CN101766842B - 人工器官用生物组织材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的生物组织材料是一种以猪主动脉血管为基体,以氧化海藻酸钠为交联剂制备的人工器官用生物组织材料,其制备的主要工序为:(1)将自屠宰场活杀猪体上取下的主动脉血管进行清洗,去除血迹和脂肪;(2)将清洗干净的猪主动脉血管用由缓冲液和氧化海藻酸钠交联剂配制成的交联液进行交联处理,交联体系的氧化海藻酸钠浓度为10~15g/100ml,pH值为4.0-7.4,温度为室温。经充分交联制备的人工器官用生物组织材料,既具有高分子材料富有韧性、弹性好的力学特征,又有适于周围细胞长入的天然结构,还有类似生物活性蛋白的促使细胞在其表面黏附生长的特点,预期应用于临床可作为各种软组织移植物替代材料。
Description
技术领域
本发明涉及人体器官替代人工生物组织材料技术,更具体地说,是涉及一种人体软组织移植物用生物组织材料技术,属于生物材料领域。
技术背景
每年因各种疾病或车祸等因素使得临床上需要大量的软组织移植物,比如食管癌引起器官缺损需人工食道移植物,动脉粥样硬化引起血管损害需人工血管移植物,风心病引起的心瓣损害需生物心瓣移植物。目前使用的软组织移植物分为生物性和人工合成两种。高分子材料人工合成的生物性材料,有优良的力学性能,但生物相容性有待提高,因此应用受到很大限制。在生物性材料中,天然生物组织来源材料的结构和成分与活体组织器官细胞间质中的蛋白质和聚糖相似,与细胞亲和性强,能为细胞生长、增殖、分化及功能发挥提供近似活体内组织发生发育的细胞外基质支架条件,使细胞聚集形成组织,控制组织结构,调节细胞表型,具有更好的临床应用前景。
但天然组织来源的生物材料自活体取出后即开始降解,不同材料间也存在着种群差异,不宜保存和直接应用。为此常需采用交联预处理来解决这些问题。经处理后的生物性材料不仅能较长时间地保持其良好的力学性能和完整的组织结构,而且还提高了抗酶降解能力,同时又降低甚至去除了材料的抗原性,大大拓宽了其应用范围。但现有的交联处理方法存在着自身的固有缺陷,即所选用的人工合成化学交联剂细胞毒性高,由其交联处理的生物材料生物相容性较差,而所选用的天然生物交联剂虽细胞毒性低,生物相容性也较好,但其价格非常昂贵,难以实际应用。
总的来看,为了解决上述各类交联剂的缺陷,尚需开发筛选出能够对人工器官用生物组织材料进行理想改性的交联剂材料,以制备出更为理想的人工器官用生物组织材料。
发明内容
针对现有技术的人工器官用生物组织材料存在的不足,本发明的目的旨在提供一种既具有高分子材料人工合成生物材料力学性,又有适于周围细胞长入的天然结构及促使细胞在其表面黏附生长的类似生物活性蛋白的人工器官用生物组织材料及其制备方法。
可实现上述发明目的的人工器官用生物组织材料,为用氧化海藻酸钠生物交联剂交联处理过的猪主动脉血管,特别是为用氧化海藻酸钠生物交联剂交联处理过的猪降主动脉血管。
作为人工器官用生物组织材料的用氧化海藻酸钠生物交联剂交联处理过的猪主动脉血管,其制备方法主要包括以下加工工序:
(1)将自屠宰场活杀猪体上取下的主动脉血管进行清洗去除血迹和脂肪;
(2)清洗干净的猪主动脉血管用由pH值为4.0-7.4的缓冲液和加入的氧化海藻酸钠配制成的交联液进行交联处理,交联体系的pH值为4.0-7.4,交联温度为室温,交联液中氧化海藻酸钠的浓度为10~15g/100ml,经充分交联制备为人工器官用生物组织材料。
在上述制备方案中,取自猪活体的主动脉血管上的血迹和脂肪的清洗去除,最好是先用生理盐水冲洗至无血水渗出,后用质量浓度为0.01%-0.05%的苯扎溴铵水溶液消毒去脂,之后再用磷酸缓冲液冲洗去除苯扎溴铵。苯扎溴铵水溶液可由市售苯扎溴铵溶液(质量浓度5%)加清水配制成。
