CN1375009A - 抗昆虫的水稻植物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新的水稻植物,以及通过施用Cry9C蛋白控制鳞翅目水稻昆虫包括水稻折叶虫、水稻蛀基昆虫、水稻切根虫、水稻粘虫、水稻棘球绦虫的方法。在本发明优选的实施方案中,该施用是通过在水稻植物中表达Cry9C蛋白实现。
Description
引言
本发明涉及控制水稻昆虫害虫的方法，水稻昆虫害虫包括鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫；尤其选自以下一组的昆虫：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，以及稻弄蝶；其中主要的是二化螟，白禾螟属incertulas，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟；此方法涉及将本发明定义的Cry9C蛋白应用于被保护的地区和植物。在本发明优化的具体实施案例中，Cry9C蛋白是通过在水稻基因组中稳定整合了一段编码Cry9C蛋白的DNA的水稻植株进行表达的。
本发明还涉及通过Cry9C蛋白的表达而具备抗水稻害虫的水稻植株，涉及具有抗水稻害虫活性的杀虫剂组分，具体包括鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫；尤其包括选自以下一组的昆虫：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，以及稻弄蝶；其中主要的是二化螟，白禾螟属incertulas，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟，杀虫成分包括Cry9C晶体，晶体蛋白，或其中作为活性组分的活性片断。
本发明还涉及应用编码由此处定义的杀虫性的Cry9C蛋白的一段DNA序列，使水稻植物获得抗昆虫性。
发明背景(i)发明领域
苏云金芽孢杆菌(“Bt”)是一种***，它能在芽孢中产生晶体。组成晶体的蛋白质已被证明具有抗昆虫幼虫的毒性。根据氨基酸的序列已经对这些晶体蛋白及其相应的基因进行分类(Crifkmore等，1998)。Cry9C蛋白是一种杀虫蛋白，最先是从苏云金芽孢杆菌发现的(Lambert等，1996)。由于表达Cry9C蛋白的转基因玉米具有令人感兴趣的抗玉米昆虫害虫的活性，它已经被成功的用于防止玉米地中的害虫侵袭(Jansens等，1997)。对Cry9C蛋白及其变种以及它们在几种植物中的表达产物的描述见PCT专利出版物WO 94/05771，WO 94/24264，WO 99/00407，以及美国专利5,885,571和5,861,543(其内容并入本文作为参考文献).
昆虫害虫是稻米生产的重要限制因素，并且在所有水稻生长的环境都会发生。害虫严重减少稻米产量，据报道在亚洲(除中国之外)由于害虫造成的减产约为31.5％(Heinrichs，1994)。(ii)相关专业技术说明
通过在植物中表达编码苏云金芽孢杆菌中的杀虫性的Cry1Ab或Cry1Ac蛋白(e.g.，Fujimoto等，1993；Wunn等，1996；Wu等，1997；Ghareyazie等，1997；Nayak等，1997；和Cheng等，1998)，植物血凝素(Rao等，1998)或蛋白酶抑制剂(Xu等，1996；Duan等，1996)的基因，有几种类型的水稻获得了对一些有害的鳞翅目类水稻昆虫害虫的昆虫抵抗力。从苏云金芽孢杆菌中分离出的晶体蛋白，对鳞翅目类水稻昆虫害虫的的毒性成分已被评估为Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1F，Cry1G，及Cry2A蛋白(Karim等，1997；Lee等，1997b)。
为了防止或延迟持续暴露在表达了Bt蛋白的植物中的昆虫害虫的抗性形成，优选具有不同来源的并在水稻植物含量较高的Bt蛋白，同时优选在一株植物中对具有不同种作用方式抗性基因能够进行组合表达的Bt蛋白。本发明提供了表达Cry9C蛋白的新型水稻，该蛋白对相关水稻昆虫害虫产生了高剂量影响，并且形成了新品种的商品化的水稻植物，这一品种能够更好地防御害虫的侵害，同时防止和延迟害虫中抗性的形成。
于九月20-24(1999)在泰国普吉召开的水稻生物技术国际计划大会上，Cohen等发表了优化Bt水稻高剂量附加防御抗性的管理策略(参见摘要25页)。
发明概要
本发明提供了对下列害虫具有抗性的水稻植物：1)鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，和或者水稻折叶虫；2)选自以下一组的昆虫包括：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，以及稻弄蝶；3)选自以下一组的昆虫包括：二化螟，白禾螟属incertulas，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟。这类水稻植物包含一段稳定整合在植物基因组的可在植物中表达的DNA序列，它编码的蛋白包括SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。本发明还提供包含一段能够编码Cry9C蛋白的DNA序列的水稻植物的种子，谷物和经过加工的谷物。
在另一个本发明的具体实施案例中，在这类水稻植物的基因组中还包括一段DNA序列，它编码的蛋白是选自如下一组蛋白：Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1I，Cry1J，Cry2A，Cry6B，Cry3A，蛋白酶抑制剂，豇豆胰岛素抑制剂，蛋白酶抑制剂II，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，GNA植物血凝素，Xhenorhabdus或Photorhabdus spp.杀虫蛋白，对草铵膦具有抗性的蛋白质。
本发明还提供一种方法用于获得对以下几组害虫具有抗性的水稻植株及其后代：1)鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，和或者水稻折叶虫；2)选自以下一组的昆虫包括：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，以及稻弄蝶；3)选自以下一组的昆虫包括：二化螟，白禾螟属incertulas，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟；方法包括利用一段DNA序列转化水稻，其中DNA序列是可在植物中表达的，且它编码由SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列组成的蛋白的DNA序列；或者是能够编码由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA序列。
本发明还提供一种方法用于生产对以下几组害虫：1)鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，和或者水稻折叶虫；2)选自以下一组的昆虫包括：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，以及稻弄蝶；3)选自以下一组的昆虫包括：二化螟，白禾螟属incertulas，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟，具有抗性的水稻植株和繁殖材料，如种子。方法包括利用一段DNA序列转化水稻，其中DNA序列是可在植物中表达的，且它所编码的蛋白包括由SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列；或者是能够编码包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列。
