ES2210306T3 - Sistemas de trampa para interacciones, para detectar interacciones de proteinas. - Google Patents

Sistemas de trampa para interacciones, para detectar interacciones de proteinas.

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ES2210306T3
ES2210306T3 ES95928118T ES95928118T ES2210306T3 ES 2210306 T3 ES2210306 T3 ES 2210306T3 ES 95928118 T ES95928118 T ES 95928118T ES 95928118 T ES95928118 T ES 95928118T ES 2210306 T3 ES2210306 T3 ES 2210306T3
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John M. Mccoy
Timm H. Jessen
Chanxing Wilson Xu
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Abstract

LO DESCRITO AQUI ES UN METODO DE DETERMINACION SI UNA PRIMERA PROTEINA ES CAPAZ SE INTERACTUAR FISICAMENTE CON UNA SEGUNDA PROTEINA, INCLUYENDO: (A) PROPORCIONAR UNA CELULA HUESPED QUE CONTENGA (I) UN GEN INFORMADOR ENLAZADO DE FORMA OPERABLE A UN EMPLAZAMIENTO DE UNION DE PROTEINA; (II) UN PRIMER GEN DE FUSION QUE EXPRESE UNA PRIMERA PROTEINA DE FUSION, LA PRIMERA PROTEINA DE FUSION INCLUYENDO LA PRIMERA PROTEINA UNIDA DE FORMA COVALENTE A UNA ESTRUCTURA DE UNION QUE ES CAPAZ DE UNIRSE ESPECIFICAMENTE AL EMPLAZAMIENTO DE UNION DE LA PROTEINA; Y (III) UN SEGUNDO GEN DE FUSION QUE EXPRESE UNA SEGUNDA PROTEINA DE FUSION, LA SEGUNDA PROTEINA DE FUSION INCLUYENDO LA SEGUNDA PROTEINA UNIDA DE FORMA COVALENTE A UNA ESTRUCTURA DE ACTIVACION DE GEN Y ESTANDO CONSTREÑIDA EN CONFORMIDAD; Y (B) MEDIAR LA EXPRESION DEL GEN INFORMADOR COMO UNA MEDIDA DE UNA INTERACCION ENTRE LA PRIMERA Y SEGUNDA PROTEINAS. TAMBIEN SE DESCRIBEN METODOS DE ENSAYO DE INTERACCIONES DE PROTEINA, Y DE IDENTIFICACION DE ANTAGONISTAS Y AGONISTAS DE INTERACCIONES DE PROTEINA. TAMBIEN SE DISCUTE LAS PROTEINAS AISLADAS MEDIANTE ESTOS METODOS. FINALMENTE, SE DESCRIBEN POBLACIONES DE CELULAS EUCARIOTICAS, CADA CELULA TENIENDO UNA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE QUE CODIFICA UN PEPTIDO INTRACELULAR CONSTREÑIDO EN CONFORMIDAD.

Description

Sistemas de trampa para interacciones, para detectar interacciones de proteínas.
Antecedentes de la invención
Esta invención se refiere a métodos para detectar interacciones entre proteínas y aislar nuevas proteínas.
Sumario de la invención
En general, la invención describe métodos para detectar interacciones entre proteínas.
De acuerdo con ello, en un aspecto, la invención describe un método para determinar si una primera proteína es capaz de interaccionar físicamente con una segunda proteína. El método incluye (a) proporcionar una célula hospedadora que contiene (i) un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA; (ii) un primer gen de fusión que expresa una primera proteína de fusión, conteniendo la primera proteína de fusión la primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente al sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA; y (iii) un segundo gen de fusión que expresa una segunda proteína de fusión, incluyendo la segunda proteína de fusión la segunda proteína y un resto activador del gen, estando dicha segunda proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o bien
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína,
y (b) medir la expresión del gen indicador como una medida de una interacción entre la primera y dicha segunda proteínas.
Preferiblemente, la segunda proteína es un péptido corto de al menos 6 aminoácidos de longitud y de menos de o igual a 60 aminoácidos de longitud; incluye una secuencia peptídica generada al azar o diseñada intencionadamente; o está restringida en su conformación como resultado del enlazamiento covalente con una proteína que restringe su conformación, por ejemplo, la tiorredoxina o una molécula similar a la tiorredoxina. Donde la segunda proteína esta unida covalentemente a una proteína que restringe su conformación, la invención describe un polipéptido en el que la segunda proteína está embebida dentro de la proteína que restringe su conformación a la que está unida covalentemente.
Donde la proteína que restringe la conformación es la tiorredoxina, la invención describe también un método adicional que incluye una segunda proteína que está restringida en su conformación mediante puentes disulfuro entre residuos de cisteína en el extremo amino y en el extremo carboxilo de la segunda proteína.
En otro aspecto, la invención describe un método para detectar una proteína interactuante en una población de proteínas, que comprende; (a) proporcionar una célula hospedadora que contiene (i) un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA; y (ii) un gen de fusión que expresa una proteína de fusión, incluyendo la proteína de fusión una proteína de ensayo unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente al sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA; (b) introducir en la célula huésped un segundo gen de fusión que expresa una segunda proteína de fusión, incluyendo la segunda proteína de fusión una proteína de dicha población de proteínas y un resto activador del gen, estando dicha proteína de dicha población de proteínas restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de dicha proteína de dicha población de proteínas,
y (c) medir la expresión del gen indicador como una medida de la interacción entre dicha proteína de ensayo y dicha proteína de dicha población de proteínas. Preferiblemente, la población de proteínas incluye péptidos cortos de entre 1 y 60 aminoácidos de longitud.
La invención describe también un método para detectar una proteína interactuante dentro de una población en el que la población de proteínas es un juego de secuencias peptídicas generadas al azar o diseñadas intencionadamente, o donde la población de proteínas está restringida en su conformación por el enlazamiento covalente con una proteína que restringe su conformación. Preferiblemente, donde la población de proteínas está restringida en su conformación por el enlazamiento covalente con una proteína que restringe su conformación, la población de proteínas está embebida dentro de la proteína que restringe su conformación. La invención describe además un método para detectar una proteína interactuante dentro de una población en el que la proteína que restringe la conformación es la tiorredoxina. Preferiblemente, la población de proteínas está inserta dentro del bucle del sitio activo de la tiorredoxina.
La invención describe además un método en el que cada una de la población de proteínas está restringida en su conformación mediante puentes disulfuro entre residuos de cisteína en el extremo amino y en el extremo carboxilo de dicha proteína.
En realizaciones preferidas de diversos aspectos, la célula hospedadora es una levadura; el dominio de unión al DNA es LexA; y/o el gen indicador se ensaya mediante una reacción con color o mediante la viabilidad celular.
En otras realizaciones el señuelo puede ser la Cdk2 o una secuencia de la proteína Ras.
En otro aspecto relacionado, la invención describe un método para identificar un candidato a elemento interactuante. El método incluye (a) proporcionar un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA; (b) proporcionar una primera proteína de fusión, que incluye una primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente al sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA; (c) proporcionar una segunda proteína de fusión, que incluye una segunda proteína y un resto activador del gen, estando dicha segunda proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína,
siendo capaz la segunda proteína de interaccionar con dicha primera proteína; (d) poner en contacto dicho candidato a elemento interactuante con dicha primera proteína y/o dicha segunda proteína; y (e) medir la expresión de dicho gen indicador.
La invención describe un método para identificar un candidato a elemento interactuante en el que se proporciona la primera proteína de fusión proporcionando un primer gen de fusión que expresa la primera proteína de fusión y en el que la segunda proteína de fusión se proporciona proporcionando un segundo gen de fusión que expresa dicha segunda proteína de fusión. (Alternativamente, el gen indicador, el primer gen de fusión, y el segundo gen de fusión están incluidos en un único fragmento de DNA.)
La invención describe también un método para identificar candidatos a elementos interactuantes en el que se permite que interaccionen la primera proteína de fusión y la segunda proteína de fusión antes de ponerlos en contacto con dicho candidato a elemento interactuante, y un método relacionado en el que se permite que interaccionen la primera proteína de fusión y el candidato a elemento interactuante antes de ponerlos en contacto con dicha segunda proteína de fusión.
En una realización preferida, el candidato a elemento interactuante está restringido en su conformación o estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o uniendo sus extremos amino y carboxilo. Donde el candidato a elemento interactuante es un antagonista, la expresión del gen indicador se reduce. Donde el candidato a elemento interactuante es un agonista, la expresión del gen indicador se incrementa. El candidato a elemento interactuante es un miembro seleccionado del grupo que consiste en proteínas, polinucleótidos, y moléculas pequeñas. Además, un candidato a elemento interactuante puede estar codificado por un miembro de una genoteca de cDNA o de DNA sintético. Además, el candidato a elemento interactuante puede ser una forma mutada de dicha primera proteína de fusión o dicha segunda proteína de fusión.
En un aspecto relacionado, la invención describe una población de células eucarióticas, que tienen cada célula una molécula de DNA recombinante que codifica un péptido intracelular, que está restringido en su conformación, o bien
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo,
habiendo al menos 100 moléculas recombinantes diferentes, que codifican péptidos intracelulares diferentes, restringidos en su conformación, en dicha población, estando cada molécula en al menos una célula de dicha población.
Preferiblemente, los péptidos intracelulares dentro de la población de células están restringidos en su conformación porque están unidos covalentemente a una proteína que restringe su conformación.
En realizaciones preferidas el péptido intracelular está embebido dentro de la proteína que restringe su conformación, preferiblemente la tiorredoxina; el péptido intracelular está restringido en su conformación mediante puentes disulfuro entre residuos de cisteína en el extremo amino y en el extremo carboxilo de dicha segunda proteína; la población de células eucarióticas son células de levadura; la molécula de DNA recombinante codifica además un resto activador del gen unido covalentemente a dicho péptido intracelular; y/o el péptido intracelular interacciona físicamente con una segunda proteína recombinante en el interior de dichas células eucarióticas.
En otro aspecto, la invención describe un método para ensayar una interacción entre una primera proteína y una segunda proteína. El método incluye: (a) proporcionar un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA; (b) proporcionar una primera proteína de fusión que incluye una primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente al sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA; (c) proporcionar una segunda proteína de fusión que incluye una segunda proteína y un resto activador del gen, estando dicha segunda proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína,
(d) combinar el gen indicador, la primera proteína de fusión, y la segunda proteína de fusión; y (e) medir la expresión del gen indicador.
La invención describe además un método para ensayar la interacción entre dos proteínas en el que se proporciona la primera proteína de fusión proporcionando un primer gen de fusión que expresa la primera proteína de fusión y en el que se proporciona la segunda proteína de fusión proporcionando un segundo gen de fusión que expresa la segunda proteína de fusión.
La invención se refiere también a un método para aislar una proteína que comprende:
(a)
proporcionar una célula hospedadora que contiene:
(i)
un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA; y
(ii)
un gen de fusión que expresa una proteína de fusión, conteniendo dicha proteína de fusión una proteína de ensayo unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA;
(b)
introducir en dicha célula hospedadora un segundo gen de fusión que expresa una segunda proteína de fusión, conteniendo dicha segunda proteína de fusión:
una proteína de una población de proteínas y un resto activador del gen, estando dicha proteína de dicha población de proteínas restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de dicha proteína de dicha población de proteínas,
(c)
medir la expresión de dicho gen indicador, y
(d)
aislar una proteína basándose en su capacidad para alterar la expresión de dicho gen indicador cuando está presente en dicha segunda proteína de fusión.
La invención se refiere también a un método para aislar una proteína interactuante que comprende:
(a)
proporcionar un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA;
(b)
proporcionar una primera proteína de fusión, conteniendo dicha primera proteína de fusión una primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA;
(c)
proporcionar una segunda proteína de fusión, conteniendo dicha segunda proteína de fusión una segunda proteína y un resto activador del gen,
estando dicha segunda proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína,
siendo capaz dicha segunda proteína de interaccionar con dicha primera proteína;
(d)
poner en contacto un candidato a proteína interactuante con dicha primera proteína o dicha segunda proteína;
(e)
medir la expresión de dicho gen indicador, y
(f)
aislar una proteína interactuante basándose en su capacidad para alterar la expresión de dicho gen indicador cuando está presente con dicha primera proteína o dicha segunda proteína.
En otro aspecto más, la invención describe una proteína que contiene la secuencia Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe-Arg-Ser-Leu-Phe (SEQ ID NO: 1), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Met-Val-Val-Ala-Ala-Glu-Ala-Val-Arg-Thr-Val-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Thr (SEQ ID NO: 2), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Pro-Asn-Trp-Pro-His-Gln-Leu-Arg-Val-Gly-Arg-Val-Leu-Trp-Glu-Arg-Leu-Ser-Phe-Glu (SEQ ID NO: 3), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Ser-Val-Arg-Met-Arg-Tyr-Gly-Ile-Asp-Ala-Phe-Phe-Asp-Leu-Gly-Gly-Leu-Leu-His-Gly (SEQ ID NO: 9), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Glu-Leu-Arg-His-Arg-Leu-Gly-Arg-Ala-Leu-Ser-Glu-Asp-Met-Val-Arg-Gly-Leu-Ala-Trp-Gly-Pro-Thr-Ser-His-Cys-Ala-Thr-Val-Pro-Gly-Thr-Ser-Asp-Leu-Trp-Arg-Val-Ile-Arg-Phe-Leu (SEQ ID NO: 10), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Tyr-Ser-Phe-Val-His-His-Gly-Phe-Phe-Asn-Phe-Arg-Val-Ser-Trp-Arg-Glu-Met-Leu-Ala (SEQ ID NO: 11), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Gln-Val-Trp-Ser-Leu-Trp-Ala-Leu-Gly-Trp-Arg-Trp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Trp-Asn-Met (SEQ ID NO: 12), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Trp-Arg-Arg-Met-Glu-Leu-Asp-Ala-Glu-Ile-Arg-Trp-Val-Lys-Pro-Ile-Ser-Pro-Leu-Glu (SEQ ID NO: 13), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Trp-Ala-Glu-Trp-Cys-Gly-Pro-Val-Cys-Ala-His-Gly-Ser-Arg-Ser-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Lys-Tyr-His-Val-Ser-Phe-Leu-Gly-Pro-Cys-Lys-Met-Ile-Ala-Pro-Ile-Leu-Asp (SEQ ID NO:17) preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe-Arg-Ser-Leu-Phe (SEQ ID NO: 18), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Tyr-Arg-Trp-Gln-Gln-Gly-Val-Val-Pro-Ser-Asn-Trp-Ala-Ser-Cys-Ser-Phe-Arg-Cys-Gly (SEQ ID NO: 19), preferiblemente restringida en su conformación; una proteína que contiene la secuencia Ser-Ser-Phe-Ser-Leu-Trp-Leu-Leu-Met-Val-Lys-Ser-Ile-Lys-Arg-Ala-Ala-Trp-Glu-Leu-Gly-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Asn-Thr-Ser-Gly-Trp-Ala-Ser-Leu-Ala-Asp-Phe-Tyr (SEQ ID NO: 20) preferiblemente restringida en su conformación; y DNA sustancialmente puro que codifica las proteínas mencionadas inmediatamente antes.