在上述制备方案中,配制氧化海藻酸钠交联液的缓冲液为柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液,其中柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液可由0.1M的柠檬酸溶液和0.1M的柠檬酸钠溶液按质量份数比1∶1.8~2.0配制;磷酸盐缓冲液可由0.14~0.28M的NaCl,0.003~0.006M的KCl,0.01~0.02M的Na2HPO4和0.0016~0.0032M的KH2PO4配制。
在上述制备方案中,主动脉血管用氧化海藻酸钠交联液交联处理时的交联液的用量一般控制为每1cm2的组织用1ml-5ml交联液进行处理。
在上述制备方案中,主动脉血管与氧化海藻酸钠交联液的交联最好是在有轻微振动的条件下进行交联处理,以便交联液能与被交联的组织接触更充分和均匀,通常是在摇床内进行交联处理。
在上述制备方案中,猪主动脉血管从活杀猪体中取出到进行交联处理的时间一般控制为不大于6h。
猪主动脉血管用氧化海藻酸钠交联液交联制备为人工器官用生物组织材料后,需存储于30%-50%(无水乙醇与水的体积比为1∶2~1∶1)的乙醇溶液中备用。材料在使用或进行活体实验或体外细胞相关实验时,还须进行γ射线辐照消毒。
在制备人工器官用生物组织材料的研究完成过程中,发明人经反复多次试验和对交联剂性能的深刻理解,选定氧化海藻酸钠交联剂作为猪主动脉血管的交联剂。氧化海藻酸钠是海藻酸钠的衍生物,海藻酸钠是一种从褐藻中分离出来的天然多糖,具有可降解性和高度的生物相容性、无任何的免疫原性,并不诱导任何持续性的炎症反应,同时由于其价格相对低廉,被广泛地应用在组织工程和医药等领域。用高碘酸钠对海藻酸钠进行氧化改性,适度氧化的海藻酸钠不但保留了良好的生物相容性,增加了其生物稳定性,还引入了活性基团(-CHO),能够与氨基酸或蛋白质发生反应。
氧化海藻酸钠作为一种天然生物交联剂,具有细胞毒性低、对天然组织破坏小、细胞亲和力强等优势。用氧化海藻酸钠处理过的生物组织材料,抗原性去除较彻底,生物稳定性较高,体外抗酶降解能力较好,最终抗张强度较好。和其他化学交联剂相比,氧化海藻酸钠的最大优点是低细胞毒性,同时价格也相对低廉。通过MTT试验测定的交联剂细胞毒性显示,氧化海藻酸钠细胞毒性明显小于戊二醛,也小于环氧聚合物。
本发明以生物交联剂氧化海藻酸钠为交联剂,以猪主动脉为基体所制备的人工器官用生物组织材料,既具有高分子材料富有韧性、弹性好的力学特征,又有适于周围细胞长入的天然结构,还有类似生物活性蛋白的促使细胞在其表面黏附生长的特点,可大大降低其余部分交联剂存在的缺陷,很适合作为人工器官用材料。且其制备过程简单,技术要求不高,易实现产业化。
附图说明
附图1为交联前后材料的去细胞情况(HE染色,放大100倍)。其中1-1新鲜样品;1-2为用氧化海藻酸钠在PH为4.0,交联液浓度为15%的条件下交联7天的情况;1-3为用氧化海藻酸钠在PH为7.4,交联液浓度为15%的条件下交联3天的情况。
附图2为交联前后材料的胶原纤维的变化情况(Mallory三色染色,放大100倍)。2-1新鲜样品;2-2为用氧化海藻酸钠在PH为4.0,交联液浓度为15%的条件下交联3天的情况;2-3为用氧化海藻酸钠在PH为7.4,交联液浓度为15%的条件下交联3天的情况。
附图3为交联前后材料的弹性纤维的变化情况(Verhoeff铁苏木素染色法,放大100倍)。3-1新鲜样品;3-2为用氧化海藻酸钠在PH为4.0,交联液浓度为15%的条件下交联3天的情况;3-3为用氧化海藻酸钠在PH为7.4,交联液浓度为15%的条件下交联3天的情况。
