CN101029300A - 一种降酸酵母及其在杨梅果酒酿造中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的降酸酵母，该酵母为东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6，CCTCC NO.M207003，是从杨梅果肉中分离出来。该酵母能进行柠檬酸－乙醇发酵，将果汁中的柠檬酸降解为乙醇，在降酸培养基中的降酸总量高达90％以上，可用于果酒的降酸发酵。

Description

一种降酸酵母及其在杨梅果酒酿造中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种酵母，特别是伊萨酵母属的东方伊萨酵母，还涉及该酵母在果酒降酸中的应用。

背景技术

杨梅果酒的生产过程中，酸度太高的问题常常困扰着生产厂家及广大消费者。常规的降酸方法为化学降酸和物理降酸。化学法降酸虽然降酸效果显著，但对风味及色泽影响很大。离子交换树脂和电渗析是国内外物理降酸的主要方法。研究表明离子交换树脂的降酸效果显著，但树脂同时吸附大量的多酚类物质，导致酒体色泽严重褪色和保健成分的损失；电渗析降酸效果较化学降酸和离子交换树脂法要好，但设备投资大。

生物降酸是采用某些乳酸菌或酵母对果酒或果汁中的有机酸进行分解或转化的方法，这种方法不仅可以降酸，同时对果酒风味和色泽的影响很小，目前被认为是比化学和物理降酸法更为可行的方法。其中利用乳酸菌对葡萄酒中的苹果酸转化为乳酸的工艺在葡萄酒生产中已有很长的应用历史。此外，还发现裂殖酵母也可将果酒中的苹果酸降解。葡萄酒中主要的有机酸为酒石酸和苹果酸，其中苹果酸为二元酸，且具有刺激性，酸感较强，经乳酸菌转化为一元酸乳酸后，可使葡萄酒酸度降低，口感变得更为柔和。

国家知识产权局于2006年1月18日公告了“一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法”的发明专利申请，该专利申请所公开的葡萄酒降酸酵母是以葡萄酒酵母1450和酒类酒球菌SD-2a为亲株，应用原生质体融合技术构建出来的。其形态、大小及菌落特征均与葡萄酒酵母1450相似，可在高酸度的环境下能进行苹果酸-乳酸发酵，降低果酒的苹果酸含量。其发酵酒精的能力接近葡萄酒酵母1450，降酸能力接近酒酒球菌SD-2a，降酸量可到达77.6％。然而，该专利申请所公开的酵母却没有转化柠檬酸的作用，因此不适用有机酸80％以上为柠檬酸的杨梅汁或杨梅果酒的降酸。

2003年天津科技大学赵玉平的博士论文《山楂综合利用和开发研究》中公开了一株从山楂果中分离出来的毕氏酵母Pichia ohmer Y19能进行柠檬酸-乙醇发酵，以及该酵母在山楂酒酿造中的应用。Y19在山楂果汁中有很好的降酸能力，降酸总量高达80％，且对黄酮含量影响很小，但该文未涉及杨梅果酒生物降酸的菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的降酸酵母。

本发明的另一目的在于提供该酵母在杨梅果酒酿造中的应用。

本发明实现上述目的技术方案是：东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6，CCTCC NO.M 207003。

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6是从杨梅果肉中分离出来的，已于2007年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为M 207003。

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6在降酸培养基中25℃培养2天后观察，细胞为长卵圆形或圆柱形，单端出芽生殖，能发酵柠檬酸产生乙醇；在麦芽汁培养基中菌落扁平有皱折，无光泽，边缘不整齐，能形成约1～6个子囊孢子，属有性生殖。其中，所述的降酸培养基由硫酸铵5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、无水氯化钙0.1g、氯化钠0.1g、酵母膏0.2g和柠檬酸20g溶于1L去离子水中制成；所述的麦芽汁培养基为糖度为10波美度、pH为5.4的麦芽汁，含2％琼脂。

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6可用普通酵母培养基培养，如YEPD培养基，培养温度为20～30℃，需氧；可采用液体石蜡保藏法保藏，保藏用培养基由2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％酵母膏、2％琼脂和蒸馏水组成。

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6能发酵柠檬酸产生乙醇，可在发酵的过程中降低柠檬酸的含量，其降酸量可达90％以上，可用于主要含酸为柠檬酸的水果果酒酿造，如杨梅果酒酿造。

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6应用于杨梅果酒酿造的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将酿酒酵母用1～6％的蔗糖溶液37℃活化20～40min，与灭菌冷却后的0.5～6％的海藻酸钠混合后，注入1～10％的氯化钙或氯化铝溶液中，形成凝胶小球，静置20～60min后用无菌水洗涤；

