CN101745104B - 含有复合佐剂的结核亚单位疫苗 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种结核亚单位疫苗,其以Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白为疫苗抗原成份,以Al(OH)3和BCG-CpG-DNA(BCG的DNA提取物)为复合佐剂。以Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白为疫苗抗原成份,使疫苗既能预防结核杆菌感染,又能预防已感染结核杆菌的感染者发生结核病,起到预防性治疗的作用。以Al(OH)3和BCG-CpG-DNA为复合佐剂,能有效提高疫苗的免疫效果,促进T细胞增殖,调节Th1/Th2动态平衡,使T细胞免疫向Th1优势应答转化。
Description
技术领域
本申请涉及一种结核亚单位疫苗,该结核疫苗以Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白为抗原成份,以Al(OH)3和BCG-CpG-DNA(来源于BCG的DNA提取物)为复合佐剂。
背景技术
结核病是一种古老却依然严重影响人类健康的传染病,近年来,全球结核病死灰复燃,再次成为全球关注的公共卫生问题和社会问题。世界卫生组织重新将结核病作为重点控制的传染病,并指出,结核病卷土重来的主要原因是大量的结核耐药菌株的出现、艾滋病的流行和结核病在全球公共卫生政策中被忽视。我国是世界第二大结核病高负担国家,人口的大量流动是我国结核病高发的主要因素之一,每年因结核病导致的死亡人数是其他传染病死亡人数之和。目前,我国除了有450万结核病患者,尚有大量结核杆菌潜伏感染者。因此,中国的结核病疫苗研究必须立足于中国特定的国情和感染状况。
由于对结核杆菌有效的抗生素种类不多,且已出现了大量的结核耐药菌株,因此要最终控制并战胜结核病,就必须依赖有效的疫苗。
结核疫苗根据其应用可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。习惯所说的疫苗就是指预防性疫苗,主要起疾病预防作用;治疗性疫苗具有疾病治疗作用,概括地讲是指在已感染结核杆菌的机体内通过疫苗免疫调动宿主的免疫能力,杀伤或抑制入侵及潜伏的结核杆菌(尤其是潜伏感染的细菌),从而起到治疗或辅助化学药物治疗的作用。
卡介苗(BCG)作为目前唯一可用的结核病疫苗,对婴幼儿结核病特别是重型结核病有显著预防效果,但对全人群的总体保护效果不佳,主要体现在两方面:一是BCG有效保护时间短、对成人无保护效果,二是卡介苗仅能预防原发感染,对已感染结核杆菌的人群几无预防作用,故难以控制新结核病例的增长。
所以理想的结核疫苗最好既能预防结核杆菌的感染,又能预防结核杆菌感染者发生结核病,因此,针对BCG上述缺陷,目前结核病疫苗研究正由早期单一寻找优于BCG的替代疫苗,逐渐过渡到针对不同人群的预防需求、研究不同类型的结核病疫苗,主要有如下三个研究方向:
(1)初免疫苗,将作为BCG替代疫苗,预防结核菌原发感染。但限于当前人类对结核病的发病机制和免疫保护机制等尚有很多不明确的地方,BCG替代疫苗的研究多年来并未取得突破性进展,该研究将是个长期过程。
(2)初免-加强疫苗,加强BCG的保护效果或延长BCG的保护时间,提高现行疫苗对成人肺结核的保护效果。
(3)已感染人群用疫苗,预防结核杆菌潜伏感染者发生结核病,或作为活动性结核病的辅助治疗性疫苗。我国有近6亿结核菌感染者,其中10%的人最终会发生结核病,其发病率高、人数庞大。因此,已感染人群用疫苗最有可能在短期内对我国结核病控制产生巨大影响。
因此在结核病疫苗的研究领域,逐步出现了采用不同免疫策略来预防同一病原体所致疾病的不同类型疫苗研究,这在疫苗研究史上绝无仅有,但可能是控制结核病的必经阶段。
从目前所研究的疫苗组成角度讲,结核疫苗根据其种类可分为全菌疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗等:
1)全菌疫苗:包括减毒活疫苗和灭活分枝杆菌疫苗。减毒活疫苗目前研究比较集中的是重组BCG(rBCG)、减毒分枝杆菌疫苗(如营养缺陷株)和其他分枝杆菌载体或病毒载体疫苗。其中,rBCG研究最多,通常是在BCG中表达/过量表达特定抗原,以增强BCG保护效果,以期作为初免疫苗,用以预防结核杆菌的原发感染。其他分枝杆菌载体或病毒载体疫苗,包括以耻垢等分枝杆菌为载体、以腺病毒、痘苗病毒为载体表达具有强免疫原性的结核菌抗原的疫苗,可用于BCG接种后的加强免疫。营养缺陷性MTB等减毒活疫苗,由于存在变异后返祖的可能性,使其研究和应用受到一定制约。灭活分枝杆菌疫苗的安全性好,具有良好的免疫调节作用,可用于潜伏感染者的预防和结核病人的辅助治疗。
2)DNA疫苗:虽然具有较好的前景,但结核DNA疫苗的发展依赖于整体核酸疫苗的发展,目前报道的DNA疫苗免疫保护效果大多难以超过BCG。关于DNA疫苗的安全性、免疫方式、持续表达能力等众多问题尚未得到确认。
3)亚单位疫苗:多以结核杆菌保护性抗原为基础,主要包括结核杆菌分泌蛋白(多由RD1区基因编码)和细胞壁蛋白以及休眠期结核杆菌表达的抗原物质等。亚单位疫苗能特异性的诱导CD4 +Th1细胞和CD8 +CTL细胞活化,并且使用安全,是理想的疫苗形式之一。由于人群中存在遗传多样性,单个蛋白抗原虽然会具有一定的免疫保护性,但抗原谱窄,还不足以引起有效的免疫保护,将多个抗原或多肽融合表达有助于提高疫苗的免疫保护率。另外亚单位疫苗需要有效的佐剂辅助才能引起理想的免疫应答,不同的免疫佐剂可以引起Th1或Th2不同方向的免疫反应。因此亚单位疫苗在设计时主要考虑两个因素:一是抗原的选择,二是佐剂的应用。
在抗原的选择上,就结核病亚单位疫苗而言,结核病保护性免疫主要是细胞免疫,诱导细胞免疫反应的抗原主要存在于结核分枝杆菌的细胞壁、细胞质和培养滤液中,其中分泌蛋白和细胞壁表面的蛋白是主要的保护性抗原。
Ag85复合物是结核杆菌主要的分泌蛋白(占30%),可分为三个组分:Ag85a、Ag85b、Ag85c,主要作用是使分枝杆菌与纤连蛋白产生高亲和力,具有分枝酰基转移酶的活性,是合成海藻糖二分枝酸酯所必需的,而后者是保持结核分枝杆菌细胞壁完整性所必须的重要结构。其中Ag85b全称为抗原85复合物B(antigen 85 complex B),又名分枝酰基转移酶(Mycolyl transferase 85B),纤连蛋白结合蛋白B(fibronectin-binding protein B),由基因Rv1886c(基因fbp)表达。基因全长978bp,蛋白全长325氨基酸,主要参与了结核分枝杆菌细胞壁的分支酰基化过程。Ag85b在Genebank的序列号为ID:885785,其制备方法可以参考以下文献:De Wit L,Palou M,Content J.Nucleotide sequence of the85B-protein gene of Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis.DNA Seq.1994;4(4):267-70;Harth G,Lee BY,Wang J,Clemens DL,Horwitz MA.Novel insights into the genetics,biochemistry,and immunocytochemistry of the30-kilodalton major extracellular protein of Mycobacterium tuberculosis.InfectImmun.1996 Aug;64(8):3038-47;Erratum in:Infect Immun 1997 Feb;65(2):852。CFP-10(10kDa culture filtrate protein)和ESAT6(early secretory antigenictarget 6kDa)均是结核杆菌早期分泌蛋白,均具有很强的诱导细胞免疫的能力。两个蛋白的基因均属于结核杆菌基因差别区1(RD1),RD1区在BCG和大多数非结核分枝杆菌中缺失。
