CN101081204A - 一种交联透明质酸钠眼植入凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种交联透明质酸钠眼植入凝胶的制备方法。该方法包括将混合有透明质酸钠、酰肼化合物、碳二亚胺类羧基活化剂和适宜缓冲对的反应液灌入两个平板之间的缝隙中，待反应液形成凝胶后，纯化，切割，包装，灭菌，得成品。该方法的特征是交联反应在两个平板之间完成，调节两个平板之间缝隙的大小可以得到不同厚度的凝胶块。该方法制备得到的凝胶可作为眼部植入材料，尤其是应用于青光眼非穿透性小梁手术植入，可以防止房水滤过通道粘连，提高滤过和维持滤过通道，使术后眼压得到良好控制。

Description

一种交联透明质酸钠眼植入凝胶的制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种交联透明质酸钠(sodium hyaluronate，以下简称SH)凝胶的制备方法及在制备眼部植入材料中的应用。

背景技术

透明质酸(hyalouronic acid，以下简称HA)是由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成的一种链状聚阴离子黏多糖，是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，具有独特的理化性质和生物学功能。商品多用HA的钠盐，即SH。SH可以作为黏弹剂用于眼科手术和骨科手术，治疗骨性关节炎和类风湿性关节炎以及预防术后粘连，也可以作为一种药物媒介应用于多种药物制剂。天然的SH具有良好的生物相容性，但它在组织中易被降解和扩散、体内存留时间较短，经修饰和交联后得到的衍生物可弥补这一缺陷。Prestwich等(Pharm Sci Technol Today，1998，1：42～43.&J ControlledRelease，1998，53：93～103.)曾对HA酰肼衍生物的制备及其抗酶解性进行研究，使用己二酸二酰肼(adipic dihydrazide，以下简称ADH)修饰HA目前主要用于合成HA-链系药物，即ADH一端与HA结合，另一端游离的酰肼基与药物结合。如专利WO9515168公开了酰肼功能化HA及其与一些双功能连接剂的合成方法，US2003114406、WO03006068、US2004234497和WO0206373等公开了HA-链系药物的合成及其在治疗心肌缺血、骨关节炎、干眼症、肿瘤和伤口愈合等方面的应用。

US6383219公开了一种使用环氧树脂交联SH的凝胶应用于青光眼手术植入，作用是保持房水滤过通道，在这项技术中，在特定的反应条件下，交联产物形成大块的凝胶，经过纯化后被精密切割成需要的形状，例如厚度0.5mm、高5mm、底边3.5mm的三角形凝胶块或类似大小的梯形凝胶块。在生产中，由于产品厚度要求较薄，凝胶又具有一定的柔韧性，要切割厚度均一且无破损的凝胶块，需要借助精密的仪器设备才能完成。

目前，使用酰肼化合物交联SH制备应用于眼植入的凝胶还未见资料公开报道。本发明采用酰肼化合物交联SH制备了眼植入凝胶，简化了产品生产步骤，无需精密切割设备，人工即可切割得到均一厚度的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种交联SH凝胶的制备方法及其使用该方法制得的凝胶在制备眼部植入材料中的应用。

本发明交联SH眼植入凝胶的制备方法包括如下步骤：

①将SH和酰肼化合物溶于pH3.5～5.5的缓冲溶液；

②将碳二亚胺溶于pH3.5～5.5的缓冲溶液；

③在步骤①得到的溶液中加入步骤②得到的溶液，混合均匀后灌入两个平板之间的缝隙，反应形成凝胶；

④收集步骤③得到的凝胶，纯化，切割，包装，灭菌制得成品。

在上述的步骤①和②中，缓冲溶液可以是三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液，也可以用双[三(羟甲基)]氨基甲烷-盐酸(Bis-Tris-HCl)缓冲液。

在上述的步骤③中，所述平板可以是表面光滑的玻璃板，也可以是表面光滑的无毒塑料板，两个平板之间的缝隙可以根据需要调节在0.2～5mm之间。

本发明制备方法中使用的SH可以选用提取法生产的产品，也可以选用发酵法生产或其他方式生产的产品，产品的平均分子量可以是10万～300万道尔顿，优选平均分子量为20万～150万道尔顿的产品，更优选平均分子量为20万～60万道尔顿的产品。

本发明制备方法中使用的酰肼化合物可以为单酰肼、双酰肼或多酰肼化合物，优选双酰肼化合物，更优选双酰肼化合物中的丁二酸二酰肼、辛二酸二酰肼或ADH。

本发明制备方法中使用的EDCI可以是单碳二亚胺或双碳二亚胺，优选单碳二亚胺，更优选乙基(N，N-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(以下简称EDCI)，在反应中，碳二亚胺的作用是活化溶液中SH的羧基，使后者在溶液pH大于3的条件下容易与酰肼化合物发生反应。