在另一个具体实施案例中，提供了控制以下几组害虫的方法：1)鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，和或者水稻折叶虫；2)选自以下一组的昆虫包括：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，以及稻弄蝶；3)选自以下一组的昆虫包括：二化螟，白禾螟属incertulas，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟，方法包括利用杀虫剂量的蛋白质与上述的害虫进行接触，其中蛋白质包括SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列或者包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，同时这一方法中还包括以下几个步骤：利用编码上述蛋白质的DNA序列转化水稻，在稻田中培植含有上述DNA序列的上述植株及其后代。而且，本发明还提供通过以上任一种方法获得的植株，种子和谷物。优化具体实施案例的详述
本发明所提供的新型转基因水稻植物，尤其是稻属(Oryza)中的各种，优选Oryza sativa，表明它们适合防止下列几类害虫的侵害：鳞翅类具体包括鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫；较适合的二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，以及稻弄蝶，尤其是二化螟；最适合的包括禾草螟属各种，刷须野螟属各种，野螟属各种，以及白禾螟属各种中的昆虫。通过在水稻中表达编码Cry9C蛋白质的DNA，可以得到这样的转基因水稻。利用本发明的植株能够很好地控制鳞翅类水稻昆虫害虫，尤其是鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫；尤其是二化螟，三化螟，斜纹贪夜蛾，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，秘夜蛾属unipuncta，禾草螟属zacconius，以及稻纵卷叶野螟。还可以利用本发明的Cry9C蛋白控制其它相关的昆虫害虫，例如水稻蛀虫米螟和其它的鳞翅目类贮藏害虫。
在本发明优化的具体实施案例中，Cry9C蛋白被用来控制水稻昆虫害虫，如二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属Polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，秘夜蛾属unipuncta，禾草螟属zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；优选的是二化螟，三化螟，刷须野螟属patnalis，和稻纵卷叶野螟。Cry9控制的优选目标是鳞翅目类水稻昆虫，其中属于此类的害虫有水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫。
Cry9C可以按照传统的方法从几种Bt菌株中分离得到，或者通过重组表达得到，如PCT专利出版物WO 94/05771，WO 94/24264，WO 99/00407，以及美国专利5,885,571和5,861,543的描述。
此处引用的术语“Cry9C蛋白”是指包括SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列的杀虫蛋白质，或包括SEQID NO：4所示序列中从氨基酸位点1到氨基酸位点625的氨基酸序列的杀虫蛋白质，以及保持杀虫活性的这两种蛋白的变体，如在PCT专利出版物WO 94/24264详述的蛋白酶抗性的丙氨酸变体。这个术语包括晶体蛋白、前毒素或它们具有杀虫效应的形态，例如利用蛋白酶消化前毒素得到的毒素，或者具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中从位于氨基酸位点1和44之间的一个氨基酸位点到位于氨基酸位点658和666之间的一个氨基酸位点形成的氨基酸序列的一种蛋白质，同时还包括融合蛋白或它的具有蛋白酶抗性的变异体。已知Cry9C蛋白的某些氨基酸可以被其它等价的氨基酸所替换，而且仍然保持了全部或某些杀虫活性，参见参考文献中的例如PCT专利出版物WO 99/00407。这些蛋白都包括在Cry9C蛋白范围内。本发明中最优选的Cry9C蛋白形式是包含SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658之间的氨基酸序列的蛋白，或包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白质。
此处引用的“cry9C DNA”是指编码Cry9C蛋白的任何DNA序列，包括天然的，重组的，半合成的或合成的DNA序列，并且包括调节区域或不编码氨基酸序列的其它区域，如内含子、前导序列或尾随序列、启动子和3′转录末端以及聚腺苷酰化序列。“Cry9C编码区”是指从起始密码子开始到终止密码子结束并且能够编码Cry9C蛋白的任何核苷酸序列。由于遗传密码的简并性，一些氨基酸密码子可以用其它的密码子替换而并不改变蛋白质的氨基酸序列。本发明中有关cry9C DNA的一个实施例是序列SEQ IDNO：3所示的DNA。此处引用的“嵌合cry9C基因”是指由两侧连接调节元件的cry9C编码区构成的cry9C DNA，调节元件如启动子和转录末端序列及聚腺苷酰化序列，它们可以使Cry9C蛋白在植物，尤其是水稻植物的细胞中进行表达。对于应用于此的其它的苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白或毒素片断，用“Cry”来表示，如Crickmore等的描述(1998)。在Cry之后只使用一个数字和一个字母时，如Cry1B，表示所有的以所列的数字和字母开头的相关序列，其中既包括前毒素也包括任何有杀虫效应的片断，如经蛋白酶处理得到的毒素(例如，“Cry1B”包括所有的Cry1B的形式如“Cry1Ba1”和“Cry1Bb1”)。
此处引用的对昆虫具有“抵抗力”或“抗性”的植物，以及对昆虫的侵染或侵袭具有“抵抗力”或“抗性”的植物，是指由人为作用，具体的是经过本发明的DNA转化，或者喷洒本发明的杀虫剂形成的植物，它们显示出明显增强了对昆虫的控制能力，否则这些昆虫将侵害此种植物。包括明显增强了摄食抑制，生长抑制或摄食植物的昆虫的致死率。在本发明最优选的具体实施案例中，本发明中的转基因植物的抗虫性是指对昆虫的完全防御能力，它可以通过由这类昆虫对植物引起的较小的侵害来测定(例如，对蛀茎昆虫来说，水稻的茎杆中没有通道)，抗虫性或者是指与没有害虫侵害的同样条件下达到几乎相同的产量。在最优选的实施案例中，本发明水稻的抗虫性是指在十天之内，最好在5天之内，杀死至少90％，优选至少95％以本发明的Cry9C水稻为食的昆虫。
本发明中，植物-可表达的DNA序列是能够表达植物中的基因产物蛋白质的一段DNA序列。在本发明最优选的具体实施案例中，这一DNA序列包含调节元件，调节元件可以使被引进植物基因组的编码序列正确地转录并翻译得到所需要的蛋白质。具有代表性的，本发明的植物-可表达的DNA序列能够在植物细胞尤其是水稻的细胞中进行转录的启动子区。植物-可表达的DNA序列还可以包括其它的元件如3′转录终止序列和聚腺苷酰化序列或内含子。
本文应用的植物或植物细胞的“基因组”是指存在于植物或植物细胞中的全部遗传物质，包括但并不局限于线粒体、叶绿体和核DNA。本文应用的在基因组中“稳定整合”的DNA是指以能够遗传给植物后代的方式进行整合的DNA，优选的方式是将DNA整合到植物的基因组尤其是核DNA中。本文应用的植物的“后代”是指植物的下一代，包括从一个植株获得的种子、后代植株以及通过包括植物繁殖可获自或取自植物的细胞、组织或完整植株，由它们可获得具有相同或不同遗传物质的更多植株或下代。
本文应用的“加工谷物”是指利用一种或几种加工方法处理过的谷物，尤其是被用于饲料和食品的加工谷物。谷物的加工过程包括但不限于研磨、粉碎、半熟化、脱皮等。来自本发明水稻Cry9C蛋白的加工和未加工谷物，以及谷物中所包含的本发明的嵌合基因，都包括在本发明的范围内。
