CN102180943A - 一种辅助降血糖多肽药物的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以普兰林肽为主药的一种辅助降血糖多肽药物的生产工艺，本发明提供了一种新的合成片段划分方法，包括：片段I-氨基树脂为AA29-AA37-RinkAmide MBHA，片段II-CTC树脂为AA17-AA28-Chlorotrityl Chloride，片段III-CTC树脂为AA1-AA16-ChlorotritylChloride。该方法具有反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低等特点。本发明同时公开了一种普兰林肽冻干粉针剂，其主要原料组成为：主药普兰林肽，赋形剂，pH值调节剂和抑菌剂。该粉针剂具有分散度高，稳定性好等优点。
Description
技术领域：
本发明涉及一种以普兰林肽为主药的辅助降血糖多肽药物的生产工艺，尤其涉及普兰林肽的一种固相片段合成法及其冻干粉针剂制剂工艺。
背景技术：
普兰林肽(Pramlintide)是胰淀粉样多肽的一种合成类似物，也是至今为止继胰岛素之后第二个获准用于治疗I型糖尿病的药物。临床研究发现，当普兰林肽与胰岛素合用时，可能导致患者体重适度减轻。
胰淀粉样多肽是一种由37个氨基酸残基构成的多肽激素，在餐后由胰腺β细胞释放，具有多种生理功能，如减慢食物(包括葡萄糖)在小肠的吸收速度，通过抑制高血糖素减少肝糖的产生，减少患者食欲，协助机体调节血糖水平等等。不过，天然胰淀粉样多肽在溶液中并不稳定，易水解，具有粘稠性大、易凝集的特点，因而不适合用于治疗。普兰林肽是经筛选、合成出的一种稳定的胰淀粉样多肽类似物。普兰林肽与胰淀粉样多肽的氨基酸序列差异表现在前者第25位(丙氨酸)、28位(丝氨酸)和29位(丝氨酸)由脯氨酸所替代。研究证实，普兰林肽可以延缓葡萄糖的吸收，抑制胰高血糖素的分泌，减少肝糖生成和释放，因而具有降低糖尿病患者体内血糖波动频率和波动幅度，改普总体血糖控制的作用。
普兰林肽的结构如下：
分子式：C171H267N51O53S2·x C2H4O2，其中x是变量。
分子量：3949.39
对于包含37个氨基酸的普兰林肽来说，依次固相合成序列保护氨基酸这一合成路线很长，整个工艺操作繁琐，收率极低，成本很高，不适合工业化。本方法提供了一种产率更高，环境污染更小以及制剂更稳定的生产工艺。
已上市的普兰林肽注射剂的处方包含有1.00mg/ml或0.60mg/ml普兰林肽，0.03mmol/ml醋酸盐，43.00mg/ml甘露醇，2.25mg/ml间甲酚，用醋酸和醋酸钠调pH值为4.0。其稳定性差，只可于2℃～8℃低温避光储臧。普兰林肽冻干粉针剂克服了注射剂存在稳定性差的不足，具有分散度高，稳定性好等优点。该制剂质量稳定，疗效确切，利于患者接受。
发明内容：
本发明的目的在于提供普兰林肽的一种新的固相片段划分方法及一种冻干粉针剂，以克服现有技术上存在的缺陷和注射剂稳定性差的不足。本发明提供了一种高收率、低成本、环境污染小、有利于实现产业化的普兰林肽固相片段划分方法，以及能改善制剂的稳定性、延长有效期、便于室温贮臧的冻干粉针剂。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基
TBTU：O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯
HOBt：1-羟基苯骈***
DIEA：N，N-二异丙基乙胺
TFA：三氟醋酸
DCM：二氯甲烷
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
EDT：乙二硫醇
Water：水
Trt：三苯甲基
tBu：叔丁基
Boc：叔丁氧羰基
Acm：乙酰氨甲基
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
一种固相片段合成普兰林肽的方法，其片段划分方法为：
其片段I-Rink Amide MBHA树脂为：
29 37
Fmoc-Pro-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Ash(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink
Amide MBHA
其片段II-CTC树脂为：
17 28
Fmoc-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-
Chlorotrityl Chloride
其片段III-CTC树脂为：
一种固相片段合成普兰林肽的方法，其技术方案包括以下步骤：
1)以氨基树脂为载体，合成片段I-氨基树脂为AA29-AA37-Rink Amide MBHA树脂；
2)以羟基树脂为载体，合成片段II-羟基树脂为AA17-AA28-CTC树脂；
3)以羟基树脂为载体，合成片段III-羟基树脂为AA1-AA16-CTC树脂，并进行固相环化；
4)制备片段II-片段I-RinkAmide MBHA树脂；
5)制备片段III-片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂；
6)切割，得到普兰林肽粗肽；
7)精制，得到普兰林肽纯品。