(2)以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为18～28％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母0.1～2％，于10～30℃进行发酵，发酵至醪液中总糖0～12g/L，膜过滤，取滤液，得酒基A；

(3)将xlc6经耐2～12％酒精驯化后，接种于澄清杨梅原汁中，接种量为10⁶～10⁹cfu/mL，15～25℃发酵至杨梅原汁中总酸0～6g/L，得降酸原汁，然后以降酸原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为18～28％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母0.1～2％进行发酵，发酵至醪液中总糖0～12g/L，膜过滤，取滤液，得酒基B；

(4)将酒基A和酒基B按1∶1～5勾兑，即可。

上述方法酿造杨梅果酒需15～25天，所得的杨梅果酒酒精度9～16％，总糖≤12g/L，总酸≤8g/L，呈***到棕红色，澄清透明，有光泽，具有爽怡、柔和的口味和新鲜悦入的原果香味，酒体完整，酸感合适；勾兑所得的杨梅果酒还可以在5～20℃下进行陈酿1年或1年以上，使其色泽、风味及口感得到进一步改善。

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6的鉴定：

1、分子生物学鉴定：

提取微量xlc6的DNA(提取方法见A·亚当斯著《酵母遗传学方法实验指南》84页)，根据Kurtzman& Robnett的方法，采用引物NL1(5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)和NL4(5′-GGT CCG TGTTTC AAG ACG G-3′)PCR扩增xlc6菌株26S rDNA近5′端的D1/D2区域，并按下述反应条件进行36个循环：94℃，1min；53℃，1min；72℃，1min 20s。所得PCR产物送至上海英俊生物技术有限公司进行测序。

xlc6菌株PCR产物总共561个碱基，如下所示。

GCGGCGAGTGAaGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAAATCGTGCTTTGCGGCACGAGTTGTAGATTG

CAGGTTGGAGTCTGTGTGGAAGGCGGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGCGCCCAGGAGGGTGAGA

GCCCCGTGGGATGCCGGCGGAAGCAGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT

CCAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGT

GAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAG

GGTATTGCGCCCGACATGGGGATTGCGCACCGCTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGCTTTCCCTGG

GCCAGCATCGGTTCTTGCTGCAGGAGAAGGGGTTCTGGAACGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCAG

GGCCAGATGCTGCGTGCGGGGACCGAGGACTGCGGCCGTGTAGGTCACGGATGCTGGCAGAACGGC

GCAACACCGCCCGTCTTGAAACACCGGACCA

选取克鲁维酵母、假丝酵母、伊萨酵母和毕氏酵母属中与xlc6 blast结果显示同源性较高的菌株和部分代表种，以S.pombe为外类群，将xlc6与选取的49个菌种作进化树，用于比对的菌种如表1所示。从图1的聚类结果可以看出，所选取的这几个属的菌株主要分为4类。其中克鲁维酵母单独聚为一类，东方伊萨酵母(I.orientalis)在与xlc6比对的554bp中，匹配率100％，rDNA差异碱基数为0；在进化树中，I.orientalis与xlc6显示出较高的同源性(98％)，而与I.orientalis最近的C.pseudolambica与I.orientalis比对的559bp中，匹配率仅92.84％，rDNA差异碱基数为40。根据Kurtzman & Robnett的理论“属于同一种的菌株，其D1/D2区碱基差异不超过1％，并预测若此差异超过1％则可以认为是属于不同种，而如果只有0-3个碱基替代，就可以认为是属于同一种或是相似种(Kurtzman & Robnett，1998)”，可以认为xlc6属于I.orientalis，或是其亚种。

                  表1  与xlc6作26S rDNA序列比对的49株菌

菌种	GenBank数据库编号	简称
			Candida boleticola	U45777	C.boleticola
Candida cantarellii	U45814	C.cantarellii
			Candida dendrica	U62301	C.dendrica
Candida entomophila	U62302	C.entomophila
			Candida ethanolica	U71073	C.ethanolica
Candida friedrichii	U45781	C.friedrichii
			Candida gropengiesseri	U45721	C.gropengiesseri

