CN101089182A

CN101089182A - 一种叶片衰老相关基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN101089182A
Application number: CN 200610012240
Authority: CN
Inventors: 孔照胜; 薛勇彪; 李美娜; 杨文强; 徐文英
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2006-06-14
Filing date: 2006-06-14
Publication date: 2007-12-19
Anticipated expiration: 2026-06-14
Also published as: CN100510076C

Abstract

本发明公开了水稻叶片衰老相关基因OsDOS及其编码蛋白的应用。本发明所提供的水稻叶片衰老相关基因OsDOS，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明所提供的水稻叶片衰老相关基因OsDOS编码蛋白OsDOS，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。本发明的基因可广泛用于培育可调控叶片衰老的禾本科植物的新品种。

Description

一种叶片衰老相关基因及其编码蛋白与应用

发明领域

本发明涉及生物工程领域中一种叶片衰老相关基因及其编码蛋白与应用，特别涉及水稻中一个叶片衰老相关基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

叶片衰老是遗传控制的一个程序化死亡过程，并且受多种发育和环境信号调节^[1]。叶片衰老时，最明显、最典型的特征是叶片逐渐变黄。其内在机制是，叶片细胞代谢的剧烈变化和细胞结构的有序解体^[2]。最初是叶绿体的解体，导致叶片变黄和光合作用丧失，接着各种生物大分子被水解，营养物质得以循环利用。

早期对于叶片衰老的分子生物学研究主要是鉴定和分析了大批衰老相关基因(SAGs)，它们大多与大分子降解与再利用、胁迫/防卫反应和基因调控有关，编码产物包括蛋白酶、核酸酶、脂酶、水解酶、胁迫响应蛋白和一些转录调节因子等^{[2，3，5，6]}。对SAGs的表达分析显示，有一个非常复杂的调控网络作调控着叶片衰老；并且提示，一些主要的调节因子可能起着关键的调控作用。近期的研究分离到一些衰老相关的调节基因，它们大多编码转录因子，如拟南芥的WRKY6^[7]和WRKY53^[8，9]，和类受体激酶，如拟南芥的SIRK^[10]和菜豆中的SARK^[11]。然而，迄今仅有少数几个调节因子通过遗传学方法确认了功能^{[9，12，13]}。

水稻是一种重要的模式植物，养活了世界上一半以上的人口^[14]。但是，迄今我们对水稻叶片衰老的分子调控却知之甚少。目前我们对水稻叶片衰老的理解仅仅局限于生理学、细胞学研究、衰老相关基因鉴定和初步的基于数量性状位点(QTLs)的遗传分析^{[15，16，17，18，19]}。研究显示，水稻成熟期穗中60-90％的碳水化合物积累是通过抽穗后的光合作用完成的^[20]，并且显示水稻生殖成熟期的叶片衰老与最终产量密切相关^[21]。因此，找到参与水稻叶片衰老调控的关键调节因子，阐明水稻叶片衰老的分子控制机制，并在水稻生殖发育后期延缓叶片衰老的发生，对于水稻的遗传改良有着极其重要的理论和实际意义。

发明内容

经过深入的研究，我们在水稻中鉴定了一个全新的细胞核定位的CCCH锌指蛋白OsDOS，研究结果显示在水稻叶片衰老过程中，OsDOS作为负调控因子，可以延缓叶片衰老的发生。利用叶片衰老时特异表达基因的启动子启动OsDOS基因的表达、转化水稻，可以在水稻生殖生长后期延缓叶片衰老的发生，提高光合作用，更好地协调源、库关系，保证产量潜力的充分发挥，为水稻超高产育种提供了新的思路。

本发明的目的是提供一种叶片衰老相关基因。

本发明所提供的叶片衰老相关基因，名称为OsDOS(Oryza sativaDelayof the Onset of Senescence)，来源于水稻的粳稻品种日本晴(O.sativa ssp.japonica var.Nipponbare)，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的核苷酸序列能够在高严谨条件下杂交的核苷酸序列；和

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

高严谨杂交的条件属于本领域的常规技术，可根据具体情况而定。在本发明中，优选使用的高严谨杂交条件为：2×SSC，0.1％SDS，65℃，15分钟；1×SSC，0.1％SDS，65℃，15分钟；和2×SSC，0.5％SDS，65℃，15分钟。