本发明提供了一种固相片段合成普兰林肽的方法，其RinkAmide MBHA树脂的替代度为0.2～0.4mmol/g；其2-Chlorotrityl Chloride树脂(CTC树脂)的替代度为0.8～1.2mmol/g；其保护氨基酸分别是Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Val，Fmoc-Pro，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Ala，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-Lys(Boc)；其缩合试剂为TBTU/HOBt/DIEA；其保护氨基酸以及缩合试剂的投料量是2～5倍当量；其合成2，7两个半胱氨酸的二硫桥键的环化试剂是I2，溶剂为DMF。
本发明提供的普兰林肽制备方法，通过固相合成法制备得到氨基酸残基片段I-RinkAmide MBHA树脂、片段II-CTC树脂和片段III-CTC树脂化合物，然后将片段I-RinkAmideMBHA树脂和片段II偶联得到片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂：
17 28
Fmoc-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-
29 37
Pro-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink Amide MBHA
再将片段III和片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂偶联得到片段III-片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂：
最后脱保护，纯化得到普兰林肽。
本发明同时制备了一种含普兰林肽药物的冻干粉针剂，其包括主药普兰林肽、赋形剂、抑菌剂、pH值调节剂。
本发明同时制备了一种含普兰林肽药物的冻干粉针剂，其赋形剂选自甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、氯化钠、山梨醇等；其抑菌剂选自间甲酚、苯甲酸、山梨酸、乙醇、甘油、苯甲醇、三氯叔丁醇、丙酸钙、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠、乳酸钠等；其pH值调节剂选自醋酸、醋酸钠、盐酸、硫酸、乳酸、苹果酸、枸橼酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等。
经过大量优化实验，本发明发现了最优选配方组成。其中，其赋形剂优选甘露醇和乳糖，抑菌剂优选间甲酚和三氯叔丁醇，pH值调节剂最优选醋酸和醋酸钠，pH值最优选3.0-5.0。
另外，本发明还提供了制备含普兰林肽药物的冻干粉针剂的方法。其工艺如下：
1精密称取处方量的上述物料至灭菌容器中；
2加入适量注射用水完全溶解；
3用醋酸和醋酸钠调节pH值至3.0至5.0之间；
4注射用水定容；
5活性碳吸附热原；
6 0.45μm微孔滤膜过滤；
7 0.22μm微孔滤膜过滤；
8检查合格后灌装于西林瓶中，真空冷冻干燥、压塞、出箱、扎盖；
9检查合格后贴签包装。
附图说明：
图1为本发明固相合成普兰林肽的工艺流程图。
具体实施方式：
本发明包含但不局限于以下实施例。
实施例1：制备片段I-Rink Amide MBHA树脂
将100.00g Fmoc-RinkAmide MBHA resin加入到反应柱中，该树脂的替代度为0.3mmol/g。加入600mlDMF溶胀，然后加入DCM600ml/次洗涤3次，再加入DMF600ml/次洗涤3次。向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。保护氨基酸以及缩合试剂的投料量为3倍当量，称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH 41.36g及TBTU28.90g、HOBt12.16g、DIEA11.63g，加入DMF搅拌溶解，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时。Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。反应完毕后，抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤3次，再用DCM600ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12小时。取出称重，为104.83g，测定替代度为0.22mmol/g。
将104.83gFmoc-Tyr(tBu)-树脂加入到反应柱中，加入DCM600ml/次洗涤3次，再加入DMF600ml/次洗涤3次。向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 27.43g及TBTU22.15g、HOBt9.32g、DIEA8.92g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应3小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