在本发明的一个具体实施案例中，Cry9C蛋白与其它的杀虫蛋白相结合，提供了更好防御相关水稻害虫的能力，同时防止和延迟昆虫的抗性形成。优选的蛋白选自以下一组蛋白：Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1I，Cry1J，Cry2A，Cry6B，Cry3A，蛋白酶抑制剂如豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI，Xu等，1996)，蛋白酶抑制剂II(pinII，Duan等，1996)或半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Irie等，1996)，GNA植物血凝素(Galanthus nivalis agglutinin，Rao等，1998)，Xhenorhabdus或Photorhabdus spp杀虫蛋白如Bowen等(1998)ffrench-Constant和Bowen。(1999)，PCT专利出版物WO 98/08388，WO 99/03328，WO 95/00647，WO 97/17432，WO 98/05212，或WO 98/08932中的描述，或对水稻害虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌或蜡状芽孢杆菌衍生蛋白，主要针对的水稻害虫包括水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫；具体是针对禾草螟属各种，野螟属各种，刷须野螟属各种，白禾螟属各种，更具体是针对二化螟，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟，及三化螟。在优化的具体实施案例中，Cry9C蛋白主要通过在转基因水稻中的联合表达，与至少一种选自以下的蛋白相结合或者这些蛋白质中的活性成分相结合：Cry1Ab，Cry1B，Cry2A，Cry1C(优选Cry1Ca4)。
而且，为了筛选转基因的植物细胞和/或使田间植物具有对除草剂的抗性，优选编码具有抗草铵膦蛋白的DNA序列，因此包含这种蛋白的植物细胞或植物可以在草铵膦分子的有毒浓度中进行正常生长，具体包括来自吸水链霉菌或绿色产色链霉菌的phosphinothricin乙酰转移酶，如在PCT专利出版物WO 87/0569，美国专利US5,561,236和US5,276,268中的描述。
为了在大肠杆菌，其它细菌或植物中表达Cry9C蛋白，可以在DNA的两侧引入适当的限制性酶切位点，这一操作可以利用众所周知的方法(Stanssens等，1989；White等，1989)通过定点突变来完成。
另外，由于Cry9C蛋白可以结合在与昆虫肠膜上的Cry1A型Bt蛋白不同的受体上，这一点可用于将表达Cry9C蛋白的转基因水稻和表达一种在靶昆虫中具有与Cry9C蛋白不同结合位点的蛋白质，如Cry1A或Cry2A蛋白的转基因植物进行交配。同样，可以利用cry9C DNA和编码在靶昆虫中具有与Cry9C蛋白不同结合位点的蛋白质的DNA，如cry1A DNA包括截短的具有杀虫效应的Cry1Ab5蛋白，进行水稻的转化，以便获得能够表达这两种昆虫控制蛋白的转基因植物或其后代。编码cry1A蛋白质的DNA，可以从任意的已经在植物包括在水稻或玉米中成功表达的，并且能够编码由Crickmore等人列出的Cry1A中的任一种蛋白质的DNA序列中筛选得到(1998(关于其全长序列，可参见引用的参考文献或数据库的编号))包括但不限于这些蛋白质的杀虫片断，优选这个DNA序列编码的Cry1Ab或Cry1Ac蛋白，尤其是Hofte等人的Cry1Ab5蛋白(1986)或它具有杀虫性的片断。在美国专利US5,866,784中已经报道了几种方法用于获得至少两种植物的Bt毒素的组合表达，这些方法包含在本发明的研究范围内。
可以将cry9C基因，优选的是cry9C嵌合基因，按照传统的方式稳定地***到水稻细胞的核基因组中，这样转化的细胞可以按照传统的方式得到再生并产生抗害虫的转化的水稻植株及其后代(种子和下一代)。在这一点上，根癌土壤杆菌中的卸载(disarmed)Ti质粒，由于包含具有杀虫相应的cry9C基因组分，它可以被用来转化水稻细胞，然后利用PCT专利发表的WO 92/09696中描述的方法，从转化的水稻细胞再生出转化的水稻植株。利用土壤杆菌进行转化所优选的组织包括但不局限于成熟的种子-衍生的愈伤组织，未成熟的胚芽-衍生的愈伤组织，及未成熟的胚芽。在与土壤杆菌共培养之前，使这些组织受伤，并且利用乙酰丁香酮或如PCT专利WO 98/37212中描述的其它的植物苯酚化合物，进行前诱导。优选的Ti质粒载体每一个都包含Ti质粒DNA的cry9C嵌合基因，它位于边缘序列之间，或至少位于右端边缘序列的左侧。当然，其它类型的载体也可以被用来转化植物细胞或植株，采用的方法包括直接基因转移(如在EP 0,233,247中的描述)，花粉介导的转化(如在EP 0,270,356，PCT WO 85/01856，及美国专利US4,684,611中的描述)，植物RNA病毒介导的转化(如在EP 0,067,553和美国专利US4,407,956中的描述)，脂质体介导的转化(如在美国专利US4,536,475中的描述)，以及其它的方法包括Shimanoto等(1989)和Datta等(1990)的水稻转化法，和用于转化单子叶植物的不同方法，如在PCTWO 93/21335和WO 92/09696中的描述。任何已知的用于转化水稻的方法都适合用于获得本发明的转基因水稻。所得到的转基因水稻可以按照传统的植物养植方法用来生产更多的具有相同特征的转基因水稻，或者将cry9C基因引入其它的水稻变异体或相关的植物品种。优选的水稻包括稻属的各个种的植株，尤其是Oryza sativa，优选的是日本(japonica)，印度(indica)或爪哇(javanica)品种的水稻，无论是在土壤，水，高地，rainfed低地，深水，漂浮生长的水稻，还是可灌溉的水稻。从转化的水稻植物获得的种子，包含cry9C基因，它是作为稳定的基因组的***成分存在于核、线粒体或叶绿体的基因组中。转化水稻的细胞可以按照传统的方式进行培养，生产出具有杀虫效应的Cry9C蛋白。
将Cry9C DNA***水稻细胞的基因组，使***的DNA位于启动子的下游(即3′端)，并且受启动子的控制，启动子可以指导植物细胞中的DNA表达。这一操作优选在植物细胞基因组中***cry9C嵌合基因来完成。优选的启动子包括：花椰菜花叶病毒分离物CM 1841(Gardner等，1981)，CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)中的强组成型35S启动子(“35S promoters”)；泛蛋白家族的启动子(如，Christensen等的玉米泛蛋白启动子，1992，参见Cornejo等，1993)；gos2启动子(Pater等，1992)；emu启动子(Last等，1990)；水稻肌动蛋白启动子如Zhang等描述的启动子(1991)；TR1′启动子和TR2′启动子(“TR1′启动子”和“TR2′启动子”是各自独立的)，它们各自驱动T-DNA中的1′和2′基因的表达(Velten等，1984)。或者，还可以利用非组成型的启动子，但是它们对植物的一种或几种组织或器官(如，叶子，茎，木髓和/或根组织)具有特异性，使得***的9C基因部分只能在特定的组织或器官中表达。例如，具有杀虫效应的cry9C基因部分能够在水稻的叶片和茎中进行选择性的表达，或通过在花粉中没有活性的启动子进行表达。其它的启动子包括光-诱导的启动子如水稻的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子，或另一种植物如豌豆的此基因的启动子，如在专利US 5,254,799中的描述。其它可选择使用的启动子是表达可以诱导的启动子(如，由于摄食昆虫，温度或化学因素造成的伤害引起的诱导)。当然，任何已知的能够在水稻尤其是叶子和茎中高度表达的启动子，都可以用于本发明。
将Cry9C DNA***水稻细胞的基因组，使***的基因部分位于基因组的适当的3′末端转录调节信号(即转录形成和聚腺苷酰化信号)的上游(即5′端)。这一操作优选在植物细胞基因组中***cry9C嵌合基因来完成。优选的聚腺苷酰化和转录形成信号包括章鱼肉碱合成酶基因(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)中的这两种信号，这两种基因在转化水稻植株中作为3′-非转录DNA序列。
