KR20110056536A

KR20110056536A - 프람린티드의 제조 방법

Info

Publication number: KR20110056536A
Application number: KR1020117007671A
Authority: KR
Inventors: 쩡 유 시아오; 진 구오 딩
Original assignee: 시노팜 타이완 리미티드
Priority date: 2008-09-03
Filing date: 2009-09-03
Publication date: 2011-05-30
Also published as: TW201014867A; IL211555A0; IL211556A0; CA2736113A1; KR20110069048A; AU2009288027B2; CN102164608A; EP2349307A4; AU2009288027A2; WO2010028122A8; TW201024316A; EP2334314A4; KR101634830B1; US20100081788A1; JP5788321B2; WO2010028131A1; EP2334314A1; JP2012502044A; US20100056755A1; CA2736126A1

Abstract

본 발명은 프람린티드의 제조를 위한 효율적인 방법 및 신규한 중간체를 제공한다.

Description

프람린티드의 제조 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF PRAMLINTIDE}

[관련 출원]

본 출원은 2008년 9월 3일자 출원된 미국 가특허출원 제 61/190,928호의 우선권을 주장하며, 상기 가특허출원의 전체 내용은 본 출원 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명은 펩티드 호르몬인 인간 아밀린(amylin)의 합성 유사체인 프람린티드(pramilintide)의 제조를 위한 효율적인 상업적 합성법에 관한 것이다. 프람린티드는 인슐린을 사용하는 제 1 형 및 제 2 형 당뇨병을 치료하기 위해 처방된다. 프람린티드를 제조하는 방법은 상기 폴리펩티드의 여러 가지 단편들을 합성하고 상기 단편들을 결합하여 프람린티드를 생성하는 단계를 실질적으로 포함한다.

프람린티드의 제조 및 용도가 미국특허 제 5,686,411호에 개시되어 있으며, 상기 미국 특허의 전체 개시 내용은 본원 명세서에 참고로 포함된다. 프람린티드는 원하는 아미노산을 성장 펩티드 사슬(growing peptide chain)에 연속적으로 첨가하는 고체상 합성을 통해 제조되는 것으로 알려져 있다. 대표적으로, α-N-카바모일 및 수지 지지체상의 성장 펩티드 사슬에 부착된 아미노산을, 염기의 존재하에 디시클로헥실카보디이미드 1-히드록시벤조트리아졸과 같은 결합제(coupling agent)의 존재하에 불활성 용매에서 실온에서 반응시킨다. 얻어지는 펩티드로부터 트리플루오로아세트산 또는 피페리딘과 같은 시약을 이용하여 α-N-카바모일 보호기가 제거되고, 다음의 원하는 N-보호된 아미노산을 이용하여 결합 반응(coupling reaction)이 반복된다. 적당한 N-보호기가 당 업계에 알려져 있는데, t-부틸옥시카보닐이 본원에서 바람직한 것이다. 미국특허 5,424,394호는 아밀린 및 아밀린 유사체의 합성을 위한 고전적인 단계적 방법을 개시하고 있다. 고체 수지 지지체에 공유 결합되어 있는 성장 펩티드 사슬에 단일 아미노산 잔기가 공유 결합된다. 상기 합성 경로는 매우 길고 비효율적인데, 몇 개의 결합 및 보호기 제거 단계가 반복되어야 하기 때문이다. 본 발명은 프람린티드의 더욱 효율적인 합성 방법을 제공하고, 종래 기술과 비교하여 최종 생성물의 수율 및 순도가 개선된다.

[발명의 요약]