具体实施方式
1、人工器官用生物组织材料制备实施例
以下通过实施例描述本发明的具体实施方式,对本发明的内容再作进一步的详细说明。但需要特别说明的是,不应将此理解为本发明的保护范围仅限于实例,相反地是,凡基于本发明的内容所实现的技术应均属于本发明的保护范围。
在以下各实施例中,除特别说明外,所涉及的百分比均为质量百分比,所涉及的份数均为质量份数。
实施例1
自屠宰场取出活杀猪的胸主动脉血管,放入冰盐水中保存,迅速转移到实验室。去除表面附着的脂肪组织和网状***。先用大量的生理盐水反复冲洗,洗净血迹和脂肪,直至无血水渗出为止。之后用质量浓度约为0.03%的苯扎溴铵水溶液消毒去脂45分钟左右,再用磷酸盐缓冲液反复冲洗去除干净苯扎溴铵。苯扎溴铵水溶液由市售质量浓度为5%的苯扎溴铵溶液加清水配制成。磷酸盐缓冲液由0.14M的NaCl,0.003M的KCl,0.01M的Na2HPO4和0.0016M的KH2PO4配制。
冲洗干净的猪主动脉血管与交联液置于摇床内在轻轻振荡的条件下进行交联,以便交联液与被交联组织更加充分和均匀地接触。从猪活体中取出主动脉血管到进行交联处理,这之间的时间控制不超过6小时。交联条件为:交联温度为室温;交联体系的pH值为4.0左右;交联液由pH值为4.0左右的缓冲液加入氧化海藻酸钠交联剂配制成,浓度为100ml交联液中含15g左右的氧化海藻酸钠;交联时间为3天。交联液中的缓冲液配制:分别配制0.1M的柠檬酸溶液和0.1M的柠檬酸钠溶液,取柠檬酸钠溶液1份再加约1.9份的柠檬酸溶液配制成柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。交联液的用量为,每1cm2的组织用约1ml-5ml交联液进行处理。
以猪主动脉血管为基体以氧化海藻酸钠为交联剂的人工食管用生物组织材料,交联制备成后存储于体积比为30%(无水乙醇与水的体积比为1∶2)左右的乙醇溶液中备用。交联材料要进行活体实验或体外细胞相关实验时,须进行γ射线辐照消毒。
此条件下交联既可节省昂贵的交联剂,又能达到理想的交联效果。
实施例2
本实施例制备的以猪主动脉血管为基体,以氧化海藻酸钠为交联剂的人工器官用生物组织材料,其制备过程与实施例1基本相同,所不同的猪主动脉血管为活杀猪的降主动脉血管,用于消毒去脂的苯扎溴铵水溶液的质量浓度为0.05%左右,交联体系的pH值为4.0左右,交联液的pH值为4.0左右,交联液中的氧化海藻酸钠浓度为100ml交联液含10g左右的氧化海藻酸钠;交联时间为3天。缓冲液的配制:先配制0.1M的柠檬酸溶液,然后配制0.1M的柠檬酸钠溶液,取柠檬酸钠溶液1份再加约2.1份柠檬酸溶液配制成柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。交联液的用量为,每1cm2的组织用1ml-5ml交联液进行处理。
交联制备成的交联材料存储于体积比为50%(无水乙醇与水的体积比为1∶1)左右的乙醇溶液中备用。进行活体实验或体外细胞相关实验时,交联材料还必须进行γ射线辐照消毒。
实施例3
本实施例制备的以猪主动脉血管为基体,以氧化海藻酸钠为交联剂的人工器官用生物组织材料,其制备过程与实施例1基本相同,所不同的猪主动脉血管为活杀猪的降主动脉血管,用于消毒去脂的苯扎溴铵水溶液的质量浓度为0.04%左右,交联体系的pH值为7.4左右,交联液的pH值为7.4左右,交联液中的氧化海藻酸钠浓度为100ml交联液含15g左右的氧化海藻酸钠;交联时间为3天。缓冲液的配制:在同一份双蒸水中配制0.14M的NaCl,0.003M的KCl,0.01M的Na2HPO4以及0.0016M的KH2PO4,再用HCl调节PH到7.4。交联液的用量为,每1cm2的组织用1ml-5ml交联液进行处理。