重复以上“向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml……抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次”步骤，依次接Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Val，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Pro保护氮基酸，合成片段I-Rink Amide MBHA树脂。
实施例2：制备片段II-CTC树脂
将60.00g 2-Chlorotrityl Chloride resin加入到反应柱中，该树脂的替代度为1.0mmol/g。加入360mlDMF溶胀，然后加入DCM360ml/次洗涤3次，再加入DMF360ml/次洗涤3次。保护氨基酸以及缩合试剂的投料量为3倍当量，称取Fmoc-Pro-OH 60.73g及TBTU57.80g、HOBt24.32g、DIEA23.26g，加入DMF搅拌溶解，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时。Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。反应完毕后，抽去反应液，用DMF360ml/次洗涤3次，再用DCM360ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12小时。取出称重，为64.78g，测定替代度为0.82mmol/g。
将64.78g Fmoc-Pro-树脂加入到反应柱中，加入DCM360ml/次洗涤3次，再加入DMF360ml/次洗涤3次。向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液360ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF360ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Leu-OH56.54g及TBTU51.37g、HOBt21.62g、DIEA20.68g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应3小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF360ml/次洗涤6次。
重复以上“向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液360ml……抽去反应液，用DMF360ml/次洗涤6次”步骤，依次接Fmoc-Ile，Fmoc-Pro，Fmoc-Gly，Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Val保护氨基酸，合成片段II-CTC树脂。
实施例3：制备片段III-CTC树脂
将60.00g 2-Chlorotrityl Chloride resin加入到反应柱中，该树脂的替代度为1.0mmol/g。加入360mlDMF溶胀，然后加入DCM360ml/次洗涤3次，再加入DMF360ml/次洗涤3次。保护氨基酸以及缩合试剂的投料量为3倍当量，称取Fmoc-Leu-OH63.61g及TBTU57.80g、HOBt24.32g、DIEA23.26g，加入DMF搅拌溶解，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时。Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。反应完毕后，抽去反应液，用DMF360ml/次洗涤3次，再用DCM360ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12小时。取出称重，为65.77g，测定替代度为0.85mmol/g。
将65.77g Fmoc-Leu-树脂加入到反应柱中，加入DCM360ml/次洗涤3次，再加入DMF360ml/次洗涤3次。向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液360ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF360ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Phe-OH 65.86g及TBTU54.58g、HOBt22.97g、DIEA21.97g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应3小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF360ml/次洗涤6次。
重复以上“向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液360ml……抽去反应液，用DMF360ml/次洗涤6次”步骤，依次接Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ala，Fmoc-Leu，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-Lys(Boc)保护氨基酸，合成片段III-CTC树脂。