La invención incluye también nuevas proteínas y otros candidatos a elementos interactuantes identificados mediante los métodos antes mencionados. Se apreciará que estas proteínas y candidatos a elementos interactuantes pueden o incrementar o disminuir la actividad del gen indicador y que estos cambios en la actividad se pueden medir utilizando ensayos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, con "gen indicador" se quiere aludir a un gen cuya expresión se puede ensayar; tales genes incluyen, sin limitaciones, lacZ, genes de la biosíntesis de aminoácidos, por ejemplo los genes de levadura LEU2, HIS3, LYS2, TRP1, o URA3, genes de la biosíntesis de ácidos nucleicos, el gen de la cloranfenicol-transacetilasa (CAT) de mamíferos, o cualquier gen de antígenos de superficie para los cuales estén disponibles anticuerpos específicos. Los genes indicadores pueden codificar cualquier proteína que proporcione un marcador fenotípico, por ejemplo, una proteína que sea necesaria para el crecimiento celular o una proteína tóxica que lleve a la muerte de la célula, o pueden codificar una proteína detectable mediante un ensayo con color que conduzca a la presencia o ausencia de color (por ejemplo, proteínas fluorescentes y sus derivados). De forma alternativa, un gen indicador puede codificar un tRNA supresor, la expresión del cual produce un fenotipo que se puede ensayar. Un gen indicador de acuerdo con la invención incluye elementos (por ejemplo, todos los elementos del promotor) necesarios para la función del gen indicador.
Con "unido de forma operativa" se quiere aludir a que un gen y una(s) secuencia(s) reguladora(s) están conectados de tal manera que se permite la expresión del gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción o proteínas que incluyen dominios de activación de la transcripción) están unidas a la(s) secuencia(s) reguladora(s).
Con "unido covalentemente" se quiere aludir a que dos dominios están unidos mediante enlaces covalentes, directa o indirectamente. Esto es, las proteínas o restos proteicos "unidos covalentemente" pueden estar inmediatamente contiguos o pueden estar separados por fragmentos de uno o más aminoácidos dentro de la misma proteína de fusión.
Con "proporcionar" se quiere aludir a introducir las proteínas de fusión en el sistema de interacción secuencial o simultáneamente, y directa (como proteínas) o indirectamente (como genes que codifican esas proteínas).
Con "proteína" se quiere aludir a una secuencia de aminoácidos de cualquier longitud, que constituye la totalidad o una parte de un polipéptido o péptido presente en la naturaleza, o que constituye un polipéptido o péptido que no está presente en la naturaleza (por ejemplo, una secuencia peptídica generada al azar o una de una colección de secuencias peptídicas diseñada intencionadamente).
Con "resto de unión" se quiere aludir a un fragmento de aminoácidos que es capaz de dirigir la unión específica de un polipéptido a una secuencia concreta de DNA (por ejemplo, un "sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA").
Con "resto débil activador de un gen" se quiere aludir a un fragmento de aminoácidos que es capaz de inducir débilmente la expresión de un gen a cuya región de control está unido. Tal como se utiliza en la presente memoria, con "débilmente" se quiere aludir a por debajo del nivel de activación logrado por la región II de activación de GAL4 (Ma y Ptashne, Cell 48:847, 1987) y está preferiblemente al o por debajo del nivel de activación logrado por el dominio de activación B112 de Ma y Ptashne (Cell 51:113, 1987). Los niveles de activación se pueden medir utilizando cualquier sistema con un gen indicador situado aguas abajo y comparando, en ensayos paralelos, el nivel de expresión estimulado por la construcción región II de GAL4-polipéptido con el nivel de expresión estimulado por el polipéptido a ensayar.
Con "alterar la expresión de un gen indicador" se quiere aludir a un incremento o una disminución de la expresión del gen indicador al nivel requerido para la detección de un cambio en el ensayo que se esté empleando. Se apreciará que el grado de cambio variará dependiendo del tipo de construcción con un gen indicador o ensayo de la expresión de un gen indicador que se esté empleando.
Con "restringida en su conformación" se quiere aludir a una proteína que tiene una flexibilidad estructural reducida porque sus extremos amino y carboxilo están fijos en el espacio. Preferiblemente, la proteína restringida en su conformación está plegada de una manera estructuralmente rígida. La restricción conformacional de acuerdo con la invención se puede provocar explotando la capacidad para establecer puentes disulfuro de un par de residuos de cisteína natural o inducido de forma recombinante, residiendo uno en o cerca del extremo amino terminal de la proteína de interés y el otro en o cerca del extremo carboxilo terminal. De forma alternativa, la restricción conformacional se puede facilitar embebiendo la proteína de interés dentro de una proteína restringida en su conformación.
Con "proteína que restringe la conformación" se quiere aludir a cualquier péptido o polipéptido que es capaz de reducir la flexibilidad de los extremos amino y/o carboxilo de otra proteína. Preferiblemente, tales proteínas proporcionan una estructura base o plataforma rígida para la proteína de interés. Además, tales proteínas son capaces preferiblemente de proporcionar protección frente a la degradación proteolítica y similares, y/o son capaces de incrementar la solubilidad. Los ejemplos de proteínas que restringen la conformación incluyen la tiorredoxina y otras proteínas similares a la tiorredoxina, nucleasas (por ejemplo, RNasa A), proteasas (por ejemplo, tripsina), inhibidores de proteasas (por ejemplo, el inhibidor de la tripsina pancreática bovina), anticuerpos o fragmentos suyos estructuralmente rígidos, y conotoxinas. Un péptido que restringe la conformación puede ser de cualquier longitud apropiada y puede ser incluso un residuo de un único aminoácido.
Las "proteínas similares a la tiorredoxina" se definen en la presente memoria como secuencias de aminoácidos sustancialmente similares, por ejemplo, que tienen al menos una homología del 18%, a la secuencia de aminoácidos de la tiorredoxina de E. coli a lo largo de una secuencia de aminoácidos de una longitud de 80 aminoácidos. De forma alternativa, una secuencia de DNA similar a la de la tiorredoxina se define en la presente memoria como una secuencia de DNA que codifica una proteína o un fragmento de una proteína caracterizado por tener una estructura tridimensional sustancialmente similar a la de la tiorredoxina humana o de E. coli, por ejemplo, la glutarredoxina y opcionalmente por contener un bucle con un sitio activo. La secuencia de DNA de la glutarredoxina es un ejemplo de una secuencia de DNA similar a la de la tiorredoxina que codifica una proteína que exhibe tal similitud sustancial en la conformación tridimensional y que contiene un bucle con un sitio activo Cys....Cys. La secuencia de aminoácidos de la tiorredoxina de E. coli está descrita en Eklund et al., EMBO J. 3:1443-1449 (1984). La estructura tridimensional de la tiorredoxina de E. coli está representada en la Fig. 2 de Holmgren, J. Biol.. Chem. 264:13963-13966 (1989). Una secuencia de DNA que codifica la tiorredoxina de E. coli está expuesta en Lim et al., J. Bacteriol., 163:311-316 (1985). La estructura tridimensional de la tiorredoxina humana está descrita en Forman-Kay et al., Biochemistry 30:2685-2698 (1991). Una comparación de las estructuras tridimensionales de la tiorredoxina de E. coli y la glutarredoxina está publicada en Xia, Protein Science 1:310-321 (1992). Estas cuatro publicaciones están incorporadas en la presente memoria como referencia con el propósito de proporcionar información sobre las proteínas similares a la tiorredoxina que es conocida para un experto en la técnica. En la presente memoria están descritos ejemplos de proteínas similares a la tiorredoxina.
Con "candidatos a elementos interactuantes" se quiere aludir a proteínas ("candidatos a proteínas interactuantes") o compuestos que interaccionan físicamente con una proteína de interés; esta expresión abarca también agonistas y antagonistas. Los agonistas interactuantes se identifican como compuestos o proteínas que tienen la capacidad de incrementar la expresión de un gen indicador mediada por un par de proteínas interactuantes. Los antagonistas interactuantes se identifican como compuestos o proteínas que tienen la capacidad de disminuir la expresión de un gen indicador mediada por un par de proteínas interactuantes.
Los "compuestos" incluyen moléculas pequeñas, generalmente con un peso molecular por debajo de 1000, hidratos de carbono, polinucleótidos, lípidos, y similares.
Con "proteína de ensayo" se quiere aludir a una de un par de proteínas interactuantes, haciéndose referencia generalmente al otro miembro del par como "candidato a elemento interactuante" (véase la definición anterior).
Con "generado al azar" se quiere aludir a secuencias que no tienen una secuencia predeterminada; esto contrasta con secuencias "diseñadas intencionadamente" que tienen una secuencia de DNA o proteica o un motivo determinado previamente a su síntesis.
Con "mutada" se quiere aludir a alterada en su secuencia, por mutagénesis o dirigida al sitio o al azar. Una forma mutada de una proteína incluye mutaciones puntuales así como inserciones, deleciones, o reorganizaciones.
Con "intracelular" se quiere aludir a que el péptido está localizado en el interior de la célula, más que en la superficie celular.
Con una "Ras activada" se quiere aludir a cualquier forma mutada de la Ras que permanece unida al GTP durante un período de tiempo más largo que el exhibido por la correspondiente forma de tipo salvaje de la proteína. Con "Ras" se quiere aludir a cualquier forma de la proteína Ras que incluye, sin limitaciones, N- ras, K-ras, y H-ras.
Los sistemas de trampas para las interacciones descritos en la presente memoria proporcionan ventajas sobre métodos más convenciones para aislar proteínas interactuantes o genes que codifican proteínas interactuantes.
El documento WO 94/10300 describe un método para determinar si una primera proteína es capaz de interaccionar físicamente con una segunda proteína. El método implica:
(a)
proporcionar una célula hospedadora que contiene
(i)
un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de unión de una proteína
(ii)
un primer gen de fusión que expresa una primera proteína de fusión, incluyendo la primera proteína de fusión la primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente al sitio de unión de la proteína; y
(iii)
un segundo gen de fusión que expresa una segunda proteína de fusión, incluyendo la segunda proteína de fusión la segunda proteína unida covalentemente a un resto débil activador de un gen; y
(b)
medir la expresión del gen indicador como una medida de la interacción entre la primera y la segunda proteínas.
Chakraborty et al. (J. Biol. Chem. 207:17498-17501, 1992) describen un método para la detección de interacciones proteína-proteína entre proteínas HLH in vivo en el que la dimerización a través del motivo HLH reconstruye un factor híbrido de transcripción que contiene el dominio de unión al DNA de levaduras GAL4 unido a un motivo HLH y el dominio de activación de VP-16 unido a otro.
Por ejemplo, el sistema de los solicitantes proporciona métodos rápidos y baratos que tienen una utilidad muy general para identificar y purificar genes que codifican una amplia gama de proteínas útiles basándose en la interacción física de la proteína con un segundo polipéptido. Esta utilidad general deriva en parte del hecho de que los componentes de los sistemas se pueden modificar fácilmente para facilitar la detección de interacciones de proteínas de afinidad ampliamente variable (por ejemplo, utilizando genes indicadores que difieren cuantitativamente en su sensibilidad frente a la interacción con una proteína). La naturaleza inducible del promotor utilizado para expresar las proteínas interactuantes incrementa también el ámbito de candidatos a elementos interactuantes que se puede detectar puesto que se pueden aislar incluso proteínas cuya expresión crónica es tóxica para la célula hospedadora simplemente induciendo una corta ráfaga de expresión de la proteína y ensayando su capacidad para interaccionar y estimular la expresión de un gen indicador.
Si se desea, la detección de proteínas interactuantes se puede lograr a través del uso de etiquetas de dominios débiles de activación de genes. Este abordaje evita las restricciones sobre el conjunto de proteínas disponibles candidatas a elementos interactuantes que se pueden asociar con dominios de activación más fuertes (tales como GAL4 o VP16); aunque el mecanismo no está claro, tal restricción aparentemente es el resultado de niveles bajos a moderados de toxicidad en la célula hospedadora mediados por el dominio de activación fuerte.