본 발명은 수율이 높고 상업적인 제조에 적용할 수 있는 프람린티드의 제조를 위한 효율적인 방법을 제공한다. 이 방법은 아미노산 단편들을 단계적으로 합성하고, 이 단편들을 서로 결합시켜 프람린티드를 생성하는 것을 포함한다. 본 발명은 프람린티드의 제조를 위한 4 종의 신규한 아미노산 단편을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 4 종의 단편은 고체상에서 합성되고, 결합 반응은 용액상에서 수행된다. 바람직하게, 상기 단편은 보호된 지정 아미노산(protected designated amino acid)을, 불용성 고체 수지 지지체에 공유 결합되어 있는 성장 펩티드 사슬(growing peptide chain)에 결합시킴으로써 제조된다. 용어 "보호된 지정 아미노산"은 일반적으로 카르복시 말단으로부터 아미노 말단으로 진행하여 특정 서열의 펩티드를 형성하는 단일 아미노산(보호된 측쇄 및 아미노 말단을 가짐)을 말한다. 용어 "성장 펩티드 사슬"은 수지에 결합된 아미노산 또는 펩티드의 α-아미노기의 보호기를 제거한 다음, 유리 α-아미노기를 다음의 α-아미노 보호된 아미노산의 어떤 카르복시-활성화 형태와 반응(결합)시켜서 펩티드결합을 형성하고 지지체에 결합된 펩티드를 얻는 것을 포함하는 일반적인 합성 주기를 말한다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여, 일련의 실험 결과를 기재하고 있는 하기의 실시예가 제시된다. 본 발명에 관한 하기의 실시예는 본 발명을 특별히 제한하는 것으로 해석되지 않는다는 것은 물론이다. 당업자의 지식에 속할 수 있는 것으로, 이제부터 알려지거나 차후에 개발되는 본 발명의 변형은 특허청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 판단된다.

실시예 1: 보호된 단편 Sl (1-8)의 제조

2-Cl-Trt-Cl 수지(CTC 수지)에 Fmoc-Ala-OH를 로딩하는 것에서 출발하여 단계적 Fmoc SPPS(고체상 펩티드 합성) 과정에 의해 보호된 팹티드의 합성을 수행했다. 세척 후 CTC 수지(4 g)를 디이소프로필에틸아민(DIEA, 2.3g)의 존재하에 DMF에 용해된 Fmoc-Ala-OH(1.49g)의 용액과 함께 1.5 시간 동안 교반했다. 상기 수지를 5: 4: 1 체적비의 DCM/ MeOH/ DIEA의 혼합 용매로 0.5 시간 동안 처리하여 더욱 캐핑했다. 상기 수지를 세척한 후, DMF에 용해된 20% 피페리딘으로 10분 및 20분간 두 번 처리하여 Fmoc 보호기를 제거했다. 잔류 시약을 세척한 후, 제 2의 아미노산(Fmoc-Cys(Acm)-OH)을 도입하여 제 1 결합 반응을 출발했다. Fmoc로 보호된 아미노산을, DMF에 용해된 1:1:2 몰비의 HBTU(0-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸-유로늄-헥사플루오르-o-포스페이트)/HOBt(N-히드록시벤조트리아졸)/DIEA을 이용하여 원위치(in situ)에서 활성화한 다음, 수지상의 성장 펩티드에 3 시간 동안 결합시켰다. 상기 결합의 종료를 Kaiser 테스트로 확인했다. 상기 수지를 세척한 후, DMF에 용해된 20% 피페리딘으로 10 분 및 30 분간 2회 처리하여 α-아민상의 Fmoc 보호기를 제거했다. 이러한 단계들을, 펩티드 서열에 따라 또 다른 아미노산을 이용하여 반복했다. 사용된 모든 아미노산들은 서열 Boc-Lys(Boc)-OH의 마지막 아미노산을 제외하고 Fmoc-N^α로 보호하였다. 삼작용기 아미노산은 다음과 같이 측쇄 보호되었다: Lys(Boc)-OH, Asn(Trt)-OH, Thr(tBu)-OH. 3 당량의 활성화된 아미노산을 결합 반응에 이용했다. 합성의 종료시, 그 펩티드 수지를 DMF, MeOH 및 MTBE로 순차적으로 세척하고, 진공 건조시켜서 수지상에 건조 펩티드를 얻었다.

DCM에 용해된 20% TFE 용액을 이용하여, 전술한 바와 같이 제조한 수지상의 펩티드(8g)로부터 펩티드를 2 시간 동안 분열시켰다. 그 펩티드 용액의 용매를 MeOH로 교체하고 농축(30 mL)했다. 그 농축된 잔류물을 냉각하고 물(30 mL)을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 침전된 생성물을 여과로 분리하고 MeOH/물(10 mL/ 10 mL)의 혼합 용매로 2회 세척하여 Boc-Lys(Boc)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Ala-OH (S1a)를 얻었다.