CFP-10在Genebank中的序列号为ID:886194,其制备方法可以参考以下文献:Berthet FX,Rasmussen PB,Rosenkrands I,Andersen P,Gicquel B.AMycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novellow-molecular-mass culture filtrate protein(CFP-10).Microbiology.1998 Nov;144(Pt 11):3195-203;Barnes PF,Mehra V,Rivoire B,Fong SJ,Brennan PJ,VoegtlineMS,Minden P,Houghten RA,Bloom BR,Modlin RL.Immunoreactivity of a 10-kDaantigen of Mycobacterium tuberculosis.J Immunol.1992 Mar 15;148(6):1835-40。
ESAT6在Genebank中的序列号为ID:886209,其制备方法可以参考以下文献:AL,Nagai S,Houen G,Andersen P,Andersen AB.Purification andcharacterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacteriumtuberculosis.Infect Immun.1995 May;63(5):1710-7;Berthet FX,Rasmussen PB,Rosenkrands I,Andersen P,Gicquel B.A Mycobacterium tuberculosis operonencoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein(CFP-10).Microbiology.1998 Nov;144(Pt 11):3195-203。
融合蛋白CFP10-ESAT6的制备方法可以参考以下文献:Li H,Chen J,Liu G,Yao W,Yang J,Liu Y,Zeng L,Tian Y,Wang T.Construction and expression of theprokaryotic expression vector of MTB cfp10-ESAT6 fusion gene.Sheng Wu Yi XueGong Cheng Xue Za Zhi.2007 Jun;24(3):636-40;Wang XY,Bao L,Zhao MC,ZhangHD,Long Y.Expression of the fusion protein CFP 10-ESAT6 of Mycobacteriumtuberculosis and the study of its immunogenicity.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi XueBan.2006 May;37(3):353-6.Chinese。
HspX又名α-晶体蛋白(alpha-crystallin),是一种位于结核分枝杆菌细胞膜内侧的热休克蛋白(heat shock protein),属于小热休克蛋白家族(small heat shockprotein family),由基因Rv2031c(hspX)表达。基因全长435bp,蛋白全长144氨基酸。可能的作用是维持结核杆菌在潜伏期(无症状感染状态)的活性,在感染初期对于菌体复制可能也有作用,可能是结核杆菌潜伏期的一个重要靶抗原。
HspX在Genebank中的序列号为ID:887579,其制备方法可以参考以下文献:Haile Y,Bjune G,Wiker HG.Expression of the mceA,esat-6 and hspX genes inMycobacterium tuberculosis and their responses to aerobic conditions and torestricted oxygen supply.Microbiology.2002Dec;148(Pt 12):3881-6;Roupie V,Romano M,Zhang L,et al.Immunogenicity of eight dormancy regulon-encodedproteins of Mycobacterium tuberculosis in DNA-vaccinated and tuberculosis-infectedmice.Infect Immun,2007,75(2):941-9。
目前Ag85b和ESAT6用做结核病亚单位疫苗显示出一定的保护力。研究表明,在结核杆菌感染的小鼠体内,ESAT6产生了一定的保护效果(文献:Olsen AW,Hansen PR,Holm A,Andersen P.Efficient protection against Mycobacteriumtuberculosis by vaccination with a single subdominant epitope from the ESAT-6antigen.Eur J Immunol 2000;30:1724-1732)。而基于ESAT6和Ag85b的融合蛋白与佐剂联用后,在小鼠体内产生了较持久的保护作用(文献:Weinrich Olsen A,van Pinxteren LA,Meng Okkels L,Birk Rasmussen P,Andersen P.Protection of micewith a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85b andesat-6.Infect Immun 2001;69:2773-2778)。
而HspX用于亚单位疫苗的研究尚未发现,但有文章指出作为潜伏期表达量升高的蛋白,HspX作为结核杆菌潜伏感染者的预防性疫苗,有一定优势(文献:Andersen P.Vaccine strategies against latent tuberculosis infection.TRENDS inMicrobiology.2006 Vol.15 No.1)。
在佐剂的应用上,在结核亚单位疫苗中,目前研究的佐剂主要有MPL(单磷酰脂质A,3-0-descyl-4′-monophosphoryl lipidA),弗氏完全佐剂和不完全佐剂,DDA(二甲基三十六烷基胺,dimethyl dioctadecyl ammoniumbromide),QS21,AS01,AS02,AS04等。
目前上市疫苗中唯一批准使用的佐剂是Al(OH)3,但是Al(OH)3主要引起Th2型免疫应答,单独使用于结核疫苗时,不能引起足够的细胞免疫应答,而后者是抗结核的主要保护性免疫。另外,Al(OH)3多次注射后不良反应会显著增多,而结核潜伏感染者预防或结核病辅助治疗性疫苗,均需在体内多次注射,因此,传统铝佐剂在目前的结核亚单位疫苗中不常被考虑。
MPL应用较为广泛,单独使用或与DDA联合使用效果都较好(例如:OlsenAW,Williams A,Okkets IM,Hatch G,Andersen A.Protective effect of a subunitvaccine based on a fusion of antigen 85B and ESAT-6 in the aerosol guinea pig model.Infect Immun 2004;72:6146-50.)。MPL与皂甙类佐剂QS21以一定量配比后再加入角鲨烯和维生素E就构成了佐剂AS01和AS02的主要成分,后两种佐剂在国外某些在研结核疫苗中获得较好的效果。