Además, los métodos reivindicados hacen uso de proteínas restringidas en su conformación (es decir, proteínas con flexibilidad reducida debido a restricciones en sus extremos amino y carboxilo). La restricción conformacional se puede provocar embebiendo la proteína de interés dentro de una proteína que restringe su conformación (es decir, una proteína de la longitud apropiada y una composición de aminoácidos que es capaz de trabar la proteína candidata a elemento interactuante en una estructura tridimensional concreta). Los ejemplos de proteínas que restringen la conformación incluyen, pero no se limitan a, la tiorredoxina (u otras proteínas similares a la tiorredoxina), nucleasas (por ejemplo, RNasa A), proteasas (por ejemplo, tripsina), inhibidores de proteasas (por ejemplo, el inhibidor de la tripsina pancrática bovina), anticuerpos o fragmentos suyos estructuralmente rígidos, y conotoxinas.
De forma alternativa, la restricción conformacional se puede lograr explotando la capacidad para establecer puentes disulfuro de un par de residuos de cisteína natural o inducido de forma recombinante, residiendo uno en el extremo amino de la proteína de interés y el otro su extremo carboxilo. Tal puente disulfuro traba la proteína en una estructura de bucle rígido y por ello restringido en su conformación. Los puentes disulfuro entre cisteínas amino-terminales y carboxilo-terminales se pueden formar, por ejemplo, en el citoplasma de las cepas mutantes trxB de E. coli. En algunas condiciones los puentes disulfuro se pueden formar también dentro del citoplasma y el núcleo de organismos superiores que portan mutaciones equivalentes, por ejemplo, una cepa mutante YTR4 de S. cerevisiae (Furter et al., Nucl. Acids Res. 14:6357-6373, 1986; número de acceso al GenBank P29509). Además, las fusiones de la tiorredoxina descritas en la presente memoria (fusiones trxA) se pueden someter a esta alternativa por los medios de introducir una restricción conformacional, puesto que las cisteínas en la base de péptidos insertados dentro del bucle del sitio activo de la tiorredoxina están a una distancia apropiada una de la otra para formar puentes disulfuro en condiciones apropiadas.
Las proteínas restringidas en su conformación como candidatos a elementos interactuantes son útiles en la invención porque se pueden someter al análisis de la estructura terciaria, facilitando así el diseño de moléculas orgánicas sencillas imitadoras con propiedades farmacológicas mejoradas. Por ejemplo, como la tiorredoxina tiene una estructura conocida, la estructura de la proteína situada entre sus regiones restringidas en su conformación se puede resolver más fácilmente utilizando métodos tales como la NMR y el análisis diferencial de rayos X. Ciertas proteínas que restringen la conformación protegen también la proteína embebida de la degradación celular y/o incrementan la solubilidad de la proteína, y/o alteran de otra manera la capacidad del candidato a elemento interactuante para interaccionar.
Una vez aisladas, las proteínas interactuantes se pueden analizar también utilizando el sistema de trampa para las interacciones, siendo la señal generada por la interacción una indicación de cualquier cambio en las capacidades de interacción de las proteínas. En un ejemplo concreto, se realiza una alteración (por ejemplo, por procedimientos estándar de mutagénesis dirigida o al azar in vivo o in vitro) en una o en las dos proteínas interactuantes, y se controla el efecto de la(s) alteración(es) midiendo la expresión del gen indicador. Utilizando esta técnica, se aislan proteínas interactuantes con un potencial de interacción incrementado o disminuido. Tales proteínas son útiles como moléculas terapéuticas (por ejemplo, agonistas o antagonistas) o, como se describe más adelante, como modelos para el diseño de moléculas orgánicas sencillas imitadoras.
Los agonistas y antagonistas proteicos se pueden identificar y aislar también fácilmente utilizando una variación del sistema de trampa para las interacciones. En particular, una vez que se ha recogido una interacción proteína-proteína, se introduce en la célula hospedadora un DNA adicional que codifica un candidato a agonista o antagonista, o preferiblemente, una secuencia de una genoteca de secuencias que codifican agonistas o antagonistas potenciales, y se mide la expresión del gen indicador. De forma alternativa, los compuestos candidatos a elementos interactuantes agonistas o antagonistas (es decir, que incluyen polipéptidos así como compuestos no proteicos, por ejemplo, polinucleótidos monocatenarios) se introducen en un sistema in vivo o in vitro de trampa para las interacciones de acuerdo con la invención y se mide su capacidad para afectar a la expresión del gen indicador. Una disminución de la expresión del gen indicador (comparado con un control que carece de la secuencia o compuesto candidato) indica un antagonista. A la inversa, un incremento en la expresión del gen indicador (comparado de nuevo con un control) indica un agonista. Los agonistas y antagonistas de la interacción son útiles como agentes terapéuticos o como modelos para diseñar imitadores sencillos; si se desea, una proteína agonista o antagonista puede estar restringida en su conformación para proporcionar las ventajas descritas en la presente memoria. Los ejemplos concretos de proteínas interactuantes para las que se pueden identificar antagonistas o agonistas incluyen, pero no se limitan a, el par receptor-ligando de la IL-6, el par receptor-ligando del TGF-\beta, el par receptor-ligando de la IL-1 y otras interacciones receptor-ligando, pares proteína quinasa-sustrato, pares interactuantes de factores de transcripción, componentes interactuantes de rutas de transducción de señales (por ejemplo, dominios citoplasmáticos de ciertos receptores y proteínas G), pares de proteínas interactuantes implicadas en la regulación del ciclo celular (por ejemplo, p16 y CDK4), y pares de neurotransmisores.
También están incluidas en la presente invención genotecas que codifican proteínas restringidas en su conformación. Tales genotecas (que pueden incluir colecciones de secuencias de DNA naturales así como sintéticas) se expresan intracelularmente o, de forma opcional, en sistemas libres de células, y se pueden utilizar junto con cualquier selección o escrutinio genético estándar o con uno cualquiera de un número de formatos de trampas para interacciones para la identificación de proteínas interactuantes, proteínas agonistas o antagonistas, o proteínas que dotan a una célula de cualquier característica identificable, por ejemplo, proteínas que perturban la progresión del ciclo celular. De acuerdo con esto, las genotecas que codificas péptidos (o al azar o diseñadas) se pueden utilizar en selecciones o escrutinios que están o no basados en la transcripción. Con estas genotecas (que incluyen preferiblemente al menos 100 especies que codifican péptidos diferentes y con mayor preferencia incluyen 1000, o 100.000 o más especies individuales) se puede transformar cualquier hospedador útil procariótico o eucariótico, representando las levaduras el hospedador preferido. De forma alternativa, tales genotecas que codifican péptidos se pueden expresar en sistemas libres de células.
Otras características y ventajas de la invención se volverán aparentes a partir de su siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos se describen primero brevemente.
Las Fig. 1A-1C ilustran un sistema de trampa para las interacciones de acuerdo con la invención.
La Fig. 2 es un diagrama de un vector pJM1 para genotecas.
La Fig. 3A es una fotografía que muestra la interacción de aptámeros de péptidos con otras proteínas.
La Fig. 3B ilustra la secuencia de ejemplos de péptidos que interactúan con la Cdk2.
La Fig. 4 ilustra la coprecipitación de los péptidos 3 y 13 mediante Gst-Cdk2.
Carril 1. Perlas de Gst, el extracto contiene TrxA;
Carril 2. Perlas de Gst, el extracto contiene TrxA-péptido 3;
Carril 3. Perlas de Gst, el extracto contiene TrxA-péptido 13;
Carril 4. Perlas de Gst-Cdk2, el extracto contiene TrxA;
Carril 5. Perlas de Gst-Cdk2, el extracto contiene TrxA-péptido 3; y
Carril 6. Perlas de Gst-Cdk2, el extracto contiene TrxA-péptido 13.
La Fig. 5 ilustra el vector BRM116-H-Ras(G12V).
La Fig. 6 ilustra el vector pEG202-H-Ras(G12V).
Descripción detallada
Los solicitantes han desarrollado un nuevo sistema de trampa para las interacciones para la identificación y el análisis de proteínas restringidas en su conformación que o interaccionan físicamente con una segunda proteína de interés o que antagonizan o agonizan tal interacción. En una realización, el sistema implica una cepa hospedadora eucariótica (por ejemplo, una cepa de levadura) que se modifica mediante ingeniería genética para producir una proteína de interés terapéutico o diagnóstico en forma de proteína de fusión unida covalentemente a un dominio conocido de unión al DNA; a esta proteína se hace referencia como proteína "señuelo" porque su propósito en el sistema es "capturar" polipéptidos interactuantes (denominados la "presa"; véase más adelante) útiles, pero desconocidos o no caracterizados hasta ahora. La cepa hospedadora eucariótica contiene también uno o más "genes indicadores", es decir, genes cuya transcripción se detecta en respuesta a una interacción señuelo-presa. Las proteínas señuelo, por medio de su dominio de unión al DNA, se unen a su sitio de reconocimiento específico en el DNA aguas arriba con respecto a un gen indicador; la transcripción indicadora no se estimula, sin embargo, porque la proteína señuelo carece de dominio de activación.
Para aislar secuencias de DNA que codifican nuevas proteínas interactuantes, se introduce miembros de una genoteca de expresión de DNA (por ejemplo, una genoteca de cDNA o DNA sintético, obtenida o al azar o intencionadamente) en la cepa que contiene el gen indicador y la proteína señuelo; cada miembro de la genoteca dirige la síntesis de un candidato a proteína interactuante fusionado con una etiqueta de dominio de activación de un gen que no varía. A estas proteínas codificadas en la genoteca que interaccionan físicamente con la proteína señuelo unida al promotor se hace referencia como proteínas "presa". Tales proteínas presa unidas (por medio de su etiqueta de dominio de activación) activan de forma detectable la expresión del gen indicador situado aguas abajo y proporcionan un ensayo fácil para identificar un clon concreto de DNA que codifica una proteína interactuante de interés. En la presente invención, cada candidato a proteína presa está restringido en su conformación (por ejemplo, o embebiendo la proteína dentro de una proteína que restringe su conformación o uniendo los extremos amino y carboxilo de la proteína). Tal proteína se mantiene en una estructura tridimensional fija, facilitando el diseño de fármacos imitadores.
Un ejemplo de un sistema de trampa para las interacciones de acuerdo con la invención se muestra en las Figuras 1 A-C. La Figura 1A muestra una cepa de levadura auxótrofa para la leucina que contiene dos genes indicadores, LexAop-LEU2 y LexAop-lacZ, y un gen de una proteína señuelo que se expresa de forma constitutiva. La proteína señuelo (mostrada como un pentágono) se fusiona con un dominio de unión al DNA (mostrado como un círculo). La proteína que se une al DNA reconoce y se une específicamente al sitio de reconocimiento específico de una proteína que se une al DNA (mostrado como un rectángulo sólido) unido de forma operativa a un gen indicador. En las Figuras 1B y 1C, las células contienen de forma adicional candidatos a proteínas presa (candidatos a elementos interactuantes) (mostrados como un rectángulo no relleno en 1B y un hexágono no relleno en 1C) fusionados con un dominio de activación (mostrado como cuadrado relleno); cada proteína presa está embebida en una proteína que restringe su conformación (mostradas como dos semicírculos rellenos). La Figura 1B muestra que si el candidato a proteína presa no interacciona con la fusión inerte respecto a la transcripción LexA-proteína señuelo, los genes indicadores no se transcriben; la célula no puede crecer formando una colonia en un medio leu^{-}, y es blanca en un medio con Xgal porque no contiene ninguna actividad \beta-galactosidasa. La Figura 1C muestra que, si el candidato a proteína presa interacciona con el señuelo, se activan ambos genes indicadores; la célula forma una colonia en un medio leu^{-}, y las células de esa colonia tienen actividad \beta-galactosidasa y son azules en un medio con Xgal. Preferiblemente, en este sistema, la proteína señuelo (es decir, la proteína que contienen un dominio de unión al DNA específico del sitio) en inerte con respecto a la transcripción, y los genes indicadores (que están unidos por la proteína señuelo) no tienen esencialmente ninguna transcripción basal.
Cada componente del sistema se describe ahora con más detalle.
Proteínas señuelo
La cepa hospedadora de la selección representada en las Figuras 1 A-C contiene un DNA que codifica una proteína señuelo fusionado con un DNA que codifica un resto de unión al DNA derivado de la proteína bacteriana LexA. El uso de un dominio de unión al DNA de LexA proporciona ciertas ventajas. Por ejemplo, en las levaduras, el resto de LexA no contiene ninguna función de activación y no tiene ningún efecto conocido sobre la transcripción de los genes de la levadura (Brent y Ptashne, Nature 312:612-615, 1984; Brent y Ptashne, Cell 43:729-736, 1985). Además, el uso del dominio de unión al DNA de LexA en lugar de, por ejemplo, el dominio de unión al DNA de GAL4 permite la expresión condicional de proteínas presa en respuesta a la inducción por galactosa; esto facilita la detección de proteínas presa que podrían ser tóxicas para la célula hospedadora si se expresaran continuamente. Finalmente, el uso de un sistema bien definido, tal como el de LexA, permite un conocimiento en lo que respecta a la interacción entre LexA y el dominio de unión de LexA (es decir, el operador LexA) a explotar con el propósito de optimizar la ocupación del operador y/u optimizar la geometría de la proteína señuelo unida para conseguir el efecto de una activación máxima del gen.
Preferiblemente, la proteína señuelo incluye también un dominio de dimerización de LexA; este dominio opcional facilita la formación eficiente de dímeros de LexA. Como LexA se une a su sitio de unión al DNA en forma de dímero, la inclusión de este dominio en la proteína señuelo optimiza también la eficiencia de la ocupación del operador (Golemis y Brent, Mol. Cell Biol. 12:3006-3014, 1992).
LexA representa un dominio de unión al DNA preferido en la invención. Sin embargo, se puede utilizar en el sistema de trampa para las interacciones cualquier otro dominio de unión al DNA inerte con respecto a la transcripción o esencialmente inerte con respecto a la transcripción; tales dominios de unión al DNA son bien conocidos e incluyen porciones que se unen al DNA de las proteínas ACE1 (CUP1), cl de lambda, represor lac, jun, fos, GCN4, o el represor Tet. El dominio de unión al DNA de GAL4 representa un resto de unión al DNA ligeramente menos preferido para las proteínas señuelo.
