CN115976088B - 低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用 - Google Patents

低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用。本发明提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量中的应用。本发明发现罗氏真养菌H16_A0228、H16_B0917蛋白的失活能够明显降低罗氏真养菌的内毒素含量。H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白功能缺失的工程化罗氏真养菌不仅内毒素含量显著降低，同时其细胞干重和PHA产量显著提高，为PHA的工程化菌株的开发提供了新的基因和菌株资源，为降低PHA的内毒素含量提供了有效方法，对于拓展PHA在医疗材料中的应用具有重要意义。

Description

低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用。
背景技术
内毒素是多数革兰氏阴性菌细胞外膜的一种成分，细胞外膜是一种不对称的脂质双层，主要由作为内层的磷脂和作为外层的脂多糖组成。脂多糖则由疏水性的脂质A(LipidA)、亲水性的非特异性核心多糖(Core polysaccharides)和长链的O抗原多糖(O-antigen)组成，核心多糖含有一个外己糖区域和一个内庚糖区域，分别与特异性多糖和脂质A相连，长链的O抗原多糖赋予菌株一种特异性表面抗原，由重复的寡糖亚基组成，脂质A则是引起内毒素毒性的关键成分。已有文献报道脂质A缺陷对大多数其他革兰氏阴性细菌是致命的(Clementz,T.Inhibition of lipopolysaccharide biosynthesis and cell growthfollowing inactivation of the kdtA gene in Escherichia coli.[J].Journal ofBiological Chemistry,1995,270(46):27646.)。
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的高分子聚合物，具有多元材料学性能，在医疗、农业、环保、化工等领域都得到了广泛的应用，尤其在医疗材料领域，由于其具备优异的材料性能，被认为是一种具有广阔应用前景的材料。然而生物合成的PHA不能直接和人体接触，必须除去热原成分(如内毒素)才是能达到医用级的PHA 材料。
罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，又名Cupriavidus necator)，是革兰氏阴性菌中的一种，也是可用于合成PHA的菌株之一。然而PHA材料中残留的内毒素(endotoxin)极大地限制了PHA在医疗材料中的应用，因此纯化后的PHA需要最大限度的降低内毒素的含量。目前尚未发现对罗氏真养菌进行基因改造以降低其内毒素含量的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供在罗氏真养菌中降低内毒素的含量的方法。本发明的另一目的是提供一种降低内毒素含量的工程化罗氏真养菌。
本发明以罗氏真养菌为研究对象，开发通过基因工程改造降低其内毒素含量的方法。在研发过程中，本发明发现，罗氏真养菌的脂质A的分子量、脂肪酸链结构等化学结构与大肠杆菌等其他革兰氏阴性菌存在较大差异，例如：罗氏真养菌的脂质A多出一个4-氨基-4-脱氧-L-***糖，而且罗氏真养菌的脂肪酸链的一级酰基链为C14，且同时在2和2’位置各产生一条二级酰基链，二级酰基链也均为C14(大肠杆菌的一级酰基链为C14，二级酰基链中有一条是C12)。而目前发现的革兰氏阴性菌脂质A的脂肪酸链的合成酶普遍具有底物特异性，不同长度脂肪酸链的合成由不同的酶催化(例如月桂酰转移酶催化C12脂肪酸链的合成，豆蔻酰转移酶催化C14脂肪酸链的合成)。由此推知罗氏真养菌中参与脂质A及其脂肪酸链的合成的酶及其合成、调控机制可能与大肠杆菌等其他革兰氏阳性菌明显不同，但目前尚未见关于罗氏真养菌中脂质A及其脂肪酸链的合成途径和相关酶的报道。
此外，本发明在研发过程中曾尝试在罗氏真养菌利用现有技术公开的降低大肠杆菌、百日咳杆菌等革兰氏阴性菌的内毒素毒性或含量的方法，例如：敲除用于调控脂肪酸链转移到脂质A的碳骨架上msbB和pagP基因同时过表达Francisella tularensis来源的内膜磷酸酶lpxEft以改变脂质A的结构，以及，表达来自铜绿假单胞菌来源的酰基转移酶LpxDpa、LpxApa以使得不同位置酰基链长度改变，但是，上述方法均无法在罗氏真养菌中实现降低内毒素含量的目的，进一步证明了罗氏真养菌中脂质A及其脂肪酸链的化学结构特征导致其合成酶及其合成、调控机制可能与大肠杆菌等其他革兰氏阳性菌明显不同。
经不断尝试，本发明意外地发现，罗氏真养菌H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的弱化或敲除能够显著降低其内毒素的含量，而且，还有利于PHA产量和生物量的提升。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量中的应用。
第二方面，本发明提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在提高罗氏真养菌的PHA产量中的应用。