交联制备成的交联材料存储于体积比为50%(无水乙醇与水的体积比为1∶1)左右的乙醇溶液中备用。进行活体实验或体外细胞相关实验时,交联材料还必须进行γ射线辐照消毒。
实施例4
本实施例制备的以猪主动脉血管为基体,以氧化海藻酸钠为交联剂的人工器官用生物组织材料,其制备过程与实施例1基本相同,所不同的猪主动脉血管为活杀猪的降主动脉血管,用于消毒去脂的苯扎溴铵水溶液的质量浓度为0.05%左右,交联体系的pH值为7.4左右,交联液的pH值为7.4左右,交联液中的氧化海藻酸钠浓度为100ml交联液含10g左右的氧化海藻酸钠;交联时间为3天。缓冲液的配制:在同一份双蒸水中配制0.14M的NaCl,0.003M的KCl,0.01M的Na2HPO4以及0.0016M的KH2PO4,再用HCl调节PH到7.4。交联液的用量为,每1cm2的组织用1ml-5ml交联液进行处理。
交联制备成的交联材料存储于体积比为50%(无水乙醇与水的体积比为1∶1)左右的乙醇溶液中备用。进行活体实验或体外细胞相关实验时,交联材料还必须进行γ射线辐照消毒。
2、人工器官用生物组织材料性能指标测试实施例
(1)交联度测试实施例
交联度是反映交联程度的一个重要指标,它由交联后组织中的自由氨基含量与未交联组织中的自由氨基含量之比表示。由于氧化海藻酸钠的交联要消耗组织中大量的自由氨基,故交联度越大,组织中残留的自由氨基就越少。对上述人工器官用生物组织材料制备实施例制备的交联材料的交联度测量,采用茚三酮法进行。
表1-不同条件下交联材料的交联度
从上表可以看出,相同时间内,在pH4.0,浓度15%条件下,交联最快。3天后四种交联条件均能达到较高的交联度。交联度越高说明材料交联越好,生物组织中的自由氨基去除越彻底,生物组织的抗原性去除也越彻底,材料植入活体后产生的免疫排斥反应越弱。
(2)力学性能测试实施例
作为人工器官用的生物组织工程材料,组织的力学性能是一个十分重要的指标。对上述人工器官用生物组织材料制备实施例制备的交联材料的力学性能测量,采用INSTRON公司的302instron万能材料实验机测定。
表2-不同条件下交联材料的力学性能
从上面的数据我们可以看到,交联可以提高材料的一些力学性能,其中模量,最大张应力,都有明显的提高,这其中以在PH7.4,交联液浓度15%的条件下处理的样品提高幅度最大。而在最大应力处的应变,有所减小。这说明交联后的组织略显僵硬,而新鲜的组织的弹性较好,而且比较柔软。
(3)细胞毒性测试实施例:
要达到理想的临床效果,还必须使材料有优良的细胞相容性。对上述人工器官用生物组织材料制备实施例制备的交联材料细胞毒性的测量,采用四唑盐比色法,以L-929细胞为检测细胞,对交联料进行细胞毒性试验。结果如下:
表3-不同条件下交联材料的细胞毒性
注:条件1为pH4.0,浓度15%;条件2为pH4.0,浓度10%;条件3为pH7.4,浓度15%;条件4为pH7.4,浓度10%。
细胞毒性分级为,0~1级为合格,故本交联材料的细胞相容性是合格的。
3、人工器官用生物组织材料微观结构分析实施例
生物组织材料交联后的去细胞情况、胶原纤维变化情况、弹性纤维变化情况等对交联材料也十分重要。这些情况的变化可通过对生物工程组织材料交联前后的光镜照片对比分析得到。
(1)交联前后材料的去细胞情况微观结构分析实施例
猪主动脉血管交联后材料去细胞情况见附图1-1、1-2、1-3所示的光镜照片。从光镜照片可看出,新鲜组织的结构很完整,有很多带有紫色细胞核的细 胞。在条件PH为7.4,交联液浓度为15%的交联液中,交联三天的样品,去除了部分细胞。而在条件PH为4.0,交联液浓度为15%的交联液中,交联三天的样品,绝大部分的细胞成分已经被去除,对细胞的去除作用较明显。细胞是组织产生抗原的主要来源之一,其去除越彻底,交联组织产生的免疫原性就越小。