Las proteínas señuelo se pueden elegir a partir de cualquier proteína de interés e incluyen proteínas de importancia desconocida, conocida, o que se sospeche desde el punto de vista diagnóstico, terapéutico o farmacológico. Las proteínas señuelo preferidas incluyen oncoproteínas (tales como myc, particularmente el extremo carboxilo de myc, ras, src, fos, y particularmente los dominios oligoméricos de interacción de fos) o cualesquiera otras proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular (tales como quinasas, fosfatasas, las porciones citoplasmáticas de receptores asociados a la membrana). Los ejemplos concretos de proteínas señuelo preferidas incluyen la ciclina y las quinasas dependientes de ciclina (por ejemplo, la Cdk2) o pares receptor-ligando, o pares de neurotransmisores, o pares de otras proteínas de señalización. En cada caso, la proteína de interés se fusiona con una dominio conocido de unión al DNA tal como se describe de forma general en la presente memoria. Más adelante se proporcionan ejemplos utilizando como señuelos Cdk2 y Ras.
Indicadores
Como se muestra en la Figura 1B, una cepa hospedadora preferida de acuerdo con la invención contiene dos genes indicadores diferentes, el gen LEU2 y el gen lacZ, que portan cada uno aguas arriba un sitio de unión para la proteína señuelo. Los genes indicadores representados en la Figura 1B incluyen cada uno, como sitio de unión aguas arriba, uno o más operadores LexA en lugar de sus secuencias nativas de activación situadas aguas arriba (UAS, del inglés "Upstream Activation Sequences"). Estos genes indicadores se pueden integrar en el cromosoma o pueden ser portados por plásmidos de replicación autónoma (por ejemplo, los plásmidos de 2\mu de las levaduras).
En las realizaciones in vivo de la invención se prefiere una combinación del tal par de indicadores por un número de razones. Primero, la construcción LexAop-LEU2 permite que las células que contienen proteínas interactuantes se seleccionen ellas mismas mediante el crecimiento en un medio que carece de leucina, facilitando el examen de grandes cantidades de células que contienen candidatos potenciales a proteínas interactuantes. Segundo, el indicador LexAop-lacZ permite que las células LEU^{+} sean escrutadas rápidamente para confirmar una interacción. Y, tercero, entre otras consideraciones técnicas, el indicador LexAop-LEU2 proporciona una primera selección extremadamente sensible, mientras que el indicador LexAop-lacZ permite la discriminación entre proteínas de diferentes afinidades de interacción.
Aunque los genes indicadores descritos en la presente memoria representan una realización preferida de la invención, también se pueden emplear otros genes equivalentes cuya expresión se pueda detectar o ensayar mediante técnicas estándar en conjunción con, o en lugar de, los genes LEU2 y lacZ. Por lo general, tales genes indicadores codifican una enzima que proporciona un marcador fenotípico, por ejemplo, una proteína que es necesaria para el crecimiento celular o una proteína tóxica que conduce a la muerte de la célula, o codifican una proteína detectable mediante un ensayo con color o porque su expresión conduce a la presencia o ausencia de color. De forma alternativa, el gen indicador puede codificar un tRNA supresor cuya expresión se puede ensayar, por ejemplo, porque suprime una mutación letal para la célula hospedadora. Los ejemplos concretos de otros genes útiles cuya transcripción se puede detectar incluyen genes de la biosíntesis de aminoácidos y ácidos nucleicos (tales como HIS3, URA3, TRP1, y LYS2 de levaduras), GAL1, galk de E. coli (que complementa al gen GAL1 de levaduras), y los genes indicadores CAT, GUS, proteínas fluorescentes y sus derivados, y cualquier gen que codifique un antígeno de la superficie celular para el que estén disponibles anticuerpos (por ejemplo, CD4). Los genes indicadores se pueden ensayar por medios cualitativos o cuantitativos para distinguir los candidatos a elementos interactuantes como agonistas o antagonistas.
Proteínas presa
En la selección descrita en la presente memoria, se utiliza otra construcción de DNA que codifica una serie de candidatos a proteínas interactuantes (es decir, proteínas presa), cada una de ellas está restringida en su conformación, o por estar embebida en una proteína que restringe su conformación o porque están unidos los extremos amino y carboxilo de la proteína presa (por ejemplo, mediante el establecimiento de puentes disulfuro). Una proteína presa que sirve de ejemplo incluye un resto amino terminal no variable que porta, entre los extremos amino y carboxilo, un ATG para la expresión de la proteína, una secuencia opcional para la localización nuclear, un dominio débil de activación (por ejemplo, los dominios de activación B112 o B42 de Ma y Ptashne; Cell 51:113, 1987), y una etiqueta opcional con un epítopo para la detección inmunológica rápida de la síntesis de la proteína de fusión. Las secuencias de genotecas, las secuencias de DNA sintético diseñadas al azar o intencionadamente, o las secuencias que codifican proteínas restringidas en su conformación, se pueden insertar aguas abajo con respecto a este fragmento N-terminal para producir genes de fusión que codifican proteínas presa.
Las proteínas presas distintas de las descritas en la presente memoria son también útiles en la invención. Por ejemplo, se pueden construir los cDNA a partir de cualquier población de mRNA e insertarlos en un vector de expresión equivalente. Tal genoteca de elección se puede construir de novo utilizando kits comercialmente disponibles (por ejemplo, de Stratagene, La Jolla, CA) o utilizando procedimientos preparativos bien establecidos (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Nueva York, John Willey & Sons, 1987). De forma alternativa, están pública y comercialmente disponibles numerosas genotecas de cDNA (de numerosos organismos diferentes); las fuentes de las genotecas incluyen, por ejemplo, Clontech (Palo Alto, CA), y Stratagene (La Jolla, CA). También se hace notar que las proteínas presa no necesitan ser polipéptidos de longitud completa que estén presentes en la naturaleza. En realizaciones preferidas, las proteínas presa están codificadas por secuencias de DNA sintético, son los productos de marcos abiertos de lectura generados al azar, son marcos abiertos de lectura sintetizados con una inclinación intencionada hacia una secuencia, o son porciones suyas. Preferiblemente, tales secuencias cortas generadas al azar codifican péptidos con una longitud entre 1 (y preferiblemente, 6) y 60 aminoácidos. En un ejemplo concreto, la proteína presa incluye sólo un dominio de interacción; tal dominio puede ser útil como agente terapéutico para modular la actividad de una proteína señuelo (es decir, como antagonista o agonista).
De forma similar, se puede utilizar cualquier número de dominio de activación para esa porción de la molécula presa; tales dominios de activación son preferiblemente dominios débiles de activación, es decir, más débiles que el resto de la región II de activación del GAL4 y preferiblemente no más fuertes que B112 (medidos, por ejemplo, mediante la comparación con la región II de activación del GAL4 o con B112 en ensayos en paralelo con \beta-galactosidasa utilizando genes indicadores lacZ); tal dominio puede, sin embargo, ser más débil que el B112. En particular, la extraordinaria sensibilidad del esquema de selección mediante el LEU2 permite que se utilice en la invención incluso dominios de activación extremadamente débiles. Los ejemplos de otros dominios débiles de activación útiles incluyen B17, B42, y los dominios de hélices anfipáticas (AH) descritos en Ma y Ptashne (Cell 51:113, 1987), Ruden et al. (Nature 350:426-430, 1991), y Giniger y Ptashne (Nature 330:670, 1987).
Las proteínas presa, si se desea, pueden incluir otras secuencias opcionales de localización nuclear (por ejemplo, las derivadas de los genes GAL4 o MAT\alpha2) u otras etiquetas opcionales con epítopos (por ejemplo, porciones de la proteína c-myc o el epítopo bandera disponible en Immunex). Estas secuencias optimizan la eficiencia del sistema, pero no se requieren para su operación. En particular, la secuencia de localización nuclear optimiza la eficiencia con la que las moléculas presa alcanzan la(s) construcción(es) con los genes indicadores localizada(s) en el núcleo, incrementando así su concentración efectiva y permitiendo que se detecten interacciones más débiles entre proteínas. La etiqueta con el epítopo meramente facilita un inmunoensayo sencillo de la expresión de la proteína de fusión.
Los expertos en la técnica reconocerán también que el gen indicador, el dominio de unión al DNA, y los componentes de dominio de activación del gen anteriormente descritos pueden derivar de cualquier fuente eucariótica o procariótica apropiada, incluyendo los genomas de levaduras, células de mamíferos, o células procarióticas o los cDNA así como secuencias artificiales. Es más, aunque la levadura representa un organismo hospedador preferido para el sistema de trampa para las interacciones (por razones de facilidad de propagación, manipulación genética, y escrutinio a gran escala), también se pueden utilizar otros organismos hospedadores tales como células de mamíferos. Si se elige un sistema de un mamífero, un gen indicador preferido es el gen CAT, sensible y fácil de ensayar; pueden elegirse dominios de unión al DNA y dominios de activación de genes útiles de entre los anteriormente descritos (por ejemplo, el dominio de unión al DNA de LexA y los dominios de activación B42 o B112).
Proteínas restringidas en su conformación
De acuerdo con una realización de la presente invención, la secuencia de DNA que codifica la proteína presa está embebida en una secuencia de DNA que codifica una proteína que restringe su conformación (es decir, una proteína que disminuye la flexibilidad de los extremos amino y carboxilo de la proteína presa). Los métodos para unir directamente los extremos amino y carboxilo de una proteína (por ejemplo, a través del establecimiento de puentes disulfuro entre residuos de cisteína situados en posiciones apropiadas) se han descrito anteriormente. Como alternativa a este abordaje, pueden utilizarse proteínas que restringen la conformación. En general, las proteínas que restringen la conformación actúan como estructuras base o plataformas, que limitan el número de posibles configuraciones tridimensionales que el péptido o proteína de interés está libre para adoptar. Los ejemplos preferidos de proteínas que restringen la conformación son la tiorredoxina u otras secuencias similares a la de la tiorredoxina, pero muchas otras proteínas son útiles también para este propósito. Preferiblemente, las proteínas que restringen la conformación son de pequeño tamaño (generalmente, de menos de o igual a 200 aminoácidos), de estructura rígida, de conformación tridimensional conocida, y son capaces de acomodar inserciones de proteínas de interés sin ser necesaria la alteración de sus estructuras. Una característica clave de tales proteínas es la disponibilidad, en sus superficies expuestas al disolvente, de localizaciones donde de pueden hacer inserciones de péptidos (por ejemplo, el bucle del sitio activo de la tiorredoxina). También es preferible que de los genes que producen la proteína que restringe la conformación se puedan obtener una expresión elevada en diversos hospedadores procarióticos y eucarióticos, o en sistemas adecuados libres de células, y que las proteínas sean solubles y resistentes a la degradación por proteasas. Los ejemplos de proteínas que restringen la conformación útiles en la invención incluyen nucleasas (por ejemplo, RNasa A), proteasas (por ejemplo, tripsina), inhibidores de proteasas (por ejemplo, el inhibidor de la tripsina pancreática bovina), anticuerpos y fragmentos rígidos suyos, y conotoxinas. Esta lista, sin embargo, no es limitante. Se espera que otras proteínas que restringen la conformación que tienen secuencias no identificadas anteriormente, o quizás no identificadas o publicadas todavía, puedan ser útiles basándose en su estabilidad estructural y rigidez.
Como se mencionó anteriormente, una proteína preferida que restringe la conformación de acuerdo con la invención es la tiorredoxina u otras proteínas similares a la tiorredoxina. Como ejemplo de proteína similar a la tiorredoxina útil en esta invención, la tiorredoxina de E. coli tienen las siguientes características. La tiorredoxina de E. coli es una proteína pequeña, de sólo 11,7 kD, que se puede producir en niveles elevados. El pequeño tamaño y la capacidad para la síntesis a alto nivel de la proteína contribuyen a una elevada concentración intracelular. La tiorredoxina de E. coli se caracteriza además por una estructura terciaria muy estable y apretada que puede facilitar la purificación de la proteína.
La estructura tridimensional de la tiorredoxina de E. coli es conocida y contiene varios bucles en su superficie, incluyendo un bucle Cys....Cys fácilmente distinguible con un sitio activo entre los residuos Cys_{33} y Cys_{36} que sobresale del cuerpo de la proteína. El bucle Cys....Cys con el sitio activo es una región en forma de bucle en la superficie, identificable y accesible, y no está implicado en interacciones con el resto de la proteína que contribuyan a la estabilidad estructural global. Es por ello un buen candidato a lugar para las inserciones de proteínas presa. La tiorredoxina humana, la glutarredoxina, y otras moléculas similares a la tiorredoxina contienen también este bucle Cys....Cys con un sitio activo. Tanto el extremo amino como el carboxilo de la tiorredoxina de E. coli están en la superficie de la proteína y están también fácilmente accesibles para la construcción de fusiones. La tiorredoxina de E. coli es también estable frente a las proteasas, estable frente al calor hasta 80ºC y estable frente a un pH bajo.
Otras proteínas similares a la tiorredoxina codificadas por secuencias de DNA similares a la de la tiorredoxina útiles en esta invención comparten secuencias homólogas de aminoácidos, y características físicas y estructurales similares. Así, las secuencias de DNA que codifican otras proteínas similares a la tiorredoxina se pueden utilizan en lugar de la tiorredoxina de E. coli de acuerdo con esta invención. Por ejemplo, son adecuadas las secuencias de DNA que codifican la tiorredoxina de otras especies, por ejemplo, la tiorredoxina humana. La tiorredoxina humana tiene una estructural tridimensional que es superponible virtualmente a la estructura tridimensional de E. coli, como se determina comparando las estructuras de NMR de las dos moléculas. Forman-Kay et al., Biochem. 30:2685 (1991). La tiorredoxina humana contiene también un bucle con un sitio activo equivalente estructural y funcionalmente al bucle Cys....Cys con el sitio activo que se encuentra en la proteína de E. coli. Se puede utilizar en lugar de o además de la tiorredoxina de E. coli en la producción de la proteína y de péptidos pequeños de acuerdo con el método de esta invención. Las inserciones en el bucle con el sitio activo de la tiorredoxina humana y en el extremo amino pueden ser tan bien toleradas como las de la tiorredoxina de E. coli.
