CN101062015A - 抗幽门螺杆菌感染的尿素酶表位融合肽脂质体疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗幽门螺杆菌感染的尿素酶表位融合肽脂质体疫苗。该疫苗以幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位的融合肽为免疫原,用脂质体包被该免疫原制备脂质体疫苗。该脂质体疫苗可以诱导机体产生特异性免疫反应,抑制幽门螺杆菌在胃内的定植,同时可明显降低已在胃内定植的幽门螺杆菌的菌量。在生物医学领域,本发明提供的疫苗可以用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及霍乱毒素B亚单(CTB)位与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位(UreB)表位融合肽(CtUBE)表达质粒的构建、转化、表达、纯化及CtUBE脂质体疫苗的制备,提供了一种抗幽门螺杆菌感染的预防与治疗性疫苗。
背景技术
幽门螺杆菌是引起胃炎、消化道溃疡及胃癌等疾病的主要病因,所有临床分离的幽门螺杆菌菌株均表达尿素酶,而且同时高度保守。尿素酶可以分解尿素产生氨气,中和胃酸,为幽门螺杆菌的定植提供有利环境。由于尿素酶的这些特点,使其成为抗幽门螺杆菌疫苗研制中候选抗原的热点。但有研究表明,用完整的尿素酶免疫动物并不能很好的抑制尿素酶的活性,因而不能完全阻止幽门螺杆菌在胃内的定植(Infect Immun 1992,60:4826-31)。进一步研究表明,完整的尿素酶可以刺激机体产生两种单克隆抗体,其中一种为可以促进尿素酶活性的构象表位特异性抗体,另一种为B亚单位上的线性表位特异性抗体,线性表位特异性抗体可以抑制构象表位特异性抗体对尿素酶活性的促进作用(Infect Immun 2001,69:6597-603;Biomedical Research 2005,26:35-42)。已经有大量实验表明,尿素酶B亚单位(UreB)不仅对幽门螺杆菌感染具有预防作用,而且还可以在一定程度上清除体内已经感染的幽门螺杆菌。这些结果提示,如果用尿素酶B亚单位的表位刺激机体免疫***,可以避免产生构象表位特异性抗体,从而增强以尿素酶为免疫原所刺激的免疫反应对幽门螺杆菌感染的抑制和清除效果。
霍乱毒素(CT)是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,由1个28kDa的A亚基(CTA)和5个完全相同的11.6kDa的B亚基(CTB)组成,形成AB结构。其中CTA具有ADP-核糖基转移酶活性,为CT的毒性亚基;CTB可与大多数哺乳动物细胞表面的神经节苷脂GM1特异性结合,为CT的无毒性亚基,每个CTB与GM1都有很高的亲和力,5个CTB彼此以非共价键结合形成五聚体,充当CTA与受体细胞之间的桥梁。CTB与GM1结合后,将CTA转移到受体细胞膜上或胞浆内,从而激活G蛋白,活化的G蛋白又激活腺苷酸环化酶,导致细胞内cAMP浓度升高,最终引起腹泻。由于CTB为CT的无毒性亚单位及其特异性结合GM1活性,因而被用作黏膜免疫佐剂受到了广泛的研究。大量的动物实验结果表明,CTB是一种很好的黏膜免疫佐剂和弱免疫原的载体,同时还可以赋予半抗原免疫原性,增强弱免疫原的免疫原性。
脂质体为一种生物膜双分子层囊性微球,由水相中脂质双层疏水区的脂肪链通过疏水键相互聚集自行收缩排列而形成,在其形成过程中可包裹水溶性成分获得颗粒形态,被包裹的内容物可以受到脂质体膜的保护。水溶性抗原包被于脂质体中可借助脂质体的传递被直接送达抗原提呈细胞的胞质中,脂质体膜基质及附加的修饰成分还可以直接活化免疫细胞的信号传递***。在脂质体膜的保护下,抗原分子可以不受体液成分的破坏,脂质体类疫苗可用于多种黏膜途径的免疫接种。通过选择脂质体膜基质组分及对脂质体膜加以修饰,还可以选择所诱导的免疫反应的类型。***树突状细胞和组织巨噬细胞都能够吞噬脂质体,在这些细胞内抗原经过加工表达于I型主要组织相容性分子(MHC I),激发免疫反应,诱导特异性T细胞和细胞毒性T细胞免疫。因而,脂质体被广泛用作疫苗的传递载体和免疫佐剂。
在幽门螺杆菌感染的预防与治疗研究中,发展了各种动物模型,利用这些动物模型,可以揭示幽门螺杆菌在许多相关性疾病发生、发展和转归中的作用,以及对幽门螺杆菌疫苗的预防和保护效果的评价。小鼠体型小、易繁殖、来源便利、属系多样是作为动物模型的好材料。通过大量的实验研究,已经成功地在小鼠体内建立了胃炎和十二指肠炎模型,此模型炎症部位同人类相似,被广泛应用于抗幽门螺杆菌疫苗的研究。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种抗幽门螺杆菌感染的尿素酶表位融合肽脂质体疫苗。
本发明的另一个目的是提供该脂质体疫苗的制备方法。
本发明的第三个目的是提供幽门螺杆尿素酶B亚单位与黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位融合肽的制备方法(包括融合肽的基因克隆与工程菌的构造、表达及表达产物的纯化)。
