利要求21的方法，其中温度在5℃和25℃之间。

24.根据权利要求1-23中任何一项的方法，其中酸性溶液包含能灭活和/或改变步骤(b)后生物材料中存在的固定和/或非固定交联剂部分的酸。

25.根据权利要求1-23中任何一项的方法，其中酸性溶液包含能使胶原上的活性羧基和胺基交联形成酰胺键的酸。

26.根据权利要求1-25中任何一项的方法，其中步骤(c)中使用的酸性溶液包含氨基羧酸。

27.根据权利要求26的方法，其中氨基羧酸选自L-组氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸。

28.根据权利要求1-27中任何一项的方法，其中含醇溶液、交联剂和酸性溶液都是不含缓冲剂的。

29.根据权利要求1-28中任何一项的方法，其中步骤(c)被步骤(d)替换或被步骤(d)补充，所述步骤(d)包括将步骤(b)中的所述材料暴露于包含一种或多种多价阳离子的无缓冲剂的溶液。

30.根据权利要求29的方法，其中多价阳离子选自镁、铁和铝盐。

31.通过根据权利要求1-30中任何一项的方法制造的抗钙化生物材料。

32.一种抗钙化生物材料，其包括交联的胶原，其中所述生物材料的钙含量小于约50μg/mg生物材料，和其中所述生物材料能被植入至少200天而该生物材料不会增加其钙含量超过50μg/mg生物材料，且其中所述交联胶原包括仲胺。

33.根据权利要求32的抗钙化生物材料，其中植入前的所述生物材料的钙含量小于约20μg/mg生物材料。

34.根据权利要求32的抗钙化生物材料，其中植入前的所述生物材料的钙含量小于约10μg/mg生物材料。

35.一种可植入生物装置，其包括根据权利要求31-34中任何一项的抗钙化生物材料。

36.根据权利要求35的装置，其中所述生物材料被涂布到所述装置的表面上。

37.根据权利要求35或权利要求36的装置，还包括至少第二涂层。

38.根据权利要求37的装置，其中所述至少第二涂层包括抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂、生长因子、抗脱水剂或防腐剂。

39.根据权利要求38的装置，其中抗微生物剂选自异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氯法齐明、利福布汀、氟喹诺酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四环素、红霉素、环丙沙星、多西环素、氨苄西林、两性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、戊烷脒、阿托伐醌、巴龙霉素、diclazaril、无环鸟苷、三氟尿苷、膦甲酸、青霉素、庆大霉素、更昔洛韦、iatroconazole、咪康唑、吡硫锌、重金属包括但不限于金、铂、银、锌和铜、以及它们的组合形式，包括盐，如氯化物、溴化物、碘化物和高碘酸盐，以及与载体的复合物，和其它形式。

40.根据权利要求38的装置，其中生长因子剂选自羟基磷灰石、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素-样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤血管生成因子(TAF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、转化生长因子α和β(TGF-α和TGF-β)、白细胞介素-8(IL-8)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；白细胞介素，和干扰素。

41.根据权利要求37的装置，其中所述至少第二涂层还包括选自以下的生物可吸收材料：聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，聚二氧杂环己酮，聚己内酯，多肽，聚碳酸酯，聚羟基丁酸酯，聚(亚烷基草酸酯)，醋酸乙烯酯与不饱和羧酸的共聚物，水溶性或可分散性纤维素衍生物，氧化乙烯聚合物，聚丙烯酰胺，胶原，明胶，聚(原酸酯)，氨基酸的聚酰胺，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚醚醚酮，磷酸三钙，和它们的混合物。

42.根据权利要求35-41中任何一项的装置，其中所述装置选自人造心脏、内部或外部心脏辅助装置、心瓣膜假体、瓣环、皮肤移植物、血管移植物、血管支撑架、结构支撑架、血管分流器、心脏血管分流器、硬膜移植物、软骨移植物、软骨植入物、心包膜移植物、韧带假体、腱假体、膀胱假体、小拭子、缝合线、永久留置经皮装置、外科补片、心血管支撑架、涂层支撑架和涂层导管。

43.根据权利要求42的装置，其中装置为心瓣膜假体。

44.根据权利要求35-43中任何一项的装置，其中装置还包括组织碎片。

45.根据权利要求44的装置，其中组织碎片是从动物收获的。

46.根据权利要求45的装置，其中动物选自人、牛、猪、狗、鹿和袋鼠。

47.根据权利要求35-46中任何一项的装置，其中装置还包括组织的合成类似物。

48.根据权利要求45-47中任何一项的装置，其中组织碎片包括大量细胞，当在手术部位植入时，大量细胞中的至少一部分能迁移出组织碎片，增殖并在植入部位处与周围组织结合。