序列表中序列1的DNA序列由1161个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1到第1161位碱基，不含内含子。

本发明的另一个目的是提供一种叶片衰老相关基因OsDOS，OsDOS编码的蛋白是一种水稻叶片衰老相关蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中序列2氨基酸残基序列是由386个氨基酸残基组成的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。其中的细胞系可以是真核的也可以是原核的。

本发明的另一个目的是提供一种在禾本科植物中调控衰老的方法，其包括调控OsDOS基因或其同源序列的表达或者调控OsDOS蛋白的量。

本发明的又一个目的是提供OsDOS基因或其同源序列在调控禾本科植物衰老方面的应用。

利用任何一种可以引导外源基因在水稻中表达的载体，将本发明所提供的OsDOS基因敲除掉，或者通过RNAi的方法使OsDOS基因保持沉默，水稻就表现为叶片早衰；将本发明所提供的OsDOS基因的全长编码序列导入水稻，水稻就表现为叶片衰老延缓。为了便于对转基因水稻进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。本发明的基因可广泛用于培育叶片衰老可调控的、高产水稻新品种。

附图说明

图1显示了OsDOS的细胞核定位。(A)OsDOS-GFP绿色荧光信号在转基因水稻根尖细胞的细胞核内；(B)碘化丙啶染色的图像；和(C)两者整合的图像。比例尺，20μm。

图2为OsDOS的原核表达。

M.分子量标记，以KD表示；1道为IPTG诱导前的样品；2道为IPTG诱导后的样品。箭头指示GST-OsDOS重组蛋白的诱导带。

图3为叶片生长不同阶段OsDOS表达的实时荧光定量PCR分析。其中2LS、4LS、T、SE和PB分别代表2-叶期、4-叶期、分蘖期、拔节期和孕穗期的最后一片全出叶；FL，2nd L和3rd L分别代表灌浆期的剑叶、倒二叶和倒三叶。

图4为OsDOS RNAi转基因水稻的分子鉴定。4A.用于水稻转化的RNAi表达质粒的示意图。其中的发夹结构由一段OsDOS的反向序列、一段水稻的内含子序列和同一OsDOS片段的正向序列构成。然后克隆到pTCK303双元表达载体的玉米泛素启动子和NOS终止子之间。4B.OsDOSRNAiT₀株系的Southern杂交分析，叶片基因组DNA分别经EcoR I和HindIII完全酶切后，用潮霉素基因片段探针杂交。野生型作对照。4C.OsDOSRNAi T₀株系中OsDOS的表达水平降低。4个RNAi转基因T₀株系和野生型对照的孕穗期剑叶总RNA用于实时荧光定量PCR分析。

图5为OsDOS RNAi转基因水稻的表型。其中A和B为野生型植株；C和D为RNAi株系i-3；E和F为RNAi株系i-4。B、D和F分别是A、C和E的基部特写图。5A，5C，和5E中的比例尺：25cm；5B，5D，和5F中的比例尺：15cm。

图6为OsDOS过表达转基因水稻的分子鉴定。6A.用于水稻转化的OsDOS过表达质粒的示意图。OsDOS全长编码序列克隆到pTCK303双元表达载体的玉米泛素启动子和NOS终止子之间。6B.10个OsDOS过表达T₀株系的Southern杂交分析，未转基因植株为对照。叶片基因组DNA分别经EcoR I和HindIII完全酶切后，用潮霉素基因片段的探针杂交。6C.OsDOS过表达T₀株系中OsDOS表达显著增高。抽穗期OsDOS过表达T₀株系和野生型对照的穗的总RNA用于实时荧光定量PCR分析。

图7为OsDOS过表达转基因水稻的表型。7A.OsDOS过表达植株的整株表型，过表达植株叶片衰老明显延缓。7B和C.OsDOS过表达植株和野生型对照抽穗后1、2、3和5天(B)，和40天(C)穗的比较，OsDOS过表达植株的穗，只能部分抽出或完全抽不出来。7B中的箭形物指示穗颈位置，7C中的箭头指示剑叶叶环的位置。比例尺均为10cm。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1、OsDOS的克隆