Cry9C DNA可作为杂合基因被随意地***植物基因组中(Vaeck等，1987)，并受到与选择性标记基因相同的启动子的控制，因此植物能够表达同时保持两种蛋白质活性的融合蛋白。这样，可通过提高培养基中选择性标记试剂的浓度筛选出高表达的Cry9C蛋白。
本发明还提供了一种方法用于制备抗以下害虫的水稻：鳞翅目类昆虫，尤其是二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，秘夜蛾属unipuncta，禾草螟属zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；优选的是禾草螟属各种，野螟属各种，刷须野螟属各种，以及白禾螟属；最优选的是二化螟，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟，和三化螟。这个方法的特点是利用编码Cry9C蛋白的DNA序列，以已知的步骤转化水稻。在本发明优选的方法中，利用编码Cry9C蛋白的DNA序列转化水稻所产生的植株可以抵抗鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫的侵害。
本发明的另一具体实施案例，提供了一种用于生产水稻及其繁殖材料如种子的方法，它们能够抗选自以下一组昆虫的侵害：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，秘夜蛾属unipuncta，禾草螟属zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；优选的是禾草螟属各种，野螟属各种，刷须野螟属各种，以及白禾螟属；最优选的是二化螟，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟，和三化螟，方法包括利用编码Cry9C蛋白的DNA序列转化水稻细胞，再生产出包含有上述DNA序列的植株和繁殖材料。在优选的具体实施案例中，提供的方法用于生产水稻及其繁殖材料如种子，它们可以抵抗鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫的侵害，方法包括利用编码Cry9C蛋白的DNA序列转化水稻细胞，再生产出包含有上述DNA序列的植株和繁殖材料。
本发明还提供了控制以下害虫的方法：鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫；特别是二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，秘夜蛾属unipuncta，禾草螟属zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；优选的是禾草螟属各种，野螟属各种，刷须野螟属各种，以及白禾螟属；最优选的是二化螟，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟，和三化螟；方法包括利用杀虫剂量的Cry9C蛋白与上述的害虫进行接触。在最优选的具体实施案例中，通过在田间播种、栽培或耕作转化水稻以表达Cry9C蛋白进行这种接触。这种情况下，只有试图以水稻为食的水稻害虫才受到Cry9C蛋白的影响。
在本发明的另一个具体实施案例中，可以将含有杀虫效应剂量的Cry9C蛋白的组合物播洒在水稻上，以使这些害虫与Cry9C蛋白相接触。这种组合物的常规配方，是利用Cry9C蛋白作为活性组分，加上适当的载体，稀释液，乳化剂和/或分散剂(如Bernhard和Utz的描述，1993)。杀虫的组合物可以配制成湿润的粉末，丸剂，颗粒或尘粒，或利用水或无水溶剂制成液体配方如泡沫，凝胶，悬浮液，浓缩液等。在这些组合物中Cry9C蛋白的浓度取决于配方的属性和最终的应用方式。通常，可利用本发明的杀虫组合物来保护水稻田，使用一次可以持续1至2周抵抗鳞翅目类昆虫的侵害。为了更深度的防护(如，整个生长季节)，在使用喷洒组合物的情况下，应该定期的使用附加用量的组合物。Bt细胞或晶体，晶体蛋白，前毒素，毒素，以及具有杀虫效应的前毒素的组分和其它的杀虫剂，还有杀真菌剂，杀虫剂，除草剂和化肥，能够与Cry9C一起使用，可以获得额外的好处。通常，组合物中Cry9C蛋白的浓度占配方总重量的至少0.1％到100％，更常用的浓度占配方总重量0.15％到0.8％。
本发明也提供了一种生产加工和未加工水稻谷粒的方法，包括在田间种植本发明的Cry9C水稻，并收获及处理种子，获得加工和未加工水稻谷粒。本发明中经转化或处理过的水稻植株的产量获得提高。
可以利用已经建立的程序测定抗以下昆虫的蛋白毒性：鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻折叶虫，二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，秘夜蛾属unipuncta，禾草螟属zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶。适用于本发明的测定方法是用含有蛋白(确定浓度)的溶液浸湿一层水稻种子或叶片。然后将幼虫放在种子或叶片上，放置一定时间之后，计算死亡的幼虫的数目并对存活的幼虫进行称重。在同一次测试中，设置适当的对照样品以便测定同一条件下的背景死亡率和标准的幼虫生长状况。利用加上了或加进了蛋白质的人造食物或加上了蛋白质的水稻种子或水稻叶片可以进行相似的试验，如Lee等(1997a)或Theunis等(1998)的描述。按照常规操作，选用合适的对照如以体外试验的一段切割的茎或一个完整的植株检验***作为对照体系，可以测定表达了本发明蛋白质的转基因水稻对昆虫的毒性，如Nayak等(1997)或Ghareyazie等(1997)的描述。
可以在水稻田里捕捉水稻害虫并可以按照已知的方法进行养殖(参见如Kamano和Sato，1985，二化螟的养殖)对于白禾螟属的incertulas种，例如，可以应用Yannian等(1998)描述的养殖方法。鳞翅目类水稻昆虫害虫的分类学可以通过此领域的普通技术人员已知的方法进行测定，参见，如Barrion和Litsinger(1994)。
本发明中用于控制以下害虫的方法：鳞翅类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫，或者水稻leaffolders；特别是选自以下一组的昆虫：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，秘夜蛾属unipuncta，禾草螟属zacconius，Hereitogrammalicarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；优选的是禾草螟属各种，Cnaphalocrocis spp，刷须野螟属各种，以及白禾螟属；最优选的是二化螟，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟，和三化螟；优选包括将杀虫剂量的Cry9C蛋白施用(例如，喷洒或在转基因植物中表达)到受保护的田地或地区。受保护的田地或地区可以包括，例如，昆虫害虫的栖息地，水稻生长的田间。或将要种植水稻的地区。
下列实施例用于说明本发明，而不意味限制本发明的范围。
在说明书和实施例中涉及的序列表如下：
序列表：
SEQ ID NO：1-自然发生的Cry9C蛋白和cry9C DNA序列
SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：1所示的Cry9C蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：3-在水稻中进行表达的cry9C DNA和Cry9C氨基酸序列
SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：3所示的Cry9C蛋白的氨基酸序列