10 g의 Sla를 DMF/피리딘/MeOH의 혼합 용매에 용해시킨 다음, DMF/MeOH에 용해된 I₂ 용액을 2.5 시간에 걸쳐 첨가했다. 1 시간 후, 그 혼합물을 물에 용해된 비타민 C/초산암모늄을 이용하여 퀀칭(quenching)했다. 물을 더욱 첨가하여 미정제 Sl을 얻었다. 실리카 겔로 정제를 수행하여 Sl인

을 얻었다.

실시예 2: 보호된 단편 S2 (9-19)의 제조

Fmoc - Thr ( tBu )- Gln ( Trt )- Arg ( Pbf )- Leu - Ala - Asn ( Trt )- Phe - Leu - Val - His ( Trt )-Ser(tBu)-OH

2-Cl-Trt-Cl 수지(CTC 수지)에 Fmoc-Ser(tBu)-OH를 로딩하는 것에서 시작하여 단계적 Fmoc SPPS(고체상 펩티드 합성) 과정에 의해 보호된 펩티드의 합성을 수행했다. 세척 후, CTC 수지(10 g)를, 디이소프로필에틸아민(2.3 g)의 존재하에 DMF에 용해된 Fmoc-Ser(tBu)-OH (4.6 g)의 용액과 함께 1.5 시간 동안 교반했다. 상기 수지를 세척한 후, DMF에 용해된 20% 피페리딘으로 10 분 및 30 분간 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거했다. 잔류 시약을 세척한 후, 제 2 아미노산(Fmoc-His(Trt)-OH)을 도입하여 제 1 결합 반응을 출발했다. DMF에 용해된 1:1:2 몰비의 HBTU/HOBt/DIEA를 이용하여 상기 Fmoc 보호된 아미노산을 원위치에서 활성화한 다음, 수지상의 성장 펩티드에 3 시간 동안 결합시켰다. 상기 결합의 종결을 Kaiser 테스트로 확인했다. 상기 수지를 세척한 후, DMF에 용해된 20% 피페리딘으로 10 분 및 30 분간 2회 처리하여 α-아민상의 Fmoc 보호기를 제거했다. 펩티드 서열에 따른 또 다른 아미노산을 이용하여 상기 단계들을 반복했다. 사용된 모든 아미노산은 Fmoc-N^α 보호하였다. 삼작용기 아미노산은 다음과 같이 측쇄 보호하였다: Asn(Trt)-OH, Arg(Pbf)-OH, Gln(Trt)-OH 및 Thr(tBu)-OH. 3 당량의 활성화 아미노산을 결합 반응에 이용했다. 합성의 종료시, 수지상의 성장 펩티드를 DMF, MeOH 및 MTBE로 순차적으로 세척하고, 진공 건조시켜 수지상의 건조 펩티드를 얻었다.

DCM에 용해된 20% TFE 용액을 이용하여, 전술한 바와 같이 제조한 수지상의 펩티드(24 g)로부터 펩티드를 2 시간 동안 분열시켰다. 그 펩티드 용액의 용매를 MeOH로 교체하고 농축(50 mL)했다. 농축된 잔류물에 차가운 MeOH(50 mL)를 첨가하여 생성물을 완전히 침전시켰다. 그 생성물을 여과로 분리하고 차가운 MeOH(20 mL)로 2회 세척하여 S2인 (Fmoc-Thr(tBu)-Gln( Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-OH (12 g)를 얻었다.

실시예 3: 보호된 단편 S3 (20-29)의 제조

Fmoc - Ser ( tBu )- Asn ( Trt )- Asn ( Trt )- Phe - Gly - Pro - Ile - Leu - Pro - Pro - OH