Candida inconspicua	U71062	C.inconspicua
			Candida intermedia	U44809	C.intermedia
Candida lyxosophila	U76204	C.lyxosophila
			Candida methanosorbosa	U70186	C.methanosorbosa
Candida pseudolambica	U71063	C.pseudolambica
			Candida rugopelliculosa	U71069	C.rugopelliculosa
Candida rugosa	U45727	C.rugosa
			Candida sake	U45728	C.sake
Candida thaimueangensis	AB264014	C.thaimueangensis
			Candida valida	AJ508586	C.valida
Issatchenkia hanoiensis	DQ466541	I.hanoiensis
			Issatchenkia occidentalis	U76348	I.occidentalis
Issatchenkia orientalis	U76347	I.orientalis
			Issatchenkia scutulata var.scutulata	U76529	I.scutulata
Issatchenkia terricola	U76345	I.terricola
			Kluyveromyces aestuarii	U69579	K.aestuarii
Kluyveromyces africanus	U68550	K.africanus
			Kluyveromyces bacillisporus	U69583	K.bacillisporus
Kluyveromyces blattae	U69580	K.blattae
			Kluyveromyces delphensis	U69576	K.delphensis
Kluyveromyces dobzhanskii	U69575	K.dobzhanskii
			Kluyveromyces lactis var.lactis	U94922	K.lactis
Kluyveromyces lodderae	U6855l	K.lodderae
			Kluyveromyces marxianus	U94924	K.marxianus
Kluyveromyces phaffii	U69578	K.phaffii
			Kluyveromyces piceae	U84346	K.piceae
Kluyveromyces polysporus	U68548	K.polysporus
			Kluyveromyces thermotolerans	U69581	K.thermotolerans
Kluyveromyces waltii	U69582	K.waltii
			Kluyveromyces wickerhamii	U69577	K.wickerhamii
Kluyveromyces yarrowii	U68559	K.yarrowii
			Pichia(Komagataella)pastoris	U75963	Pichia.pastoris
Pichia(Yamadazyma)stipitis	U45741	Pichia.stipitis
			Pichia angophorae	U75521	P.angophorae
Pichia bispora	U74589	p.bispora
			Pichia canadensis	U75415	P.canadensis
Pichia dryadoides	U75422	P.dryadoides
			Pichia galeiformis	U75738	P.galeiformis
Pichia membranifaciens	U75725	P.membranifaciens
			Pichia methanolica	U75523	P.methanolica
Pichia scaptomyzae	DQ409150	P.scaptomyzae
			Schizosaccharomyces pombe	U40085	S.pombe

2、生理生化鉴定：

1)发酵糖类试验：

鉴定所需发酵用碳源为：棉子糖、D-半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖。取12.5％豆芽汁为基础液，分装杜氏管，115℃灭菌15分钟；测试的糖分别用无菌水配成10％的溶液，煮沸15分钟，稍冷，用无菌移液管吸取一定量的糖液分装于杜氏管，使糖浓度达到2％，棉子糖为4％。以新鲜培养的酵母菌分别接种于发酵管，25℃下培养，观察杜氏管内气体体积积存量以及培养基的颜色变化，共观察两周，第一周每天记录一次，第二周共检查2～3次。结果根据下述原则表述：

+阳性        7天内杜氏管被气体全部充满

d迟缓阳性    多于7天杜氏管被气体全部充满

-阴性        没有气体积累

2)碳源同化培养实验(见表2)

              表2  碳源同化实验

碳源类型	碳源种类
		六碳糖双糖三糖五碳糖多糖醇类有机酸	D-半乳糖、D-甘露糖、葡萄糖蔗糖、麦芽糖、乳糖棉子糖D-木糖、L-***糖、D-核糖、L-鼠李糖可溶性淀粉甘油、山梨醇、D-甘露醇琥珀酸、柠檬酸、乳酸

①培养基的制备：配酵母碳源同化作用培养基YNB1000ml，加入与5g葡萄糖相当的碳源化合物，棉子糖加倍，若同化的碳源是有机酸，则先把酸度调至pH5.7，过滤灭菌，吸取5ml以上溶液注入16×160mm试管中。

②同化结果的观察与记录方法：取一白色卡片其上用墨汁或黑色墨水划上约3/4cm宽的直线，把培养1个月后的同化管充分摇匀，贴于该卡片上，透过培养液观察卡片上的黑线，并根据下述原则记录：

+++  透过试管完全看不见黑线；

++   可见黑线但呈现一发散的模糊条；

+    黑线可看清但边缘模糊；

-    黑线清晰可见且边缘不模糊。

记录为“+++”和“++”的试管则表明同化反应为阳性，记录为“+”表明同化为弱阳性和“-”的试管则为阴性。如是形成膜、醭等也记录为阳性。为了便于观察结果，制作阳性和阴性对照及总的空白对照，即以葡萄糖为唯一碳源的培养基为阳性对照，记为+++；而不含任何碳源的培养基为阴性对照。