本发明的最后一个目的是公开该质体疫苗的用途。
用CTB的融合肽进行疫苗研究已经有不少报道,但多数是将CTB与一完整的蛋白或亚基融合。本发明将CTB的编码序列与幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)表位(CHHLDKSIKEDVQFADSRI)的编码序列连接,克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a,构建了新的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)表位与CTB的融合肽(CtUBE)表达质粒(pET-CtUBE)。通过热激法将质粒pET-CtUBE转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,进行诱导表达,对表达、分离、复性及纯化条件进行摸索,建立了融合肽在大肠杆菌中表达、分离、复性及纯化的体系。通过逆相蒸发法制备融合肽CtUBE脂质体,对影响脂质体包封率的主要因素进行优化试验,建立了融合肽CtUBE脂质体疫苗的制备方法。利用BALB/c小鼠模型对此脂质体疫苗的预防与治疗效果进行评价,结果表明融合肽CtUBE脂质全疫苗在不需要加入佐剂的情况下即可以有效诱导机体免疫反应,产生特异性抗UreB血清IgG和黏膜IgA抗体,预防幽门螺杆菌在BALB/c小鼠胃内的定植,明显降低被感染小鼠胃内细菌量,促进胃组织损伤的愈合。动物实验结果证明新型融合肽CtUBE脂质体疫苗对H.pylori的感染具有明显的预防与治疗作用。
附图说明
图1:ctb基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图(1:DL2000 DNA Marker;2,3:ctb基因PCR扩增产物;4.阴性对照)。
图2:融合肽表达质粒pET-CtUBE结构图(ctb编码序列***在NcoI和EcoRI位点之间,UreB表位编码序列UB-33***在EcoRI和XhoI位点之间)。
图3:融合肽表达质粒pET-CtUBE测序图(3个实线框分别标出XhoI、EcoRI和NcoI酶切位点,虚线框标出表位编码序列,下划线部分为ctb基因序列)。
图4:融合肽CtUBE的表达分析(12%SDS-PAGE;1-4:分别为在1mM IPTG诱导5h、4h、3h和2h后的表达情况;5:蛋白质分子量Marker;6:未经诱导的工程菌)。
图5:融合肽CtUBE纯化后的SDS-PAGE分析(1:经Wash Buffer洗涤后的CtUBE包涵体;2:DEAE Sepharose FF柱纯化后的CtUBE;3:蛋白质分子量Marker)。
图6:复性纯化后CtUBE的ELISA分析。
图7:负染后CtUBE脂质体的透射电镜照片。
图8:特异性血清IgG和黏膜IgA滴度测定结果。
图9:快速尿素酶测验(RUT)、细菌培养试验及胃炎组织病理学评分结果。
图10:胃炎组织病理切片图(HE染色,100X;A为PBS对照组小鼠感染幽门螺杆菌后的胃组织切片,B为CtUBE脂质体疫苗预防免疫后受到保护的胃组织切片,C为CtUBE脂质体疫苗治疗接种后的未完全愈合的胃组织切片)。
图8和9中Liposome+CtUBE表示CtUBE脂质体免疫组;Liposome表示空白脂质体组;PBS表示PBS对照组;Uninfected表示无免疫无细菌侵染组。
具体实施方式
材料
(1)菌株与质粒
大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),Escherichia coli DH5α为本实验室保存。
质粒pET28a购自Novagen公司。
(2)动物
无特殊病原菌(SPF)级雌性BALB/c小鼠,5周龄,重16-20g,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号:SCXK(沪)2003-0003。
(3)工具酶
Taq DNA聚合酶购自上海赛百胜基因技术有限公司;限制酶NcoI、EcoRI、XhoI及DNA连接酶购自MBI Fermentas公司;溶菌酶购自上海生工,DNase I购自华美生物工程公司。
(4)其它主要试材
3、3′、5、5′-四甲基联苯胺(TMB)、神经节苷脂GM1、弗氏完全和不完全佐剂购自美国Sigma公司;辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗购自北京博奥森公司;DEAE Sepharose FF购自Whatman公司;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工;考马斯亮兰检测试剂盒购自南京建成生物工程公司。
(5)主要缓冲溶液
裂解液:1mg/ml溶菌酶、1mmol/L EDTA、50mmol/L NaCl、50mmol/L Tris,pH 8.0;