2-Cl-Trt-Cl 수지 (CTC 수지)에 Fmoc-Pro-OH를 로딩하는 것에서 출발하여 단계적 Fmoc SPPS(고체상 펩티드 합성) 과정에 의해 보호된 펩티드의 합성을 수행했다. 세척 후, CTC 수지(3 g)를, 디이소프로필에틸아민(2.3 g)의 존재하에 DMF에 용해된 Fmoc-Pro(tBu)-OH(1.2 g)의 용액과 함께 1.5 시간 동안 교반했다. 상기 수지를 세척한 후, DMF에 용해된 20% 피페리딘으로 10 분 및 30 분간 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거했다. 잔류 시약을 세척한 후, 제 2 아미노산(Fmoc-Pro-OH)을 도입하여 제 1 결합 반응을 출발했다. DMF에 용해된 1:1:2 몰비의 HBTU/HOBt/DIEA를 이용하여 상기 Fmoc 보호된 아미노산을 원위치에서 활성화한 다음, 수지상의 성장 펩티드에 3 시간 동안 결합시켰다. 상기 결합의 종결을 Kaiser 테스트로 확인했다. 상기 수지를 세척한 후, DMF에 용해된 20% 피페리딘으로 10 분 및 30 분간 2회 처리하여 α-아민상의 Fmoc 보호기를 제거했다. 펩티드 서열에 따라 또 다른 아미노산을 이용하여 상기 단계들을 반복했다. 사용된 모든 아미노산은 Fmoc-N^α 보호하였다. 삼작용기 아미노산은 다음과 같이 측쇄 보호하였다: Ser(tBu)-OH, 및 Asn(Trt)-OH. 3 당량의 활성화 아미노산을 결합 반응에 이용했다. 합성의 종료시, 수지상의 성장 펩티드를 DMF, MeOH 및 MTBE로 순차적으로 세척하고, 진공 건조시켜 수지상의 건조 펩티드를 얻었다.

DCM에 용해된 1% TFE 용액을 이용하여, 전술한 바와 같이 제조한 수지상의 펩티드(10 g)로부터 펩티드를 1.5 시간 동안 분열시켰다. 피리딘으로 중화한 후, 그 펩티드 용액을 농축(15 mL)했다. 농축된 잔류물을 헵탄(50 mL)에 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 그 생성물을 여과로 분리하고 DCM/헵탄(1 mL/3 mL)의 혼합 용매로 3회 세척하여 S3인 (Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH (5.2 g)를 얻었다.

실시예 4: 보호된 단편 S4 (30-36)의 제조

Fmoc - Thr ( tBu )- Asn ( Trt )- Val - Gly - Ser ( tBu )- Asn ( Trt )- Thr ( tBu )- OH

2-Cl-Trt-Cl 수지 (CTC 수지)에 Fmoc-Thr(tBu)-OH를 로딩하는 것에서 출발하여 단계적 Fmoc SPPS(고체상 펩티드 합성) 과정에 의해 보호된 펩티드의 합성을 수행했다. 세척 후, CTC 수지(10 g)를, 디이소프로필에틸아민(2.3 g)의 존재하에 DMF에 용해된 Fmoc-Thr(tBu)-OH(4.8 g)의 용액과 함께 1.5 시간 동안 교반했다. 상기 수지를 세척한 후, DMF에 용해된 20% 피페리딘으로 10 분 및 30 분간 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거했다. 잔류 시약을 세척한 후, 제 2 아미노산(Fmoc-Asn(Trt)-OH)을 도입하여 제 1 결합 반응을 출발했다. DMF에 용해된 1:1:2 몰비의 HBTU/HOBt/DIEA를 이용하여 상기 Fmoc 보호된 아미노산을 원위치에서 활성화한 다음, 수지상의 성장 펩티드에 3 시간 동안 결합시켰다. 상기 결합의 종결을 Kaiser 테스트로 확인했다. 상기 수지를 세척한 후, DMF에 용해된 20% 피페리딘으로 10 분 및 30 분간 2회 처리하여 α-아민상의 Fmoc 보호기를 제거했다. 펩티드 서열에 따른 또 다른 아미노산을 이용하여 상기 단계들을 반복했다. 사용된 모든 아미노산은 Fmoc-N^α 보호하였다. 삼작용기 아미노산은 다음과 같이 측쇄 보호하였다: Ser(tBu)-OH, Asn(Trt)-OH 및 Thr(tBu)-OH. 3 당량의 활성화 아미노산을 결합 반응에 이용했다. 합성의 종료시, 수지상의 성장 펩티드를 DMF, MeOH 및 MTBE로 순차적으로 세척하고, 진공 건조시켜 수지상의 건조 펩티드를 얻었다.

DCM에 용해된 20% TFE 용액을 이용하여, 전술한 바와 같이 제조한 수지상의 펩티드(23 g)로부터 펩티드를 2 시간 동안 분열시켰다. 그 펩티드 용액의 용매를 MeOH로 교체하고 농축(60 mL)했다. 농축된 잔류물에 MeOH(50 mL)를 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 그 생성물을 여과로 분리하고 MeOH/물(20 mL)로 2회 세척하여, S4인 (Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-0H (10.6 g)을 얻었다.