3)同化氮源试验：

一般采用生长谱法，具体方法如下：

①菌液制备：挑取新鲜培养的酵母菌一环接入1ml无菌生理盐水中，混匀后，制成细胞悬浮液。

②浇制带菌平板：将每管装有20ml无氮源的基础培养基，熔化后冷至45℃左右，将1ml的菌液全部倒入无氮源的基础培养基试管中，充分摇匀，倾碟，凝固后28℃下倒置几小时，使表面稍干，在平皿的底部标上氮源名称的标记。为了避免邻近不同氮源的干扰，在不同氮源的交界区之间，用无菌小钢铲开一小沟(平板近中心不开沟)。每皿以六种氮源为宜。

③点样：用无菌不锈钢匙(或用无菌牙签)按标记加氮源少许(约米粒大小)，先正放2～4小时，然后置25℃下倒置培养1～2天，观察结果。

4)生成类淀粉化合物试验：

在酵母生成类淀粉化合物的斜面培养基上，划线接入已活化好的酵母菌，于25℃培养1～2周后，在表面滴加路哥氏碘液1～2滴。凡能生类淀粉化合物的酵母菌，在菌落周围呈蓝色。

5)无维生素生长测试

取16.7克无维生素酵母菌基础培养基，溶于1000ml蒸馏水中，过滤灭菌，放在4℃冰箱中备用。

第一次培养：用接种环挑取一环活化的菌种，接入5ml无维生素基础培养基的试管，25℃培养3～7天。

第二次培养：取0.1ml第一次培养液接入含有新鲜培养基的试管中，25℃培养3～7天。观察并记录结果。

6)在50％(w/v)和60％(w/v)葡萄糖-酵母膏中生长测试：

将50克葡萄糖溶于50ml含有0.1％酵母膏的水中，然后加入3％(w/w)琼脂溶解后分装试管，每管5ml，115℃灭菌10分钟，取出做斜面(注意：灭菌过度将会导致培养褐变，灭菌后已褐变的培养基不宜再用)。将已活化好的酵母菌在上述培养基斜面上划线，经过25℃培养30天后观察有无生长现象。为防止培养期间由于水分蒸发而导致培养的渗透压进一步加大，试管最好用橡胶塞密封。

7)分解尿素测试

取新培养的酵母菌，接种于作水解尿素试验的琼脂斜面上，25℃培养，每天观察结果。5～7天后，如琼脂斜面上呈现淡红色，则此酵母能分解尿素。

8)石蕊牛奶试验

牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白等成分。在牛奶加入石蕊作为酸碱和氧化还原指示剂，取新培养的酵母菌，接种于该培养基中，培养30天后观察情况。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性时呈蓝色，还原时则自下而上褪色。一般鉴定酵母时牛奶中可不加石蕊。

9)37℃生长测试

将酵母接种于YEPD琼脂上于37℃培养2～4天，如果弱生长，则再重新接种，以同样温度培养2～4天观察的结果为准。

10)产酯测定

取10％豆芽汁酿成5％的葡萄糖溶液，接入新培养的酵母菌，25℃下培养3～5天，用嗅觉判断是否有酯类香气。

11)子囊孢子的显微镜观察

将酵母菌接入麦芽汁培养基斜面上，于25℃～28℃培养24小时；将培养好的菌体转入麦芽液体管中，于28℃培养24小时；将培养好的菌液全部倒入离心管中，3000r/min离心10分钟，弃去上清液；重复操作三次；将沉淀酵母泥涂于生孢子的培养基，于25℃培养3～5天。

上述实验所用培养基如下：

A.YEPD培养基(37℃)

YEPD液体培养基：酵母浸膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，自然pH麦芽汁液体培养基

麦芽汁液体培养基将麦芽汁调至10波美度的糖度，调pH至5.4；过滤后分装于试管，每管4ml；112℃，20分钟灭菌。加2％琼脂即为固体培养基。

B.McClary培养基(子囊孢子)

葡萄糖0.1％，氯化钾0.18％，酵母汁0.25％，醋酸钠0.82％，琼脂2％，用蒸馏水配，装入试管。112℃，15分钟灭菌。

C.Gorodkowa培养基(子囊孢子)

葡萄糖0.1％，蛋白胨1％，12％氯化钠，水洗琼脂2％，蒸馏水配，装入试管；112℃，20分钟灭菌。

D.PDA(假丝观察)