Wash Buffer:50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.5%Triton X-100,pH8.0;
包涵体溶解缓冲液:50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.1mmol/L PMSF、8mol/L脲;
Renaturation Buffer:50mmol/L Tris-HCl,50mmol/L NaCl,50mmol/L甘氨酸,5%甘油,3mmol/L半胱氨酸,0.4mmol/L胱氨酸;
平衡缓冲液:30mmol/L Tris-HCl,pH9.0;
PBS:8mM Na2HPO4,4.5mM KH2PO4,137mM NaCl,2.6mM KCl,pH8.04。
实施例1 融合肽CtUBE表达载体的构建
(1)设计合成PCR引物,同时引入NcoI和EcoRI位点:
PCTB01:5′-AAAAA
CCATGGGCACACCTCAAAATATTACTGATTTG-3′,
PCTB02:5′-AA
GAATTCGCCGCCATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGCAT-3′;
(2)以霍乱弧菌基因组DNA为模板,通过PCR方法(94℃预变性3min;94℃ 45s,56℃ 50s,72℃ 50s,40循环;72℃延伸10min)扩增CTB编码序列(附图1);
(3)PCR产物用NcoI和EcoRI双酶切后克隆至pET-28a的多克隆位点,获得中间载体pET-CtUBE-Pre,中间载体转化Escherichia coli DH5α进行扩增;
(4)合成UreB表位编码序列,同时引入EciRI和XhoI位点:
UBP1:5′-
AATTCTGCCACCACTTGGATAAAAGCATTAAAGAAGATGTTCAGTTCGCTGATTCAAGGATCTAATAA
C-3′;
UBP2:5′
TCGAGTTATTAGATCCTTGAATCAGCGAACTGAACATCTTCTTTAATGCTTTTATCCAAGTGGTGGCA
G-3′;
(5)UBP1和UBP2混合退火(94℃ 2min,56 5min)后,克隆到中间载体pET-CtUBE-Pre的EcoRI和XhoI位点,获得融合蛋白表达载体pET-CtUBE(附图2);
(6)质粒pET-CtUBE转化E.coli BL21(DE3),用含Kan(70mg/L)的LB平板筛选阳性克隆,对阳性克隆进行PCR鉴定,PCR阳性转化子进行测序确证(附图3)。
结果表明,融合肽编码序列***位点、拼接顺序及编码碱基均与设计相符,克隆的ctb基因序列通过BLAST比较分析,与GENBANK中的ctb基因序列同源性在98%以上。
实施例2 融合肽CtUBE表达、分离、复性及纯化体系的建立
(1)将测序正确的阳性转化子转接入LB培养基,1mM IPTG诱导表达(附图4),经12%SDS-PAGE分析融合蛋白表达形式,同时用电子扫描分析表达量;
(2)融合肽以包涵体形式表达,扩大表达培养后,用含溶菌酶的裂解液裂解细菌细胞,离心收集包涵体;
(3)包涵体用Wash Buffer洗涤5次后,用包涵体溶解缓冲液溶解,并缓缓加入约10倍体积的Renaturation Buffer,转入4℃复性48小时以上;
(4)复性好的融合蛋白经平衡缓冲液充分透析后,上DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱纯化,并进行SDS-PAGE分析纯度;
(5)用5μg/ml神经节苷脂GM1包被96孔板,ELISA方法分析融合蛋白与神经节苷脂GM1及抗UreB血清的识别结合活性(附图5)。
结果表明,转化菌在1mM IPTG诱导4h时,融合肽表达量占菌体总蛋白34.7%(附图4);溶菌酶裂解细胞,分离收集的包涵体经Wash Buffer洗涤后纯度可达91.9%,经一次阴离子交换层析后,纯度可达95.6%(附图5);ELISA分析CtUBE可与GM1结合,同时也可被抗UreB血清识别(附图6)。
实施例3 融合肽CtUBE脂质体疫苗的制备
(1)在茄形瓶中分别加入0.314g卵磷脂和0.126g胆固醇,并加入6ml氯仿使卵磷脂和胆固醇溶解混匀;
(2)旋转蒸发仪上蒸干氯仿,加入2.26ml氯仿和3.74ml***,溶解卵磷脂和胆固醇薄膜;
(3)加入2ml 1mg/ml的CtUBE溶液(溶解于pH8.04的PBS),冰浴超声4min;
(4)旋转蒸发仪上减压至0.05MPa左右,在37℃下蒸发除尽有机溶剂;
(5)向茄形瓶中加入10ml PBS(pH8.04)高速旋转3-4h,得到淡乳黄色脂质体混悬液;
(6)依次用1.0μm、0.8μm和0.4μm微孔滤膜调节脂质体粒径;
(7)取脂质体混悬液1ml加入1.5ml离心管,4℃ 40000×g离心1h;
(8)吸出上清后加入pH8.04的PBS缓冲液600μl,混匀后于4℃ 40000×g继续离心1h,吸出上清,同法继续清洗脂质体1次;