실시예 5: 결합 및 Fmoc 제거 반응

S4 (FmocThr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)OH) (1.0 kg; 1.0 당량), H-Tyr(tBu)-NH₂ (0.45 Kg; 3.0 당량) 및 l-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) (0.26 Kg; 3.0 당량)을 질소하에 적당한 반응기에 장입했다. l-메틸-2-피롤리디돈(NMP) (20.7 Kg)을 장입하고 0.5 시간 동안 교반했다. 얻어지는 혼합물을 0 내지 10 ℃까지 냉각했다. 다음에, 얻어지는 냉각 혼합물에 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC) (0.24 Kg; 3.0 당량) 및 l-메틸-2-피롤리디돈(NMP) (10,3 Kg)을 1 시간에 걸쳐서 적가하면서 온도를 0 내지 10 ℃로 유지했다.

상기 반응 혼합물을 20 내지 30 ℃까지 가온하고 15 시간 동안 유지했다. 디에틸아민(DEA) (0.42 Kg; 10.0 당량)을 첨가하면서 온도를 25 ℃로 유지했다. 그 반응 혼합물을 20 내지 30 ℃에서 2 시간 동안 교반했다. 온도를 35 ℃로 유지하면서 에틸 아세테이트(EA) (7.38Kg) 및 연화된 음료수(SPW) (50.0Kg)를 그 반응 혼합물에, 구름점(cloud point)이 관찰될 때까지 서서히 첨가하고, 1 시간 동안 구름점에서 유지했다. 나머지 SPW을 첨가하면서 온도를 35 ℃로 유지했다. 그 고체를 여과하고 MeOH/SPW= 1/1의 혼합 용매로 2회 세척한 다음 헵탄으로 2회 세척했다. 얻어지는 습윤 케이크를 질소로 1 시간 동안 퍼지(purge)하고 50 ℃에서 5 시간 건조하여 M2인 (Thr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)Tyr(tBu)-NH₂) (약 0.81 Kg)을 얻었다.

실시예 6: 결합 반응

M2 (0.81 Kg; 1.0 당량), S3 (Fmoc-Ser(tBu)Asn(Trt)Asn(Trt)PheGlyProlleLeu ProProOH) (0.85 Kg; 0.9 당량) 및 l-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) (0.26 Kg; 3.0 당량)을 질소하에 적당한 반응기에 장입했다. 다음에, l-메틸-2-피롤리디논(NMP) (16.7 Kg)을 장입하고 0.5 시간 동안 교반했다. 얻어지는 혼합물을 0 내지 10 ℃까지 냉각했다.

얻어지는 혼합물에 에틸(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드(EDCI) (0.30 Kg; 3.0 당량)를 첨가하면서 온도를 20 내지 30 ℃로 유지하고 3 시간 동안 교반했다. 온도를 35 ℃로 유지하면서 에틸 아세테이트(EA) (5.1 Kg) 및 SPW (43.6 Kg)을 상기 반응 혼합물에, 구름점(cloud point)이 관찰될 때까지 서서히 첨가하고, 1 시간 동안 구름점에서 유지했다. 나머지 SPW을 첨가하면서 온도를 35 ℃로 유지했다. 그 고체를 여과하고 MeOH로 2회 세척했다. 얻어지는 습윤 케이크를 질소로 1 시간 동안 퍼지하고 50 ℃에서 5 시간 건조하여 M3인 (FmocSer(tBu)Asn(Trt)Asn(Trt)PheGlyProlleLeuProProThr(tBu)Asn(Trt)ValGly Ser(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)Tyr(tBu)-NH₂) (약 1.56 Kg)을 얻었다.