称取43.18g I2加入810mlDMF中搅拌溶解，完全溶解后加入到反应柱内，氮气吹搅反应30min，取样，用DMF洗涤6次，用Ellman反应检测巯基反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF810ml/次洗涤3次，再用DCM810ml/次洗涤3次，抽干，倒出。从而合成2，7两个半胱氨酸的二硫桥键。
实施例4：制备片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂
将由实施例2制备的片段II-CTC树脂加入玻璃反应柱内，向玻璃反应柱加入配制好的1％TFA/DCM溶液360ml，搅拌反应30min，收集反应液，加入1％TFA/DCM 360ml/次洗涤2次，合并反应液，旋蒸浓缩，得到淡黄色油状物，在水中沉淀，得白色粉状物。
将由实施例1制备的片段I-Rink Amide MBHA树脂加入玻璃反应柱内，向玻璃反应柱加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取TBTU22.15g、HOBt9.32g、DIEA8.92g，加入DMF搅拌溶解，加入已裂解的片段II化合物，完全溶解后加到玻璃反应柱内搅拌反应6小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例5：制备片段III-片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂
将由实施例3制备的片段III-CTC树脂加入玻璃反应柱内，向玻璃反应柱加入配制好的1％TFA/DCM溶液360ml，搅拌反应30min，收集反应液，加入1％TFA/DCM 360ml/次洗涤2次，合并反应液，旋蒸浓缩，得到淡黄色油状物，在水中沉淀，得白色粉状物。
将由实施例4制备的片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂加入玻璃反应柱内，向玻璃反应柱加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取TBTU22.15g、HOBt9.32g、DIEA8.92g，加入DMF搅拌溶解，加入已裂解的片段III化合物，完全溶解后加到玻璃反应柱内搅拌反应6小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例6：裂解
将由实施例5制备的肽树脂加入到圆底烧瓶中，加入配制好的裂解试剂(TFA∶EDT∶water＝95∶2.5∶2.5)2400ml，搅拌反应120min。过滤，树脂用TFA洗涤3次。合并滤液，缓慢沉降到24000ml的无水***中。静置2h后开始离心，离心完毕后用无水***2700ml/次离心洗涤6次，将得到的粗肽放入冰箱过夜，冷冻干燥，即得普兰林肽粗品。
实施例7：纯化
色谱柱：Φ15cm
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(C18)10μm
上样量：≤10g目的肽/次
检测波长：230nm
流速：400ml/min
流动相：A：0.3％醋酸水溶液；B：乙腈
色谱条件：梯度程序见下表。
将得到的粗肽减压干燥后加水8800ml溶解，溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤。滤液按照纯化条件上样，收集目的峰溶液，并将收集的溶液浓缩，冷冻干燥，得目标产物，收率为18.5％。
实施例8：制备普兰林肽冻干粉针剂
0.60mg/ml普兰林肽，3％w/v甘露醇，2.25mg/ml间甲酚，用醋酸和醋酸钠调节pH为4.0，其制备工艺如下：
在无菌条件下，称取普兰林肽3g，甘露醇150g以及11.25g间甲酚，置于灭菌容器中，加处方量80％注射用水，搅拌使溶解，用醋酸和醋酸钠调pH至4.0，加注射用水至5000ml，搅匀。加25g注射用活性炭搅拌30min，灭菌滤器粗滤脱炭，用0.45μm微孔滤膜过滤，最后用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液检测合格后，灌装于7ml灭菌西林瓶内(5ml/瓶)，冷冻真空干燥，真空压塞，出箱，轧盖。使每瓶相当于3mg普兰林肽。
由本实施例制得普兰林肽冻干粉针剂(含普兰林肽3mg)1000瓶，通过稳定性加速试验与动物血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验，对其稳定性及临床用药安全性进行了考察。
稳定性加速试验：
分别将上市的一批供试品和按市售包装的一批样品放入温度为40±2℃、相对湿度为75％±5％的恒温恒湿箱中进行考察，分别在0、1、2、3和6个月时取样测定，结果见表8-1和表8-2。
表8-1上市对照品加速试验结果
表8-2自制样品加速试验结果
通过表8-1和表8-2可以看出，经加速试验考察6个月，本发明制备的普兰林肽冻干粉针剂与已上市的普兰林肽注射液比较，外观色泽、酸度、溶液澄清度没有明显变化，而已上市的供试品的杂质增加、含量下降明显，表明本发明制备的普兰林肽冻干粉针剂可于室温下保存，稳定性增加。
血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验：