第三方面，本发明提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在提高罗氏真养菌的生物量中的应用。
第四方面，本发明提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量同时提高罗氏真养菌的PHA产量和生物量中的应用。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量、提高罗氏真养菌的PHA产量和/或提高罗氏真养菌的生物量中的应用。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供罗氏真养菌H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量、提高罗氏真养菌的PHA产量和/或提高罗氏真养菌的生物量中的应用。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量、提高罗氏真养菌的PHA产量和/或提高罗氏真养菌的生物量中的应用。
上述应用中，生物量的提高可表现为细胞干重的提高。
本发明中，H16_A0228、H16_B0917为蛋白的编码基因在GenBank中的locus_tag，在GenBank中可获得H16_A0228、H16_B0917蛋白及其编码基因的序列。
具体地，H16_B0917蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示，H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。H16_A0228蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示，H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
H16_B0917蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)具体如下：
MKHRLQAALTIAVFKLVAALPYGVTARLGDAIGKLLYRIPSRRRRIVHTNLSLCFPDMDADTRDKLARNHFGHVLRSYLERGVQWFGSAERLGKLVELDSRIDLASCAEHPTIFMGFHFVGIEAGCMFYSMRHPVASLYTRMSSQMLEDISRTQRGRFGAEMIPRSGSGKQVVRTLRAGCPVMLASDMDFGINDSVFVPFFGVPACTLTSASRLASMTGARVVPFTTEVLPDYRGYRLRIFDPLEGFPSGSVEEDSRRMNAFLEAQIATMPEQYYWIHRRFKNRPAGMPSVY。
H16_A0228蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)具体如下：
MSRVFTWLGIGLLTVLGKLPYPFVARFGEALGSLLYLVPSERRRVVQANLRLCFPDRTEAEIDELSRQSFRILFRSFAERGIFWTGSEAQMRRWVQIDDQAGLVALDGTPHILVTLHLSGVEAGAIRLTIDLREHLGRSGASLYTRQKNDLFDHFLKHARGRFGANMISRNDSARDILRCLKKGEALQLIADMDFGERDSEFVPFFGVQALTLTSVSRLARLTGAKVVPIYTEMLPDYQGYVLRILPPWEDYPGASVTDDTRRMNAFFEDCIRPRVPEYYWVHKRFKHRLPGEPEIY。
上述应用中，表达和/或酶活性降低包括减弱所述蛋白的表达和/或酶活性，或者使得所述蛋白不表达或失活。
对于实现表达和/或酶活性降低的方式，本发明没有特殊限制，例如，可采用基因工程手段对目标蛋白、其编码基因、其调控元件和/或其调节基因或蛋白进行修饰，以使得目标蛋白的表达量和/或酶活性降低。
在本发明的一些实施方式中，H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低通过以下(1)～(3)中的任意一种或多种方式的组合实现：
(1)对蛋白的氨基酸序列进行突变以使得蛋白的表达和/或酶活性降低；
(2)对蛋白的编码基因的核苷酸序列进行突变以使得蛋白的表达和/或酶活性降低；
(3)将蛋白的编码基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更弱的元件以使得蛋白的表达量降低。
以上所述的氨基酸序列的突变包括缺失、***或替换一个或多个氨基酸。
以上所述的核苷酸序列的突变包括缺失、***或替换一个或多个核苷酸。
以上所述的转录、翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点等。
在本发明的一些实施方式中，所述H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低通过失活所述蛋白实现。
在本发明的一些实施方式中，所述H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低通过缺失所述蛋白的编码基因(H16_B0917基因、H16_A0228基因)实现。
第五方面，本发明提供一种工程化罗氏真养菌，所述工程化罗氏真养菌被修饰以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低。
在本发明的一些实施方式中，所述工程化罗氏真养菌被修饰以使得其中H16_A0228蛋白的表达和/或酶活性降低。