실시예 7: Fmoc 제거 반응

M3 (1.56 Kg; 1.0 당량) 및 디클로로메탄(DCM) (12.5 Kg)을 적당한 반응기에 장입했다. 다음에, 온도를 20 내지 30 ℃로 유지하면서 피페리딘(0.60 Kg; 15.0 당량)을 장입하고 2 시간 동안 교반했다. 온도를 30 ℃로 유지하면서 메틸-t-부틸 에테르(MTBE) (34.7 Kg)를 구름점이 관찰될 때까지 서서히 첨가하고 구름점에서 1 시간 동안 유지했다. 나머지 MTBE를 첨가하면서 온도를 30 ℃로 유지했다. 그 생성물을 여과하고 MeOH/SPW= 1/ 1의 혼합 용매로 2회 세척하고 메틸-t-부틸 에테르(MTBE)로 2회 세척했다. 얻어지는 습윤 케이크를 질소로 1 시간 동안 퍼지하고 50 ℃에서 5 시간 건조시켜 M4인 (Ser(tBu)Asn(Trt)Asn(Trt)PheGlyProlleLeuProProThr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)Tyr(tBu)-NH₂) (약 1.32 Kg)을 얻었다.

실시예 8: 결합 반응

M4 (1.32 Kg; 1.0 당량), S2 (FmocThr(tBu)Gln(Trt)Arg(Pbf)LeuAlaAsn(Trt)PheLeuValHis(Trt)Ser(tBu)OH) (1.03 Kg; 0.95 당량) 및 l-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) (0.17 Kg; 3.0 당량)을 질소하에 적당한 반응기에 장입했다. 다음에, l-메틸-2-피롤리디논(NMP) (27.17 Kg)을 장입하고 0.5 시간 동안 교반했다. 얻어지는 혼합물을 0 내지 10 ℃까지 냉각했다.

상기 냉각 혼합물에 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC) (0.16 Kg; 3.0 당량) 및 l-메틸-1-2-피롤리디논(NMP) (6.80 Kg)의 용액을 적가하면서 온도를 0 내지 10 ℃로 유지했다. 그 반응 혼합물을 20 내지 30 ℃까지 가온하고 15 시간 동안 유지했다. 그 반응 혼합물에 에틸 아세테이트(EA) (9.47 Kg)를 첨가했다. 온도를 35 ℃로 유지하면서 MeOH/SPW=1/1 (86.8 Kg)의 혼합 용매를 구름점이 관찰될 때까지 서서히 첨가하고 구름점에서 1 시간 동안 유지했다. 온도를 35 ℃로 유지하면서 나머지 SPW을 첨가했다. 얻어지는 고체를 여과하고 MeOH/SPW = 4/1의 혼합 용매로 세척했다. 얻어지는 습윤 케이크를 질소로 1 시간 동안 퍼지하고 50 ℃에서 5 시간 동안 건조시켜 M5인 (FmocTh (tBu)Gln(Trt)Arg(Pbf)LeuAlaAsn(Trt)PheLeuValHis(Trt)Ser(tBu)Ser(tBu)Asn(Trt)Asn(Trt)PheGlyProlleLeuProProThr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)Tyr (tBu)-NH2) (약 2.16 Kg)을 얻었다.

실시예 9: Fmoc 제거 반응

M5 (2.16 Kg; 1.0 당량) 및 디클로로메탄(DCM) (28.7 Kg)을 질소하에 적당한 반응기에 장입했다. 다음에, 온도를 20 내지 30 ℃로 유지하면서 피페리딘(0.32 Kg; 10.0 당량)을 장입하고 2 시간 동안 교반했다. 온도를 0 내지 10 ℃로 유지하면서 메틸-t-부틸 에테르(MTBE) (47.9 Kg)를 구름점이 관찰될 때까지 서서히 첨가하고 구름점에서 1 시간 동안 유지했다. 나머지 MTBE를 첨가하면서 온도를 0 내지 10 ℃로 유지했다. 그 생성물을 여과하고 MeOH/SPW= 4/ 1의 혼합 용매로 2회 세척하고 메틸-t-부틸 에테르(MTBE)로 2회 세척했다. 얻어지는 습윤 케이크를 질소로 1 시간 동안 퍼지하고 50 ℃에서 5 시간 건조시켜 M6인 (Thr(tBu)Gln(Trt)Arg(Pbf) LeuAlaAsn(Trt)PheLeuValHis(Trt)Ser(tBu)Ser(tBu)Asn(Trt)Asn(Trt)PheGlyProl

leLeuProProThr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)Tyr(tBu)-NH₂) (약 1.87 Kg)을 얻었다.