血管刺激性：
选取双耳无损伤的健康家兔6只，左侧耳缘静脉注射实施例8溶液1ml，右耳注射等容量5％葡萄糖溶液，每天1次，连续注射7天。
注射期间，每天定时观察耳缘静脉的刺激性反应。第8天处死家兔，取双侧耳缘静脉及周围组织，用甲醛固定，在注射部位的近心端作常规组织切片，光镜下观察有无病理变化。观察指标及判断标准见表8-3。
表8-3血管刺激性评分及判断标准
结果显示，家兔耳缘静脉注射实施例8溶液的刺激性，与5％葡萄糖溶液比较无明显差异。肉眼观察，未见血管充血、周围组织水肿等炎症反应。组织切片检查，未见血管结构异常、内皮损伤、血栓形成及其它病理变化。其肉眼和光镜观察的血管、周围组织的累计得分均小于0.5，表明无刺激性。
肌肉刺激性：
取健康家兔6只，每只家兔左侧股四头肌内注射实施例8溶液1m l，右侧注射同体积生理盐水。注射后观察注射部位肌肉有无充血、水肿等反应，半数动物48h后(第3天)放血处死，纵向切开皮肤，肉眼观察两侧注射部位有无充血、水肿等反应，并取其组织做病理检查。然后按表8-4中的标准评价该药的刺激反应。余下动物继续观察14d，于第18天放血处死后重复上述操作，评价标准见表8-4。
表8-4肌肉刺激反应评价标准
结果表明，家兔左侧股四头肌内注射实施例8溶液后，肉眼观察注射部位肌肉无充血、水肿等反应，病理组织检查亦未见组织变性或坏死等明显性刺激反应，与生理盐水侧相比无显著差异。
对豚鼠的致敏作用：
选取健康豚鼠6只，每只腹腔注射实施例8溶液0.5ml，隔日注射1次，共注射3次。然后随机分为2组，分别在第1次给药后14或21天，静注实施例8溶液1ml。观察豚鼠有无兴奋不安、呼吸困难等过敏症状。
结果两组豚鼠均活动正常，未见呼吸异常等。
体外溶血性试验：
制备2％家兔红细胞悬液。取试管7支，按表8-5加入各种液体。将各试管轻轻摇匀，置37℃恒温水浴中孵育，观察0.5、1、2、3、6小时的结果。红细胞体外凝集与溶血的判断标准见表8-6。
表8-5普兰林肽溶液体外溶血试验加样表
表8-6红细胞体外溶血与凝集试验判断标准
结果，蒸馏水对照管在0.5小时完全溶血。生理盐水和各普兰林肽溶液在6小时内均无溶血现象。轻轻振摇，生理盐水和各浓度普兰林肽溶液管底沉积的红细胞均能完全分散，表明普兰林肽溶液无红细胞凝集反应。
血管刺激性、肌肉刺激性、体外溶血性及过敏性实验表明，实施例8溶液无明显的刺激性、过敏性，也不会引起溶血反应。表明本发明制备的普兰林肽冻干粉针剂安全性好，可供临床静脉注射与肌肉注射应用。
实施例9：制备普兰林肽冻干粉针剂
1.00mg/ml普兰林肽，3％w/v甘露醇，0.4％w/v三氯叔丁醇，用醋酸和醋酸钠调节pH为4.0，其制备工艺如下：
在无菌条件下，称取普兰林肽1.5g，甘露醇45g以及6g三氯叔丁醇，置于灭菌容器中，加处方量80％注射用水，搅拌使溶解，用醋酸和醋酸钠调pH至4.0，加注射用水至1500ml，搅匀。加25g注射用活性炭搅拌30min，灭菌滤器粗滤脱炭，用0.45μm微孔滤膜过滤，最后用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液检测合格后，灌装于3ml灭菌西林瓶内(1.5ml/瓶)，冷冻真空干燥，真空压塞，出箱，轧盖。使每瓶相当于1.5mg普兰林肽。
由本实施例制得普兰林肽冻干粉针剂(含普兰林肽1.5mg)1000瓶，通过稳定性加速试验与动物血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验，对其稳定性及临床用药安全性进行了考察。
稳定性加速试验：
分别将上市的一批供试品和按市售包装的一批样品放入温度为40±2℃、相对湿度为75％±5％的恒温恒湿箱中进行考察，分别在0、1、2、3和6个月时取样测定，结果见表9-1和表9-2。
表9-1上市对照品加速试验结果
表9-2自制样品加速试验结果
通过表9-1和表9-2可以看出，经加速试验考察6个月，本发明制备的普兰林肽冻干粉针剂与已上市的普兰林肽注射液比较，外观色泽、酸度、溶液澄清度没有明显变化，而已上市的供试品的杂质增加、含量下降，表明本发明制备的普兰林肽冻干粉针剂可于室温下保存，稳定性增加。
血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验：
血管刺激性：
选取双耳无损伤的健康家兔6只，左侧耳缘静脉注射实施例9溶液1ml，右耳注射等容量5％葡萄糖溶液，每天1次，连续注射7大。
注射期间，每天定时观察耳缘静脉的刺激性反应。第8天处死家兔，取双侧耳缘静脉及周围组织，用甲醛固定，在注射部位近心端作常规组织切片，光镜下观察有无病理变化。观察指标及判断标准见表9-3。
表9-3血管刺激性评分及判断标准
结果显示，家兔耳缘静脉注射实施例9溶液的刺激性，与5％葡萄糖溶液比较无明显差异。肉眼观察，未见血管充血、周围组织水肿等炎症反应。组织切片检查，未见血管结构异常、内皮损伤、血栓形成及其它病理变化。其肉眼和光镜观察的血管、周围组织的累计得分均小于0.5，表明无刺激性。
肌肉刺激性：
取健康家兔6只，每只家兔左侧股四头肌内注射实施例9溶液1ml，右侧注射同体积生理盐水。注射后观察注射部位肌肉有无充血、水肿等反应，半数动物48h后(第3天)放血处死，纵向切开皮肤，肉眼观察两侧注射部位有无充血、水肿等反应，并取其组织做病理检查。然后按表9-4中的标准评价该药的刺激反应。余下动物继续观察14d，于第18天放血处死后重复上述操作，评价标准见表9-4。