以野生型水稻品种日本晴(购买自中国水稻研究所)幼苗100-200mg为材料，用Plant RNeasy试剂盒(QIAGEN)提取总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。ss cDNA(single strand cDNA，单链cDNA)的合成按照SMART^TM PCR cDNA Library Construction Kit(CLONTECH)的方法，合成单链(single strand)cDNA。将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板。PCR扩增引物为5′-ATGATGATGATGGGG-3′(SEQ ID №：3)和5′-TCAGTTGATGAGGTC-3′(SEQ ID №：4)。反应体系为：20μl体系，内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP mix 1.6μl，5μM的引物1和引物2各1.0μl，TAQ酶(15U/μl)0.1μl。在PE9600或9700或MJ PCR仪上扩增：94℃预变性3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共计35个循环；72℃延伸10min。获得的PCR产物，经测序确认为OsDOS全长编码序列。数据库分析显示OsDOS没有内含子，编码一个由386个氨基酸组成的蛋白，含两个CCCH锌指基序。

实施例2、OsDOS蛋白的定位于细胞核内

为了检测OsDOS蛋白的亚细胞定位，我们构建了OsDOS和绿色荧光蛋白基因(GFP)的融合表达质粒，并且用于转化水稻。为了使OsDOS蛋白在C-末端与绿色荧光蛋白(GFP)融合，在设计PCR引物时，OsDOS终止密码子TGA被TGC取代，同时引入BamH I和Hind III这两个酶切位点将OsDOS的编码序列和GFP融合在同一个阅读框内，测序确认没有碱基突变后，构建进入经过改造的双元表达载体pCAMBIA1301(CAMBIA公司)的35S启动子和NOS终止子之间，得到p1301-OsDOS-GFP表达质粒。PCR扩增引物为5′-CGGGATCCATGATGATGATGGGGGAAGG-3′(下划线为BamH I酶切位点)(SEQ ID №：5)和5′CA AAGCTTGCAGTTGATGAGGTCGGACACC-3′(下划线为Hind III酶切位点)(SEQ ID №：6)。

1301-OsDOS-GFP表达质粒转入农杆菌Agrobacterium tumefaciens株系EHA105中去。采用农杆菌介导的转化方法导入野生型水稻品种日本晴中。具体步骤如下：

(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导。去壳的野生型水稻品种日本晴种子经70％乙醇表面消毒3min后，用30％NaClO溶液搅拌消毒40分钟，无菌水冲洗4-5次，浸泡过夜后用滤纸吸干。将灭菌后的成熟胚直接接种于N₆D₂培养基上诱导愈伤组织，于25-26℃，暗培养4-7天后就可从盾片处诱导出初生愈伤组织。同时用镊子去掉胚上长出的胚芽。期间每隔十天继代一次，至长出胚性愈伤。

(2)农杆菌的培养。将构建好的重组质粒用电击法转化EHA105农杆菌感受态细胞，在含有潮霉素的YEB平板培养基上28℃培养48小时。挑取农杆菌单克隆接种于20ml YEB液体培养基中，28℃摇菌培养至对数生长晚期；取0.5ml活化后的菌种转接至50ml YEB培养基(50mg/L潮霉素)中，28℃培养至OD₆₀₀为0.5左右。

(3)共培养及转化、筛选、分化。首先收集培养好的农杆菌菌体，4℃，4,000g，10min，等体积AAM-AS培养基中重悬，将预培养4天的日本晴胚性愈伤组织浸入此AAM-AS菌液，侵染20min。然后将愈伤组织转移到N₆D₂C培养基(培养基上铺一张无菌滤纸)，25℃暗培养3天后，用无菌水(300mg/L头孢霉素)洗涤愈伤4-5遍，无菌滤纸吸干后转愈伤组织至N₆D₂S₁培养基上，进行筛选。两周后，转移至N₆D_0.5S₂培养基上进行第二代筛选(2周/代)，重复此步骤一次。经3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织转移至预分化培养基上，在分化培养箱(12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天。分化培养基上转接一次后，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生植株在生根壮苗培养基上生根壮苗，待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天后，将小苗移入试验田。