실시예 10: 결합 반응

M6 (1.87 Kg; 1.0 당량), Sl

-OH) (0.46Kg, 1.0 당량) 및 l-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) (0.14 Kg; 3.0 당량)을 질소하에 적당한 반응기에 장입했다. l-메틸-2-피롤리디논(NMP) (19.3Kg)을 장입하고 0.5 시간 동안 교반했다. 얻어지는 혼합물을 0 내지 10 ℃까지 냉각했다.

온도를 0 내지 10 ℃로 유지하면서 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC) (0.13 Kg; 3.0 당량) 및 l-메틸-2-피롤리디논(NMP) (9.63 Kg)의 용액을 1 시간 동안 상기 냉각 혼합물에 첨가했다. 그 반응 혼합물을 0 내지 10 ℃로 0.5 시간 동안 유지한 다음, 20 내지 30 ℃로 가온하고 17 시간 동안 교반했다. 에틸 아세테이트(EA) (8.39 Kg)를 상기 반응 혼합물에 첨가했다. 온도를 35 ℃로 유지하면서 SPW (74.6 Kg)을 구름점이 관찰될 때까지 서서히 첨가하고 구름점에서 1 시간 동안 유지했다. 나머지 SPW을 첨가하면서 온도를 35 ℃로 2 시간 동안 유지했다. 얻어지는 고체를 여과하고 MeOH/SPW = 4/1의 혼합 용매로 3회 세척했다. 얻어지는 습윤 케이크를 질소로 1 시간 동안 퍼지하고 30 ℃에서 건조시켜 M7인 (Boc-SlS2S3S4Try(tBu)NH₂) (약 2.09 Kg)을 얻었다.

실시예 11: 탈블로킹화 반응

M7 (2.09 Kg)를 질소하에 반응기 I에 장입했다. 그 고체를 0 내지 10 ℃에서 유지하고, SPW (0.52 Kg), 트리플루오로아세트산(TFA) (29.38 Kg), 및 트리이소프로필실란(TIS) (0.47 Kg)을 질소하에 반응기 II에 장입했다.

반응기 II내의 혼합 용액을 0 내지 10 ℃까지 냉각하고 25 ℃의 반응기 I에 장입했다. 그 반응 혼합물을 20~30 ℃ 에서 3 시간 동안 교반했다.

상기 반응 혼합물을 0 내지 10 ℃까지 냉각하고, 미리냉각한 (0 내지 10 ℃) 메틸-t-부틸 에테르(MTBE) (61.85 Kg)를 15 ℃에서 서서히 첨가하고 1 시간 동안 교반했다. 얻어지는 고체 생성물을 여과하고 메틸-t-부틸에테르(MTBE)로 2회 세척하고 테트라히드로푸란(THF)으로 2회 세척했다. 얻어지는 습윤 케이크를 질소로 1 시간 동안 퍼지하고 50 ℃에서 6 시간 동안 건조시켜 프람린티드 아세테이트(약 1.21 Kg)를 얻었다.

<110> SCINOPHARM TAIWAN LTD. <120> PROCESS FOR THE PREPARATION OF PRAMLINTIDE <130> 4951-88APCT <150> 61/190928 <151> 2008-09-03 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 1 5 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly Ser Asn 1 5 10 15 Thr Tyr <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly 1 5 10 15 Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 20 25 <210> 8 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35

Claims

하기 화학식 (I)의 프람린티드의 제조 방법으로서,
(a) 하기 화학식 (II)의 보호된 측쇄 펩티드를 H-Tyr(P2)-NH₂와 반응시켜서 하기 화학식 (III)의 보호된 측쇄 펩티드를 얻는 단계;
(b) 화학식 (III)의 펩티드의 말단 P1 보호기를 제거하고 하기 화학식 (IV)의 보호용 측쇄 펩티드와 반응시켜서 하기 화학식 (V)의 보호된 측쇄 펩티드를 얻는 단계;
(c) 화학식 (V)의 펩티드의 말단 P 보호기를 제거하고 하기 화학식 (VI)의 보호용 측쇄 펩티드와 반응시켜서 하기 화학식 (VII)의 보호된 측쇄 펩티드를 얻는 단계;
(d) 화학식 (VII)의 펩티드의 말단 P 보호기를 제거하고 하기 화학식 (VIII)의 보호용 측쇄 페티드와 반응시켜서 하기 화학식 (IX)의 보호된 측쇄 프람린티드를 얻는 단계;
(e) 화학식 (IX)의 펩티드의 측쇄의 보호기 및 말단 아미노 보호기를 제거하여 프람린티드(I)를 얻는 단계를 포함하는 제조 방법:
[화학식 I]