(9)将上清液合并为一管,用考马斯亮兰检测试剂盒测定上清液中总蛋白含量;
(10)按以下计算公式计算包封率:包封率(Qw%)=(加入总蛋白量-上清中蛋白量)/加入总蛋白量×100%;
(11)取少量脂质体,负染后用电镜观测脂质体的形状及粒径;
(12)脂质体存于4℃存放30天,观察稳定性,检测包封率,确定其渗滤情况。
结果表明,制备的脂质体淡黄色,无沉淀及团聚颗粒,分散均匀,无沉降无分层;包封率71.4%,粒径分布在100-500nm(附图7),球形或楕球形;4℃存放30天后,脂质体无明显变化,检测包封率为68.6%,表明低温下存放稳定。
实施例4 融合肽CtUBE脂质体疫苗的药效学研究
SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为7组(n=14),3组小鼠实行方案1(预防方案,1组为免疫组,另2组分别为空白脂质体对照和PBS对照组),3组小鼠实行方案2(治疗方案,1组为免疫组,另2组分别为空白脂质体对照和PBS对照组),1组小鼠用作空白对照(无免疫接种和感染接种)。
方案1(预防方案):
1.禁食12h后,在免疫组每只小鼠灌喂0.2ml CtUBE脂质体疫苗(约40μg CtUBE),PBS对照组和空白脂质体对照组则分别灌喂0.2ml PBS或空白脂质体,灌胃后继续禁食3h;
2.1周后,再次以等量的CtUBE脂质体疫苗、PBS或空白脂质体灌喂各对应组小鼠,同法在每隔1周后进行灌喂,共灌喂4次;
3.第4次灌胃2周后,各组每只小鼠用0.3ml新鲜培养的H.pylori SS1(悬浮于0.2MNaHCO3溶液中,细菌浓度约1×108CFUs/ml)灌胃接种;
4.细菌接种每隔3天进行1次,共接种4次,接种后小鼠继续饲养3周后,进行方案3(检测方案)。
方案2(治疗方案):
1.禁食12h后,各组每只小鼠用0.3ml新鲜培养的H.pylori SS1(悬浮于0.2M NaHCO3溶液中,细菌浓度约1×108CFUs/ml)灌胃接种,灌胃后继续禁食3h;
2.细菌接种每隔3天进行1次,共接种4次;
3.第4次灌胃接种细菌2周后,进行免疫接种:免疫组每只小鼠灌喂0.2ml CtUBE脂质体疫苗(约40μg CtUBE),PBS对照组和空白脂质体对照组则分别灌喂0.2ml PBS或空白脂质体;
4.1周后,再次以等量的CtUBE脂质体疫苗、PBS或空白脂质体灌喂各对应组小鼠,同法在每隔1周后进行灌胃,免疫接种共4次;
5.第4次免疫接种完成后,小鼠继续饲养3周,进行方案3(检测方案)。
方案3(检测方案):
1.IgG检测:处死小鼠,收集血清,用ELISA方法检测血清抗UreB特异性抗体IgG滴度(滴度表示为OD450nm值高于对照0.4时血清的稀释倍数,附图8);
2.IgA检测:取出胃体,沿小弯处剪开,并将胃组织纵向均分为3份,其中1份连同胃内容物转入1.5ml离心管,加入0.3ml Extraction Buffer,离心后取上清用ELlSA方法检测黏膜抗UreB特异性抗体IgA滴度(滴度表示为OD450nm值高于对照0.2时提取液的稀释倍数,附图8);
3.快速尿素酶检测(RUT):取1份胃组织,称重后加入0.5ml生理盐水,匀浆后取0.25ml匀浆液加入3ml含有酚红的尿素肉汤,37℃培养4h后,测OD550nm值,若测得OD550nm值高于空白对照平均值2倍时,判断为幽门螺杆菌感染(附图9);
4.细菌培养试验:取胃组织匀浆液进行倍比稀释,铺BHI琼脂平板(含TMB,多粘菌素和万古霉素),于微需氧环境下37℃培养4-5天,对菌落克隆(半透明浅灰色菌落)进行计数(附图9),并对细菌进行形态学观察和生化反应检测(氧化酶、过氧化氢酶等)。
5.组织病理学检测:取1份胃组织,经甲醛固定石蜡包埋后,于光镜下HE染色观察痰症程度(附图10),并对胃炎进行组织病理学评分(附图9)。评分标准如下:0分-无明显可见白细胞(淋巴细胞和中性粒细胞)浸润;1分在胃粘膜固有层深部有少许散在白细胞浸润;2分-在胃粘膜深部至中部固有层有中等程度白细胞浸润;3分-在胃粘膜深部至中部固有层有大量白细胞浸润,少量微脓肿;4分-在胃粘膜固有层全层至黏膜下层有严重的弥散性白细胞浸润,微脓肿较多。
结果显示:
1.对比PBS对照组:CtUBE脂质体疫苗预防组小鼠血清抗UreB特异性IgG和黏膜抗UreB特异性IgA均有极显著增加(p<0.001);空白脂质体组与PBS组的血清抗UreB特异性IgG和黏膜抗UreB特异性IgA无显著差异(p值分别为0.499和0.122;附图8A、C)。
2.对比PBS对照组:CtUBE脂质体疫苗治疗组小鼠血清抗UreB特异性IgG有显著增加(p=0.001<0.01),而黏膜抗UreB特异性IgA有极显著增加(p<0.001);空白脂质体组与PBS组的血清抗UreB特异性IgG和黏膜抗UreB特异性IgA无显著差异(p值分别为0.390和0.244;附图8B、D)。