但这些目前效果比较好的佐剂组成复杂,价格昂贵,一方面会使最终的疫苗产品价格升高,另一方面也会因获得不易而限制它们在结核疫苗研究开发和评价中的应用。
另外,含非甲基化CpG二核苷酸的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)做为免疫刺激序列能诱导Th1型为主的免疫应答,在肿瘤、过敏性疾病中有潜在的应用价值,目前也开始逐步在疫苗佐剂中尝试实验和研究。虽然已合成和筛选出了一些有活性的CpG ODN序列,但由于CpG ODN的免疫刺激作用具有种属特异性,动物实验中有活性的未必能在人体产生免疫刺激作用。由于还没有弄明白CpG ODN的构效关系,要设计并合成出对人体能产生免疫刺激作用的CpG ODN也非易事,并且CpG ODN的安全性还未被验证。因此,要将CpG ODN做为疫苗佐剂,还存在一定困难。
发明内容
正如背景技术中指出的,我国有近6亿结核菌感染者,其中10%的人最终会发生结核病,其发病率高、人数庞大。因此,已感染人群用疫苗最有可能在短期内对我国结核病控制产生巨大影响。这就需要采用不同免疫策略,研制不同类型疫苗来防治结核病。
另外,从结核病目前治疗的现状来讲,单纯依靠化学药物治疗来控制结核病在人群中蔓延的效果并不令人满意。因此开发出具有预防和治疗作用的疫苗将是对化学药物治疗结核病的极有利补充。
基于这样的需求和研发构思,本申请的发明人将具有不同特点的结核杆菌保护性抗原组合,并筛选出适当的佐剂,形成了本发明的结核疫苗。
在抗原的组成上,本发明的结核亚单位疫苗包含Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX四种蛋白成份。这四种蛋白成份可各自以独立形式存在,也可以任何两种或三种或四种蛋白的融合蛋白的形式存在于疫苗中,优选的存在形式为Ag85b、融合蛋白CFP10-ESAT6、HspX。这四种蛋白成份在疫苗中的重量比为:0.5-2∶0.5-2∶0.5-2∶0.5-2,优选为1∶0.5∶0.5∶1,以单位剂量疫苗来讲,四种蛋白成份的含量为每种蛋白5-20μg,优选为每种蛋白5-10μg,更优选为Ag85b10μg、ESAT6 5μg、CFP10 5μg、HspX 10μg。当以Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX的形式存在于疫苗中时,这三种抗原的重量比组成为:0.5-2∶0.5-2∶0.5-2.,优选重量比为1∶1∶1,以单位剂量疫苗来讲,这三种抗原的含量为:每种蛋白5-20μg,优选为每种蛋白10μg。
Ag85b、ESAT6和CFP10蛋白属于结核杆菌保护性抗原,作为疫苗成分免疫人体后,刺激机体产生对于这三种蛋白的特异性细胞免疫,当有结核杆菌进入或潜伏于人体时,这种较强的细胞免疫有助于抑制结核杆菌的增殖,或促进其清除,对结核病的预防有关键作用。HspX蛋白属于结核杆菌潜伏期优势蛋白,由于在潜伏期,结核杆菌的其他蛋白分泌极少,因此HspX作为疫苗成分,可以在结核杆菌潜伏期诱导机体产生较强的细胞免疫,有助于清除已进入人体且处于潜伏状态的结核杆菌,进而有利于预防结核杆菌潜伏感染者发展为结核病患者。本申请的发明人通过对上述抗原的免疫原性研究证实了Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX三种蛋白均具有良好的免疫原性,联合使用均能发挥各自的抗原作用,它们组合形成的疫苗,不仅适用于预防结核杆菌感染,也适用于结核杆菌潜伏感染者的治疗。
如前述,在亚单位疫苗中,佐剂是提高抗原免疫活性的重要成份,为了保证本发明形成的亚单位疫苗能够产生有效的机体免疫应答,还需要筛选出适当的佐剂。
影响佐剂效果的因素很多,如与其配伍的蛋白种类,与蛋白的配比,佐剂的制备工艺等因素。因此适用于目前已有结核亚单位疫苗的佐剂,可能并不适用于其他组成的结核亚单位疫苗;而且,目前效果比较好的佐剂组成复杂,价格昂贵,它们的应用一方面会使最终的疫苗产品价格升高,另一方面也会因获得不易而限制它们在结核疫苗研究开发和评价中的应用,这对于我国的结核疫苗研发、生产及社会承受力都会产生很大负担。基于上述原因,本申请的发明人对适用于本发明结核疫苗抗原成份的佐剂进行了研究和筛选。
考虑到Al(OH)3是目前唯一在上市疫苗中使用的佐剂,其安全性已被验证和认可,并且Al(OH)3具有缓释作用,对疫苗的持续释放实现缓释给药有帮助,因此希望通过与其他佐剂的配伍使用,发挥Al(OH)3的这些优势。而Al(OH)3多次注射后不良反应会显著增多,需要控制其在疫苗中的含量,这对提高需反复注射的疫苗的安全性至关重要。
本申请的发明人通过前期的研究发现,BCG-CpG-DNA,是BCG的DNA提取物,BCG的DNA中富含未甲基化的CpG基序,具有免疫调节作用。考虑到BCG已在人群中广泛应用,其DNA提取物的安全性有保障,因此本申请的发明人尝试将BCG-CpG-DNA做为免疫佐剂和Al(OH)3配合使用,结果意外发现,两者联合做为本发明结核亚单位疫苗的佐剂时,能有效的提高机体对本发明结核亚单位疫苗的细胞免疫应答,促进T细胞的增殖,调节Th1/Th2的平衡转向Th1优势应答。复合佐剂的效果远好于单独Al(OH)3或单独BCG-CpG-DNA的使用效果,也远好于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA与其他抗原成份的配伍效果,比如乙肝抗原、流脑多糖抗原等,这说明不仅Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的联合具有协同作用,而且Al(OH)3和BCG-CpG-DNA复合佐剂与本发明结核亚单位疫苗的抗原成分之间也有协同效果。
本发明所指的BCG-CpG-DNA是BCG的DNA提取物,其为片段长短不等的BCG DNA片段的混合物,其含有未甲基化的CpG基序,因此简称为“BCG-CpG-DNA”。在实现免疫佐剂效果方面,对BCG DNA片段的大小没有特别要求,如果优选DNA片段不低于1kb,或更优选为5-10kb时,能得到更好的免疫佐剂效果。BCG的DNA富含未甲基化的CpG基序,因此能产生免疫佐剂的效果,如果优选BCG-CpG-DNA中CpG的质量百分含量在15.75%-24.75%,更优选在21.5-23.5%时,能产生更好的免疫佐剂效果。
BCG-CpG-DNA可采用常规的细菌基因组DNA的提取方法制备获得,也可采用Tohru Tokunaga等的制备方法,参见JNCI,1984,Vol,72,No.4:955-962“Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from mycobacterium bovisBCG.I.isolation,physicochemical characterization,and antitumor activity”,也可采用中国发明专利ZL200410033878.1中记载的制备方法:将菌种接种于适合分枝杆菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体;菌体经破碎后离心收集上清液;上清液经CTAB(溴化十六烷基三甲基胺)的沉淀物用NaCl溶液溶解后用有机溶剂抽提收集无蛋白层,该无蛋白层再次抽提后的上清液用乙醇处理收集沉淀,对该沉淀进行后处理。由这些示例性的方法获得的BCG-CpG-DNA都能用于本发明的结核亚单位疫苗,产生良好的免疫佐剂效果。从制备方法的简便性上,优选采用中国发明专利ZL200410033878.1中记载的制备方法,在此全文引用ZL200410033878.1作为参考。