Otras secuencias similares a la de la tiorredoxina que pueden emplearse en esta invención incluyen la totalidad o porciones de las proteínas glutarredoxina y sus homólogas de diversas especies (Holmgren, referencia anterior). Aunque la glutarredoxina de E. coli y la tiorredoxina de E. coli comparten menos de un 20% de homología en sus aminoácidos, las dos proteínas tienen similitudes conformacionales y funcionales (Eklund et al., EMBO J. 3:1443-1449 (1984)) y la glutarredoxina contiene un bucle con un sitio activo equivalente estructural y funcionalmente al bucle Cys...Cys con el sitio activo de la tiorredoxina. La glutarredoxina es por ello una molécula similar a la tiorredoxina tal como se define en la presente memoria.
Además, puede emplearse también como secuencia de DNA similar a la de la tiorredoxina la secuencia de DNA que codifica la proteína disulfuro isomerasa (PDI), o aquella porción que contiene el dominio similar a la tiorredoxina, y sus homólogas de diversas especies (Edman et al., Nature 317:267-270 (1985)), puesto que un dominio repetido de la PDI comparte una homología >30% con la tiorredoxina de E. coli y ese dominio repetido contiene un bucle con un sitio activo equivalente estructural y funcionalmente al bucle Cys....Cys con el sitio activo de la tiorredoxina de E. coli. Las dos últimas publicaciones se incorporan a la presente memoria como referencia con el propósito de proporcionar información sobre la glutarredoxina y la PDI que es conocida y está disponible para un experto en la técnica.
De forma similar también se puede emplear en la presente invención como secuencia de DNA similar a la de la tiorredoxina la secuencia de DNA que codifica la fosfolipasa C específica de fosfoinosítidos (PI-PLC), fragmentos suyos, y sus homólogas de diversas especies (Bennett et al., Nature, 334:268-270 (1988)) basándose en la homología en la secuencia de aminoácidos con la tiorredoxina de E. coli, o alternativamente basándose en la similitud de la conformación tridimensional y la presencia de un bucle con un sitio activo equivalente estructural y funcionalmente al bucle Cys....Cys con el sitio activo de la tiorredoxina de E. coli. La totalidad o una porción de la secuencia de DNA que codifica una proteína del retículo endoplásmico, ERp72, o sus homólogas de diversas especies están también incluidas como secuencias de DNA similares a la de la tiorredoxina para los propósitos de esta invención (Mazzarella et al., J. Biol. Chem. 265: 1094-1101 (1990)) basándose en la homología en la secuencia de aminoácidos, o alternativamente basándose en la similitud de la conformación tridimensional y la presencia de un bucle con un sitio activo equivalente estructural y funcionalmente al bucle Cys....Cys con el sitio activo de la tiorredoxina de E. coli. Otra secuencia similar a la de la tiorredoxina es una secuencia de DNA que codifica la totalidad o una porción de un factor de células T de adultos derivado de la leucemia (ADF) u sus homólogos de otras especies (Wakasugi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8282-8286 (1990)). Se cree ahora que el ADF es la tiorredoxina humana. De forma similar, la proteína responsable de promover la formación de puentes disulfuro en el periplasma de E. coli, el producto del gen dsbA (Bardwell et al., Cell 67:581-589, 1991) se puede considerar también una secuencia similar a la de la tiorredoxina. Las tres últimas publicaciones se incorporan a la presente memoria como referencia con el propósito de proporcionar información sobre PI-PLC, ERp72, y dsbA que son conocidas y están disponibles para un experto en la técnica.
Se espera de la definición de secuencias similares a la de la tiorredoxina utilizada anteriormente que otras secuencias no específicamente identificadas anteriormente, o quizás no identificadas o publicadas todavía, puedan ser útiles como secuencias similares a la de la tiorredoxina basándose en la homología de su secuencia de aminoácidos con la tiorredoxina de E. coli o basándose en tener estructuras tridimensionales sustancialmente similares a la de la tiorredoxina de E. coli o la humana y tener un bucle con un sitio activo equivalente funcional y estructuralmente al bucle Cys....Cys con el sitio activo de la tiorredoxina de E. coli. Un experto en la técnica puede determinar si una molécula tiene estas dos últimas características comparando su estructura tridimensional, analizada por ejemplo mediante cristalografía de rayos X o espectroscopía de NMR bidimensional, con la estructura tridimensional publicada para la tiorredoxina de E. coli y analizando la secuencia de aminoácidos de la molécula para determinar si contiene un bucle con un sitio activo que sea equivalente estructural y funcionalmente al bucle Cys....Cys con el sitio activo de la tiorredoxina de E. coli. Con "sustancialmente similar" en la estructura tridimensional o en la conformación se quiere indicar tan similar a la tiorredoxina de E. coli como lo es la glutarredoxina. Además se ha descrito un algoritmo predictivo que posibilita la identificación de proteínas similares a la tiorredoxina por medio del análisis asistido por ordenador de la secuencia primaria (Ellis et al., Biochemistry 31,4882-4891 (1992)). Basándose en la descripción anterior, un experto en la técnica será capaz de seleccionar e identificar, o si se desea, modificar, una secuencia de DNA similar a la de la tiorredoxina para su uso en esta invención sin recurrir a experimentación innecesaria. Por ejemplo, las mutaciones puntales sencillas realizadas en porciones de la tiorredoxina nativa o secuencias nativas similares a la de tiorredoxina que no afecten a la estructura de la molécula resultante son secuencias alternativas similares a la de la tiorredoxina, como lo son las variantes alélicas de la tiorredoxina nativa o secuencias similares a la de la tiorredoxina.
Las secuencias de DNA que hibridan con la secuencia de la tiorredoxina de E. coli o sus homólogos estructurales en condiciones de hibridación astringentes o relajadas codifican también proteínas similares a la tiorredoxina para su uso en esta invención. Como ejemplo de una tal condición de hibridación astringente está la hibridación con SSC 4X a 65ºC, seguida de un lavado con SSC 0,1X a 65ºC durante una hora. Alternativamente una condición de hibridación astringente que sirve de ejemplo es en formamida al 50%, SSC 4X a 42ºC. Ejemplos de condiciones de hibridación no astringentes son SSC 4X a 50ºC o la hibridación con formamida al 30-40% a 42ºC. El uso de la totalidad de tales secuencias similares a la tiorredoxina se cree que está incluido en esta invención.
Se puede preferir por una variedad de razones que las proteínas presa estén fusionadas dentro del bucle con el sitio activo de la tiorredoxina o de las moléculas similares a la tiorredoxina. La cara de tiorredoxina que rodea al bucle con el sitio activo ha evolucionado, manteniendo la función principal de la proteína como disulfuro oxidorreductasa no específica de proteína, para ser capaz de interaccionar con una amplia variedad de superficies proteicas. La región del bucle con el sitio activo se halla entre segmentos de estructura secundaria fuerte y esto proporciona una plataforma rígida a la cual se pueden atar proteínas presa.
Una proteína presa pequeña insertada en el bucle con el sitio activo de la proteína similar a la tiorredoxina está presente en una región de la proteína que no está implicada en mantener la estructura terciaria. Por ello la estructura de tal proteína de fusión es estable. A decir verdad, se puede escindir la tiorredoxina de E. coli en dos fragmentos en una posición cercana al bucle con el sitio activo, y permanecen todavía las interacciones terciarias que estabilizan la proteína.
El bucle con el sitio activo de la tiorredoxina de E. coli tiene la secuencia NH_{2}...Cys_{33}-Gly-Pro-Cys_{36}...COOH. Fusionar una proteína presa seleccionada con una proteína similar a la tiorredoxina en la porción del bucle activo de la proteína restringe la presa por ambos extremos, reduciendo los grados de libertad en la conformación de la proteína presa, y reduciendo por consiguiente el número de estructuras alternativas tomadas por la presa. La proteína presa insertada está unida por cada extremo mediante residuos de cisteína, que pueden formar un puente disulfuro entre ellas como hacen en la tiorredoxina nativa y limitar además la libertad en la conformación de la presa insertada.
Además, al estar posicionada dentro del bucle con el sitio activo, la proteína presa está colocada en la superficie de la proteína similar a la tiorredoxina, una ventaja para el uso en escrutar con respecto a las conformaciones de proteína bioactiva y otros ensayos. En general, la utilidad de la tiorredoxina u otras proteínas similares a la tiorredoxina está descrita en McCoy et al., Patente de los EE.UU. Nº 5.270.181 y LaVallie et al., Bio/Technology 11:187-193 (1993). Estas dos referencias se incorporan a la presente memoria como referencia.
Ahora sigue una descripción de los sistemas de trampas para las interacciones de la tiorredoxina de acuerdo con la invención. Estos ejemplos están diseñados para ilustrar, no limitar, la invención.
Sistema de trampas para las interacciones de la tiorredoxina
Los sistemas de trampas para las interacciones utilizan proteínas restringidas en su conformación que se han desarrollado para la detección de interacciones entre proteínas, para la identificación y aislamiento de proteínas que participan en tales interacciones, y para la identificación y aislamiento de agonistas y antagonistas de tales interacciones. Los sistemas que sirven de ejemplo se describen ahora.
1. Trampa para la interacción de la tiorredoxina con el señuelo Cdk2
La progresión de las células eucarióticas a través del ciclo celular requiere la acción coordinada de un número de proteínas reguladoras que interaccionan con y regulan la actividad de las Cdk (Sherr, Cell 79:551-55 (1994)). Estas proteínas moduladoras incluyen ciclinas, que regulan positivamente la actividad de las Cdk, inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (Cki), y un número de proteínas quinasas y fosfatasas, algunas de las cuales, tales como CAK y Cdc25, regulan positivamente la actividad de las quinasas, algunas de las cuales, tal como Weel, inhiben la actividad de las quinasas, y algunas de las cuales, tal como Cdil (Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)), tienen efectos que hasta ahora son desconocidos (revisado en Morgan, Nature 374:131-134 (1995)). Se piensa que la Cdk2 se requiere para que las células eucarióticas superiores progresen de G1 a la fase S (Fang y Newport, J. Cell Biol.. 66:731-742 (1991); Pagano et al., J. Cell Biol. 121:101-111 (1993); van den Heuvel y Harlow, Science 262:2050-2054 (1993)). La actividad quinasa de la Cdk2 esta regulada positivamente por la Ciclina E y la Ciclina A (Koff et al., Science 257:1689-1694 (1992); Dulic et al., Science 257:1958-1961 (1992); Tsai et al., Nature 353:174-177 (1991)), regulada negativamente por p21, p27 y p57 (Harper et al., Cell 75:805-816 (1993); Polyak et al., Genes Dev. 8:9-22 (1994); Toyoshima y Hunter, Cell 78:67-74 (1994); Matsuoka et al., Genes Dev. 9:660-662 (1995); Lee et al., Genes Dev. 9:639-649 (1995); además, la Cdk2 forma complejos con Cdil en la transición de G1 a S (Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)). Los autores de la invención describen aquí el uso de un sistema de doble híbrido en levaduras para seleccionar moléculas que reconocen la Cdk2 a partir de genotecas combinatorias.
Se construye un vector presa que contiene el gen de la tiorredoxina de E. coli (trxA). Se utiliza como esqueleto el vector pJG 4-4 (Gyuris et al., Cell 75:791, 1993) y se corta con EcoRI y XhoI. Se obtiene un fragmento de DNA que codifica el dominio de activación de la transcripción B112 mediante la amplificación por PCR del plásmido LexA-B112 (Doug Ruden, tesis doctoral, Universidad de Harvard, 1992) y se corta con MunI y NdeI. Se escinde el gen trxA de E. coli del vector pALTRXA-781 (Patente de los Estados Unidos Nº 5.292.646; InVitrogen Corp., San Diego, CA) mediante la digestión con NdeI y SalI. Los fragmentos trxA y B112 se ligan luego mediante técnicas estándar en el esqueleto pJG 4-4 cortado con EcoRI/XhoI, formando pYENAeTRX. Este vector codifica una proteína de fusión que contiene el dominio de localización nuclear del SV40, el dominio de activación de la transcripción B112, una etiqueta con el epítopo de la hemaglutinina, y la tiorredoxina de E. coli (Fig. 2A).
Las genotecas de péptidos se construyen como sigue. Se sintetiza el oligómero de DNA 5' GACTGACTGGTCCG(NNK)_{20}GGTCCTCAGTCAGTCAGTCAG 3' (con N = A, C, G, T y K = G, T) (SEQ ID NO: 4) y se aparea con el segundo oligómero (5' CTGACTGACTGAGGACC 3') (SEQ ID NO: 5) para formar DNA de doble cadena en el extremo 3' del primer oligómero. La segunda cadena se completa enzimáticamente utilizando la enzima Klenow, cebando la síntesis con el segundo oligómero. El producto se escinde con AvaII, y se inserta en el pYENAeTRX cortado con RsrII. Después de la ligación, se utiliza la construcción para transformar E. coli por métodos estándar (Ausubel et al., referencia anterior). La genoteca contenía 2,9 x 109 miembros, de los cuales más de 109 dirigen la síntesis de péptidos.