3.对比PBS对照组:CtUBE脂质体疫苗预防组小鼠的RUT、胃内细菌定植量及胃炎组组织病理评分均具有极显著差异(p<0.001);空白脂质体组小鼠的RUT、胃内细菌定植量及胃炎组组织病理评分无差异(p值分别为0.954、0.631和0.470;附图9A、C、E)。
4.对比PBS对照组:CtUBE脂质体疫苗治疗组小鼠的RUT、胃内细菌定植量及胃炎组组织病理评分均具有极显著差异(p<0.001);空白脂质体组小鼠的RUT、胃内细菌定植量及胃炎组组织病理评分无差异(p值分别为0.764、0.198和0.828;附图9B、D、F)。
5.对比PBS对照组:CtUBE脂质体疫苗预防组小鼠胃受到明显保护,胃组织切片经显微观察很少有炎细胞侵润,CtUBE脂质体疫苗治疗组小鼠胃的炎性损伤有不同程度的愈合,炎细胞侵润程度与PBS级相比有明显好转(附图10)。
结果说明:
1.用CtUBE脂质体疫苗免疫小鼠,无论是预防接种还是治疗接种,均可明显增加血清抗UreB特异性IgG和黏膜抗UreB特异性IgA的分泌。
2.用CtUBE脂质体疫苗免疫小鼠,预防接种后可明显抑制H.pylori在小鼠胃内的定植,治疗接种后,可明显降低胃内菌量,促进胃损伤愈合,表明融合肽CtUBE脂质体疫苗具有免疫预防和治疗H.pylori感染的作用。
Claims (8)
1.抗幽门螺杆菌感染的尿素酶表位融合肽脂质体疫苗,其特征在于该疫苗是将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位与黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位融合后的融合蛋白包被于脂质体内而形成的载药脂质体。
2.按照权利要求1所述的脂质体疫苗,其特征在于该疫苗使用了幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位与黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位的融合肽作为免疫原,该融合肽结构为幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位连接在黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位的碳未端。
3.按照权利要求1和2所述的脂质体疫苗,其特征在于使用了幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位,该表位的氨基酸序列为CHHLDKSIKEDVQFADSRI。
4.幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位与黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位的融合肽表达质粒,该质粒基于大肠杆菌表达质粒pET-28a构建,融合肽的编码序列***在质粒pET-28a的NcoI和XhoI位点,可以在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内经IPTG诱导后表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位与霍乱毒素B亚单位的融合肽。
5.幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位与黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位的融合肽的制备方法,融合肽表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,并通过IPTG诱导后提取包涵体,经洗涤、复性和DEAE Sepharose FF阴离子交换层析纯化后,可得到纯度为95.6%的融合肽。
6.按照权权利要求4和5所述制备的融合肽,其特征在于可以诱导免疫***产生特异性抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的血清IgG和黏膜IgA抗体,可单独用于疫苗或与药物载体或其它成分组合制成药物组合物,或用于生产出能够有效地防止幽门螺杆菌附着的抗体药物。
7.抗幽门螺杆菌感染的尿素酶表位融合肽脂质体疫苗的制备方法,通过逆向蒸发法将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位与黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位的融合肽包被于脂质体,可以获得包封率71.4%,粒径分布在100-500nm,分散均匀的球形或楕球形脂质体。
8.按照权权利要求4、5、6和7制备的脂质体疫苗,其特征在于诱导免疫***产生特异性抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的血清IgG和黏膜IgA抗体,可明显抑制幽门螺杆菌在胃内的定植,还可以明显降低已经在胃内定植的幽门螺杆菌的细菌量,可以用作抗幽门螺杆菌疫苗,或用于生产出能够有效地防止幽门螺杆菌附着的抗体药物。