转基因水稻的根尖用2μg/ml PI(Propidium Iodide，30mM 2-N-Morpholino-ethanesulfonic acid，100mM甘露醇，pH 5.9)中染色30min。然后压片，在激光共聚焦显微镜(LSM 510，Zeiss，Oberkochen，Germany)下观察，用488nm激发GFP荧光，用568nm激发PI荧光。同时采集GFP和PI荧光图像。

在激光共聚焦显微镜下观察转基因水稻根尖细胞中融合蛋白表达，结果如图1所示：图1A显示OsDOS-GFP绿色荧光信号在转基因水稻根尖细胞的细胞核内；图1B显示同一细胞用碘化丙啶染色的结果；图1C为前两者整合的图像，从结果可以看出OsDOS-GFP绿色荧光信号集中在细胞核内，表明OsDOS是一个细胞核定位的蛋白。

实施例3、OsDOS蛋白的表达

将OsDOS的全长编码序列克隆入蛋白表达载体pGEX-4T1(AmershamBiosciences公司)。PCR扩增引物为5′-CG GGATCCATGATGATGATGGGGGAAGG-3′(下划线为EcoR I酶切位点)(SEQ ID№：7)和5′-CA GTCGACTCAGTTGATGAGGTCGGACACC-3′(下划线为Sal I酶切位点)。(SEQ ID №：8)经测序鉴定正确融合后，用此重组表达质粒转化表达菌株BL21(DE3)。挑单菌落，在LB培养液中加0.5mM的IPTG诱导表达，37℃下诱导4h，然后离心收集全菌体。菌体加100μl蛋白加样缓冲液，100℃沸水中煮5min。最后，经SDS-PAGE电泳鉴定得到了GST-OsDOS重组蛋白。(结果见图2)

实施例4、OsDOS的表达模式分析

所用的水稻材料是在自然条件下生长的日本晴水稻。取不同生长阶段叶片进行实时荧光定量PCR分析。2LS、4LS、T、SE和PB分别代表2-叶期、4-叶期、分蘖期、拔节期和孕穗期的最后一片全出叶；FL，2nd L和3rd L分别代表灌浆期的剑叶、倒二叶和倒三叶。用Plant RNeasy试剂盒(QIAGEN)提取总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。使用TaqMan Reverse Transcription Regents试剂盒(Applied Biosystems)进行反转录，所得到cDNA样品分别稀释为5、1.25ng/μl两个浓度梯度，各取1μl样品进行检测，在实验中每个浓度设三次重复。基因特异引物的设计使用PRIMER EXPRESS软件(Applied Biosystems)。PCR反应及其检测分别使用SYBR Green Master mix kit和ABI 7900序列检测***(AppliedBiosystems)。反应体系和数据分析采用比较C_T值得方法(见ABI公司的实验手册)。以18S rRNA作为内对照对数据进行归一化^[22]。OsDOS的引物是5′-ATGATGATGATGGGGGAAGG-3′(SEQ ID №：9)和5′-CTCACGGGGAGGTGAGACC-3′(SEQ ID №：10)；18SrRNA的引物是5′-CGGCTACCACATCCAAGG AA-3′(SEQ ID №：11)和5′-TGTCACTACCTCCCCGTGTCA-3′(SEQ ID №：12)。

结果如图3所示，在叶片自然衰老过程中，OsDOS的表达呈现下调趋势，表现为发育依赖的下调表达模式。

实施例5、OsDOS RNAi转基因水稻的分子鉴定

(1)干扰RNA(RNAi)表达载体的构建和转基因水稻株系的产生

按照Wang等的方法^[23]，将约450bp的OsDOS的片段，通过酶切的方法克隆到双元表达载体pTCK 303(可向本实验室索要或购买)，构建成一个RNAi表达质粒(图4A)。PCR扩增引物为5′ GGGGTACC ACTAGTCGTCCTCGCCGCTGGC-3′(下划线分别是Kpn I和Spe I酶切位点)(SEQID №：13)和5′CG GGATCC GAGCTC TCCGGACTCCACCCTCTGG-3′(下划线分别是BamH I和Sac I酶切位点)(SEQ ID №：14)。测序确定无错误后，按照实施例2中的方法转化水稻，结果得到4个OsDOS RNAi转基因水稻株系。