Para realizar el escrutinio buscando péptidos interactuantes, se utilizan 20 \mug de la genoteca para transformar la cepa de levadura EGY48 (Mat\alpha his3 leu2::2Lexop-LEU2 ura3 trp1 LYS2; Gyuris et al., referencia anterior). La cepa contiene también el plásmido indicador pSH 18-34, un derivado del pLR1\Delta1, que contiene el origen de replicación del plásmido de 2\mu de levaduras, el gen URA3, y el gen indicador GAL1-lacZ con los elementos reguladores aguas arriba del GAL1 reemplazados por 4 operadores colE1 de LexA (West et al., Mol. Cell Biol.. 4:2467, 1984; Ebina et al., J. Biol. Chem. 258:13258, 1983; Hanes y Brent, Cell 57:1275, 1989), así como el vector señuelo pLexA202-Cdk2 (Cdk2 codifica la quinasa 2 humana dependiente de ciclinas, una enzima esencial para el ciclo celular) (Gyuris et al., referencia anterior; Tsai et al., Oncogene 8:1593, 1993). Se obtuvieron y reunieron aproximadamente 2,5 x 10^{6} transformantes. La primera etapa de selección, el crecimiento en un medio deficiente en leucina después de la inducción con galactosa al 2%/rafinosa al 1% (Gyuris et al., referencia anterior; Guthrie y Fink, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Vol. 194, 1991), se lleva a cabo con un exceso de 8 veces (20 x 10^{6} ufc) de la genoteca presente en las levaduras, y se obtienen alrededor de 900 colonias después del crecimiento a 30ºC durante 5 días. Las 300 colonias más grandes se purifican sembrando en vetas y se ensaya en ellas la expresión dependiente de galactosa del producto del gen LEU2 y de la \beta-galactosidasa (codificada por pSH 18-34), dando lugar éste último a colonias azules de levaduras en presencia de Xgal en el medio (Ausubel et al., referencia anterior). Treinta y tres colonias cumplen estos requisitos las cuales, después de secuenciar, incluyen 14 clones diferentes que se unen todos ellos específicamente a un señuelo LexA-Cdk2, pero no a LexA o a un señuelo LexA-Cdk3 (Finley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1994). La fuerza de la unión se juzga de acuerdo con la intensidad del color azul formado por una colonia de levaduras que contiene cada elemento interactuante diferente. Mediante estos medios, se clasifica cada elemento interactuante como un ligante fuerte, medio, o débil, lo que se normaliza con respecto a la cantidad de color azul causado por las diversas proteínas complementarias de la Cdk2 presentes de forma natural en los ensayos de interacción de apareamiento una al lado de la otra. Aquí se da un ejemplo de la secuencia peptídica de un representante de cada clase:
\newpage
Ligante fuerte: péptido 3 (SEQ ID NO: 6)
1
Ligante medio: péptido 2 (SEQ ID NO: 7)
2
Ligante débil: péptido 6 (SEQ ID NO: 8)
3
Los péptidos control que no se unen detectablemente son: c4:
4
La figura 3A muestra que 5 de los péptidos reaccionaron fuertemente con el señuelo LexA-Cdk2 pero no con un gran número de proteínas no relacionadas. Ninguno de los aptámeros de la Cdk2 interaccionó con CDC28 o Cdc2, que son ambas idénticas en un 65% a la Cdk2. Sin embargo, 2 de los 5 elementos interactuantes de la Cdk2 interaccionaron también con la Cdk3 humana, y 1 de los 5 interaccionó también con la Cdc2c de Drosophila, sugiriendo que estos péptidos reconocen determinantes comunes a estas proteínas. Tanto las consideraciones teóricas como los experimentos de calibración con el extremo carboxilo del represor de lambda sugieren que la transcripción del indicador pSH18-34 de EGY48 se puede activar mediante interacciones de proteínas con unas Kd tan débiles como 10^{-6} M. El hecho de que los péptidos 3 y 13 dirijan una transcripción vigorosa del indicador LexAop-lacZ es consistente con la idea de que puedan interactuar de forma significativamente más fuerte. La secuencia de estos péptidos se muestra en la Figura 3B. Dos de los péptidos son más largos que la longitud unidad; aparentemente ambos son artefactos de las manipulaciones in vitro utilizadas para construir la genoteca. Ningún péptido mostró una similitud significativa en la secuencia con proteínas conocidas, y ninguno mostró una similitud más que ocasional con ningún otro, sugiriendo que no se han agotado los motivos peptídicos capaces de reconocer la Cdk2.
Para confirmar la especificidad de la interacción de la Cdk2, los autores de la invención inmovilizaron una proteína de fusión Gst-Cdk2 sobre perlas de sefarosa-glutation, y utilizaron estas perlas para precipitar específicamente dos aptámeros de péptidos expresados por bacterias (Fig. 4). La Gst-Cdk2 se expresó en E. coli y se purificó sobre sefarosa-glutation como está descrito (Lee et al., Nature 374:91-94 (1995)). Los péptidos 3 y 13 se prepararon como sigue: se prepararon los fragmentos que dirigían la síntesis de los péptidos 3 y 13 mediante amplificación por PCR del inserto codificado por el correspondiente plásmido de la genoteca y se introdujeron en pAL-TrxA (LaVallie et al., Bio/Technology 11:187-193 (1993)). Se expresaron las proteínas de fusión y se lisaron en una célula de presión de French como está descrito (LaVallie et al., BIO/Technology 11, 187-193 (1993)). Se realizó la coprecipitación con perlas de Gst-Sefarosa como está descrito (Lee et al., Nature 374, 91-94 (1995)), y se sometieron las muestras a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 15% con SDS y se transfirieron a membranas de nylon. Las proteínas de fusión que contenían la TrxA se visualizaron realizando ensayos en las membranas utilizando como sonda un anticuerpo anti-TrxA, y poniendo de manifiesto el anticuerpo inmovilizado con los reactivos ECL que incluían un anticuerpo IgG anticonejo acoplado a peroxidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham, Arlington Heights, IL).
Estos experimentos demuestran que las interacciones entre la Cdk2 y los aptámeros de péptidos se pueden observar in vitro, y son así independientes de cualquier proteína nativa de las levaduras que haga de mediador. Una vez identificados, estos péptidos se pueden utilizar en experimentos de competición.
La capacidad para seleccionar TrxA-péptidos que interaccionan específicamente con señuelos intracelulares diseñados permite la creación de otras clases de reactivos intracelulares. Por ejemplo, los derivados apropiados de las fusiones TrxA-péptido pueden permitir la creación de antagonistas y agonistas (como está descrito anteriormente). De forma alternativa, las fusiones de péptidos permiten la creación de "efectores de correspondencias" homodiméricos o heterodiméricos, que fuerzan la interacción de pares de proteínas concretas. En un ejemplo concreto, se fuerza a que dos proteínas se unan utilizando una secuencia tipo cremallera de leucina unida a una proteína que restringe su conformación que contiene un candidato a péptido de interacción. Esta proteína se puede unir a ambos miembros de un par de proteínas de interés y dirigir su interacción. De forma alternativa, el "efector de correspondencias" puede incluir dos secuencias diferentes, una que tenga afinidad por un primer polipéptido y la segunda que tenga afinidad por el segundo polipéptido; de nuevo, el resultado es la interacción dirigida entre el primer y el segundo polipéptidos. Otra aplicación práctica de las fusiones de péptidos descritas en la presente memoria es la creación de "destructores", que dirigen una proteína unida a ellas hacia la destrucción por proteasas del hospedador. En un ejemplo de la aplicación de un destructor, se fusiona una proteasa con un componente de un par interactuante y se permite que ese componente interaccione con el objetivo a destruir (por ejemplo, un sustrato de una proteasa). Mediante este método, se lleva la proteasa a su sitio deseado de acción y se incrementa de forma efectiva su potencial proteolítico. Otra aplicación más de las proteínas de fusión descritas en la presente memoria es como "estabilizantes conformacionales", que inducen a las proteínas diana a favorecer una conformación particular o a estabilizar esa conformación. En un ejemplo concreto, la proteína ras tiene una conformación que indica a una célula que se divida y otra conformación que indica a una célula que no se divida. Seleccionando un péptido o proteína que estabilice la conformación deseada, se puede influir sobre si una célula se dividirá. Otras proteínas que experimentan cambios conformacionales que incrementan o disminuyen la actividad se pueden unir también a un "estabilizante conformacional" apropiado para influir sobre la propiedad de la proteína deseada.
2. Inhibición funcional de la Cdk2
Para determinar si los péptidos interactuantes con la Cdk2 podrían inhibir la función de la Cdk2 in vivo, los autores de la invención se aprovecharon del hecho de que la Cdk2 humana puede complementar alelos sensibles a la temperatura de Cdc28 (Elledge y Spottswood, EMBO 10:2653-2659, 1991; Ninomiya et al., PNAS 88:9006-9010, 1991; Meyerson et al., EMBO 11:2909-2917, 1992). El péptido 13 inhibe la eficiencia de plaqueo de una levadura dependiente de la Cdk2. Una cepa que porta la mutación sensible a la temperatura cdc28-1N puede formar colonias a alta temperatura si porta un plásmido que expresa la Cdk2. A la temperatura restrictiva, comparada con la eficiencia de plaqueo de levaduras que expresan péptidos de control, la expresión del péptido 13 disminuye 10 veces la eficiencia de plaqueo de esta cepa. Tanto el péptido 3 como el 13 tienen efectos similares sobre la eficiencia de plaqueo a 37ºC de una cepa Cdk2 (+) que porta el alelo cdc28-13ts.
La expresión del péptido 13 aminora el tiempo de replicación de una cepa Cdk2(+), cdc28ts-1N en un factor del 50%. El examen microscópico de las cepas que expresan el péptido reveló que una elevada proporción de estas células tenía una morfología alargada característica de las células cdc28-1N a la temperatura restrictiva, mientras que las células que expresaban un péptido control tenían una morfología más normal.
El péptido 13 no afecta al crecimiento de una cepa cdc28-1Nts a alta temperatura cuando el defecto se complementa mediante un plásmido que expresa un producto Cdc28 tipo silvestre, y no tienen ningún efecto sobre las levaduras a la temperatura permisiva. Aunque los autores de la invención no intentan adherirse a ninguna teoría en particular, parece que este péptido bloquea la progresión del ciclo celular de las levadura uniéndose a alguna cara de la molécula de la Cdk2 e inhibiendo su función e interfiriendo con ello en su capacidad para interaccionar con las ciclinas, con otras parejas, o con los sustratos.
3. Trampa para la interacción de la tiorredoxina con un señuelo OncoRas
Las proteínas ras son esenciales en muchas rutas de transducción de señales y regulan numerosas funciones fisiológicas incluyendo la proliferación celular. Los genes ras se identificaron por primera vez a partir del genoma del virus del sarcoma de Harvey y Kirsten. Los tres tipos de genes ras de mamíferos (N-, K-ras, y H-ras) codifican proteínas altamente conservadas unidas a la membrana y que se unen al nucleótido de la guanina con una masa molecular de 21 kDa, que oscilan entra la forma activa (unida al GTP) y la forma inactiva (unida al GDP).
En las células normales, la forma activa de la Ras es de vida corta, y su actividad GTPasa intrínseca convierte rápidamente el GTP unido a ellas en GDP. La actividad GTPasa se estimula 10^{5} veces mediante proteínas activadoras de la GTPasa (GAPS). La Ras unida al GTP interacciona con la GAP, c-Raf, el factor de la neurofibromatosis tipo 1 (NF-1) y el estimulador de la disociación del nucleótido de la guanina de Ral (Ral-GDS).
Las proteínas RAS activadas mediante mutaciones se encuentran en aproximadamente el 30% de las células tumorales humanas y tienen una actividad GTPasa enormemente disminuida que no se estimula mediante las GAP. La mayoría de las mutaciones estudiadas hasta ahora se deben a una mutación puntual en el residuo Gly-12 o en el residuo Gln-61 de Ras. Estos mutantes de Ras permanecen en forma activa e interaccionan con los efectores situados aguas abajo para dar como resultado tumorigénesis. Se ha demostrado que hay diferencias conformacionales significativas entre las formas unidas a GTP de las proteínas RAS tipo silvestre y oncogénicas. Tales diferencias conformacionales son causas probables de la transformación maligna inducida por las proteínas oncogénicas ras.
Tales cambios conformacionales activados por mutaciones en los mutantes de H-ras unida a GTP proporcionan dianas para los miembros de una genoteca de péptidos al azar restringidos en su conformación. En el presente ejemplo, la genoteca es una genoteca de péptidos de la tiorredoxina restringidos en su conformación, como se describió anteriormente. Los miembros de la genoteca, que interaccionan con la Ras oncogénica se han identificado utilizando una variación de la tecnología de la trampa para las interacciones proporcionada anteriormente. En los aptámeros de péptidos de la Ras oncogénica aislados se puede ensayar su capacidad para alterar la interacción de la Ras oncogénica con efectores conocidos e inhibir la transformación celular.
Los autores de la invención han utilizado la H-ras(G12V) oncogénica bien caracterizada para el aislamiento y la caracterización de sus aptámeros de péptidos. Se pueden aislar aptámeros peptídicos para otros oncogenes utilizando adaptaciones de este protocolo tal como se proporciona en la presente memoria.
Construcción del señuelo
La construcción del DNA de LexA-Ras(G12V)/pEG202:H-Ras(G12V) se llevó a cabo digiriendo BTM116-H-Ras(G12V) (Fig. 5) con BamHI y SalI. El DNA de H-Ras(G12V) se ligó con el esqueleto del pEG202 digerido con BamHI y SalI. Al plásmido resultante se le llamó pEG202-H-Ras(G12V) (o V6) (Fig. 6).