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---|---|
CN (1) | CN101062015A (zh) |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101863965A (zh) * | 2010-05-21 | 2010-10-20 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 幽门螺杆菌尿素酶b抗原表位多肽及其应用 |
CN101863963A (zh) * | 2010-05-21 | 2010-10-20 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种幽门螺杆菌抗原表位多肽及其应用 |
CN101955545A (zh) * | 2010-09-07 | 2011-01-26 | 四川大学 | 一种多靶点重组基因及其蛋白在防治幽门螺旋杆菌感染中的应用 |
CN102144974A (zh) * | 2011-04-19 | 2011-08-10 | 四川大学 | 一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的脂质体制剂及制备方法 |
CN102178941A (zh) * | 2011-03-17 | 2011-09-14 | 中国药科大学 | 一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法 |
CN102604993A (zh) * | 2012-01-10 | 2012-07-25 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法 |
CN101703240B (zh) * | 2009-10-30 | 2012-12-12 | 北京工商大学 | 一种促肠吸收的纤溶酶载酶脂质体及其制备方法 |
CN105017385A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-11-04 | 吉林大学 | 基于模拟人组胺受体4(hr4)表位的疫苗及其构建方法 |
CN105037499A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-11-11 | 吉林大学 | 利用噬菌体抗体库针对人组胺受体4(hr4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法 |
CN105462997A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-04-06 | 江南大学 | 一种新脲酶辅基基因及其应用 |
CN106421768A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-02-22 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于cd4+t细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗及制备方法 |
CN108057118A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-05-22 | 上海知萌生物医药科技有限公司 | 多重乙肝疫苗及其制备方法 |
US10513543B2 (en) * | 2013-12-06 | 2019-12-24 | Shanghai United Cell Biotechnology Co., Ltd. | Antigen chimera, antigen composition, vaccine, method of preparing the same and cassette thereof |
-
2007
- 2007-05-22 CN CNA2007100224854A patent/CN101062015A/zh active Pending
Cited By (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101703240B (zh) * | 2009-10-30 | 2012-12-12 | 北京工商大学 | 一种促肠吸收的纤溶酶载酶脂质体及其制备方法 |
CN101863963B (zh) * | 2010-05-21 | 2013-03-20 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种幽门螺杆菌抗原表位多肽及其应用 |