本发明中BCG-CpG-DNA的CpG含量可以通过高效液相检测而获得,例如可以采用ZL200410033878.1中记载的通过反相-高效液相法(RP-HPLC),采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶(dC)为5-甲基胞嘧啶(m5-dC),利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶(BAP)将DNA水解为单个脱氧核苷,利用反相-高效液相法(RP-HPLC)对修饰和未修饰的DNA水解样品中m5-dC检出量的差别而对CpG进行定量。
在本发明的结核亚单位疫苗中,佐剂的组成为Al(OH)3和BCG-CpG-DNA,两种成份的重量比为28∶1-1∶4,优选为14∶3-4∶3;以单位剂量疫苗来讲,Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的含量为:Al(OH)30.05mg-0.7mg,BCG-CpG-DNA 25μg-200μg,优选为Al(OH)30.1mg-0.35mg,BCG-CpG-DNA 75μg。
加入BCG-CpG-DNA后,不仅提高了Al(OH)3的免疫佐剂效能,而且降低了Al(OH)3的用量,本申请的发明人发现在配合使用的情况下,Al(OH)3只需0.35mg/剂,就能产生很好的免疫应答效果,该剂量远低于Al(OH)3在疫苗中的通常用量范围。下表1是中国药典三部(2005版)中有关疫苗的氢氧化铝用量要求,对比可见,通过与BCG-CpG-DNA配伍,本发明结核亚单位疫苗中Al(OH)3的用量远低于目前Al(OH)3的常规用量。
表1中国药典三部(2005版)中疫苗用氢氧化铝的用量要求
疫苗名称 | 氢氧化铝含量(mg/ml) | 儿童用量(ml/次) | 成人用量(ml/次) |
吸附百日咳白喉联合疫苗 | 1.0-1.5 | 0.5 | - |
吸附百白破联合疫苗 | 1.0-1.5 | 0.5 | - |
吸附无细胞百白破联合疫苗 | 1.0-1.5 | 0.5 | - |
吸附破伤风疫苗 | 不高于3.0 | 0.5 | 0.5 |
吸附白喉疫苗 | 不高于3.0 | 0.5 | - |
吸附白喉疫苗(成人及青少年用) | 不高于2.5 | - | 0.5 |
吸附白喉破伤风联合疫苗 | 不高于2.5 | 0.5 | - |
吸附白喉破伤风联合疫苗(成人及青少年用) | 不高于2.5 | - | 0.5 |
I型肾综合征出血热灭活疫苗 | 不高于0.7 | 1.0 | 1.0 |
II型肾综合征出血热灭活疫苗 | 不高于0.7 | 1.0 | 1.0 |
双价肾综合征出血热灭活疫苗 | 不高于0.7 | 1.0 | 1.0 |
人用狂犬病疫苗(Vero细胞) | 不高于0.7 | 1.0 | 1.0 |
人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞) | 不高于0.7 | 1.0 | 1.0 |
本发明的有益效果:
1、细胞免疫是抗结核病的主要保护性免疫,其中,T淋巴细胞免疫应答起着至关重要的作用。本发明以T淋巴细胞免疫应答作为评价机体细胞免疫功能的基本指标,发现本发明的结核病亚单位疫苗对机体T淋巴细胞应答具有显著的增强效果。
Th细胞是免疫***重要的调节细胞和效应细胞,根据分泌的细胞因子不同,Th细胞被分为Th1和Th2两大类,前者主要分泌IFN-γ和IL-2等,后者主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等。Th1/Th2的动态平衡受多因素调节,其中IL-12被认为是Th1应答的始动因子,促进Th0细胞向Th1细胞分化;活化的Th1细胞分泌IFN-γ,后者有利于激活巨噬细胞等效应性细胞,促使后者分泌NO等效应分子,进而实现抑制或杀灭结核杆菌的目的。现已发现,呼吸***的多种疾病与Th1/Th2的失衡有关,对结核病而言,Th1优势应答介导保护性免疫反应,Th2优势应答则介导以迟发性***反应为主的反应,伴随着病理性免疫损伤(Mosmann TR,Sad S.The expanding universeof T-cell subsets:Th1,Th2 andmore.Immunol Today,1996,17:138-146.)。本发明的结核病亚单位疫苗能有效的增强机体Th1类细胞因子的产生,对机体Th1/Th2应答有显著的调节作用,使机体对结核病的免疫反应以Th1优势应答为主。
2、疫苗的组成特点使疫苗具有预防和治疗两种作用。
3、疫苗的佐剂成份对本发明抗原成份的辅助免疫增强作用强,其效果远好于单独Al(OH)3和单独BCG-CpG-DNA,也远好于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA与其他疫苗活性成份的配伍效果,比如乙肝抗原、流脑多糖抗原等,这说明不仅Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的联合具有协同作用,而且Al(OH)3和BCG-CpG-DNA复合佐剂与本发明结核亚单位疫苗中的抗原成分之间也有协同效果。
4、疫苗的佐剂成份所采用的Al(OH)3和BCG-CpG-DNA都是已广泛用于人体的药物或生物制品,安全性高;另外制备工艺成熟,价格低廉。
附图说明
图1Ag85b蛋白的SDS-PAGE电泳图
图2HspX蛋白的SDS-PAGE电泳图
图3CFP10-ESAT6蛋白的SDS-PAGE电泳图
图4本发明的结核亚单位疫苗体内产生抗-Ag85b-IgG的结果
图5本发明的结核亚单位疫苗体内产生抗HspX-IgG的结果
图6本发明的结核亚单位疫苗体内产生抗C/E-IgG抗体的结果(C/E即融合蛋白CFP10-ESAT6)
图7-9本发明的结核亚单位疫苗促进T淋巴细胞增殖的结果
图10-12本发明的结核亚单位疫苗促进腹腔巨噬细胞分泌IL-12的结果
图13-15本发明的结核亚单位疫苗酶联免疫斑点实验结果
图16本发明的结核亚单位疫苗对结核杆菌感染豚鼠的脏器病变指数结果
图17本发明的结核亚单位疫苗对结核杆菌感染豚鼠的脾脏结核杆菌荷菌量结果
具体实施方式
以下以实施例的方式对本发明进行优选方式的阐述。
实施例1Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX三种抗原的制备
1、Ag85b基因的克隆表达以及Ag85b蛋白的纯化
从gene bank查获结核杆菌H37Rv中抗原Ag85b的核酸和氨基酸序列,根据目的序列设计引物。其中,上游引物P1:5’-CACGCATATGACAGACGTGAGCC-3’(划线部分为NdeI酶切位点),下游引物P2:5’-TTGAATTCTCAGCCGGCGCCT-3’(划线部分为EcoRI酶切位点)。以H37Rv全基因组为模板,用上述引物对目的片段进行PCR扩增,扩增体系为50ul(ddH2O 20.5ul、10×Buffer 5ul、Taq酶0.5ul、dNTP 4ul、上游引物5ul、下游引物5ul、DNA模板10ul),扩增条件为94℃ 10min、94℃ 45s、62.2℃ 45s、72℃ 1min、循环33次、72℃5min,4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,进行胶回收,获得目的片段,经NdeI和EcoRI双酶切后在T4DNA连接酶催化下分别与pET30a克隆表达载体16℃连接过夜。连接好的质粒转化DH5α,37℃培养过夜。挑选菌落于10ml LB培养基扩增,提取质粒后用上述内切酶消化,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后的阳性菌落经质粒测序进行进一步验证,并确认其基因序列正确。