(2)OsDOS RNAi转基因水稻的Southern鉴定

野生型水稻和4个OsDOS RNAi转基因水稻基因组DNA的提取按照paterson等的方法^[24]进行。取5μg基因组DNA，分别用EcoR I和HindIII(Takara产品)酶切。酶切产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳(20-30V，过夜)分离，然后用常规方法在摇床上处理电泳胶：经0.125N HCl浸洗15min，变性液(1.5M NaCl，0.5N NaOH)浸洗30min，中和液(1.5MNaCl，0.5M Tris-HCl pH7.2)浸洗30min。最后用20×SSC将DNA印迹到HybondN⁺尼龙膜上。

预杂交、杂交均按常规方法进行[25]。探针及其标记：杂交探针为潮霉素抗性筛选基因(HPT II)的500bp基因片段。探针片段PCR扩增引物为5′-GCAAGGAATCGGTCAATACAC-3′(SEQ ID №：15)和5′-TCCACTATCGGCGAGTACTTC-3′(SEQ ID №：16)。用Promega公司的Primer-a-Gene试剂盒进行标记过夜。杂交前用Qiagen公司的PCR纯化试剂盒进行探针纯化。杂交用Amersham公司的膜(Hybond N⁺mannual，Amersham)。洗膜方法如下：2×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；1×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；2×SSC，0.5％SDS，65℃，15min。保鲜膜包裹杂交膜，-70℃下对X光片曝光。

结果如图4B所示，株系i-1和i-2含两个拷贝转基因，株系i-3和i-4为单拷贝***，并且这4个株系是独立转化得到的。

(3)OsDOS RNAi转基因水稻的实时荧光定量PCR鉴定(方法同实施例4)

我们检测了转基因植株中内源OsDOS的表达，结果显示，与野生型对照相比，四个T₀株系中OsDOS的表达均显著下降(图4C，株系i-1，0.39±0.10；i-2，0.28±0.05；i-3，0.31±0.08；i-4，0.14±0.04；WT，1.00±0.11)。

实施例6、OsDOS RNAi转基因水稻的表型

为准确观察转基因植株的表型，我们从四个T₀株系各取40粒种子，育秧并移栽于试验田，以野生型为对照，使其在一致的生长条件下生长。T₁株系在营养生长期，与对照相比未表现出明显不同；但到了抽穗晚期，转基因植株开始表现出叶片早衰迹象，发黄并持续加深；到了灌浆期，转基因植株叶片，除了剑叶叶片外，全部显著变黄，而对照则显得绿很多(图5)。遗传分析显示，两个单拷贝转基因T₀株系(i-3和i-4)的T₁分离群体中，后代分离比(早衰表型比正常表型)符合3∶1，分别是31∶9(χ²＝0.0333，P＝0.866)和33∶6(χ²＝1.444，P＝0.229)。上述结果表明，OsDOS表达受到抑制后导致了叶片早衰表型，并且在叶片衰老过程中OsDOS起负调节作用。

实施例7、OsDOS过表达转基因水稻的分子鉴定

(1)过表达载体的构建和转基因株系的产生

利用BamH I和Spe I两个酶切位点，将OsDOS的蛋白编码序列，构建进入双元表达载体pTCK 303的玉米泛素启动子和NOS终止子之间(图6A)。PCR扩增引物为5′-AA GGATCCATGATGATGATGGGG-3′(下划线为BamH I酶切位点)(SEQ ID №：17)和5′-GG ACTAGTTCAGTTGATGAGGTC-3′(下划线为Spe I酶切位点)(SEQ ID№：18)。

完全测序确定无PCR和克隆错误后，按照前述方法转化水稻。总共得到21个株系。按基因作用效应可以大致分三个表型组：正常组(株系OX1、4、10和17)，表型和野生型对照区别不大；中度组(株系OX 5-10、11-13、15、18和21)，呈现生长迟缓，穗部分露出；强组(株系OX2、3、14和16)，呈现生长发育迟滞，大多数穗***。

(2)OsDOS过表达水稻的Southern杂交和实时荧光定量PCR鉴定(方法同实施例5)