CN101863963A (zh) * | 2010-05-21 | 2010-10-20 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种幽门螺杆菌抗原表位多肽及其应用 |
CN101863965B (zh) * | 2010-05-21 | 2012-06-06 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 幽门螺杆菌尿素酶b抗原表位多肽及其应用 |
CN101863965A (zh) * | 2010-05-21 | 2010-10-20 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 幽门螺杆菌尿素酶b抗原表位多肽及其应用 |
CN101955545A (zh) * | 2010-09-07 | 2011-01-26 | 四川大学 | 一种多靶点重组基因及其蛋白在防治幽门螺旋杆菌感染中的应用 |
CN101955545B (zh) * | 2010-09-07 | 2012-07-04 | 四川万可泰生物技术有限责任公司 | 一种多靶点重组基因及其蛋白在防治幽门螺旋杆菌感染中的应用 |
CN102178941A (zh) * | 2011-03-17 | 2011-09-14 | 中国药科大学 | 一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法 |
CN102178941B (zh) * | 2011-03-17 | 2013-02-06 | 中国药科大学 | 一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法 |
CN102144974A (zh) * | 2011-04-19 | 2011-08-10 | 四川大学 | 一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的脂质体制剂及制备方法 |
CN102144974B (zh) * | 2011-04-19 | 2013-07-17 | 四川大学 | 一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的脂质体制剂及制备方法 |
CN102604993B (zh) * | 2012-01-10 | 2013-03-20 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法 |
CN102604993A (zh) * | 2012-01-10 | 2012-07-25 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法 |
US10513543B2 (en) * | 2013-12-06 | 2019-12-24 | Shanghai United Cell Biotechnology Co., Ltd. | Antigen chimera, antigen composition, vaccine, method of preparing the same and cassette thereof |
CN105017385A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-11-04 | 吉林大学 | 基于模拟人组胺受体4(hr4)表位的疫苗及其构建方法 |
CN105037499A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-11-11 | 吉林大学 | 利用噬菌体抗体库针对人组胺受体4(hr4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法 |
CN105017385B (zh) * | 2015-07-02 | 2018-08-03 | 吉林大学 | 基于模拟人组胺受体4(hr4)表位的疫苗及其构建方法 |
CN105462997A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-04-06 | 江南大学 | 一种新脲酶辅基基因及其应用 |
CN106421768A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-02-22 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于cd4+t细胞免疫的幽门螺杆菌多亚单位疫苗及制备方法 |
CN108057118A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-05-22 | 上海知萌生物医药科技有限公司 | 多重乙肝疫苗及其制备方法 |
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