从测序正确的菌落中提取质粒转化BL-21感受态细胞,获得重组菌,于LB液体培养基中培养重组菌,待菌液600nm光密度(optical density,OD)值达到0.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mmol/L,诱导表达4h。
离心经诱导表达的菌液,菌体沉淀用T-E缓冲液(Tris 50mmol/L,EDTA2mmol/L)洗涤后重悬,冰浴超声裂解后离心、弃上清。沉淀用含4mol/L Urea的T-E缓冲液重悬后洗1-3遍,离心弃上清。沉淀用含6mol/L Urea的T-E缓冲液重悬,离心弃沉淀。上清完全透析至含有6mol/L Urea的T-E缓冲液中。用Source 30Q阴离子交换柱进行纯化,即用A液(含6mol/L Urea的T-E缓冲液)平衡柱子后上样(流速2ml/min),收集流穿峰,基线稳定后用B液(含有6mol/LUrea和1mol/L NaCl的T-E缓冲液)线性洗脱(3ml/min)。收集流穿后,梯度复性至T-E缓冲液中(6-4-2-0mol/L)。
2、HspX基因的克隆表达以及HspX蛋白的纯化
从gene bank查询结核杆菌H37Rv中抗原HspX的核酸和氨基酸序列,根据目的序列设计引物。其中,上游引物P1:5’-TTCATCATATGGCCACCACCCT-3’(划线部分为加入的NdeI酶切位点),下游引物P2:5’-GTGCAAGCTTTCAGTTGGTGGAC-3’(划线部分为加入的Hind III酶切位点)。以H37Rv全基因组为模板,用上述引物对目的片段在50μl PCR体系中进行扩增,扩增体系为50ul(ddH2O 20.5ul、10×Buffer 5ul、Taq酶0.5ul、dNTP 4ul、上游引物5ul、下游引物5ul、DNA模板10ul),扩增条件为94℃ 10min、94℃ 45s、53.7℃ 45s、72℃ 1min、循环33次、72℃ 5min,4℃保存。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后,进行胶回收,获得目的片段,经NdeI和Hind III双酶切后在T4 DNA连接酶催化下与pET30a克隆表达载体16℃连接过夜,连接好的质粒转化DH5α,37℃培养过夜。挑选菌落于10ml LB培养基扩增,提取质粒后用上述内切酶消化,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后的阳性菌落经质粒测序进行进一步验证,并确认其基因序列正确。
从测序正确的菌落中提取质粒转化BL-21感受态细胞,获得重组菌,于LB液体培养基中培养重组菌,待菌液600nm光密度(optical density,OD)值达到0.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mmol/L,诱导表达4h。
离心经诱导表达的菌液,菌体沉淀用T-E缓冲液洗涤后重悬,冰浴超声裂解后离心,取上清液待做纯化。用阴离子交换柱(QHP,Q Sepharose HighPerformance)和疏水(Phenyl Sepharose High Performance)柱进行纯化。用A液(T-E缓冲液)平衡柱子后上样(流速2ml/min),待流穿完全流出基线稳定后,分别用15%、50%、100%B液(含1mol/L NaCl的T-E缓冲液)线性洗脱(3ml/min),收取50%B洗脱液;经含40%硫酸铵的T-E缓冲液平衡柱子后上样(流速2ml/min),待流穿完全流出基线稳定后,分别以60%、80%、100%B液(T-E缓冲液)洗脱,收集100%B洗脱液,再经含35%硫酸铵的T-E缓冲液平衡柱子后上样(流速2ml/min),待流穿完全流出基线稳定后,分别以90%、100%B液(T-E缓冲液)洗脱,收集100%洗脱液。
3、cfp10-esat6基因的克隆表达以及CFP10-ESAT6蛋白的纯化
从gene bank查询结核杆菌H37Rv中抗原cfp10和ESAT6的核酸和氨基酸序列,根据目的序列应用基因拼接法设计引物。其中,cfp10的上游引物P1:5’-GATAGTCTCATATGGCAGAGATGAAGACCG-3’(划线部分为加入的NdeI酶切位点);cfp10的下游重叠引物P2:5’-GCTTCCACCTCCTCCGCTTCCACCACCTCCGCTTCCACCGCCACCGAAGCCCATTTGCG-3’;esat6的上游重叠引物P3:5’-GCTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGTGGAAGCGGAGGAGGTGGA AGCATGACAGAGCAGCAG_-3’;ESAT6下游引物P4 5’-CATGAA TTCCTATGCGAA CATCCCAGTGAC G-3’(划线部分为加入的EcoRI酶切位点);P2删除终止密码TGA;在P2的5’端和P3的5’端分别引入互补的Linker(Gly4Ser1)3。
以H37Rv全基因组为模板,用上述引物对cfp10和esat6分别在50ulPCR体系中进行扩增,扩增体系为50ul(ddH2O 30.5ul、10×Buffer 5ul、Taq酶0.5ul、dNTP 4ul、上游引物4ul、下游引物4ul、DNA模板2ul);然后利用Overlap PCR反应扩增cfp10-esat6融合基因,扩增体系为50ul(ddH2O 31.5ul、10×Buffer5ul、Taq酶0.5ul、dNTP 4ul、上游引物4ul、下游引物4ul、cfp10 PCR纯产物2ul,ESAT6PCR纯产物2ul)。cfp10扩增条件为96℃ 5min、96℃ 45s、60℃ 45s、72℃ 1min、循环30次、72℃ 7min,4℃保存;esat6扩增条件为96℃ 5min、96℃ 45s、62℃ 45s、72℃ 1min、循环30次、72℃ 7min,4℃保存;cfp10-esat6融合基因的扩增条件为96℃ 5min、96℃ 1min、64℃ 1min、72℃ 1min、循环30次、72℃ 7min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后,进行胶回收,获得目的片段,经NdeI和EcoRI双酶切后在T4DNA连接酶催化下与pET30a克隆表达载体16℃连接过夜,连接好的质粒转化DH5α,37℃培养过夜。挑选菌落于10ml LB培养基扩增,提取质粒后用上述内切酶消化,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后的阳性菌落经质粒测序进行进一步验证,并确认其基因序列正确。
从测序正确的菌落中提取质粒转化BL-21感受态细胞,获得重组菌,于LB液体培养基中培养重组菌,待菌液600nm光密度(optical density,OD)值达到0.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mmol/L,诱导表达4h。
离心经诱导表达的菌液,菌体沉淀用PB缓冲液洗涤后重悬,冰浴超声裂解后离心,取上清液待做纯化。用阴离子交换柱(QHP,Q Sepharose HighPerformance)进行纯化。用A液(PB缓冲液)平衡柱子后上样(流速2ml/min),待流穿完全流出基线稳定后,用5%B液(含1mol/L NaCl的PB缓冲液)梯度洗脱(2ml/min),收集洗脱液。
4、蛋白鉴定
纯化后的蛋白经12%的SDS-PAGE电泳,并进行N末端测定,结果,三种蛋白分子量大小和N末端氨基酸序列分别与Ag85b、HspX、CFP10-ESAT6相符:三种蛋白分子量大小分别为34.4kD,16kD,23kD;三种蛋白的N末端氨基酸序列分别为MTDVSRKIRAWGRRL、MATTLPVQRHPRSLF和MAEMKTDAATLAQEAG。
实施例2BCG-CpG-DNA的提取和制备