本发明制备方法中凝胶的灭菌可以采用高压蒸汽灭菌，如121℃加热15～20分钟等，也可以采用流通蒸汽灭菌，如100℃流通蒸汽加热25～30分钟等。

本发明方法让反应物混合之后即刻灌入两个固定平板之间的缝隙中，反应液在平板之间形成一定厚度的凝胶，通过调节平板之间缝隙的大小，可以直接得到需要厚度的凝胶块，凝胶块经纯化后，在解剖镜或低倍显微镜下，可以很容易的被人工用薄刀片切割成需要的形状，大大简化了产品生产步骤，且无需精密切割设备，人工即可切割得到均一厚度的产品。

本发明采用酰肼化合物交联SH制备的眼植入凝胶具有良好的生物相容性和抗酶降解性，可以应用于生产眼部植入材料产品，尤其是用于生产治疗青光眼非穿透性小梁手术植入的产品，能够防止房水滤过通道粘连，形成减压室，提高滤过和维持滤过通道，可有效降低眼压，并减少抗青光眼药物的应用。这种产品在临床的使用方法类似于法国柯尼尔(CORNEAL)公司上市的治疗青光眼用引流植入物(SKGEL3.5、SKGEL4.5)，也就是US6383219公开的治疗青光眼的一种手术方法：在不打开前房的情况下，切除与Schlemm管外壁平齐的深层巩膜角膜组织，然后植入交联SH凝胶，缝合巩膜瓣和结膜瓣，使房水得以通过，并向巩膜瓣下间腔、巩膜瓣周围、脉络膜上腔和结膜下而引流。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明本发明，不是限制本发明。

实施例一

将0.125g SH(平均分子量141.5万道尔顿)溶解于5ml Tris-HCl(pH4.5)缓冲溶液中，加入ADH12.5mg，混匀；另取EDCI 30mg溶解于1ml Tris-HCl(pH4.5)缓冲溶液中，然后倒入上述SH和ADH的混合溶液中，迅速混匀，缓缓倒入事先固定好的两个玻璃板之间的缝隙中，反应液充满缝隙后，将玻璃板水平放置，反应2～24小时，至反应液完全胶化。

两个玻璃板为面积大小一致的长方形小玻璃片，厚约0.3mm，面积约3cm×7cm，玻璃板之间缝隙的固定采用在两个小玻璃片之间夹置一定厚度的小垫片来实现，小垫片为厚0.45mm，大小约0.5cm×3cm的玻璃片或硬质无毒塑料，沿玻璃片短边塞在两个长方形小玻璃之间，再用金属夹固定玻璃片两端(短边)。上述所有使用的材料事先都要经过清洗、烘干和消毒。

反应液成胶后，打开玻璃片两端的金属夹，用去离子水将凝胶冲离玻璃板，置洁净容器中用大量去离子水浸泡纯化2～4小时，再用pH7.2的等渗磷酸盐缓冲溶液浸泡0.5～1小时，在洁净环境中，将凝胶块平铺在洁净玻璃板上，在解剖镜下，用薄刀片切成边长为3.5mm的等腰三角形凝胶片，或切成高4.5mm、底边分别为0.5mm和3mm的等腰梯形凝胶片，将切好的凝胶片分装于5ml玻璃瓶中，加盖，于121℃高压灭菌15分钟，即得成品。

实施例二

将0.125g SH(平均分子量37万道尔顿)溶解于5ml Tris-HCl(pH4.0)缓冲溶液中，加入ADH21.7mg，混匀；EDCI 30mg溶解于1ml Tris-HCl(pH4.0)缓冲溶液中，然后倒入上述SH和ADH的混合溶液中，迅速混匀，缓缓倒入缝隙宽度为0.47mm的两个玻璃板之间，待反应液充满缝隙后，将玻璃板水平放置，反应2～24小时，至反应液完全胶化。玻璃板的准备与实施例一基本相同，不同的是玻璃板之间夹置的小垫片厚度为0.47mm。凝胶的纯化、切割、包装和灭菌与实施例一相同。

实验数据

1.本发明凝胶体外抗酶降解性试验

实验方法：

采用凝胶片在透明质酸酶溶液中一段时间内降解HA的量与降解前HA总量的比值(R)表示抗酶降解性，R值越小则凝胶片的抗酶降解性越强。可以用葡糖醛酸的量来表示HA的量，葡糖醛酸的量采用改良咔唑显色法(参考文献：Bitter T.and Muir HM.(1962).A modifieduronic acid carbarbazole reation.Anal.Biochem.4，330-333.)测定，测定方法为：①标准曲线绘制：取葡糖醛酸对照品10mg，至50ml量瓶，加蒸馏水定容，再吸取适量作适当稀释，分别配制浓度为10、20、30、40、50、60μg/ml的对照品溶液。分别吸取对照品溶液和蒸馏水(空白对照)各1ml置具塞试管中，冷却至4℃以下，在振摇下缓缓滴加0.025mol/L硼砂硫酸溶液5ml，置沸水浴中加热10分钟，放冷，精密加入咔唑试液(咔唑0.25g，加无水乙醇200mL)0.2ml，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，放冷，在530nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。②样品测定：取样品作适当稀释，吸取1ml，照标准曲线绘制中描述的方法操作，测定吸收度，从标准曲线上查处相应的葡糖醛酸的浓度，乘与稀释倍数，即得。