[화학식 II]

[화학식 III]

[화학식 IV]

[화학식 V]
P-Ser(P2)-Asn(P2)-Asn(P2)-Phe-Gly-Pro-lle-Leu-Pro-Pro-Thr(P2)-Asn(P2)
-Val-Gly-Ser(P2)-Asn(P2)-Thr(P2)-Tyr(P2)-NH₂ (V)
[화학식 VI]

[화학식 VII]

[화학식 VIII]

[화학식 IX]

상기 식들에서, P1 및 P2는 보호기임.
제 1 항에 있어서, Pl은 Fmoc 또는 Boc인 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (d)의 Pl은 Boc인 방법.
제 1 항에 있어서, P2는 tBu, Trt 및 Pbf로부터 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (e)는 용액에서 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 a) 내지 d)의 결합 반응중 하나 이상은 l-히드록시-7-아자벤조트리아졸, l-메틸-2-피롤리디논, 에틸(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드, N,N-디이소프로필카보디이미드, 및 이들의 조합으로부터 선택된 시약을 이용하여 달성되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 보호기 제거 단계는, 보호기가 Fmoc인 경우 피페리딘을 이용하여 수행되고 보호기가 Boc인 경우 트리플루오로아세트산을 이용하여 수행되는 방법.
하기 화학식 (III)의 보호된 측쇄 펩티드:
[화학식 III]

상기 식에서, P1 및 P2는 보호기임.
제 8 항에 있어서, 상기 펩티드가 Fmoc-Thr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn (Trt)Thr(tBu)Tyr(tBu)-NH₂인 펩티드.
Fomc-Thr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)-OH를 H-Tyr(tBu)-NH₂와 반응시켜서 Fmoc-Thr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)Tyr(tBu) -NH₂를 제조하는 방법.
제 10 항에 있어서, Fomc-Thr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)-OH는 불용성의 고체 수지 지지체에 공유 결합된 성장 펩티드 사슬에 보호된 지정 아미노산을 결합시켜서 Fomc-Thr(tBu)Asn(Trt)ValGlySer(tBu)Asn(Trt)Thr(tBu)-OH를 얻는 고체상 합성에 의해 제조되는 방법.
하기 화학식 (IV)의 보호된 측쇄 펩티드:
[화학식 IV]

상기 식에서, P1 및 P2는 보호기임.
제 12 항에 있어서, 상기 펩티드가 Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH인 펩티드.
Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH의 제조 방법으로서, 불용성의 고체 수지 지지체에 공유 결합된 성장 펩티드 사슬에 보호된 지정 아미노산을 결합시켜서 Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH를 제조하는 것을 포함하는 방법.
하기 화학식 (VI)의 보호된 측쇄 펩티드:
[화학식 VI]

상기 식에서 P1 및 P2는 보호기임.
제 15 항에 있어서, 상기 펩티드가 Fmoc-Thr(tBu)-GIn(Trt)Arg(Pbf)-Leu-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-Val-His(Trt)-Ser (tBu)-OH인 펩티드.
Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)Arg(Pbf)-Leu-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-OH의 제조 방법으로서, 불용성의 고체 수지 지지체에 공유결합된 성장 펩티드 사슬에 보호된 지정 아미노산을 결합시켜서 Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)Arg(Pbf)-Leu-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-OH를 얻는 단계 및 보호기제거 단계를 포함하는 제조 방법.
하기 화학식 (VIII)의 보호된 측쇄 펩티드:

상기 식에서, P1 및 P2는 보호기임.
제 18 항에 있어서, 상기 펩티드가

인 페티드.
의 제조 방법으로서, 불용성의 고체 수지 지지체에 공유결합된 성장 펩티드 사슬에 보호된 지정 아미노산을 결합시키고, 시스테인 잔기를 선택적으로 보호하고, 상기 고체 지지체로부터 펩티드 사슬의 분리 전에 상기 펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기들 사이에 분자간 디설파이드 결합을 형성하여,

를 생성하는 단계를 포함하는 제조 방법.