参照ZL200410033878.1说明书第3-7页具体实施方式中“一、BCG-CpG-DNA的制备”和“二、提取物中CpG有效成分的检测”中记载的方法,制备用于以下实验中所用结核亚单位疫苗的BCG-CpG-DNA,并测定提取物中CpG的含量。采用上述方法提取的BCG-CpG-DNA中CpG的质量百分含量为22.5%。
实施例3本发明的结核亚单位疫苗诱导小鼠产生免疫应答的研究
将BALB/c小鼠随机分为抗原组(以“Ag”代表)、BCG-CpG-DNA组(以“CpG”代表)、抗原和Al(OH)3组(以“Ag+Al”代表)、抗原和BCG-CpG-DNA组(以“Ag+CpG”代表)、抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组(以“Ag+Al+CpG”代表),以及生理盐水对照组(以“NS”代表)。
根据分组给各组小鼠分别皮下免疫相应药物,每次给药组每只小鼠免疫0.2ml,其中各组分含量为(0.2ml中的含量,即每只动物的免疫量):Ag包含Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μg,CpG 75μg,Al(OH)3 0.35mg;生理盐水对照组小鼠每只注射0.2ml生理盐水。
表2给药实验组的用药对照表
组别 | 剂量(每只小鼠免疫量) |
Ag(抗原组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μg |
CpG(BCG-CpG-DNA组) | CpG 75μg |
Ag+Al(抗原和Al(OH)3组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mg |
Ag+CpG(抗原和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgCpG 75μg |
Ag+Al+CpG(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mgCpG 75μg |
每周免疫1次、连续免疫3次。末次免疫后1周,摘眼球处死小鼠,分离外周血血清,用于血清抗体的检测;无菌取脾,制备脾脏单个核细胞悬液,调整细胞浓度为1×106/ml或2×106/ml;收集腹腔灌洗液,分离腹腔巨噬细胞,调整细胞浓度为2.5×106/ml。
1、血清学检测:
将小鼠血清1000倍稀释后加入用Ag85b、HspX或C/E蛋白(C/E蛋白即CFP10-ESAT6融合蛋白)预包被的酶标版中,室温孵育2小时后,洗板后加入抗小鼠IgG抗体(HRP标记),室温孵育2小时后,洗板,加入TMB显色液,室温反应10-15min,加入2M H2SO4终止反应。测定450/620nm吸光度值。分析血清中抗-Ag85b-IgG、抗HspX-IgG和抗C/E-IgG抗体含量。
检测结果参见图4-6。
由实验结果可见,仅含有活性成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX的亚单位疫苗能使机体产生相应的抗体,但其中HspX的抗体水平比较低,但添加了Al(OH)3或者Al(OH)3和BCG-CpG-DNA之后,能显著的提高机体HspX的抗体水平,并且Al(OH)3和BCG-CpG-DNA联合使用的效果要好于单独使用Al(OH)3或BCG-CpG-DNA;对于提高机体CFP10-ESAT6抗体水平而言,Al(OH)3和BCG-CpG-DNA联合使用的效果要好于单独使用BCG-CpG-DNA;对于提高机体Ag85b抗体水平而言,Al(OH)3和BCG-CpG-DNA联合使用的效果要好于单独使用Al(OH)3或BCG-CpG-DNA。
综合这三种抗原的抗体情况可见,抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组能使机体有效产生针对三种抗原的抗体,做为佐剂的Al(OH)3和BCG-CpG-DNA联合使用,所产生的效果好于单独使用Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA,并且结果具有显著性差异。
2、淋巴细胞增殖实验:
将上述脾淋巴细胞分装96孔板,每孔200μl(细胞浓度为1×106/ml),然后添加20μl如下刺激源,使其在孔内终浓度为ConA(0.8μg/ml)、PPD(2μg/ml)、Ag85b(10μg/ml)、CFP10-ESAT6(10μg/ml)、HspX(10μg/ml)和培养基(作空白对照)。37℃,5%CO2全湿润培养70h后,每孔加入15μlMTT(5mg/ml),继续培养4h后,离心去上清。每孔加入100μl 20%SDS-DMF细胞裂解液,37℃过夜,置酶标仪(Wellscan MK3)上比色,测定波长为570nm,参考波长为630nm。计算复孔的OD值平均值以反应T细胞增殖强度。
实验结果参见图7-9。
由实验结果可见,无论是单独的抗原,还是添加了Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA的抗原,促进T细胞增殖的能力都不明显,而添加了Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的抗原组中T细胞增殖显著提高,从数值上表现出明显的协同作用,反映出机体对本发明的结核病疫苗产生了强烈的细胞免疫应答。这表明,Al(OH)3和BCG-CpG-DNA联合使用能有效提高三种抗原引发的T淋巴细胞的增殖,所产生的效果好于单独使用Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA,具有协同作用。
3、腹腔巨噬细胞分泌IL-12的检测(ELISA法):
将上述腹腔巨噬细胞分装24孔板,每孔1ml(细胞浓度为2.5×106/ml),贴壁培养2小时后洗去未贴壁细胞,再加入1ml培养基,并分别加入100μl如下刺激原,使其在孔内终浓度为Ag85b(10μg/ml)、CFP10-ESAT6(10μg/ml)、HspX(10μg/ml)、LPS(10μg/ml)和培养基(作空白对照)。37℃、5%CO2全湿润培养48h后离心,取上清,-80℃保存。用小鼠IL-12p70ELISA试剂盒测定腹腔巨噬细胞培养上清中IL-12含量。
实验结果参见图10-12。
由实验结果可见,与对照组相比,单独的抗原、以及单独的Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA与抗原组合,诱导巨噬细胞分泌IL-12的能力比较低;而Al(OH)3和BCG-CpG-DNA联合使用,与抗原组合,极大促进了巨噬细胞分泌IL-12的能力,反映出Th0细胞向Th1细胞分化的增强,T细胞免疫Th1/Th2的平衡向Th1优势应答转化,所产生的效果远好于单独使用Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA,结果具有显著性差异,表现出明显的协同作用。
这说明单独的抗原,以及单独的Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA与抗原组合,都不能有效的促进Th0细胞向Th1细胞分化,即将T细胞免疫引导到Th1优势应答上。而联合使用Al(OH)3、BCG-CpG-DNA和抗原,能有效的促进Th0细胞向Th1细胞分化,将诱导Th1优势应答。
4、酶联免疫斑点实验(ELISPOT):
用抗IFN-γ单克隆抗体包被培养板,10%FBS-1640培养基封闭过夜。往培养板中加入上述每只小鼠的细胞悬液(100ul/孔,2×106/ml),并分别加入20μl如下刺激原,使其在孔内终浓度为ConA(0.8μg/ml)、PPD(2μg/ml)、Ag85b(16μg/ml)、CFP10-ESAT6(16μg/ml)、HspX(16μg/ml)和培养基(作空白对照)。37℃、5%CO2全湿润培养24h,洗去细胞后,向每孔加入生物素标记二抗,室温反应2h,洗板后向每孔加入酶标亲和素,室温反应1h,洗板后向每孔加入底物至斑点明显出现,终止反应后,晾干培养板。用CTL Elispot读板仪计数每孔斑点数。