在实施例中除非另有说明，所用制备和操作重组DNA的方法按照下列文献描述的标准方法进行：Sambrook等，分子克隆-实验室手册(MolecularCloning-A Laboratory Manual)，第二版(Second Ed)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY(1989)，Ausubel等卷1和卷2分子生物学现行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，现行方法(CurrentProtocols)USA。用于植物分子生物学的材料和方法的描述参见由BIOS科学出版有限公司(UK)和Blackwell科学出版社(UK)联合出版的植物分子生物学(Plant Molecular Biology Labfax)，R.R.D.Croy著。
实施例实施例1：Cry9C蛋白对水稻昆虫害虫的杀虫性
通过昆虫摄食试验，评估Cry9Ca蛋白对挑选的水稻害虫的毒性。
利用水稻叶的浸沾试验，检验水稻折叶虫、稻纵卷叶野螟、刷须野螟属patnalis种，将易受折叶影响的各种水稻叶子用来测定纯化的Cry9Ca(R164K)蛋白(LC50)(一种Cry9Ca蛋白，在它的氨基酸序列中164位点的精氨酸被赖氨酸取代，因此增加了对蛋白酶的稳定性)的半致死浓度。将叶片胞浸泡在0，0.025，0.1，0.39，1.56，6.25，25及100微克/ml一系列浓度的经胰蛋白酶-处理的Cry9C(R164K)活性毒素浴液中。所有的稀释溶液都用含有0.01％Triton X-100无菌蒸馏水来制备，叶片风干30分钟后，放置于培养皿中并在每种浓度的样品中加入10条新生幼虫，每种浓度使用五片叶子，一个叶片代表一次重复，在侵染96个小时之后统计死亡率。利用田间试验/农业研究管理软件(ARM version 6.0.2；Gylling DataManagement(GDM)，1999)通过最小概率方差方法(Probit-Least SequareMethod)计算半致死浓度(LC50)。
对于稻纵卷叶野螟，LC50的值是0.956微克/ml(置信界限在95％置信度：0.64-1.52微克/ml)，对于刷须野螟属patnalis种，LC50值是1.230微克/ml(置信界限在95％置信度：0.82-1.92微克/ml)。因此Cry9C蛋白对水稻折叶虫，稻纵卷叶野螟和刷须野螟属patnalis种具有较高的毒性。利用对蛀茎昆虫敏感的各种水稻的叶鞘，通过水稻的浸沾试验检测斑纹蛀茎昆虫和二化螟，将叶鞘浸泡在一系列胰蛋白酶-处理的Cry9C(R163k)活性毒素的稀释溶液中，测定了五个浓度，阴性对照是：0微克/ml Cry9Ca蛋白，所有的稀释溶液都用含有0.01％Triton X-100无菌蒸馏水来制备，叶鞘风干后，将其放置于培养皿中，并在每一个浓度的样品中加入五条新生幼虫，96小时候后统计死亡率，生物检测重复10次。利用田间试验/农业研究管理软件(ARM version 6.0.2；Gylling Data Management(GDM)，1999)通过最小概率方差方法计算半致死浓度(LC50)。LC50的值是6.44微克/ml(95％置信度，置信界限：5.74-7.23)，因此可以发现Cry9C蛋白对斑纹蛀茎昆虫具有较高毒性。
将天然的Cry9Ca蛋白(SEQ ID ND：2)施用于以上昆虫得到相似的结果。
在利用新生幼虫进行的相似的昆虫叶片浸沾摄食试验中，也发现Cry1Ca4蛋白对水稻切根虫，斜纹贪夜蛾种(LC50：019μg/ml(置信界限在95％置信度：0.02-0.62)具有较高的毒性，选择Cry1Ca4溶液的一系列浓度(0.1，0.39，1.56，6.25，25及100μg/ml无菌水，加入0.01％Triton X-100)用于检测斜纹贪夜蛾种新生幼虫的活性。将穿孔(直径6cm)蓖麻叶浸泡于Cry1C溶液并风干，再将处理过的叶片放置于配有潮湿滤纸垫的培养皿中，并且在每一个重复样品中用10新生幼虫进行侵袭。培养96小时之后，测定死亡率。S.litura新生幼虫是通过一天内产生的同一批卵在25℃(+/-1℃)下进行孵化得到的，以确保孵化的同一性。利用其它的Cry1Ca蛋白进行此试验可以得到相似的结果。
利用Cry9Ca(R164K)毒性蛋白片断对斜纹贪夜蛾种进行同样的试验，在叶浸沾试验的几次重复试验中得到的结果是：LC50的值是19.63μg/ml(95％置信度，置信界限：12.61-33.55)
因此，对于水稻切根虫，斜纹贪夜蛾种，Cry1C和Cry9C都是具有较高毒性的蛋白。实施例2：利用cry9C嵌合基因转化水稻
可以利用Deblaere等(1985，1987)描述的载体***进行水稻植株的转化。载体***包含一个土壤杆菌的菌株和两个质粒组分：1)一个中间克隆载体，和2)一个非致癌Ti-质粒。
中间克隆载体实质上是从pGSC1700(Cornelissen andVandewiele，1989)衍生得到，它包含一个人造的T区，由pTiB6S3中的TL-DNA的左侧和右侧边界序列及可以使嵌合基因***到T-DNA边界的重复序列之间的多接头克隆位点构成。***到T-DNA边界的重复序列之间的T-DNA编码两个基因，即一个嵌合棒基因和一个嵌合cry9C基因。嵌合棒基因，提供对草铵膦或phpsphinothricin的抗性，它是由CaMV35S启动子(Odell等，1985)控制的吸水链霉菌(PCT专利出版WO 87/05629)的phpsphinothricin乙酰转移酶基因的编码区，CaMV35S3′转录末端和聚腺苷酰化区(Mogen等，1990)所组成的。嵌合棒基因可以用作选择性标记，并且提供了对于施用于田间的以草铵膦作为活性组分的商品化除草剂的抗性。嵌合cry9C基因是由CaMV35S启动子(Odell等，1985)控制的SEQ IDNO：3的编码区，两侧连接CaMV35S的3′转录末端和聚腺苷酰化区(Mogen等，1990)组成。
受体土壤杆菌菌株载有一个非致癌性(卸载)Ti质粒，它是将Ti质粒中的T-DNA删除而保留了正常的病毒转移基因。这个质粒也具有一个同源区，可以与中间克隆载体形成共合体。中间载体在大肠杆菌中构建，通过包含一个载有转移协助质粒的大肠杆菌的三亲株交配，将中间载体转移到受体根癌土壤杆菌菌株(Van Haute等，1983，Deblaere等，1987)。所获得的土壤杆菌菌株中的T-DNA的结构可以通过DNA印迹杂交进行测定(Deblaere等，1985)。
利用土壤杆菌介导的基因转移，将中间克隆载体转移到水稻基因组的位于T-DNA边界重复序列之间的DNA片断。将源自日本和印度的水稻栽培变种的未成熟胚胎或愈伤组织，切成小块，作为转化的靶组织，采用的技术参见PCT专利WO 92/09696的描述。将这一组织与土壤杆菌共培养，然后将草铵膦添加到水稻组织培养基中，筛选出被转化的水稻细胞。
将生长在草铵膦上的Calli转移到再生培养基，当水稻苗生出根和芽之后，将它转移到土壤中置于温室进行培养。转化作用可以通过phosphinothricin乙酰转移酶试验，应用于叶片的草铵膦，以及定量ELISA，PCR和DNA印迹分析等方法进行鉴定。植株开花后进行自受粉，成熟以后收获种子。
也可以通过对受伤的致密的胚胎发生的愈伤组织进行电穿孔获得Cry9C转化株，如美国专利US5,679,558的描述。除上述的嵌合基因，还可以构建其他的嵌合cry9C基因在水稻中进行表达，包括不同的可在植物中表达的启动子如泛蛋白和gos2启动子(Christensen等，1992，dePater等，1992)。利用上述的土壤根菌转化程序，这些嵌合基因也可以被用来转化水稻。
可以利用DNA印迹方法对具有单拷贝的整合在水稻基因组的cry9c嵌合基因的水稻植株进行筛选，利用ELISA试验和蛋白质印迹对叶片和茎中的Cry9C蛋白的表达水平进行分析。检测由成功转化的植株的种子长成的植株中Cry9C蛋白的表达和抗虫性。按照以上的方法，利用嵌合cry9C基因也可以对印度型水稻植株进行转化，当把转化的植株转移到温室之后，评估植株的转化效果和昆虫抗性。
将上述的Cry9C印度型水稻种系与一个由能够编码截短的Cry1Ab5蛋白(具有Hofte等的氨基酸序列从氨基酸位点2到616，以甲硫氨酸和丙氨酸开始)的嵌合基因转化的印度型水稻种系进行交配，以提高植物对昆虫的抗性，并且防止和延迟昆虫抗性的形成。如上所述，编码截短的Cry1Ab5蛋白的嵌合基因中包含泛蛋白和gos2启动子，可以利用这个基因获得Cry1Ab5-表达的水稻植株。按照以上的说明，同样可以利用能够编码Cry1Ca4蛋白活性组分并在植物中表达的嵌合基因转化水稻。实施例3：表达Cry9C的日本型转化水稻的昆虫抗性