Escrutinio de los aptámeros de péptidos de la H-Ras (G12V)
Se transformó la cepa EGY48 con el pEG202-H-Ras(G12V) (V6) de acuerdo con un protocolo estándar para la transformación de levaduras; en particular, se utilizó aquí el protocolo proporcionado por Zymo Research (Condado de Orange, CA). Se creció la EGY48 en medio YPD hasta DO_{600}=0,2-0,7. Se sedimentaron las células a 500 X g durante 4 minutos, y se resuspendieron en 10 ml de solución EZ1 (Zymo Research). Se sedimentaron entonces las células mediante centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de EZ2 (Zymo Research). Las alícuotas de células competentes (50 \mul) se almacenaron en un congelador a -70ºC.
Se mezcló una alícuota de células competentes con 0,1 \mug de LexA-H-Ras(G12V)/pEG202 y 500 \mul de solución EZ3 (Zymo Research). Se incubó la mezcla a 30ºC durante 30 minutos y se plaqueó en un medio para levaduras que carecía de histidina y uracilo. Se picó una colonia y se inoculó en 100 ml de medio con glucosa Ura^{-}His^{-} a 30ºC con agitación (150 rpm) hasta que la medida de la DO_{600} fue 0,96. Se centrífugo el cultivo a 2000g durante 5 minutos y los sedimentos de células se resuspendieron en 5 ml de LiOAc/TE estéril. Se centrifugaron de nuevo las células como anteriormente y se resuspendieron en 0,5 ml de LiOAc/TE estéril.
Se incubaron después alícuotas (50 \mul) de las células a 30ºC durante 30 minutos con 1 \mug del DNA de genoteca de péptidos de la tiorredoxina, 70 \mug de DNA de esperma de salmón, y 300 \mul de PEG 4000 estéril al 40% en LiOAc/TE. Se dio a las mezclas choques térmicos a 42ºC durante 15 minutos. Se plaqueó cada alícuota en una placa de 24 cm x 24 cm que contenía medio Ura^{-}His^{-}Trp^{-} con glucosa y se incubó a 30ºC durante dos días. La eficiencia de la trasformación osciló típicamente entre 50.000 y 100.000 unidades formadoras de colonia por \mug de DNA de la genoteca.
Se obtuvieron un total de 1,5 millones de transformantes y se plaquearon en el medio de selección de galactosa/rafinosa Leu^{-}Ura^{-}His^{-}Trp^{-}. De las 338 colonias formadas, se picó al azar 50 de entre ellas y se inocularon en 5 ml de medio con glucosa Leu^{-}Ura^{-}His^{-}Trp^{-} para la preparación del DNA del plásmido de las levaduras. Se mezcló medio ml de cada cultivo de levaduras con un volumen igual de arena lavada con ácido y fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (24:24:1), y se agitaron con formación de vórtice en un agitador formador de vórtice durante 2 minutos. Se centrifugó entonces la mezcla durante 15 minutos, y se precipitó el sobrenadante con etanol. Los sedimentos de DNA se resuspendieron en 50 \mul de TE.
Se utilizó un \mul de cada muestra para transformar células KC8 de E. coli mediante electroporación. Los transformantes bacterianos se seleccionaron en agar mínimo suplementado con uracilo, leucina, histidina, y ampicilina. Cada tipo de transformante dio como resultado el aislamiento final de un plásmido con un marcador de leucina, que porta un fragmento de DNA que codifica la proteína de fusión tiorredoxina-péptido.
La determinación de la secuencia de los 50 aislados se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones de los sistemas de secuenciación de fmolDNA^{TM} (Promega, Madison, WI) utilizando el iniciador 5'-GACGGGGCGATCCTCGTCG-3' (SEQ ID NO:16). Nueve de los 50 aislados (a los que se hace referencia como Nº 4, Nº 18, Nº 39, Nº 41, Nº 22, Nº 24, Nº 30, Nº 31, Nº 46) contenían secuencias que codifican un único péptido, tal como se determinó mediante electroforesis de la reacción de terminación con dT/ddT. De entre ellas, la secuencia predicha para el aptámero peptídico del Nº 39 es como sigue:
5
A partir de estos resultados, parece que se aislaron aproximadamente 60 aptámeros de péptidos únicos de H-Ras(G12V) (338 x 9/50) en la primera ronda de escrutinio.
Otras realizaciones
Tal como se describe anteriormente, la invención describe un método para detectar y analizar interacciones proteína-proteína. Típicamente, en los experimentos anteriores, la proteína señuelo se fusiona con el dominio de unión al DNA, y la proteína presa (en asociación con la proteína que restringe su conformación) está fusionada con el dominio de activación del gen. La invención, sin embargo, se adapta fácilmente a otros formatos. Por ejemplo, la invención incluye también una trampa de interacciones "a la inversa" en la que la proteína señuelo se fusiona con un dominio de activación del gen, y la proteína presa (en asociación con una proteína que restringe su conformación) se fusiona con el dominio de unión al DNA. De nuevo, una interacción entre las proteínas señuelo y presa da como resultado la activación de la expresión del gen indicador. Tal sistema de trampa de interacciones "a la inversa", sin embargo, depende del uso de proteínas presa que no activen ellas mismas la expresión del gen situado aguas abajo.
Los ensayos de interacción de proteínas descritos en la presente memoria se pueden llevar a cabo también en un sistema in vitro libre de células. Tal sistema comienza con una construcción de DNA que incluye un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA (por ejemplo, el sitio de unión de LexA). A este DNA se le añade una proteína señuelo (por ejemplo, cualquiera de las proteínas señuelo descritas en la presente memoria unida a un dominio de unión al DNA de LexA) y una proteína presa (por ejemplo, una de una genoteca de proteínas presa restringidas en su conformación candidatas a proteínas presa interactuantes unida a un dominio de activación del gen). La interacción entre la proteína señuelo y la proteína presa se ensaya midiendo el producto del gen indicador, o como un producto de RNA, como un producto de una proteína traducida in vitro, o mediante alguna actividad enzimática del producto del gen indicador traducido. Este sistema in vitro se puede utilizar también para identificar agonistas o antagonistas, simplemente añadiendo a un par conocido de proteínas interactuantes (en el sistema descrito anteriormente) un candidato a agonista o antagonista interactuante y ensayando un incremento o disminución (respectivamente) de la expresión del gen indicador, comparada con una reacción control que carece del compuesto o proteína candidata. Para facilitar el escrutinio a gran escala, las candidatas a proteína presa o candidatas a agonista o antagonista se pueden ensayar inicialmente en conjuntos de, por ejemplo, diez o veinte compuestos o proteínas candidatas. A partir de los conjuntos que demuestren un resultado positivo, se identifica luego la proteína interactuante o agonista o antagonista concreto ensayando individualmente los componentes del conjunto. Tales sistemas in vitro se pueden someter a la automatización robótica o a la producción de kits. Los kits que incluyan los componentes de cualquiera de los sistemas de trampas para las interacciones descritos en la presente memoria también están incluidos en la invención.
Los componentes (por ejemplo, las diversas proteínas de fusión o sus DNA) de cualquiera de los sistemas in vivo o in vitro de la invención se pueden proporcionar de forma secuencial o simultánea dependiendo del diseño experimental deseado.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Brent, Roger McCoy, John M. Jessen, Timm H. Xu, Chanxing Wilson
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMAS DE TRAMPAS PARA LAS INTERACCIONES PARA DETECTAR INTERACCIONES DE PROTEÍNAS
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 20
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Fish & Richardson, P.C.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 225 Franklin Street
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Boston
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: Massachusetts
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02110-2804
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE PARA EL ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.30
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Paul T. Clark
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 30.162
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE CERTIFICACIÓN: 00786/288001
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (617) 542-5070
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (617) 542-8906
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TELEX: 200154
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Val Cys Lys Ser Tyr Arg Leu Asp Trp Glu Ala Gly Ala Leu Phe}
\sac{Arg Ser Leu Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Val Val Ala Ala Glu Ala Val Arg Thr Val Leu Leu Ala Asp Gly}
\sac{Gly Asp Val Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Asn Trp Pro His Gin Leu Arg Val Gly Arg Val Leu Trp Glu Arg}
\sac{Leu Ser Phe Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 91
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(x)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: N es A o T o G o C; K es G o T.
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGACTGACT GAGGACC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Leu Val Cys lys Ser Tyr Arg Leu Asp Trp Glu Ala Gly Ala}
\sac{Leu Phe Arg Ser Leu Phe Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Met Val Val Ala Ala Glu Ala Val Arg Thr Val Leu Leu Ala}
\sac{Asp Gly Gly Asp Val Thr Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Pro Asn Trp Pro His Gln Leu Arg Val Gly Arg Val Leu Trp}
\sac{Glu Arg Leu Ser Phe Glu Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Arg Met Arg Tyr Gly Ile Asp Ala Phe Phe Asp Leu Gly Gly Leu}
\sac{Leu His Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Leu Arg His Arg Leu Gly Arg Ala Leu Ser Glu Asp Met Val Arg Gly}
\sac{Leu Ala Trp Gly Pro Thr Ser His Cys Ala Thr Val Pro Gly Thr Ser Asp}
\sac{Leu Trp Arg Val Ile Arg Phe Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Ser Phe Val His His Gly Phe Phe Asn Phe Arg Val Ser Trp Arg Glu}
\sac{Met Leu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Val Trp Ser Leu Trp Ala Leu Gly Trp Arg Trp Leu Arg Arg Tyr Gly}
\sac{Trp Asn Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\newpage
\sa{Trp Arg Arg Met Glu Leu Asp Ala Glu Ile Arg Trp Val Lys Pro Ile Ser}
\sac{Pro Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Ala Ser Val Cys Gly Pro Leu Leu Ser Lys Arg Gly Tyr Gly}
\sac{Pro Pro Phe Tyr Leu Ala Gly Met Thr Ala Pro Glu Gly Pro Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Ala Ser Val Cys Gly Pro Leu His Tyr Trp Gly Leu Gly Gly}
\sac{Phe Val Asp Leu Trp Gln Glu Thr Thr Gly Val Gly Pro Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGGGGCGA TCCTCGTCG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\newpage
\sa{Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Val Cys Ala His Gly Ser Arg Ser Leu}
\sac{Thr Leu Leu Thr Lys Tyr His Val Ser Phe Leu Gly Pro Cys Lys Met}
\sac{Ile Ala Pro Ile Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Val Cys Lys Ser Tyr Arg Leu Asp Trp Glu Ala Gly Ala Leu Phe Arg}
\sac{Ser Leu Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Arg Trp Gln Gln Gly Val Val Pro Ser Asn Trp Ala Ser Cys Ser Phe}
\sac{Arg Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE IDENTIFICACIÓN: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Phe Ser Leu Trp Leu Leu Met Val Lys Ser Ile Lys Arg Ala Ala}
\sac{Trp Glu Leu Gly Pro Ser Ser Ala Trp Asn Thr Ser Gly Trp Ala Ser Leu}
\sac{Ala Asp Phe Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (94)

1. Un método para determinar si una primera proteína es capaz de interaccionar físicamente con una segunda proteína, que comprende:
(a)
proporcionar una célula hospedadora que contiene
(i)
un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA
(ii)
un primer gen de fusión que expresa una primera proteína de fusión que contiene dicha primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA, y
(iii)
un segundo gen de fusión que expresa una segunda proteína de fusión, conteniendo dicha segunda proteína de fusión dicha segunda proteína y un resto activador del gen, estando dicha segunda proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína, y
(b)
medir la expresión de dicho gen indicador como una medida de una interacción entre dichas primera y segunda proteínas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha segunda proteína es un péptido de al menos 6 aminoácidos.
3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha segunda proteína es un péptido de una longitud menor que o igual a 60 aminoácidos.
4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha segunda proteína contiene una secuencia peptídica generada al azar o diseñada intencionadamente.
5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha primera proteína es la Cdk2.
6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha primera proteína es la Ras o una Ras activada.
7. El método de la reivindicación 1, en el que dicha segunda proteína está embebida dentro de dicha proteína diferente.
8. El método de la reivindicación 1, en el que dicha proteína diferente es la tiorredoxina.
9. El método de la reivindicación 1, en el que dicha proteína diferente es una molécula similar a la tiorredoxina.
10. El método de la reivindicación 8, en el que dicha segunda proteína se inserta en el bucle del sitio activo de dicha proteína tiorredoxina.
11. El método de la reivindicación 1, en el que dicha segunda proteína está restringida en su conformación mediante puentes disulfuro entre residuos de cisteína en el extremo amino y en el extremo carboxilo de dicha segunda proteína.
12. El método de la reivindicación 1, en el que dicha célula hospedadora es de levadura.
13. El método de la reivindicación 1, en el que dicho dominio de unión al DNA es LexA.
14. El método de la reivindicación 1, en el que dicho gen indicador se ensaya mediante una reacción con color.
15. El método de la reivindicación 1, en el que dicho gen indicador se ensaya mediante la viabilidad de las células.
16. Un método para detectar una proteína interactuante en una población de proteínas que comprende:
(a)
proporcionar una célula hospedadora que contiene
(i)
un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA;
(ii)
un primer gen de fusión que expresa una primera proteína de fusión que contiene una proteína de ensayo unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA, y
(b)
introducir en dicha célula hospedadora un segundo gen de fusión que expresa una segunda proteína de fusión, conteniendo dicha segunda proteína de fusión:
una proteína de dicha población de proteínas y un resto activador del gen, estando dicha proteína de dicha población restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de dicha proteína de dicha población de proteínas, y
(c)
medir la expresión de dicho gen indicador como una medida de una interacción entre dicha proteína de ensayo y dicha proteína de dicha población de proteínas.
17. El método de la reivindicación 16, en el que dicha población de proteínas contiene péptidos de entre 1 y 60 aminoácidos de longitud.
18. El método de la reivindicación 16, en el que dicha población de proteínas es un juego de secuencias peptídicas generadas al azar o diseñadas intencionadamente.
19. El método de la reivindicación 16, en el que cada una de dicha población de proteínas está embebida dentro de dicha proteína diferente.