在本发明的一些实施方式中，所述工程化罗氏真养菌被修饰以使得其中H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低。
在本发明的一些实施方式中，所述工程化罗氏真养菌被修饰以使得其中H16_A0228蛋白和H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低。
上述表达和/或酶活性降低包括减弱所述蛋白的表达和/或酶活性，或者，使得所述蛋白不表达或失活。
在本发明的一些实施方式中，H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低通过以下(1)～(3)中的任意一种或多种方式的组合实现：
(1)对蛋白的氨基酸序列进行突变以使得蛋白的表达和/或酶活性降低；
(2)对蛋白的编码基因的核苷酸序列进行突变以使得蛋白的表达和/或酶活性降低；
(3)将蛋白的编码基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更弱的元件以使得蛋白的表达降低。
以上所述的氨基酸序列的突变包括缺失、***或替换一个或多个氨基酸。
以上所述的核苷酸序列的突变包括缺失、***或替换一个或多个核苷酸。
以上所述的转录、翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点等。
在本发明的一些实施方式中，所述工程化罗氏真养菌中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白失活，或者，所述工程化罗氏真养菌不表达H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述工程化罗氏真养菌缺失H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的编码基因。
第六方面，本发明提供以上所述的工程化罗氏真养菌在生物化学品的发酵生产中的应用。
以上所述的生物化学品包括但不限于聚酯类、醇类、氨基酸类、多肽类、蛋白质类、核酸类、糖类、脂类物质等。
在本发明的一些实施方式中，提供以上所述的工程化罗氏真养菌在PHA或其衍生物的发酵生产中的应用。
在本发明的一些实施方式中，利用上述工程化罗氏真养菌发酵生产PHA物以植物油(包括但不限于棕榈油、棕榈仁油、花生油、大豆油、亚麻油、菜籽油、棉籽油、蓖麻油、玉米油中的一种或多种的混合物)为碳源进行。
用于发酵生产的培养基中还可包含氮源(包括但不限于铵盐)、无机盐(包括但不限于磷酸氢二钠、磷酸二氢钾)、微量元素(包括但不限于镁、钙、锌、锰、钴、硼、铜、镍、钼)。
第七方面，本发明提供以上所述的工程化罗氏真养菌的构建方法，所述方法包括：修饰罗氏真养菌以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低。
第八方面，本发明提供一种降低罗氏真养菌的内毒素含量的方法，所述方法包括：修饰罗氏真养菌以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低。
在本发明的一些实施方式中，所述表达和/或酶活性降低为失活H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白，或者为使得罗氏真养菌不表达H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白。
本发明的有益效果在于：本发明提供的罗氏真养菌H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的失活能够明显降低罗氏真养菌的内毒素含量。H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白功能缺失的工程化罗氏真养菌不仅内毒素含量显著降低，同时其细胞干重和PHA产量显著提高，为PHA的工程化菌株的开发提供了新的基因和菌株资源，对降低PHA的内毒素含量提供了有效方法，对于拓展PHA在医疗材料中的应用具有重要意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，所用酶试剂购自New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
以下实施例中使用的培养基配方如下：
种子培养基：10g/L peptone，5g/L Yeast Extract，3g/L glucose。
生产培养基：1.0％棕榈油，9.85g/L Na2HPO4〃12H2O,1.5g/L KH2PO4，3.0g/LNH4Cl，10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的组成为：20g/LMgSO4，2g/L CaCl2。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO4〃7H2O，30mg/LMnCl2〃4H2O，300mg/L H3BO3，200mg/L CoCl2〃6H2O，10mg/L CuSO4〃5H2O，20mg/LNiCl2〃6H2O，30mg/LNaMoO4〃2H2O。上述试剂均购自国药集团化学试剂公司。
实施例1H16_B0917缺失突变株的构建及鉴定
本实施例以罗氏真养菌H16作为出发菌，敲除H16_B0917基因，具体包括如下步骤：
步骤一：构建基础质粒