从利用35S-cry9C嵌合基因转化的实施例2中的日本型水稻获得的具有ELISA阳性的抗鳞翅目类水稻害虫杀虫活性和抗除草剂活性的T1后代植株，对它们的评估最初是通过在温室中记录摄食这类植株的二化螟幼虫生长速率和死亡率来进行。将所得的结果与摄食未经转化的水稻品种Chiyonishiki叶片的幼虫的生长速率和死亡率进行比较。
在两次温室试验中，完成四个转化(ROS-012-2805，-2401，-2702，-3703是已经被证实表达了Cry9C蛋白的转化植株)和一个阴性对照，Chiyonishiki水稻，评估它们对二化螟的抗性。将转化的水稻品系在温室中进行播种，待长出第四片叶子时，在植株上喷洒草铵膦以区分非转基因植株和转基因植株。
当植株开始分蘖时，连续两天对植株进行侵染，每一植株使用一个卵块。分别在侵染20-35天和70天以后，植株的虫害程度以0(即没有虫害)到3(即严重虫害)这样的等级进行评价。只有在植株抽穗之前，侵染才能重复进行。在侵染44-52天以后，评价对茎的外部所受虫害。侵染70天以后，解剖植株并计算含有昆虫隧道的茎的数量。Chiyonishiki植株的受虫害程度达到2.5-3.0级，证明生长阶段的害虫侵染是成功的并且未转化植株受到具有较高程度的虫害。这一结论同样适用于抽穗前阶段的侵染，因为大部分Chiyonishiki对照植株显示出二化螟的隧道。经过生长阶段侵染之后，转化水稻品系中的三种，即ROS12-2805，-2401，-2702表现出很低的受虫害程度，其中最大的植株虫害等级为0.25。
所有转基因Cry9C水稻植株显示出的有隧道的茎的数量低于Chiyonishiki对照植株。受评估的转化品系之一的ROS12-3703，完全没有受虫害并且茎杆根本没有隧道存在。
与摄食未转化植株的叶片的禾草螟属幼虫相比，摄食能够表达Cry9C蛋白的转化水稻植株的幼虫具有明显地较高的死亡率。而且，含有较高浓度Cry9C蛋白的植株比含有较低浓度的植株能够更好的防御害虫。在独立的昆虫毒性试验中，表达高含量Cry9C蛋白的转基因Cry9C植株能够很好的抑制其它的用于试验的昆虫如鳞翅目类水稻蛀茎昆虫和水稻折叶虫，尤其是三化螟，刷须野螟属patnalis以及稻纵卷叶野螟的侵害。
转化植株也能够被用来获得对其它害虫的抗性：其它的鳞翅目类如水稻弄蝶，大螟，斜纹贪夜蛾种，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，或稻弄蝶。实施例4：表达Cry9C的印度型转化水稻的昆虫抗性
从利用Pgos2-cry9C或Pubi-cry9C嵌合基因转化的实施例2中的印度型水稻获得的具有ELISA阳性的抗鳞翅目类水稻害虫杀虫活性和抗除草剂活性的T1后代植株，对它们的评估最初是通过在温室中记录摄食这类植株的三化螟和稻纵卷叶野螟的幼虫生长速率和死亡率来进行。将所得的结果与摄食未经转化的同一印度水稻品种的叶片的幼虫的生长速率和死亡率进行比较。
在温室试验中，七个转化的水稻品系(已经被证实是表达了Cry9C蛋白的转化植株，参见附表1)和一个未转化的阴性对照，印度型水稻，评估它们对三化螟和稻纵卷叶野螟的抗性。将转化的水稻品系在温室中进行播种，移植并且待长出第四片叶子时，在植株上喷洒草铵膦以区分非转基因植株和转基因植株。
在田间采集三化螟的幼虫，使它们在实验室里长成成虫，并采集它们的卵块。
移植4-5周后，每一个植株的分蘖以三化螟的五个卵块或幼虫进行侵染。侵染20-35天之后通过统计分蘖出现死心的数目相对于植株分蘖的总数目来记录植株受三化螟侵害的程度，分蘖出现死心是植株受蛀茎昆虫侵害的典型特征。在记录了虫害率之后，解剖植株并测定受虫害植株上的回收幼虫的数量(结果参见以下的附表1)。未转化的印度型水稻植株具有较高受虫害等级(分蘖总数的50-100％出现死心)，证明生长阶段的害虫侵染是成功的并且未转化植株受到较高程度的虫害，对于受虫害的植株，每一植株可以回收2-4只幼虫。
经过生长阶段侵染之后，转化水稻品系中的三种，即ROS045-01001，ROS046-00401，ROS048-00207表现出很低的受虫害程度，在所有植株的分蘖总数中每一个品系仅有1-2个分蘖出现死心。其它的品系完全防御受到三化螟的侵害。
移植6-8周后，每一个植株的分蘖以稻纵卷叶野螟的五个卵块或幼虫进行侵染。利用从0(没有虫害)到9(整个植株干枯)这样的等级统计植株受稻纵卷叶野螟的侵害程度。在记录了虫害率之后，解剖植株并测定受虫害植株上的回收幼虫的数量(结果参见以下的附表1)。
未转化的印度型水稻植株达到8级的较高受虫害程度，证明生长阶段的害虫侵染是成功的并且未转化植株受到较高程度的虫害，对于受虫害的植株，每一植株可以回收9-11只幼虫。
经过生长阶段侵染之后，所有转化品系显示出1-2级的很低的受虫害比率，表明它们能够完全防止受到稻纵卷叶野螟的侵害。一些轻微的侵害是正常的，因为昆虫需要通过消化水稻植株的物质材料才能体验Cry9C蛋白的毒性。
因此，通过这些温室植株侵染试验证实，同摄食未转化植株的鳞翅目类幼虫相比，摄食能够表达Cry9C蛋白的转化水稻植株的鳞翅目类幼虫具有明显地较高的死亡率。
不用说，本发明并不局限于上述的水稻植株和具体被应用的Cry9C蛋白。另外，本发明也包括Cry9C蛋白的任一种突变体或变异体，它们保持或提高了对鳞翅目类昆虫害虫的杀虫活性，如具有Cry9C蛋白的基本氨基酸序列并且保持Cry9C蛋白的基本杀虫活性的一种蛋白质(例如，一种杀虫性蛋白与含有SEQ ID NO：2或4所示序列或其中的杀虫效应的片断的蛋白质至少具有90％的氨基酸序列同一性，较好的至少具有95％的同一性，其中的杀虫性是针对二化螟和三化螟种)。而且，本发明也不局限于上述列举的水稻植株，还包括任意的水稻品种，杂交，自交或原种品系。而且任何易受到以下昆虫侵害的植株都包括在本发明之内，作为利用编码Cry9C蛋白的DNA转化的优选的靶目标，昆虫包括二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patanalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属polychrysus，南美稻白螟，小蔗杆草螟，草地夜蛾，秘夜蛾属unipuncta，禾草螟属zacconius，和稻弄蝶，尤其是二化螟，能够应用本发明的方法控制这些昆虫的植株还包括但不局限于其它的禾本科植物，如水燕麦，甘蔗，高粱，小麦，小米，单主寄生的水稻和印度玉米。本发明还提供一种方法用于保护除水稻之外的植物免受上述昆虫的侵害，这一方法包括利用编码Cry9C蛋白的DNA转化植物，或者将Cry9C蛋白施用于这些植物。
本发明中利用编码杀虫效应的Cry9C蛋白的DNA对水稻细胞进行转化并不局限于通过应用根癌土壤杆菌Ti质粒来完成。用于水稻转化的其它已知的技术，例如通过脂质体，电穿孔或基因枪轰击进行的直接基因转移，或利用基于植物病毒或花粉的载体***，可以用于以cry9C嵌合基因对水稻进行转化。表达可以在稳定转化的水稻植株细胞中进行，其中cry9C被整合在基因组，尤其是核基因组中，或者也可以在短暂转化的水稻植株细胞中进行。
可以确信用于转化水稻并使得水稻表达足够的Cry9C蛋白的任何方法，都能够被用于开发抗昆虫性的水稻植株。在这一点上，应该首选在个植株中表达至少两种非组成型结合Bt蛋白，如Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1C或Cry1B再加上Cry9C蛋白，以防止和延迟昆虫抗性的形成。表1
ND：未测定
| 项目 | 叶片组织中的Cry 9C(抽提蛋白总量的百分率) | 由三化螟引起的虫害 | 由稻纵卷叶野螟引起的虫害 | ||
| (出现死心的分蘖数)/(分蘖总数) | 每株回收的幼虫数 | 虫害率 | 每株回收的幼虫数 | ||
| ROS045-01001 | 1.91+/-0.44 | 1/34 | ND | 1-2 | ND |
| ROS046-00301 | 2.37+/-0.53 | 0/91 | ND | 1 | ND |