49.一种生物相容植入物，包括生物相容的支架，该支架包括含有交联胶原的抗钙化生物材料，其中所述生物材料的钙含量小于约50μg/mg生物材料，和其中所述交联胶原包括仲胺。

50.根据权利要求49的生物相容植入物，其中植入前的所述生物材料的钙含量小于约20μg/mg生物材料。

51.根据权利要求49的生物相容植入物，其中植入前的所述生物材料的钙含量小于约10μg/mg生物材料。

52.一种生物相容植入物，包括生物相容的支架，该支架包括含有交联胶原的抗钙化生物材料，其中所述胶原包括仲胺。

53.根据权利要求52的植入物，其中支架还包括合成聚合物、天然聚合物、可注射凝胶、陶瓷材料、同体组织、同种异体组织、异种组织和它们的组合。

54.一种用于修复组织损伤的试剂盒，包括：

(a)具有一种或多种根据权利要求35-48中任何一项的装置或根据权利要求49-53中任何一项的植入物的无菌容器；和

(b)针对损伤受试者的说明书。

55.根据权利要求54的试剂盒，还包括：

(c)用于从损伤受试者收集至少一种活组织样品的收获工具。

56.根据权利要求55的试剂盒，还包括至少一种用于维持至少一种组织样品生存力的试剂。

57.权利要求55的试剂盒，其中收获工具还包括用于将组织样品在无菌条件下分成至少一个组织碎片的加工工具。

58.一种处理活外植组织的方法，包括：

(a)将生物材料暴露于含醇溶液至少24小时；

(b)将步骤(a)中的所述材料暴露于交联剂；和

(c)将步骤(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；其中步骤(b)和(c)在步骤(a)之后依次进行。

59.根据权利要求58的方法，其中将所述经处理的活外植组织结合到医疗装置内部或上面。

60.根据权利要求58或59的方法，其中处理外植组织的方法为选自以下的组织处理方法：组织修复、组织填充、美容处理、治疗处理、组织增大和组织封口。

61.一种伤口敷料，其包括含有交联胶原的根据权利要求31-34中任何一项的抗钙化生物材料，其中所述胶原包括仲胺。

62.根据权利要求61的伤口敷料，其中将所述抗钙化生物材料在交联前暴露于醇。

63.根据权利要求62的伤口敷料，其中所述醇为C₁-C₆低级醇。

64.根据权利要求63的伤口敷料，其中C₁-C₆低级醇选自甲醇、乙醇、环己醇、异丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。

65.根据权利要求61-64中任何一项的伤口敷料，其中交联剂选自碳二亚胺、聚环氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、多醛和叠氮化磷酸二苯酯(DPPA)。

66.根据权利要求65的伤口敷料，其中多醛为戊二醛。

67.根据权利要求61-66中任何一项的伤口敷料，其中生物材料选自绵羊胶原、牛胶原、山羊胶原、马胶原、猪胶原、有袋动物胶原和人胶原。

68.根据权利要求67的伤口敷料，还包括选自以下的硫酸化多糖：肝素、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸己糖醛酸基己糖氨基聚糖、六硫酸肌醇和八硫酸蔗糖。

69.根据权利要求61-68中任何一项的伤口敷料，还包括抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂、生长因子、抗脱水剂或防腐剂。

70.根据权利要求69的伤口敷料，其中抗微生物剂选自异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氯法齐明、利福布汀、氟喹诺酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四环素、红霉素、环丙沙星、多西环素、氨苄西林、两性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、戊烷脒、阿托伐醌、巴龙霉素、diclazaril、无环鸟苷、三氟尿苷、膦甲酸、青霉素、庆大霉素、更昔洛韦、iatroconazole、咪康唑、吡硫锌、重金属包括但不限于金、铂、银、锌和铜、以及它们的组合形式，包括盐，如氯化物、溴化物、碘化物和高碘酸盐，以及与载体的复合物，和其它形式。

71.根据权利要求69的伤口敷料，其中生长因子剂选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素-样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤血管生成因子(TAF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、转化生长因子α和β(TGF-α和TGF-β)、白细胞介素-8(IL-8)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；白细胞介素，和干扰素。

72.根据权利要求31-34中任一项的抗钙化生物材料，包括交联的胶原，其中所述交联的胶原包括仲胺。

73.根据权利要求72的抗钙化生物材料，其中生物材料包括至少50％的胶原。

74.根据权利要求73的抗钙化生物材料，其中生物材料包括至少70％的胶原。

75.根据权利要求74的抗钙化生物材料，其中生物材料包括至少90％的胶原。

76.根据权利要求75的抗钙化生物材料，其中生物材料由胶原组成。

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