马铃薯去皮200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1L。将马铃薯洗净去皮，切成长条斜面，放入水中，以免被氧化。煮沸30分钟，经纱布过滤，滤液加水至1L，加入葡萄糖和琼脂，熔解后分装三角瓶或试管，112℃，20分钟灭菌。

E.糖发酵基础培养基

12.5％豆芽汁：黄豆芽125克加水1L，煮沸半小时，过滤后补足水至1L。112℃，30分钟灭菌。

F.产生类淀粉化合物培养基

硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，7水硫酸镁0.05％，葡萄糖1％，水洗琼脂2.5％，用蒸馏水配，pH4.5，分装于小试管，112℃，20分钟灭菌。搁置斜面。

G.产酯培养基

葡萄糖5％，用10％豆芽汁配制，分装于50ml三角瓶中，每瓶20ml，112℃，20分钟灭菌。

H.无维生素基础培养基

硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.1％，7水硫酸镁0.05％，葡萄糖2％，氯化钠0.01％，二水氯化钙0.01％，加蒸馏水100ml，分装试管，每管5ml，112℃，20分钟灭菌。

I.尿素分解测定培养基

蛋白胨0.1g，氯化钠0.5g，磷酸二氢钾0.2g，加0.0012g酚红于100ml蒸馏水中，调节pH6.8，加琼脂2g，分装试管，每管装2.7ml，灭菌后，再每管加入0.3ml经过滤灭菌的20％尿素溶液，混合后搁置斜面。

J.高渗透压培养基

称取50g和60g葡萄糖，分别加入50ml和40ml，于1％的酵母膏溶液中，加3％的琼脂熔化后，分装试管，每管3～5ml，灭菌后搁置斜面。

K.同化氮源基础培养基

葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.1％，7水硫酸镁0.05％，酵母膏0.02％，水洗琼脂2％，加蒸馏水100ml，过滤后分装试管，每管20ml，112℃，15分钟灭菌。

L.石蕊牛奶培养基

取新鲜奶粉1L加入2.5％石蕊水溶液4ml。分装试管，间歇灭菌3次，或112℃灭菌15分钟。

M.酵母碳源同化作用培养基YNB(0.67％酵母氮碱基，2％葡萄糖，3％琼脂，pH6.2。另一配方为：葡萄糖10g(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.125g，KHPO₄ 0.875g，KI 0.0001g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，维量元素母液1mL，维生素母液1mL(母液均按常规配制)，水1000mL，pH5.8～6.0。)

Xlc6的生理生化特性如表3所示，根据形态特征和生理特征，沿树枝形检索表(酵母菌的特征与鉴定手册，【英】J.A.巴尼特&R.W.佩恩著)鉴定xlc6为东方伊萨酵母，结合分子生物学鉴定结果，确定xlc6为伊萨酵母属东方伊萨酵母种，但是已知的东方伊萨酵母中并没有能进行柠檬酸-乙醇发酵的菌株，因此，确定xlc6为东方伊萨酵母的亚种或变种。

                             表3  xlc6的生理生化特性

实验	项目	结果	项目	结果
					发酵糖类试验	葡萄糖	+	乳糖	-
麦芽糖	-	D-半乳糖	-
				蔗糖		-	棉子糖	-
同化实验	硝酸钾	-	D-甘露糖						+
				硫酸铵	+	L-鼠李糖	-
	乳糖		L-***糖					-
				D-木糖	+	乳酸	+
	D-半乳糖	+/-	甘油					+
				蔗糖	+/-	柠檬酸	+/-
	麦芽糖	+/-	琥珀酸					-
				棉子糖	+/-	可溶性淀粉	+/-
	山梨醇	+/-	D-核糖					-
				葡萄糖	+/-	甘露醇	-
	其他实验	维生素培养	+					类淀粉	-
产酯测定				+	高渗透压(50％)	+
		尿素酶测试	-				高渗透压(60％)	+
37℃生长				+	石蕊牛奶	-

                     注：+  阳性，-  阴性，+/-  表现不确定

下面将通过实验来证明xlc6具有降解柠檬酸的能力以及用于杨梅果酒酿造的优点。

将xlc6接种到装有降酸培养基中培养(接种量为10⁹cfu/mL，25℃)，测定培养基中总酸的变化(以柠檬酸计)，结果见表4，xlc6在7天内把降酸培养基内的总酸含量从18.6g/L降解到1.20g/L，降酸总量高达93％。将xlc6经耐6％酒精驯化后，接种于杨梅果汁中培养(接种量为10⁹cfu/mL，25℃)，测定果汁中总酸的变化(以柠檬酸计)，结果见表5，xlc6在11天内将果汁中总酸量由9.5g/L降到4.8g/L，降酸总量达50％，可见，xlc6具有很强的降解柠檬酸的能力。

