CN101104643A - 硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和应用 - Google Patents

Abstract

硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和应用，属于硒化多糖技术领域，其特征在于硒化多糖硫酸酯化合物包含吡喃型糖单元或者/和包含呋喃型糖单元，其制备方法采用多糖硫酸酯和硒化试剂反应，硒化试剂是***及其盐，硒化试剂与多糖硫酸酯中的硫酸酯基团的摩尔比是1∶0.1－10。本发明化合物在制备抗癌药物和抗氧化药物中的应用。本发明的***与在糖单元硫酸根发生取代反应，而生成本发明的硒化多糖硫酸酯，因此产品的得率和质量均比其它的方法高，本发明另一个优点是硒含量高：最高硒含量可达45％远高于目前有文献报道的最高为12.5％硒含量。

Description

硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和应用

技术领域

本发明属于硒化多糖技术领域，具体涉及一种硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和在制备抗癌药物、抗氧化药物中的应用。

背景技术

多糖类是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子，具有抗感染、免疫促进、肿瘤防治、病毒性肝炎、类风湿症、艾滋病等免疫损伤或免疫缺损症和抗氧化等多方面功能和生物活性。影响多糖生物学活性的结构因素包括多糖的主链性质、支链性质和多糖分子的高级结构，其中多糖主链的糖单元组成、糖苷键类型均直接决定多糖的活性，多糖支链的类型、聚合度、支链在多糖链上的分布及其取代度决定了多糖的活性大小，多糖分子的高级结构如链的柔韧性和空间构像与多糖的活性紧密相关。为提高多糖的生物活性，多糖的分子修饰和结构改造具有重要意义。近年来，有关多糖的分子修饰研究已大有进展。利用糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团运用化学方法进行修饰，有可能提高多糖的活性。修饰的方法很多，有硫酸化、羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、双基团衍生化等。

硫酸化多糖也称多糖硫酸酯或多糖硫酸酯，是指糖羟基上带有硫酸根的多糖，是抗病毒多糖中研究最多的一类天然或化学修饰多糖，包括从动植物中提取的各种硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸衍生物及人工合成、半合成的各种硫酸多糖，如硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖、硫酸木聚糖、硫酸香菇多糖、岩藻依聚糖、卡拉胶硫酸软骨素等。硫酸多糖因具有广泛的生物学性质，包括抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病、对免疫***作用和抗凝活性，而受到极大关注。

硒元素是生命活动的必需元素，其存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有***钠和硒酸钠，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能构成若干氧化酶的活性中心，可增强机体的抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力，这说明了硒与人体健康的直接关系。多糖具有多种生理功能，与抗衰老、防治癌症等密切有关。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，而有机硒的毒性低，副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著，因此，将无机硒与多糖有机结合使之转化为有机硒化合物硒多糖，将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。

硒多糖硫酸酯是利用多糖硫酸酯将其中部分硫用硒取代而半合成的有机硒化合物，由我国首次合成。研究发现，它可提高血液谷胱甘肽过氧物酶的活力、血红蛋白的含量、红细胞对H₂O₂的稳定性及抗自由基的能力，还发现它能增强机体的免疫功能。有关硒的抗癌、防癌作用的研究也已有报道。

随着生活水平的提高，各个保健食品公司、医药公司开发的富硒食品、富硒药品已成为了热潮。近年来关于富硒的产品和专利也出现了许多。如公开号：CN1038454A，硒化卡拉胶的制法。该方法是以硒粉为原料，用硝酸将其溶解制备成浓度为0.5-1.0mg/ml的硒液，在将其加入到浓度为0.5-5％的卡拉胶中，再加入Kappa-角叉菜胶或Lambda角叉菜胶溶胶溶液，进行硒化反应，在经过乙醇沉析后得到粗品硒化卡拉胶。该方法制备的硒化卡拉胶，硒含量较低，并且在制备方法上使用硒粉和浓硝酸可以生成如硒化氢等有毒的负产物。专利公开号CN1069495，专利名称为硒多糖其制造方法。该方法通过发酵制备富硒酵母，再经过分离提取，加碱匀浆、中和、浓缩、乙醇沉淀等制成。该方法制备繁琐，得到的硒含量也很低。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和在制备抗癌药物、抗氧化药物中的应用，解决了现有技术中存在的问题。

本发明采用的具体技术方案如下：

一种硒化多糖硫酸酯化合物，其特征在于：硒化多糖硫酸酯化合物包含吡喃型糖单元，其结构式为：

或者

R₁～R₄、R₆至少有一个为***酯基及其盐，和

R₁～R₄、R₆相同或者不同，是羟基、***酯基及其盐、硫酸酯基及其盐或者糖苷键中的一种；

或者/和包含呋喃型糖单元，其结构式为：

或者

R₁～R₆至少有一个为***酯基及其盐，和

R₁～R₆相同或者不同，是羟基、***酯基及其盐、硫酸酯基及其盐或者糖苷键中的一种。

硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是本质上由多糖硫酸酯和硒化试剂反应制备。

所述的硒化试剂是***及其盐；硒化试剂与多糖硫酸酯中的硫酸酯基团的摩尔比是1∶0.1-10。

所述的硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是包括下列步骤：

(1)硒化反应：将多糖硫酸酯与***或其盐在酸性溶液中经钡离子的催化作用下，并加热10-100℃，恒温反应1-100小时，该反应是在糖单元上的取代反应，或在3，6-内醚-D-半乳糖单元上的加成反应，而生成多糖硫酸酯化合物；反应完毕，降温至室温；