我们选其中有代表性的10株(OX 2、3、5-9、11-13)进行Southernblot分析，结果显示这10株是独立转化的植株(图6B)。然后选了8株(OX1-3、5-9)的穗，用实时荧光定量PCR方法检测OsDOS的表达，结果显示有7株(OX 2、3、5-9)中OsDOS的表达显著升高，其中两株(OX 2和3)中OsDOS的表达比其他株系中高，然而株系OX 1中OsDOS的表达与野生型差别不大(WT，1.00±0.18；OX1，1.13±0.19；OX2，40.1±7.1；OX3，46.0±4.5；OX5，31.3±5.6；OX6，31.4±8.6；OX7，31.2±9.8；OX8，33.3±0.9；OX9，33.6±3.5)。(图6C)上述结果显示，转基因植株强弱不同的表型和OsDOS表达不同程度的增强有关。

实施例8、OsDOS过表达转基因水稻的表型

OsDOS过表达植株呈现出明显的叶片衰老延缓(图7A)，显示正常情况下OsDOS起延缓叶片衰老的作用。另外，OsDOS过表达植株也表现出植株较矮(株高：OX，72.3±4.35cm；WT，98.3±5.21cm)，株型紧凑，叶片光滑，穗发育异常，穗部分露出或全部抽不出来，抽穗延迟(图7A、B和C)。

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序列表

<110>中国科学院遗传研究所

<120>一种叶片衰老相关基因及其编码蛋白与应用

<130>CN067IB063207

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1161

<212>DNA

<213>水稻(O.sativa ssp.japonica var.Nipponbare)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1161)

<223>

<400>1

atg atg atg atg ggg gaa gga gtc agc agc gtc ccg ccg tgg tct cac 48

Met Met Met Met Gly Glu Gly Val Ser Ser Val Pro Pro Trp Ser His

1 5 10 15

crc ccc gtg agc gga gtc gat gta ctc ggc ggc ggt ggt ggc ggt ggg 96

Leu Pro Val Set Gly Val Asp Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

gat gag atg acg ccg tac gtg arc gcc gcg ctg cgg gat tac ctg ccg 144

Asp Glu Met Thr Pro Tyr Val Ile Ala Ala Leu Arg Asp Tyr Leu Pro

35 40 45

gcg aat gat gtc ggg gtg ggg gct gac gag gag gag gag gcc gcg gcg 192

Ala Asn Asp Val Gly Val Gly Ala Asp Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala

50 55 60

atg gcc gcg gcg gtg gac gcg tac gcg tgc gac gag ttc cgg atg tac 240

Met Ala Ala Ala Val Asp Ala Tyr Ala Cys Asp Glu Phe Arg Met Tyr

65 70 75 80

gag ttc aag gtg cgg cgg tgc gcg cgc ggg cgg agc cat gac tgg acc 288

Glu Phe Lys Val Arg Arg Cys Ala Arg Gly Arg Ser His Asp Trp Thr

85 90 95

gag tgc ccc ttc gcg cac ccg ggg gag aag gcg cgc cgc cgc gat ccg 336

Glu Cys Pro Phe Ala His Pro Gly Glu Lys Ala Arg Arg Arg Asp Pro

100 105 110

cgc aag tac cac tac tcc ggc acc gcg tgc ccg gac ttc cgc aag ggc 384

Arg Lys Tyr His Tyr Ser Gly Thr Ala Cys Pro Asp Phe Arg Lys Gly

115 120 125

ggg tgc aag cgc ggc gac gcc tgc gag tac gcc cac ggc gtg ttt gag 432

Gly Cys Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Tyr Ala His Gly Val Phe Glu