                                   表4  含xlc6降酸培养基总酸含量的变化

时间/d	0	1	2	3	4	5	6	7	8
										总酸含量/(g/L)	18.6	14.3	11.1	5.20	2.20	1.40	1.30	1.20	1.20

 表5  耐6％酒精xlc6酵母在一批杨梅汁中降酸的情况

时间/d	pH值	总酸(以柠檬酸计)/(g/L)
			1	3.11	9.5
3	3.15	8.9
			5	3.18	7.8
7	3.19	7.5
			9	3.22	6.5
10	3.26	5.7
			11	3.30	4.8

附图说明

图1是以裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(S.pombe)为外类群，xlc6与选取的49个菌种作的进化树。

生物材料样品保藏

东方伊萨酵母，保藏日期：2007年1月15日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO.M207003。

具体实施方式

下面将通过实施例来进一步阐述本发明及其效果。

例1

1、原料的选择：

澄清杨梅原汁：以浙江宁波荸荠种杨梅果为原料，经榨汁、酶解和净化处理获取澄清杨梅原汁(可溶性固形物96g/L，总酸9.5g/L，pH2.9)。

酿酒酵母为安琪活性干酵母。

2、本发明方法杨梅果酒的酿造：

(1)将酿酒酵母用3％的蔗糖溶液37℃活化30min，与灭菌冷却后的3％海藻酸钠混合，注入3％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球，静置30min时后用无菌水洗涤；

(2)以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为25％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母0.5％，于25℃进行发酵，发酵至醪液中总糖3.5g/L，膜过滤，取滤液，得酒基A；

(3)将xlc6经耐8％酒精驯化后，接种于澄清杨梅原汁中，接种量为10⁹cfu/mL，25℃，发酵至杨梅原汁中总酸5g/L结束，得降酸原汁，然后以降酸原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为25％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母0.5％进行发酵，发酵至醪液中总糖3.5g/L，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基B；

(4)将酒基A和酒基B按1∶2勾兑，即可。

3、所得一批杨梅果酒的理化指标见表4。

                  表4  本发明方法酿造的一批杨梅果酒的各项指标

理化指标
		酒精度％(v/v)	10.7
Hunter色度值	L＝34.18，a＝22.13，b＝12.99
		pH	3.3～3.5
吸光度A(λmax520nm)	1.5
		总酚mg/L	600～800
总糖g/L	1.2
		总酸g/L(以柠檬酸计)	7.8
挥发酸g/L(以乙酸计)	0.48
		干浸出物g/L	17.2
总二氧化硫mg/L	7.9
		游离二氧化硫mg/L	2.6
铝(Al)mg/L	61
		铁(Fe)mg/L	2.9
铅(Pb)mg/L	小于0.3
		微生物指标
细菌总数(cfu/mL)	23
		大肠菌群(MPN/100mL)	小于3
沙门氏菌属、志贺氏菌属、金萄菌属	未检出
		感官特性
外观(色泽、澄清度)	***到棕红色，澄清透明，有光泽，无明显悬浮物(使用软木塞封口的酒允许有3个以下不大于1mm的软木渣)
		香气和滋味	具有爽怡、柔和的口味和新鲜悦人的原果香味，酒体完整，酸感合适。

4、例1所述方法酿造的杨梅果酒与传统方法酿造杨梅果酒比较如下：

传统方法酿造杨梅果酒

1)原料：澄清杨梅原汁：以浙江宁波荸荠种杨梅果为原料，经榨汁、酶解和净化处理获取澄清杨梅原汁(可溶性固形物96g/L，总酸9.5g/L，pH2.9)。

酿酒酵母为安琪活性干酵母。

2)方法：

将酿酒酵母用3％的蔗糖溶液37℃活化30min；以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为25％，接种活化好的酿酒酵母0.5％，于25℃进行发酵，发酵至醪液中总糖4g/L，得新酒，膜过滤；在滤液加入1.0g/L的CaCO₃，搅拌均匀，静置2d，待酒汁中总酸6g/L，则用醋酸纤维膜过滤，即得降酸果酒。