(2)除去Ba²⁺离子：将反应液逐步滴加硫酸溶液，使反应液中的Ba²⁺离子成为硫酸钡沉淀；

(3)除去未反应的***根离子：滤去沉淀，取滤液，再加入氯化铁溶液，调节pH值3-12，搅拌，反应过夜，过滤沉淀，取滤液；

(4)乙醇沉淀：滤液用15％的醋酸钠溶液调节pH3-9，按反应液的1-5倍体积量加入95％乙醇，过滤，然后依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤滤出物，将滤出物干燥；

(5)按需要精制成硒化多糖硫酸酯精品。

硒化多糖硫酸酯化合物在制备抗癌药物中的应用。

硒化多糖硫酸酯化合物在制备抗氧化药物中的应用。

本发明具有的有益效果如下：

1)本发明在催化剂钡离子和氯离子、硝酸根的作用下，***与在糖单元硫酸根发生取代反应，而生成本发明的硒化多糖硫酸酯，产品得率和质量均比其它的方法高。

2)利用本发明的硒化多糖硫酸酯的制法，制备的硒化多糖硫酸酯，其最高硒含量可达45％。然而目前有文献报道的最高硒含量为12.5％。

3)本发明制备硒化多糖硫酸酯的技术与其它的方法相比，避免了硒粉和硝酸反应这一有剧毒物产生的操作，而以***这一稳定性的化合物作为硒化剂，用氯化钡和硝酸作为催化剂，操作对人体无害。

4)在分子结构中引入***根，其中硒是正四价，硒是处于中间价态，既可以被氧化也可以被还原，因此本发明的硒化多糖硫酸酯在人体内具有广泛的生理功能。

具体实施方式

实施例1  MTT法体外检测硒化多糖硫酸酯抗癌药敏试验

对数生长期细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释为2.0×106个·mL-1，接种于96孔板中，每孔100μL，之后依次加入待测药物、阴性对照组、阳性对照组，并保留仅加培养基的空白组。随后在37℃、5％CO2的培养箱中连续培养24h，然后每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μL，连续培养4h。吸去上清液，每孔加入DMSO 100μL，在570nm波长处用酶标仪测吸收度(A)值。用下面的公式计算细胞增殖抑制率，并利用公式T/C(％)＝100×A_阴性/A_样品做回归计算药物的半数抑制浓度(IC50)抑制率＝(A_空白-A_给药)/A_空白

各浓度对小鼠肿瘤细胞S180、H22及人肝癌细胞株HepG2的增殖均有显著的抑制作用，且呈良好的量效关系。

实施例2抗氧化活性研究

1.对O₂·的清除作用

含有硒化多糖硫酸酯(1mg·mL^-1)pH8.2的Tris-HCl缓冲液于25℃温育20分钟后，加入0.1mol·L^-1连苯三酚的10mmol·L^-1盐酸溶液，快速摇匀，于25℃测定319nm处的吸收度，持续测定A_p。

不加硒化多糖硫酸酯，同上操作处理，测定其对比吸光值A_s。测试表明吸光度A_p相对比吸光值A_s减少。

结果表明：硒化多糖硫酸酯能有效地清除活性氧。

2.对羟自由基的清除作用和保护DNA的作用

采用Fenton体系，取0.2mLF eSO4-EDTA混合液(10mmol·L^-1)于试管中，加入0.5mL的DNA(10mmol·L^-1)，然后加硒化多糖硫酸酯(1mg·mL^-1)，用磷酸缓冲液(pH 7.4，0.1mol·L^-1)定容至1.8M L，再加入0.2mLH₂O₂(10mmol·L^-1)，混合后置于37℃恒温水浴中反应1h，然后加人2.8％(质量百分比)三氯乙酸溶液1.0ML，1.0％(质量百分比)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0ML，混匀后置沸水浴反应15min，冷却后用在波长532nm处测吸光度A_p。