| ROS046-00401 | 1.32+/-0.44 | 2/57 | ND | 1 | ND |
| ROS045-02401 | 0.92+/-0.34 | 0/39 | ND | 1 | ND |
| ROS048-00207 | 1.16+/-0.49 | 1/55 | ND | 1-2 | ND |
| ROS053-00202 | 1.15+/-0.38 | 0/32 | ND | 1 | ND |
| ROS053-00306 | 1.42+/-0.19 | 0/36 | ND | 1 | ND |
| 未转化的对照 | 0 | 46/58 | 2-3 | 7-8 | 9-10 |
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405 410 415ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc gtg aat aga gct tct ttt 1296Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe
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435 440 445tgt aga gat ctc tat gat aca aat gat gaa tta cca cca gat gaa agt 1392Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser
450 455 460acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat gtt acc ttt ttt agc ttt 1440Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe465 470 475 480caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt gta cct act 1488Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr
485 490 495tat gtt tgg acc cgt cgt gat gtg gac ctt aat aat acg att acc cca 1536Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro
500 505 510aat aga att aca caa tta cca ttg gta aag gca tct gca cct gtt tcg 1584Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser
515 520 525ggt act acg gtc tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc 1632Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu
530 535 540cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga gta acg gtt aat 1680Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn545 550 555 560tca cca tta aca caa caa tat cgc cta aga gtt cgt ttt gcc tca aca 1728Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr
565 570 575gga aat ttc agt ata agg gta ctc cgt gga ggg gtt tct atc ggt gat 1776Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp
580 585 590gtt aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa 1824Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu
595 600 605tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct 1872Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro
610 615 620ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca gtg aat gca gaa ggt 1920Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly625 630 635 640gtt agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gat aga att gaa att gtc cct 1968Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro
645 650 655gtg aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gat tta gaa gcg gcg aag aaa 2016Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys
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675 680 685gtg aca gat tat caa gtg gac caa gcg gca aat tta gtg rca tgc tta 2112Val Thr Asp Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu
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740 745 750aac ggt gtt act att agc gag ggc ggt cca ttc ttt aaa ggt cgt gca 2304Asn Gly Val Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Phe Lys Gly Arg Ala
755 760 765ctt cag tta gca agc gca aga gaa aat tat cca aca tac att tat caa 2352Leu Gln Leu Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln
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1075 1080 1085gtc aca atc cga gat ggc gct cat cac caa gaa act ctt aca ttt aat 3312Val Thr Ile Arg Asp Gly Ala His His Gln Glu Thr Leu Thr Phe Asn1090 1095 1100gca tgt gac tac gat gta aat ggt acg tat gtc aat gac aat tcg tat 3360Ala Cys Asp Tyr Asp Val Asn Gly Thr Tyr Val Asn Asp Asn Ser Tyr1105 1110 1115 1120ata aca gaa gaa gtg gta ttc tac cca gag aca aaa cat atg tgg gta 3408Ile Thr Glu Glu Val Val Phe Tyr Pro Glu Thr Lys His Met Trp Val