实验结果参见图13-15。
由实验结果可见,单独的抗原在提高淋巴细胞IFN-γ的分泌上,几乎没有作用;对比做为佐剂成份的Al(OH)3和BCG-CpG-DNA,BCG-CpG-DNA在辅助抗原提高淋巴细胞IFN-γ分泌上的能力略强于Al(OH)3,但整体作用仍很低;而抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA联合使用后,极大的提高了淋巴细胞IFN-γ的分泌,反映出Th1细胞的活化和活化后的活性很高,所产生的效果远好于单独使用Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA,结果具有显著性差异,表现出非常明显的协同作用。
这说明单独的抗原,以及单独的Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA与抗原组合,都不能有效的产生Th1优势应答,而联合使用Al(OH)3和BCG-CpG-DNA和抗原,能有效诱导出Th1优势应答,并且使Th1细胞活化后的活性提高,表现出IFN-γ分泌量的极大提高。
实施例3的实验表明,仅含有抗原成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX的亚单位疫苗能使机体产生相应的抗体,但其中HspX的抗体水平很低,与对照组接近,但添加了Al(OH)3或者Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的复合佐剂,能显著的提高机体中HspX的抗体水平,也能提高机体中Ag85b、CFP10-ESAT6的抗体水平。
但就引发机体的细胞免疫而言,无论是抗原成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX本身,BCG-CpG-DNA本身,还是Al(OH)3或BCG-CpG-DNA单独与抗原成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX联用,效果都远低于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA联合使用的效果,尤其在活化后的Th1细胞的活性(反映在IFN-γ的分泌)上这种差异特别明显。
这充分说明了,抗原成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX,与Al(OH)3和BCG-CpG-DNA配合而成的结核病亚单位疫苗,能有效的引起机体免疫应答,尤其是形成细胞免疫应答,调节Th1/Th2的平衡,使之向有利于结核病的保护性免疫反应——Th1优势应答的方向转化。
实施例4本发明的结核亚单位疫苗对结核杆菌感染豚鼠的免疫保护效果
豚鼠对结核分枝杆菌更敏感,是结核病疫苗效力评价的优选模型。本发明以豚鼠模型为基础,对本发明的结核亚单位疫苗的免疫保护效果进行了研究。
以结核分枝杆菌感染豚鼠,将感染豚鼠随机分为Ag、Ag+Al、Ag+CpG、Ag+Al+CpG实验组和NS对照组。在感染后5天根据分组给各给药组动物免疫相应药物,以后每隔2周免疫1次,共免疫3次。每次免疫方式为后腿肌肉注射0.2ml/只,其中各组分含量为(0.2ml中的含量,即每只动物的免疫量):Ag包含Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μg,CpG 75μg,Al(OH)3 0.35mg;生理盐水组动物注射0.2ml生理盐水。
表3给药实验组的用药对照表
组别 | 剂量(每只豚鼠免疫量) |
AG(抗原组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μg |
Ag+Al(抗原和Al(OH)3组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mg |
Ag+CpG(抗原和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgCpG 75μg |
Ag+Al+CpG(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mgCpG 75μg |
末次免疫后2周解剖所有豚鼠,观察豚鼠的肝、脾、肺、***等各脏器结核病变程度,并以双盲法进行病变评分;脾脏结核杆菌荷菌量:脾脏匀浆后作系列稀释,再接种改良罗氏培养基,计数结核杆菌菌落形成单位,计算其对数值,作统计学处理。
各组脏器结核病变评分见表4和图16。
表4脏器病变评分
脾脏结核杆菌荷菌量结果见表5和图17。
表5脾脏结核杆菌荷菌量(lgCFU)
从上述实验结果可见,Ag+Al+CpG实验组豚鼠的各脏器病变评分低于其他各实验组,并显著低于对照组。脾脏结核杆菌荷菌量也有相同的变化趋势。
值得一提的是,在结核疫苗效力评价领域中,豚鼠脾脏中结核杆菌荷菌量降低1-2个lgCFU,都是非常不容易的,这相应于整个荷菌量降低了一到两个数量级。如果一个结核疫苗和空白对照组相比,能在脾脏结核杆菌荷菌量上降低1-2个lgCFU,即可提示该疫苗具有很好的保护效果。有文献报道,抗结核杆菌的有效疫苗(如卡介苗)在保护效果上也是降低1-2个lgCFU:如文献(1)BCG组与阴性对照组相比,在攻击后20-60天内,肺和***荷菌量降低约1个lgCFU(DianeOrdway,Marcela Henao-Tamayo,Crystal Shanley,et al.Infl uence ofMycobacterium bovis BCG Vaccination on Cellular Immune Response of GuineaPigs Challenged with Mycobacterium tuberculosis.CLINICAL AND VACCINEIMMUNOLOGY,Aug.2008,p.1248-1258);文献(2)BCG组与对照组相比,肺荷菌量降低约1.35个lgCFU(SUSAN L.BALDWIN,CELINE D’SOUZA,ALAN D.ROBERTS,et al.Evaluation of New Vaccines in the Mouse and Guinea Pig Model ofTuberculosis.INFECTION AND IMMUNITY,June 1998,p.2951-2959)。本发明的结核疫苗与生理盐水对照组相比,脾脏荷菌量降低近1个lgCFU,与Al(OH)3组,或者BCG-CpG-DNA组相比,lgCFU的值降低了0.4-0.5个lg值,说明此种复合疫苗具有较好的保护效果。
实施例5不同剂量BCG-CpG-DNA与Al(OH)3构成的复合佐剂与抗原(Ag85b+CFP10-ESAT6+HspX)联合免疫后对豚鼠的抗结核保护作用
以结核分枝杆菌感染豚鼠,将感染豚鼠随机分为Ag、Ag+Al、Ag+Al+CpG1、Ag+Al+CpG2、Ag+Al+CpG3、Ag+Al+CpG4、Ag+Al+CpG5实验组和NS对照组。在感染后5天根据分组给各组动物免疫相应药物,以后每隔2周免疫1次,共免疫3次。每次免疫方式为后退肌肉注射0.2ml/只,疫苗中各组分浓度为:Ag为Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX按1∶1∶1混合,浓度均为50μg/ml(每种抗原注射至每只豚鼠为10μg);CpG1、CpG2、CpG3、CpG4和CpG5浓度分别为62.5μg/ml、250μg/ml、375μg/ml、500μg/ml和750μg/ml(每只豚鼠接受的CpG剂量分别为12.5μg、50μg、75μg、100μg和150μg);Al(OH)3浓度为1.75mg/ml(每只豚鼠接受的剂量为0.35mg);生理盐水组动物注射0.2ml生理盐水。