不加硒化多糖硫酸酯，同上操作处理，测定其对比吸光值A_s。测试表明吸光度A_p则相对比吸光值A_s减少。

结果表明：硒化多糖硫酸酯能有效地清除羟自由基，对DNA链具有良好的保护作用。

实施例3多糖硫酸酯的化学合成。

在N₂保护下，1g多糖加入到150mL四氢呋喃(N，N-dimethylformamide，DMF)中，室温下搅拌14h。N₂保护下，边搅拌便加入三氧化硫·吡啶(三氧化硫·吡啶与多糖中的羟基基团的摩尔比是10∶1)，然后在40℃反应10h。用500ml甲醇处理并搅拌1小时，制备出粗制多糖硫酸酯吡啶盐。用装有吸引器的烧结玻璃漏斗滤过，并不断用甲醇洗至滤液变为无色，空气中干燥。将粗制的多糖硫酸酯吡啶盐溶于30％醋酸钠溶液6.5ml中；再加入双蒸水7ml，将吡啶盐置换成钠盐。然后将盐溶液缓慢加入100ml无水甲醇中，磁力搅拌1小时，使产物沉淀。滤过收集，用乙醇不断洗涤，空气中干燥，得产品。所得多糖硫酸酯为全取代(多糖中的羟基全部被硫酸酯基团取代)。

实施例4

将1.5g卡拉胶(含硫12～13％)溶于含有1％***的硝酸溶液中，加热至40℃，在搅拌下，滴加20％氯化钡，恒温反应72小时。反应液降至室温，滴加硫酸使沉淀完全，抽滤。用15％醋酸钠溶液调pH为7，再用酒精沉淀，抽滤，烘干。产品透析精制。制得含硒18％的硒化多糖。

实施例5

将1g全取代的糊精硫酸酯(含硫24％)溶于含有1％***的硝酸溶液中，加热至30℃，在搅拌下，滴加20％氯化钡，恒温反应100小时。反应液降至室温，滴加硫酸使沉淀完全，抽滤。用15％醋酸钠溶液调pH为7，再用酒精沉淀，抽滤，烘干。产品透析精制。制得含硒36％的硒化糊精。

实施例6

将2g全取代的右旋糖酐硫酸酯(含硫24％)溶于含有1％***的硝酸溶液中，加热至50℃，在搅拌下，滴加20％氯化钡，恒温反应24小时。反应液降至室温，滴加硫酸使沉淀完全，抽滤。用15％醋酸钠溶液调pH为7，再用酒精沉淀，抽滤，烘干。产品透析精制。制得含硒45％的硒化右旋糖酐。

实施例7

将2g全取代的葡聚糖硫酸酯(含硫24％，分子量为10000)溶于含有1％***的硝酸溶液中，加热至50℃，在搅拌下，滴加20％氯化钡，恒温反应10小时。反应液降至室温，滴加硫酸使沉淀完全，抽滤。用15％醋酸钠溶液调pH为7，再用酒精沉淀，抽滤，烘干。产品透析精制。制得含硒45％的硒化葡聚糖。

实施例8

将2g全取代的淀粉硫酸酯(含硫24％，分子量为20000)溶于含有1％***的硝酸溶液中，加热至25℃，在搅拌下，滴加10％氯化钡15mL，恒温反应2小时。反应液降至室温，滴加硫酸使沉淀完全，抽滤。用15％醋酸钠溶液调pH为7，再用酒精沉淀，抽滤，烘干。产品透析精制。制得含硒19.2％含硫13.1％的硒化淀粉硫酸酯。

Claims (7)

1.一种硒化多糖硫酸酯化合物，其特征在于：硒化多糖硫酸酯化合物包含吡喃型糖单元，其结构式为：

R₁～R₄、R₆至少有一个为***酯基及其盐，和

R₁～R₄、R₆相同或者不同，是羟基、***酯基及其盐、硫酸酯基及其盐或者糖苷键中的一种；

或者/和包含呋喃型糖单元，其结构式为：

R₁～R₆至少有一个为***酯基及其盐，和

R₁～R₆相同或者不同，是羟基、***酯基及其盐、硫酸酯基及其盐或者糖苷键中的一种。

2.硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是本质上由多糖硫酸酯和硒化试剂反应制备。

3.根据权利要求2所述的硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是硒化试剂是***及其盐。

4.根据权利要求2所述的硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是硒化试剂与多糖硫酸酯中的硫酸酯基团的摩尔比是1∶0.1-10。

5.根据权利要求2所述的硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是包括下列步骤：

(1)硒化反应：将多糖硫酸酯与***或其盐在酸性溶液中经钡离子的催化作用下，并加热10-100℃，恒温反应1-100小时，该反应是在糖单元上的取代反应，或在3，6-内醚-D一半乳糖单元上的加成反应，而生成多糖硫酸酯化合物；反应完毕，降温至室温；

(2)除去Ba²⁺离子：将反应液逐步滴加硫酸溶液，使反应液中的Ba²⁺离子成为硫酸钡沉淀；

(3)除去未反应的***根离子：滤去沉淀，取滤液，再加入氯化铁溶液，调节pH值3-12，搅拌，反应过夜，过滤沉淀，取滤液；

(4)乙醇沉淀：滤液用15％的醋酸钠溶液调节pH3-9，按反应液的1-5倍体积量加入95％乙醇，过滤，然后依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤滤出物，将滤出物干燥；

(5)按需要精制成硒化多糖硫酸酯精品。

6.硒化多糖硫酸酯化合物在制备抗癌药物中的应用。

7.硒化多糖硫酸酯化合物在制备抗氧化药物中的应用。