(2)交联前后材料的胶原纤维变化情况微观结构分析实施例
猪主动脉血管交联后材料的胶原纤维变化情况见附图2-1、2-2、2-3所示的光镜照片。切片采用Mallory三色染色法制得。从光镜照片中可看出,新鲜样品的胶原纤维很完整。而在四个条件下交联液中交联三天得到的交联材料,胶原纤维保存的都很完整,未受到破坏。另外,也可看出在PH为4.0的条件下交联,其去除细胞的作用较强。
(3)交联前后材料的弹性纤维变化情况微观结构分析实施例
猪主动脉血管交联后材料的弹性纤维变化情况见附图3-1、3-2、3-3所示的光镜照片。切片采用Verhoeff铁苏木素染色法制得。从光镜照片中可看出,新鲜样品的弹力纤维很完整。而在四个条件交联液中交联三天的样品,弹力纤维保存的都很完整。
对于通过处理过的生物组织材料,我们希望在不强烈破坏胶原纤维和弹力纤维微观结构的情况下,能去除细胞等一些能产生免疫反应的生物活性物质。从上面几张图的情况可看出,交联后的组织中细胞去处的情况较好,而且微观结构保存得较好,胶原纤维和弹力纤维都没有被破坏。
Claims (10)
1.一种人工器官用生物组织材料,其特征在于生物组织材料为经氧化海藻酸钠生物交联剂交联处理过的猪主动脉血管。
2.根据权利要求1所述的人工器官用生物组织材料,其特征在于所说的猪主动脉血管为猪降主动脉血管。
3.对于权利要求1或2所述人工器官用生物组织材料的制备方法,其特征在于包括以下工序:
(1)将自屠宰场活杀猪体上取下的主动脉血管进行清洗去除血迹和脂肪;
(2)清洗干净的猪主动脉血管用由pH值为4.0-7.4的缓冲液和加入的氧化海藻酸钠配制成的交联液进行交联处理,交联体系的pH值为4.0-7.4,交联温度为室温,交联液中氧化海藻酸钠的浓度为10~15g/100ml,经充分交联即制备得人工器官用生物组织材料。
4.根据权利要求3所述的人工器官用生物组织材料的制备方法,其特征在于所述主动脉血管上的血迹和脂肪的清洗去除,是先用生理盐水冲洗至无血水渗出,后用质量浓度为0.01%-0.05%的苯扎溴铵水溶液消毒去脂,之后再用磷酸盐缓冲液冲洗去除苯扎溴铵。
5.根据权利要求3所述的人工器官用生物组织材料的制备方法,其特征在于配制氧化海藻酸钠交联液的缓冲液为柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求5所述的人工器官用生物组织材料的制备方法,其特征在于所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液由0.1M的柠檬酸溶液和0.1M的柠檬酸钠溶液按质量份数比1∶1.8~2.0配制而成;所述磷酸盐缓冲液由0.14~0.28M的NaCl,0.003~0.006M的KCl,0.01~0.02M的Na2HPO4和0.0016~0.0032M的KH2PO4配制而成。
7.根据权利要求3所述的人工器官用生物组织材料的制备方法,其特征在于主动脉血管用氧化海藻酸钠交联液交联处理时的交联液的用量为每1cm2的组织用1ml-5ml交联液进行处理。
8.根据权利要求3所述的人工器官用生物组织材料的制备方法,其特征在于主动脉血管与氧化海藻酸钠交联液是在振动的条件下进行交联处理。
9.根据权利要求8所述的人工器官用生物组织材料的制备方法,其特征在于主动脉血管与氧化海藻酸钠交联液在摇床内进行交联处理。
10.根据权利要求3所述的人工器官用生物组织材料的制备方法,其特征在于猪主动脉血管从屠宰场活杀猪体上取出到进行交联处理的时间不大于6h。
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