表6给药实验组的用药对照表
组别 | 剂量(每只豚鼠免疫量) |
Ag(抗原组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μg |
Ag+Al(抗原和Al(OH)3组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mg |
Ag+Al+CpG1(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mgCpG 12.5μg |
Ag+Al+CpG2(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mgCpG 50μg |
Ag+Al+CpG3(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mgCpG 75μg |
Ag+Al+CpG4(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mgCpG 100μg |
Ag+Al+CpG5(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA组) | Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10μgAl(OH)3 0.35mgCpG 150μg |
自结核杆菌感染后7周解剖所有豚鼠,观察豚鼠的肝、脾、肺、***等各脏器结核病变程度,并以双盲法进行病变评分;脾脏结核杆菌荷菌量:脾脏匀浆后作系列稀释,再接种改良罗氏培养基,计数结核杆菌菌落形成单位,计算其对数值,作统计学处理。结果如下:
表7脏器病变评分和脾脏结核杆菌荷菌量(lgCFU)
组别 | 脏器病变指数(X±SD) | 脾脏结核菌荷菌量lgCFU(X±SD) |
N.S | 50.8±16.9 | 5.45±0.76 |
Ag | 62.2±20.2 | 5.61±0.51 |
Ag+Al | 58.3±25.5 | 5.30±0.35 |
Ag+Al+CpG1 | 59.4±15.3 | 5.68±0.44 |
Ag+Al+CpG2 | 35.6±18.1 | 5.04±0.81 |
Ag+Al+CpG3 | 42.2±19.2 | 4.47±1.82 |
Ag+Al+CpG4 | 39.4±17.2 | 4.96±0.97 |
Ag+Al+CpG5 | 42.8±18.9 | 4.88±0.61 |
脏器外观:阴性对照组和Ag组豚鼠肺和脾上有大量、明显的结核病灶,肝上也可见到典型的结核病灶;Ag+Al和Ag+Al+CpG1组豚鼠各脏器结核病变依然严重;Ag+Al+CpG2、Ag+Al+CpG3、Ag+Al+CpG4和Ag+Al+CpG5组豚鼠各脏器结核病变得到不同程度的抑制,说明结核杆菌的增殖受到有效抑制,特别是Ag+Al+CpG3组豚鼠各脏器结核病灶明显减少。
与病变评分结果类似,Ag组、Ag+Al、Ag+Al+CpG1组和阴性对照组豚鼠脾脏结核杆菌的负荷均较高,但Ag+Al+CpG2、Ag+Al+CpG3、Ag+Al+CpG4和Ag+Al+CpG5组豚鼠脾脏结核杆菌得到不同程度的抑制,进一步说明本发明的疫苗可有效抑制结核杆菌在豚鼠体内的增殖,特别是Ag+Al+CpG3组豚鼠脾脏结核杆菌负荷明显降低。
从实验看,BCG-CpG-DNA用量为25μg-200μg,Al(OH)3的量为0.05mg-0.7mg时,两者联用能产生更好的免疫效果。
Claims (16)
1.一种结核亚单位疫苗,其特征在于包含Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白,并进一步包含Al(OH)3和BCG-CpG-DNA,所述的BCG-CpG-DNA是BCG的DNA提取物,其为片段长短不等的BCG DNA片段的混合物。
2.如权利要求1所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX以独立的蛋白形式存在,或者以任何两种或三种或四种蛋白的融合蛋白形式存在。
3.如权利要求2所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、ESAT6、CFP10、HspX的含量为单位剂量疫苗中每种蛋白5μg-20μg。
4.如权利要求3所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、ESAT6、CFP10、HspX的含量为单位剂量疫苗中每种蛋白5μg-10μg。
5.如权利要求4所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、ESAT6、CFP10、HspX的含量为单位剂量疫苗中Ag85b 10μg、ESAT65μg、CFP105μg、HspX10μg。
6.如权利要求2所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、ESAT6、CFP10、HspX的重量比为0.5-2∶0.5-2∶0.5-2∶0.5-2。
7.如权利要求6所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、ESAT6、CFP10、HspX的重量比为1∶0.5∶0.5∶1。
8.如权利要求2所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX以Ag85b、融合蛋白CFP10-ESAT6和HspX的形式存在。
9.如权利要求8所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX的含量为单位剂量疫苗中每种蛋白5-20μg。
10.如权利要求9所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX的含量为单位剂量疫苗中每种蛋白10μg。
11.如权利要求8所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX的重量比为0.5-2∶0.5-2∶0.5-2。
12.如权利要求11所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX的重量比为1∶1∶1。
13.如权利要求1-12任一项所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的含量为单位剂量疫苗中Al(OH)30.05mg-0.7mg,BCG-CpG-DNA25μg-200μg。
14.如权利要求13所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的含量为单位剂量疫苗中Al(OH)30.1mg-0.35mg,BCG-CpG-DNA75μg。
15.如权利要求1-12任一项所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的重量比为28∶1-1∶4。
16.如权利要求15任一项所述的结核亚单位疫苗,其特征在于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的重量比为14∶3-4∶3。
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