3)结果：

采用传统游离细胞发酵、酸碱中和降酸法生产的一批杨梅果酒指标如表5。

                  表5  传统方法酿造的一批杨梅果酒的各项指标

理化指标
		酒精度％(v/v)	11.2
Hunter色度值	L＝45.5，a＝19.95.13，b＝18.11
		pH	3.4～3.6
吸光度A(λmax520nm)	0.8
		总酚mg/L	350～600
总糖g/L	1.0
		总酸g/L(以柠檬酸计)	5.2
挥发酸g/L(以乙酸计)	0.41
		干浸出物g/L	16.9
总二氧化硫mg/L	7.8
		游离二氧化硫mg/L	2.5
铁(Fe)mg/L	2.9
		铅(Pb)mg/L	小于0.3
微生物指标
		细菌总数(cfu/mL)	21
大肠菌群(MPN/100mL)	小于3
		沙门氏菌属、志贺氏菌属、金萄菌属	未检出
感官特性
		外观(色泽、澄清度)	浅红色到浅棕红色，澄清透明，有一定光泽，无明显悬浮物(使用软木塞封口的酒允许有3个以下不大于1mm的软木渣)
香气和滋味	原果香味较淡，酒精味偏大，整体酸味偏弱，酸感不足，口感清淡。

从表4和5可以看出，本发明方法利用xlc6将杨梅果汁中的柠檬酸发酵为乙醇，不需要添加任何化学降酸剂就可以达到降酸的目的，采用固定化技术结合生物降酸方法酿造的杨梅果酒风味物质总酚损失少，且色、香、味各方面都优于传统方法酿造的杨梅果酒。

例2

1、原料的选择：

澄清杨梅原汁：以浙江宁波荸荠种杨梅果为原料，经榨汁、酶解和净化处理获取澄清杨梅原汁(可溶性固形物90g/L，总酸13.5g/L，pH2.7)。

酿酒酵母为安琪活性干酵母。

2、本发明方法杨梅果酒的酿造：

(1)将酿酒酵母用1％的蔗糖溶液37℃活化40min，与灭菌冷却后的0.5％海藻酸钠混合，注入1％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球，静置60min时后用无菌水洗涤；

(2)以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为25％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母2％，于10℃进行发酵，发酵至醪液中总糖2g/L，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基A；

(3)将xlc6经耐2％酒精驯化后，接种于澄清杨梅原汁中，接种量为10⁹cfu/mL，25℃，发酵至杨梅原汁中总酸6g/L，得降酸原汁，然后以降酸原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为28％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母2％进行发酵，发酵至醪液中总糖2g/L结束，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基B；

(4)将酒基A和酒基B按1∶1勾兑。

例3

1、原料的选择：

澄清杨梅原汁：以浙江宁波荸荠种杨梅果为原料，经榨汁、酶解和净化处理获取澄清杨梅原汁(可溶性固形物110g/L，总酸8.5g/L，pH3.2)。

酿酒酵母为安琪活性干酵母。

2、本发明方法杨梅果酒的酿造：

(1)将酿酒酵母用6％的蔗糖溶液37℃活化30min，与灭菌冷却后的6％海藻酸钠混合，注入10％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球，静置30min时后用无菌水洗涤；

(2)以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为28％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母0.1％，于10℃进行发酵，发酵至醪液中总糖5g/L，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基A；

(3)将xlc6经耐12％酒精驯化后，接种于澄清杨梅原汁中，接种量为10⁶cfu/mL，15℃，发酵至杨梅原汁中总酸1g/L结束，得降酸原汁，然后以降酸原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为18％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母2％进行发酵，发酵至醪液中总糖12g/L，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基B；

(4)将酒基A和酒基B按1∶5勾兑，即可。

例4

1、原料的选择：

澄清杨梅原汁：以浙江宁波荸荠种杨梅果为原料，经榨汁、酶解和净化处理获取澄清杨梅原汁(可溶性固形物100g/L，总酸10g/L，pH3)。

酿酒酵母为安琪活性干酵母。

2、本发明方法杨梅果酒的酿造：

(1)将酿酒酵母用3％的蔗糖溶液37℃活化30min，与灭菌冷却后的4％海藻酸钠混合，注入7％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球，静置30min时后用无菌水洗涤；

(2)以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为20％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母1％，于20℃进行发酵，发酵至醪液中总糖11g/L，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基A；

(3)将xlc6经耐6％酒精驯化后，接种于澄清杨梅原汁中，接种量为10⁸cfu/mL，20℃，发酵至杨梅原汁中总酸4g/L，得降酸原汁，然后以降酸原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为25％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母1％进行发酵，发酵至醪液中总糖10g/L，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基B；