表9-4肌肉刺激反应评价标准
结果表明，家兔左侧股四头肌内注射实施例9溶液后，肉眼观察注射部位肌肉无充血、水肿等反应，病理组织检查亦未见组织变性或坏死等明显性刺激反应，与生理盐水侧相比无显著差异。
对豚鼠的致敏作用：
选取健康豚鼠6只，每只腹腔注射实施例9溶液0.5ml，隔日注射1次，共注射3次。然后随机分为2组，分别在第1次给药后14或21天，静注实施例9溶液1ml。观察豚鼠有无兴奋不安、呼吸困难等过敏症状。
结果两组豚鼠均活动正常，未见呼吸异常等。
体外溶血性试验：
制备2％家兔红细胞悬液。取试管7支，按表9-5加入各种液体。将各试管轻轻摇匀，置37℃恒温水浴中孵育，观察0.5、1、2、3、6小时的结果。红细胞体外凝集与溶血的判断标准见表9-6。
表9-5普兰林肽溶液体外溶血试验加样表
表9-6红细胞体外溶血与凝集试验判断标准
结果，蒸馏水对照管在0.5小时完全溶血。生理盐水和各普兰林肽溶液在6小时内均无溶血现象。轻轻振摇，生理盐水和各浓度普兰林肽溶液管底沉积的红细胞均能完全分散，表明普兰林肽溶液无红细胞凝集反应。
血管刺激性、肌肉刺激性、体外溶血性及过敏性实验表明，实施例9溶液无明显的刺激性、过敏性，也不会引起溶血反应。表明本发明制备的普兰林肽冻干粉针剂安全性好，可供临床静脉注射与肌肉注射应用。
Claims (10)
1.一种固相片段合成普兰林肽的方法，其片段划分方法为：
其片段I-Rink Amide MBHA树脂为：
29 37
Fmoc-Pro-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink
Amide MBHA
其片段II-CTC树脂为：
17 28
Fmoc-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-
Chlorotrityl Chloride
其片段III-CTC树脂为：
2.一种固相片段合成普兰林肽的方法，其技术方案包括以下步骤：
1)以氨基树脂为载体，合成片段I-氨基树脂为AA29-AA37-Rink Amide MBHA树脂；
2)以羟基树脂为载体，合成片段II-羟基树脂为AA17-AA28-CTC树脂；
3)以羟基树脂为载体，合成片段III-羟基树脂为AA1-AA16-CTC树脂，并进行固相环化；
4)制备片段II-片段I-RinkAmide MBHA树脂；
5)制备片段III-片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂；
6)切割，得到普兰林肽粗肽；
7)精制，得到普兰林肽纯品。
3.权利要求2所述的方法，其Rink Amide MBHA树脂的替代度为0.2～0.4mmol/g；其2-Chlorotrityl Chloride树脂(CTC树脂)的替代度为0.8～1.2mmol/g；其保护氨基酸分别是Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Val，Fmoc-Pro，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Ala，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-Lys(Boc)；其缩合试剂为TBTU/HOBt/DIEA；其保护氨基酸以及缩合试剂的投料量是2～5倍当量。
4.权利要求2所述的方法，其合成2，7两个半胱氨酸的二硫桥键的环化试剂是I2，溶剂为DMF。
5.权利要求1或要求2所述的方法，其片段II-片段I-RinkAmide MBHA树脂为：
17 28
Fmoc-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-
29 37
Pro-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink Amide MBHA
其片段III-片段II-片段I-Rink Amide MBHA树脂为：
6.权利要求5所述的方法，其CTC树脂的裂解试剂是1％TFA/DCM；其Rink Amide MBHA树脂的裂解试剂是按TFA∶EDT∶Water＝95∶2.5∶2.5的体积比配制而成。
7.一种普兰林肽冻干粉针剂，其特征在于所述制剂由主药普兰林肽、赋形剂、抑菌剂与pH调节剂组成；其主药普兰林肽的浓度优选0.1-20mg/ml。
8.权利要求7所述制剂，其赋形剂选自甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、氯化钠、山梨醇等；优选1-10％w/v甘露醇和1-10％w/v乳糖。
9.权利要求7所述制剂，其防腐剂选自间甲酚、三氯叔丁醇、苯甲酸、山梨酸、乙醇、甘油、苯甲醇、丙酸钙、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠、乳酸钠等；优选0.1-50mg/ml间甲酚和0.03-2％w/v三氯叔丁醇
10.权利要求7所述制剂，其pH值调节剂选自醋酸、醋酸钠、盐酸、硫酸、乳酸、苹果酸、枸橼酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等，调节pH为2.0至6.0之间；优选用醋酸和醋酸钠调pH为3.0-5.0。
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