130 135 140

tgt tgg ctc cac ccg gcg cgc tac cgc acc cag ccg tgc aag gac ggc 480

Cys Trp Leu His Pro Ala Arg Tyr Arg Thr Gln Pro Cys Lys Asp Gly

145 150 155 160

acc gcc tgc cgc cgc cgc gtc tgc ttc ttc gcc cac acc ccg gac cag 528

Thr Ala Cys Arg Arg Arg Val Cys Phe Phe Ala His Thr Pro Asp Gln

165 170 175

ctc cgc gtc ctc ccg gcg cag cag tcc agc ccc agg agc gtg gcg tcc 576

Leu Arg Val Leu Pro Ala Gln Gln Ser Ser Pro Arg Ser Val Ala Ser

180 185 190

tcg ccg ctg gcc gag tcc tac gac ggc tcg ccg ctg cgc cgc cag gcg 624

Ser Pro Leu Ala Glu Ser Tyr Asp Gly Ser Pro Leu Arg Arg Gln Ala

195 200 205

ttc gag agc tac ctc acc aag acc atc atg tcc tcg tcc ccg acc agc 672

Phe Glu Ser Tyr Leu Thr Lys Thr Ile Met Ser Ser Ser Pro Thr Ser

210 215 220

acc ctc atg tct ccg ccc aag tcg ccc ccg tcg gag tcc ccg cca ttg 720

Thr Leu Met Ser Pro Pro Lys Ser Pro Pro Ser Glu Ser Pro Pro Leu

225 230 235 240

tcg ccc gac ggt gcc gcg gcc atc cgt cgc gga tct tgg ccc ggc gtc 768

Ser Pro Asp Gly Ala Ala Ala Ile Arg Arg Gly Ser Trp Pro Gly Val

245 250 255

ggc tcg ccg gtg aac gac gtc ctg gcc tcg ttc cgc cag ctc cgc ctc 816

Gly Ser Pro Val Asn Asp Val Leu Ala Ser Phe Arg Gln Leu Arg Leu

260 265 270

aac aag gtg aag tcg tcg ccg tcc ggc ggg tgg agc tac cct tcg tcg 864

Asn Lys Val Lys Ser Ser Pro Ser Gly Gly Trp Ser Tyr Pro Ser Ser

275 280 285

tcc gcc gtc tac ggg tct ccc aag gcc gcc acc ggc ctc tac agc ctc 912

Ser Ala Val Tyr Gly Ser Pro Lys Ala Ala Thr Gly Leu Tyr Ser Leu

290 295 300

ccc acc act cca ctg gct tcc acg gca acg gtg acc acc gcc tcc agc 960

Pro Thr Thr Pro Leu Ala Ser Thr Ala Thr Val Thr Thr Ala Ser Ser

305 310 315 320

ttc atg ccc aac ctg gag cca ctg gac ctc ggg ctc atc ggc gac gag 1008

Phe Met Pro Asn Leu Glu Pro Leu Asp Leu Gly Leu Ile Gly Asp Glu

325 330 335

gag ccg gtc cag agg gtg gag tcc gga aga gcc ctc cgg gag aag gtg 1056

Glu Pro Val Gln Arg Val Glu Ser Gly Arg Ala Leu Arg Glu Lys Val

340 345 350

ttc gag cga ctg agc cgg gat ggt gcc atc tcc ggc gac gcc aca gcc 1104

Phe Glu Arg Leu Ser Arg Asp Gly Ala Ile Ser Gly Asp Ala Thr Ala

355 360 365

ttc gcc acc gcc ggt gtt ggc ctc gac gtt gat tgg gtg tcc gac ctc 1152

Phe Ala Thr Ala Gly Val Gly Leu Asp Val Asp Trp Val Ser Asp Leu

370 375 380

atc aac tga 1161

Ile Asn

385

<210>2

<211>386

<212>PRT

<213>水稻(O.sativa ssp.japonica var.Nipponbare)

<400>2

Met Met Met Met Gly Glu Gly Val Ser Ser Val Pro Pro Trp Ser His

1 5 10 15

Leu Pro Val Ser Gly Val Asp Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Asp Glu Met Thr Pro Tyr Val Ile Ala Ala Lea Arg Asp Tyr Leu Pro

35 40 45

Ala Asn Asp Val Gly Val Gly Ala Asp Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala

50 55 60

Met Ala Ala Ala Val Asp Ala Tyr Ala Cys Asp Glu Phe Arg Met Tyr

65 70 75 80

Glu Phe Lys Val Arg Arg Cys Ala Arg Gly Arg Ser His Asp Trp Thr

85 90 95

Glu Cys Pro Phe Ala His Pro Gly Glu Lys Ala Arg Arg Arg Asp Pro

100 105 110

Arg Lys Tyr His Tyr Ser Gly Thr Ala Cys Pro Asp Phe Arg Lys Gly

115 120 125

Gly Cys Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Tyr Ala His Gly Val Phe Glu