试验步骤：

透明质酸酶溶液的配制：取适量透明质酸酶溶解于磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钠2.5g、无水磷酸氢二钠1.0g与氯化钠8.2g，加水使成1000ml，pH6.3。简称PBS)，稀释为浓度为60u/ml和30u/ml的溶液。

取本发明实施例二所得到的凝胶片5片，放入10ml具塞试管中，加入浓度为30u/ml的透明质酸酶溶液5ml，于37℃水浴1小时后迅速置冰水中30分钟，过滤，取续滤液置室温放置15分钟，吸取1ml，以透明质酸酶溶液(30u/ml)为空白，按咔唑显色法测定酶解液中糖醛酸的量。

另取本发明实施例二所得到的凝胶片5片，放入5ml量瓶中，加浓度为0.5mol/L的硫酸溶液1ml，加热至膜溶解，冷却至室温，加入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液1ml和浓度为60u/ml的玻璃酸酶PBS溶液2.5ml，用PBS溶液定容至刻度，混匀，过滤，收集续滤液，吸取1ml，以透明质酸酶溶液(30u/ml)为空白，按咔唑显色法测定水解液中糖醛酸的量。

试验结果：

本发明实施例二凝胶片的R＝0.415，说明本发明实施例二具有良好的抗酶降解特性，适合用于制备眼部植入材料。

2.本发明凝胶体内植入试验

为了证明本发明凝胶片的生物相容性，并与市场上市产品作对比，验证其提高房水滤过的效果，进行以下动物眼内植入试验。

实验步骤：

新西兰白兔20只，手术眼20只。分为3组，空白对照组(只作手术，不植入凝胶片)8只，阳性对照(植入法国CORNEAL公司的SKGEL4.5一片)4只，试验组(植入本发明实施例二凝胶片一片)8只。兔左眼行类似青光眼非穿透小梁手术(参考文献：非穿透性小梁手术联合透明质酸钠生物胶植入术的临床疗效观察。中华眼科杂志2001，37(6)：404～408)，即在不打开前房的情况下，切除与Schlemm管外壁平齐的深层巩膜角膜组织，然后植入SH凝胶膜1片，原位缝合巩膜瓣2针，用2～3针可吸收缝线将结膜瓣切口间断固定于角巩膜组织上。术毕，结膜下注射庆大霉素2万单位，***2.5mg。

术前测定一次眼压(IOP)，术后每周测一次IOP，检查手术眼角膜和结膜厚度(炎症、水肿情况)，并观察动物活动、进食、***等有无异常。术后三个月解剖手术眼，观察局部刺激情况并取样作组织切片。

试验结果：

三组动物中央角膜厚度均无变化，手术2周观察时，在手术部位的结膜和角膜外缘均有轻微水肿发生，随后逐渐消退。

三组动物IOP变化趋势如图所示，其中r＝(术后IOP-术前IOP)/术前IOP×100％。

由图中可以看出，与空白对照组比较，阳性对照组和试验组有显著眼压下降，后两组眼压下降趋势较为类似，说明本发明实施例二所得凝胶片具有提高房水滤过的作用，其效果与法国CORNEAL公司的SKGEL4.5相近。

术后三组动物的活动、进食、***均未发现异常。三个月后解剖手术眼，三组动物眼组织结构正常，无明显局部刺激反应，组织切片观察均未发现异物反应。说明本发明实施例二具有良好的生物相容性，适合用于制备眼部植入材料。

Claims (8)

1.一种交联透明质酸钠眼植入凝胶的制备方法，包括如下步骤：

①将透明质酸钠和酰肼化合物溶于pH3.5～5.5的缓冲溶液；

②将碳二亚胺溶于pH3.5～5.5的缓冲溶液；

③在步骤①得到的溶液中加入步骤②得到的溶液，混合均匀后灌入两个平板之间的缝隙，反应形成凝胶；

④收集步骤③得到的凝胶，纯化，切割，包装，灭菌制得成品。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤①和②中所述的缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或双[三(羟甲基)]氨基甲烷-盐酸(Bis-Tris-HCl)缓冲液。

3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤①中使用的透明质酸钠的平均分子量为10万～300万道尔顿，优选平均分子量为20万～150万道尔顿，更优选平均分子量为20万～60万道尔顿。

4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤①中使用的酰肼化合物为单酰肼、双酰肼或多酰肼化合物，优选双酰肼化合物，更优选双酰肼化合物中的丁二酸二酰肼、辛二酸二酰肼或己二酸二酰肼。

5.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤②中使用的碳二亚胺为单碳二亚胺或双碳二亚胺，优选单碳二亚胺，更优选乙基(N，N-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。

6.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤③中所述的平板为表面光滑的玻璃板或无毒塑料板。

7.权利要求1所述的制备方法所制得的凝胶。

8.权利要求7所述的凝胶在制备眼部植入材料中的应用。

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