(4)将酒基A和酒基B按1∶3勾兑，即可。

勾兑所得的杨梅果酒还可以在20℃下进行陈酿1年。

例5

1、原料的选择：

澄清杨梅原汁：以浙江宁波荸荠种杨梅果为原料，经榨汁、酶解和净化处理获取澄清杨梅原汁(可溶性同形物95g/L，总酸11g/L，pH3)。

酿酒酵母为安琪活性干酵母。

2、本发明方法杨梅果酒的酿造：

(1)将酿酒酵母用5％的蔗糖溶液37℃活化30min，与灭菌冷却后的3％海藻酸钠混合，注入10％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球，静置30min时后用无菌水洗涤；

(2)以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为26％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母2％，于25℃进行发酵，发酵至醪液中总糖8g/L，，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基A；

(3)将xlc6经耐8％酒精驯化后，接种于澄清杨梅原汁中，接种量为10⁹cfu/mL，18℃，发酵至杨梅原汁中总酸0.5g/L结束，得降酸原汁，然后以降酸原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为20％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母2％进行发酵，发酵至醪液中总糖8g/L，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基B；

(4)将酒基A和酒基B按1∶4勾兑，即可。

勾兑所得的杨梅果酒还可以在5℃下进行陈酿1年半。

例6

1、原料的选择：

澄清杨梅原汁：以浙江宁波荸荠种杨梅果为原料，经榨汁、酶解和净化处理获取澄清杨梅原汁(可溶性固形物95g/L，总酸11g/L，pH3)。

酿酒酵母为安琪活性干酵母。

2、本发明方法杨梅果酒的酿造：

(1)将酿酒酵母用5％的蔗糖溶液37℃活化30min，与灭菌冷却后的3％海藻酸钠混合，注入10％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球，静置30min时后用无菌水洗涤；

(2)以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为26％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母2％，于25℃进行发酵，发酵至醪液中总糖0g/L，，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基A；

(3)将xlc6经耐8％酒精驯化后，接种于澄清杨梅原汁中，接种量为10⁹cfu/mL，18℃，发酵至杨梅原汁中总酸0.5g/L结束，得降酸原汁，然后以降酸原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为20％，接种经海藻酸钙/铝同定化的酿酒酵母2％进行发酵，发酵至醪液中总糖8g/L，醋酸纤维膜过滤，取滤液，得酒基B；

(4)将酒基A和酒基B按1∶4勾兑，即可。

勾兑所得的杨梅果酒还可以在5℃下进行陈酿1年半。

<110>韶关学院

<120>一种降酸酵母及其在杨梅果酒酿造中的应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>561

<212>DNA

<213>Issatchenkia orientalis

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(561)

<400>1

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cgg gga ccg agg act gcg gcc gtg tag gtc acg gat gct ggc aga acg    528

gcg caa cac cgc ccg tct tga aac acc gga cca                        561

Claims (4)

1、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)xlc6，CCTCC NO.M 207003。

2、权利要求1所述的xlc6在杨梅果酒的酿造中的应用。

3、根据权利要求2所述的xlc6应用于酿造杨梅果酒的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将酿酒酵母用1～6％的蔗糖溶液37℃活化20～40min，与灭菌冷却后的0.5～6％的海藻酸钠混合后，注入1～10％的氯化钙或氯化铝溶液中，形成凝胶小球，静置20～60min后用无菌水洗涤；

(2)以澄清杨梅原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为18～28％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母0.1～2％，于10～30℃进行发酵，发酵至醪液中总糖0～12g/L，膜过滤，取滤液，得酒基A；

(3)将xlc6经耐2～12％酒精驯化后，接种于澄清杨梅原汁中，接种量为10⁶～10⁹cfu/mL，15～25℃发酵至杨梅原汁中总酸0～6g/L，得降酸原汁，然后以降酸原汁为发酵基料，用糖调整可溶性固形物含量为18～28％，接种经海藻酸钙/铝固定化的酿酒酵母0.1～2％进行发酵，发酵至醪液中总糖0～12g/L，膜过滤，取滤液，得酒基B；

(4)将酒基A和酒基B按1∶1～5勾兑，即可。

4、根据权利要求3所述的xlc6应用于酿造杨梅果酒的方法，该方法还包括以下步骤：勾兑所得的杨梅果还可以在5～20℃下进行陈酿1年或1年以上。