以罗氏真养菌H16基因组为模板，使用917H1-F和917H1-R进行PCR扩增得到H16_B0917的上游同源臂917-H1，使用917H2-F和917H2-R进行PCR扩增得到H16_B0917的下游同源臂917-H2；以修饰后的质粒pK18mob为模板，使用pK-F、pK-R为引物PCR扩增得到载体片段，将917-H1、917-H2通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pKO-H16_B0917(序列如SEQ ID NO.1所示)。以上使用的引物如表1所示。
表1
步骤二：构建H16_B0917缺失突变的目标菌株
将步骤一获得的重组质粒pKO-H16_B0917转化至大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌H16中，利用***质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有500μg/mL壮观霉素、100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有壮观霉素抗性的克隆，并使用引物917-H1FP(SEQ ID NO.19)：ATGTCGCTGACCGACGACCATGTC和917-H1RP(SEQ ID NO.20):TTGGCACCACCAGCCTGACCAATG进行PCR鉴别H16_B0917基因敲除的重组菌株，最终获得的重组菌为敲除H16_B0917基因的罗氏真养菌Re01。
实施例2 H16_A0228缺失突变株的构建及鉴定
本实施例以罗氏真养菌H16作为出发菌，敲除H16_A0228基因，具体包括如下步骤：
步骤一：构建基础质粒
以罗氏真养菌H16基因组为模板，使用228H1-F和228H1-R进行PCR扩增得到H16_A0228的上游同源臂228-H1，使用228H2-F和228H2-R进行PCR扩增得到H16_A0228的下游同源臂228-H2；以修饰后的质粒pK18mob为模板，使用pK-F、pK-R为引物PCR扩增得到载体片段；将228-H1、228-H2通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pKO-H16_A0228(序列如SEQ ID NO.2所示)。使用的引物如表2所示。
表2
步骤二：构建H16_A0228缺失突变的目标菌株
将步骤一获得的重组质粒pKO-H16_A0228转化至大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌H16中，利用***质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有500μg/mL壮观霉素、100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有壮观霉素抗性的克隆，并使用引物228-H1FP(SEQ ID NO.21):ATCGATACCACCGAGATCCATTCG和228-H1RP(SEQ ID NO.22):AGCTGCATGGCTTTGACGACTACC进行PCR鉴别H16_A0228基因敲除的重组菌株，最终获得的重组菌为敲除H16_A0228的罗氏真养菌Re02。
实施例3H16_B0917和H16_A0228双缺失突变株的构建与鉴定
本实施例以实施例2构建的罗氏真养菌Re02为出发菌，敲除H16_B0917基因，具体步骤如下：
将实施例1中获得的重组质粒pKO-H16_B0917转化至大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法转入实施例2构建的罗氏真养菌Re02中，利用***质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有500μg/mL壮观霉素、100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有壮观霉素抗性的克隆，并使用引物917-H1FP：ATGTCGCTGACCGACGACCATGTC和917-H1RP:TTGGCACCACCAGCCTGACCAATG进行PCR鉴别H16_B0917基因敲除的重组菌株，最终获得的重组菌为同时敲除H16_B0917和H16_A0228的罗氏真养菌Re03。
实施例4菌株Re01，Re02，Re03的性能验证
本实施例以罗氏真养菌H16为对照菌，对Re01，Re02，Re03进行发酵后的内毒素含量、生物量及PHB含量的测试。
步骤一：菌株Re01、Re02、Re03的发酵培养
将Re01、Re02、Re03及罗氏真养菌H16在LB平板上进行平板划线，得到单克隆，将单克隆接种于种子培养基(4mL)中，培养12小时。将过夜培养的菌液转接到装有10mL种子培养基的100mL玻璃锥形瓶，接种终OD量约0.1，30℃，220rpm，培养8h，即可进行转接培养。PHA发酵生产的培养是将OD值在6-7之间的前培养种子液，按终OD为0.1的终接种量接种于装有30mL生产培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm发酵培养48h。每株菌设置3个平行。
步骤二：菌株Re01、Re02、Re03的内毒素含量测定
取上述步骤一发酵后的1mL新鲜菌液，13400g离心1min收集菌体，弃上清，随后使用30％的乙醇溶液重悬菌体后离心，并弃上清，重复上述步骤两次，洗涤菌体。最后使用去离子水将菌体稀释至OD600为0.5，在100℃下裂解30min，然后在室温下放置24小时使内毒素充分释放。使用ToxinSensor显色法LAL内毒素检测试剂盒检测内毒素含量。检测结果如表3所示。相比于对照菌株罗氏真养菌H16，Re01、Re02、Re03的内毒素单位含量分别降低46倍、52倍、95倍。