130 135 140

Cys Trp Leu His Pro Ala Arg Tyr Arg Thr Gln Pro Cys Lys Asp Gly

145 150 155 160

Thr Ala Cys Arg Arg Arg Val Cys Phe Phe Ala His Thr Pro Asp Gln

165 170 175

Leu Arg Val Leu Pro Ala Gln Gln Ser Ser Pro Arg Ser Val Ala Ser

180 185 190

Ser Pro Leu Ala Glu Ser Tyr Asp Gly Ser Pro Leu Arg Arg Gln Ala

195 200 205

Phe Glu Ser Tyr Leu Thr Lys Thr Ile Met Ser Ser Ser Pro Thr Ser

210 215 220

Thr Leu Met Ser Pro Pro Lys Ser Pro Pro Ser Glu Ser Pro Pro Leu

225 230 235 240

Ser Pro Asp Gly Ala Ala Ala Ile Arg Arg Gly Ser Trp Pro Gly Val

245 250 255

Gly Ser Pro Val Asn Asp Val Leu Ala Ser Phe Arg Gln Leu Arg Leu

260 265 270

Asn Lys Val Lys Ser Ser Pro Ser Gly Gly Trp Ser Tyr Pro Ser Ser

275 280 285

Ser Ala Val Tyr Gly Ser Pro Lys Ala Ala Thr Gly Leu Tyr Ser Leu

290 295 300

Pro Thr Thr Pro Leu Ala Ser Thr Ala Thr Val Thr Thr Ala Ser Ser

305 310 315 320

Phe Met Pro Asn Leu Glu Pro Leu Asp Leu Gly Leu Ile Gly Asp Glu

325 330 335

Glu Pro Val Gln Arg Val Glu Ser Gly Arg Ala Leu Arg Glu Lys Val

340 345 350

Phe Glu Arg Leu Ser Arg Asp Gly Ala Ile Ser Gly Asp Ala Thr Ala

355 360 365

Phe Ala Thr Ala Gly Val Gly Leu Asp Val Asp Trp Val Ser Asp Leu

370 375 380

Ile Asn

385

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>水稻(O.sativa ssp.japonica var.Nipponbare)

<400>3

atgatgatga tgggg 15

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcagttgatg aggtc 15

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgggatccat gatgatgatg ggggaagg 28

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

caaagcttgc agttgatgag gtcggacacc 30

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgggatccat gatgatgatg ggggaagg 28

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cagtcgactc agttgatgag gtcggacacc 30

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tgatgatgat gggggaagg 19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ctcacgggga ggtgagacc 19

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cggctaccac atccaaggaa 20

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tgtcactacc tccccgtgtc a 21

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

ggggtaccac tagtcgtcct cgccgctggc 30

<210>14

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cgggatccga gctctccgga ctccaccctc tgg 33

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gcaaggaatc ggtcaataca c 21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

tccactatcg gcgagtactt c 21

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

aaggatccat gatgatgatg ggg 23

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ggactagttc agttgatgag gtc 23

Claims

1、一种水稻叶片衰老相关基因OsDOS，其包含下列核苷酸序列之一：

序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的核苷酸序列；

与序列表中SEQ ID №：1限定的核苷酸序列能够在高严谨条件下杂交的核苷酸序列；和

与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

2、含有权利要求1中所述基因的表达载体。

3、含有权利要求1中所述基因的宿主细胞系。

4、一种水稻叶片衰老相关蛋白OsDOS，其选自由权利要求1中水稻叶片衰老相关基因OsDOS所编码蛋白质，以及将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

5、权利要求1的基因在被用作探针方面的应用。

6、权利要求5的应用，其中的探针被用来发现其它物种中的衰老相关基因。

7、权利要求1的基因在调控禾本科植物衰老方面的应用。

8、权利要求7的应用，其中所述的禾本科植物是水稻。

9、一种在禾本科植物中调控衰老的方法，其包括调控权利要求1中所述基因在禾本科植物中的表达。

10、根据权利要求9的方法，其中所述的调控包括过表达所述基因或者抑制所述基因的表达。

11、根据权利要求10的方法，其中抑制所述基因表达是通过使用RNAi来实现的。

12、一种在禾本科植物中调控衰老的方法，其包括调控权利要求2中所述蛋白在禾本科植物中的量。

13、根据权利要求9-12任意一项中的方法，其中所述的禾本科植物是水稻。