20. El método de la reivindicación 16, en el que dicha proteína diferente es la tiorredoxina.
21. El método de la reivindicación 20, en el que cada una de dicha población de proteínas está insertada en el bucle del sitio activo de dicha tiorredoxina.
22. El método de la reivindicación 16, en el que cada una de dicha población de proteínas está restringida en su conformación mediante puentes disulfuro entre residuos de cisteína en el extremo amino y en el extremo carboxilo de dicha proteína.
23. El método de la reivindicación 16, en el que dicha primera proteína es la Cdk2.
24. El método de la reivindicación 16, en el que dicha primera proteína es la Ras o una Ras activada.
25. El método de la reivindicación 16, en el que dicha célula hospedadora es de levadura.
26. El método de la reivindicación 16, en el que dicho dominio de unión al DNA es LexA.
27. El método de la reivindicación 16, en el que dicho gen indicador se ensaya mediante una reacción con color.
28. El método de la reivindicación 16, en el que dicho gen indicador se ensaya mediante la viabilidad de las células.
29. Un método para identificar un candidato a elemento interactuante, que comprende
(a)
proporcionar un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA
(b)
proporcionar una primera proteína de fusión, conteniendo dicha primera proteína de fusión una primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA;
(c)
proporcionar una segunda proteína de fusión que contiene dicha segunda proteína y un resto activador del gen, estando dicha segunda proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína,
siendo capaz dicha segunda proteína de interaccionar con dicha primera proteína,
(d)
poner en contacto dicho candidato a elemento interactuante con dicha primera proteína y/o dicha segunda proteína, y
(e)
medir la expresión de dicho gen indicador.
30. El método de la reivindicación 29, en el que proporcionar dicha primera proteína de fusión comprende proporcionar un primer gen de fusión que expresa dicha primera proteína de fusión y en el que proporcionar dicha segunda proteína de fusión comprende proporcionar un segundo gen de fusión que expresa dicha segunda proteína de fusión.
31. El método de la reivindicación 29, en el que se permite que interaccionen dicha primera proteína de fusión y dicha segunda proteína de fusión antes de ponerlas en contacto con dicho candidato a elemento interactuante.
32. El método de la reivindicación 29, en el que se permite que interaccionen dicha primera proteína de fusión y dicho candidato a elemento interactuante antes de ponerlos en contacto con dicha segunda proteína de fusión.
33. El método de la reivindicación 29, en el que dicho candidato a elemento interactuante está restringido en su conformación, o estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o uniendo sus extremos amino y carboxilo.
34. El método de la reivindicación 29, en el que dicho candidato a elemento interactuante es un antagonista y reduce la expresión del gen indicador.
35. El método de la reivindicación 29, en el que dicho candidato a elemento interactuante es un agonista e incrementa la expresión del gen indicador.
36. El método de la reivindicación 29, en el que dicho candidato a elemento interactuante es un miembro seleccionado del grupo que consiste en proteínas, polinucleótidos, y moléculas pequeñas.
37. El método de la reivindicación 29, en el que dicho candidato a elemento interactuante está codificado por un miembro de una genoteca de cDNA o DNA sintético.
38. El método de la reivindicación 29, en el que dicho candidato a elemento interactuante es una forma mutada de dicha primera proteína de fusión o dicha segunda proteína de fusión.
39. El método de la reivindicación 29, en el que dicho gen indicador, dicho primer gen de fusión, y dicho segundo gen de fusión están incluidos en un único fragmento de DNA.
40. El método de la reivindicación 29, en el que dicha primera proteína es la Cdk2.
41. El método de la reivindicación 29, en el que dicha primera proteína es la Ras o una Ras activada.
42. Una población de células eucarióticas, que tienen cada célula una molécula de DNA recombinante que codifica un péptido intracelular que está restringido en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo del péptido,
habiendo al menos 100 moléculas recombinantes diferentes, que codifican péptidos intracelulares diferentes, restringidos en su conformación, en dicha población, estando cada molécula en al menos una célula de dicha población.
43. La población de la reivindicación 42, en la que dicho péptido intracelular está embebido dentro de dicha proteína diferente.
44. La población de células eucarióticas de la reivindicación 42, en la que dicha proteína diferente es la tiorredoxina.
45. La población de células eucarióticas de la reivindicación 42, en la que dicho péptido intracelular está restringido en su conformación mediante puentes disulfuro entre residuos de cisteína en el extremo amino y en el extremo carboxilo de dicha segunda proteína.
46. La población de células eucarióticas de la reivindicación 42, en la que dichas células son células de levadura.
47. La población de células eucarióticas de la reivindicación 42, en la que dicha molécula de DNA recombinante codifica además un resto activador de un gen unido covalentemente a dicho péptido intracelular.
48. La población de células eucarióticas de la reivindicación 42, en la que dicho péptido intracelular interacciona físicamente con una segunda proteína recombinante en el interior de dicha célula eucariótica.
49. Un método para ensayar una interacción entre una primera proteína y una segunda proteína, que comprende:
(a)
proporcionar un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA;
(b)
proporcionar una primera proteína de fusión que contiene dicha primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA;
(c)
proporcionar una segunda proteína de fusión que contiene dicha segunda proteína y un resto activador del gen, estando dicha segunda proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína;
(d)
combinar dicho gen indicador, dicha primera proteína de fusión, y dicha segunda proteína de fusión; y
(e)
medir la expresión de dicho gen indicador.
50. El método de la reivindicación 49, el que proporcionar dicha primera proteína de fusión comprende proporcionar un primer gen de fusión que expresa dicha primera proteína de fusión y en el que proporcionar dicha segunda proteína de fusión comprende proporcionar un segundo gen de fusión que expresa dicha segunda proteína de fusión.
51. Una proteína que contiene la secuencia Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe-Arg-Ser-Leu-Phe (SEQ ID NO: 1).
52. La proteína de la reivindicación 51, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
53. Una proteína que contiene la secuencia Met-Val-Val-Ala-Ala-Glu-Ala-Val-Arg-Thr-Val-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Thr (SEQ ID NO: 2).
54. La proteína de la reivindicación 53, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
55. Una proteína que contiene la secuencia Pro-Asn-Trp-Pro-His-Gln-Leu-Arg-Val-Gly-Arg-Val-Leu-Trp-Glu-Arg-Leu-Ser-Phe-Glu (SEQ ID NO: 3).
56. La proteína de la reivindicación 55, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
57. Una proteína que contiene la secuencia Ser-Val-Arg-Met-Arg-Tyr-Gly-Ile-Asp-Ala-Phe-Phe-Asp-Leu-Gly-Gly-Leu-Leu-His-Gly (SEQ ID NO: 9).
58. La proteína de la reivindicación 57, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
59. Una proteína que contiene la secuencia Glu-Leu-Arg-His-Arg-Leu-Gly-Arg-Ala-Leu-Ser-Glu-Asp-Met-Val-Arg-Gly-Leu-Ala-Trp- Gly-Pro-Thr-Ser-His-Cys-Ala-Thr-Val-Pro-Gly-Thr-Ser-Asp-Leu-Trp-Arg-Val-Ile-Arg- Phe-Leu (SEQ ID NO:10).
60. La proteína de la reivindicación 59, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
61. Una proteína que contiene la secuencia Tyr-Ser-Phe-Val-His-His-Gly-Phe-Phe-Asn-Phe-Arg-Val-Ser-Trp-Arg-Glu-Met-Leu-Ala (SEQ ID NO: 11).
62. La proteína de la reivindicación 61, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
63. Una proteína que contiene la secuencia Gln-Val-Trp-Ser-Leu-Trp-Ala-Leu-Gly-Trp-Arg-Trp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Trp-Asn-Met (SEQ ID NO: 12).
64. La proteína de la reivindicación 63, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
65. Una proteína que contiene la secuencia Trp-Arg-Arg-Met-Glu-Leu-Asp-Ala-Glu-Ile-Arg-Trp-Val-Lys-Pro-Ile-Ser-Pro-Leu-Glu (SEQ ID NO: 13).
66. La proteína de la reivindicación 65, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
67. Una proteína que contiene la secuencia Trp-Ala-Glu-Trp-Cys-Gly-Pro-Val-Cys-Ala-His-Gly-Ser-Arg-Ser-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr- Lys-Tyr-His-Val-Ser-Phe-Leu-Gly-Pro-Cys-Lys-Met-Ile-Ala-Pro-Ile-Leu-Asp (SEQ ID NO:17).
68. La proteína de la reivindicación 67, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
69. Una proteína que contiene la secuencia Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe-Arg-Ser-Leu-Phe (SEQ ID NO: 18).
70. La proteína de la reivindicación 69, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
71. Una proteína que contiene la secuencia Tyr-Arg-Trp-Gln-Gln-Gly-Val-Val-Pro-Ser-Asn-Trp-Ala-Ser-Cys-Ser-Phe-Arg-Cys-Gly (SEQ ID NO: 19).
72. La proteína de la reivindicación 71, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
73. Una proteína que contiene la secuencia Ser-Ser-Phe-Ser-Leu-Trp-Leu-Leu-Met-Val-Lys-Ser-Ile-Lys-Arg-Ala-Ala-Trp-Glu-Leu- Gly-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Asn-Thr-Ser-Gly-Trp-Ala-Ser-Leu-Ala-Asp-Phe-Tyr (SEQ ID NO: 20).
74. La proteína de la reivindicación 73, en la que dicha proteína está restringida en su conformación.
75. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 51.
76. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 53.
77. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 55.
78. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 57.
79. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 59.
80. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 61.
81. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 63.
82. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 65.
83. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 67.
84. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 69.
85. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 71.
86. Un DNA que codifica la proteína de la reivindicación 73.
87. Un método para aislar una proteína que comprende:
(a)
proporcionar una célula hospedadora que contiene
(i)
un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA; y
(ii)
un gen de fusión que expresa una proteína de fusión, conteniendo dicha proteína de fusión una proteína de ensayo unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA;
(b)
introducir en dicha célula hospedadora un segundo gen de fusión que expresa una segunda proteína de fusión, conteniendo dicha segunda proteína de fusión:
una proteína de una población de proteínas y un resto activador del gen, estando dicha proteína de dicha población restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de dicha proteína de dicha población de proteínas,
(c)
medir la expresión de dicho gen indicador, y
(d)
aislar una proteína basándose en su capacidad para alterar la expresión de dicho gen indicador cuando está presente en dicha segunda proteína de fusión.
88. Un método para aislar una proteína interactuante que comprende:
(a)
proporcionar un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA;
(b)
proporcionar una primera proteína de fusión, comprendiendo dicha primera proteína de fusión una primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA;
(c)
proporcionar una segunda proteína de fusión, conteniendo dicha segunda proteína de fusión una segunda proteína y un resto activador del gen, estando dicha segunda proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína,
siendo capaz dicha segunda proteína de interaccionar con dicha primera proteína;
(d)
poner en contacto un candidato a proteína interactuante con dicha primera proteína o dicha segunda proteína;
(e)
medir la expresión de dicho gen indicador, y
(f)
aislar una proteína interactuante basándose en su capacidad para alterar la expresión de dicho gen indicador cuando está presente con dicha primera proteína o dicha segunda proteína.
89. Un método para determinar si una primera proteína es capaz de interaccionar físicamente con una segunda proteína, que comprende:
(a)
proporcionar una célula hospedadora que contiene
(i)
un gen indicador unido de forma operativa a un sitio de reconocimiento para una proteína que se une al DNA;
(ii)
un primer gen de fusión que expresa una primera proteína de fusión que contiene dicha primera proteína unida covalentemente a un resto de unión que es capaz de unirse específicamente a dicho sitio de reconocimiento para la proteína que se une al DNA, estando dicha primera proteína restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la segunda proteína, y
(iii)
un segundo gen de fusión que expresa una segunda proteína de fusión, conteniendo dicha segunda proteína de fusión dicha segunda proteína y un resto activador del gen, y
(b)
medir la expresión de dicho gen indicador como una medida de una interacción entre dicha primera y segunda proteínas.
90. El uso de una población de células eucarióticas, que tienen cada célula una molécula de DNA recombinante que codifica una proteína intracelular que está restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la proteína,
habiendo al menos 100 moléculas recombinantes diferentes, que codifican péptidos intracelulares diferentes, restringidos en su conformación, en dicha población, estando cada molécula en al menos una célula de dicha población, en un escrutinio intracelular para la identificación de proteínas interactuantes, o para la identificación de proteínas que dotan a una célula de una característica identificable.
91. El uso de acuerdo con la reivindicación 90, en el que el escrutinio intracelular no está basado en la transcripción.
92. El uso de acuerdo con la reivindicación 90, en el que el DNA que codifica los péptidos restringidos en su conformación está generado al azar.
93. Un método para identificar, y opcionalmente aislar, proteínas antagonistas o agonistas, que comprende:
-
proporcionar una célula hospedadora que contiene un par de proteínas interactuantes, y un gen indicador cuya expresión esté mediada por el par de proteínas interactuantes,
-
introducir en dicha célula hospedadora un DNA que codifica un candidato a proteína agonista o antagonista, en el que dicho candidato a proteína agonista o antagonista está restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo de la proteína,
-
medir la expresión de dicho gen indicador
-
opcionalmente, aislar una proteína agonista que tiene la capacidad de incrementar la expresión del gen indicador, o una proteína antagonista que tiene la capacidad de disminuir la expresión del gen indicador.
94. El uso de un candidato a proteína interactuante restringido en su conformación para incrementar o disminuir la actividad de un gen indicador en una célula eucariótica, en el que el gen indicador codifica una proteína que proporciona un marcador fenotípico, y en el que dicho candidato a proteína interactuante está restringida en su conformación, o
-
estableciendo enlaces covalentes en sus extremos amino y carboxilo con otra proteína o péptido, o
-
uniendo los extremos amino y carboxilo del candidato a proteína interactuante.
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