上述ToxinSensor显色法LAL内毒素检测试剂盒购自金斯瑞生物科技股份有限公司。
表3
步骤三：菌株Re01、Re02、Re03的生物量测定
取上述步骤一的发酵液量使用50mL量筒量取菌液体积(记为V，单位：mL)，置于已称重的离心管中(重量记为m1，单位：g)，8000rpm，室温，离心10min，弃上清，收集菌体；随后使用15mL 30％的乙醇溶液，重悬菌体，8000rpm，室温，离心10min，重复两次，洗去菌株中的油脂及培养基，最后将收集菌体的离心管置于60℃烘箱中，烘至恒重，并利用分析天平精确称取其重量(记为m2，单位：g)。并计算其干重。结果如表4所示。相比于对照菌株罗氏真养菌H16，Re01、Re02、Re03的生物量分别提高27.8％，17.9％，28.2％。
上述干重计算公式为M＝(m2-m1)/V*1000，单位为g/L。
表4
菌株 干重(g/L)
罗氏真养菌H16 8.37±0.89
Re01 10.70±1.80
Re02 9.87±1.10
Re03 10.73±2.35
步骤四：菌株Re01、Re02、Re03的PHB含量测定
1、样品处理：称取上述步骤三烘干后的样品精准称重30～40mg置于消解管中，加入2mL的酯化液和2mL氯仿，酯化管加盖密封100℃反应4h，反应结束后静置冷却至室温，加入1mL去离子水，涡旋震荡至完全混合，静置分层后，取下层有机相进行气相色谱法分析。
上述酯化液配置方法为取485mL无水甲醇，加入1g/L的苯甲酸，缓慢加入15mL浓硫酸，即制为500mL的酯化液。
2、标准品处理：聚[(R)-3-羟基丁酸]，用于标定3HB单元，白色粉末，称取梯度值为15mg、25mg、35mg，称量方式及处理方式与上述样品处理方式相同。
3、GC分析PHA组成及含量：使用岛津公司的GC-2014型气相色谱仪。色谱仪的配置为：HP-5型毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器FID，SPL分流进样口；高纯氮气作为载气，氢气为燃气，空气为助燃气；使用AOC-20S型自动进样器，丙酮为洗涤液。GC分析程序的设置为：进样口温度240℃，检测器温度250℃，柱温起始温度为80℃，维持1.5分钟；以30℃/分钟的速率升至140℃并维持0分钟；以40℃/分钟的速率升至240℃并维持2分钟；总计时间为8分钟。GC结果采用内标归一法根据峰面积进行定量计算PHB含量。结果如表5所示，相比于对照菌株，RE01，RE02，RE03的PHB含量分别提高7.02％，5.42％，9.61％。
表5
菌株 PHB％
罗氏真养菌H16 70.59％
Re01 75.55％
Re02 74.42％
Re03 77.38％
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量中的应用；所述H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达降低在提高罗氏真养菌的PHA产量中的应用；所述H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达降低在提高罗氏真养菌的生物量中的应用；所述H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量同时提高罗氏真养菌的PHA产量和生物量中的应用；所述H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌被修饰以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达降低；
所述H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求5所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白失活，或者，所述工程化罗氏真养菌不表达H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白。
7.权利要求5或6所述的工程化罗氏真养菌在生物化学品发酵生产中的应用。
8.权利要求5或6所述的工程化罗氏真养菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：修饰罗氏真养菌以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达降低。
9.一种降低罗氏真养菌的内毒素含量的方法，其特征在于，所述方法包括：修饰罗氏真养菌以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达降低；
所述H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
10.根据权利要求9所述的降低罗氏真养菌的内毒素含量的方法，其特征在于，所述表达降低为失活H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白，或者，使得罗氏真养菌不表达H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白。
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