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355 360 365Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr
370 375 380Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr385 390 395 400Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp
405 410 415Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser
420 425 430His Val Thr Phe Phe Ser Phe Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala
435 440 445Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp
450 455 460Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val465 470 475 480Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly
485 490 495Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu Arg Arg Thr Thr Ash Gly Thr Phe Gly
500 505 510Thr Leu Arg Val Thr Val Asn Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu
515 520 525Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg
530 535 540Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg545 550 555 560Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr
565 570 575Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile
580 585 590Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile
595 600 605Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu
610 615 620Asp625
Claims (14)
1.抗鳞翅目类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫或水稻折叶虫的水稻植株，它具有一段稳定整合在基因组并可在植物中表达的DNA序列，此DNA序列编码的蛋白质包括SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
2.抗选自以下一组昆虫的水稻植株，昆虫包括：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属Polychrysus，南美稻白螟，小蔗秆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，和稻弄蝶；水稻植株中具有一段稳定整合在基因组并可在植物中表达的DNA序列，此DNA序列编码的蛋白质包括SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
3.抗二化螟，三化螟，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟的水稻植株，它具有一段稳定整合在基因组并可在植物中表达的DNA序列，此DNA序列编码的蛋白质包括SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1至3所述的任一种植株的种子、谷物和加工后的谷物，它们具有一段编码上述蛋白的DNA序列。
5.如权利要求4所述的加工后的谷物，它是经过粉碎、研磨、脱皮和/或半熟化得到的谷物。
6.如权利要求1至3所述的任一种植株，在它的基因组中含有一段DNA序列，此DNA编码的蛋白质是选自以下一组蛋白质：Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1I，Cry1J，Cry2A，Cry6B，Cry3A，蛋白酶抑制剂，豇豆胰蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂II，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，GNA植物血凝素，Xhenorhabdus或Photorhabdus spp中的杀虫蛋白，和具有草铵膦de抗性的蛋白质。
7.一种用于获得抗鳞翅目类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫或水稻折叶虫的水稻植株及其后代的方法，它包括利用可在植物中表达的，编码具有SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质的一段DNA序列转化水稻植株。
8.一种用于获得抗选自以下一组昆虫的水稻植株及其后代的方法：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属Polychrysus，南美稻白螟，小蔗秆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，和稻弄蝶，它包括利用可在植物中表达的，编码具有SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者具有SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列的蛋白质的一段DNA序列转化水稻植株。
9.一种用于获得抗二化螟，三化螟，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟的水稻植株及其后代的方法，它包括利用可在植物中表达的，编码具有SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质的一段DNA序列转化水稻植株。
10.一种用于控制鳞翅目类水稻蛀茎昆虫，水稻弄蝶，水稻切根虫，水稻粘虫，水稻棘球绦虫或水稻折叶虫的方法，包括利用杀虫剂量的具有SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质与上述昆虫进行接触。
11.一种用于控制选自以下一组昆虫的方法：二化螟，三化螟，大螟，稻纵卷叶野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷须野螟属patnalis，刷须野螟属exigua，刷须野螟属ruralis，稻三点水螟，稻白禾螟，斜纹贪夜蛾，禾草螟属Polychrysus，南美稻白螟，小蔗秆草螟，草地夜蛾，美洲粘虫，禾草螟属zacconius，和稻弄蝶的方法，包括利用杀虫剂量的具有SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质与上述昆虫进行接触。
12.一种用于控制二化螟，三化螟，刷须野螟属patnalis，稻纵卷叶野螟的方法，包括利用杀虫剂量的具有SEQ ID NO：2所示序列中从氨基酸位点44到氨基酸位点658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质与上述昆虫进行接触。
13.如权利要求10至12所述的任一种方法，其中所述的接触包括利用编码上述蛋白质的一段DNA序列转化水稻植株，以及在田间培植具有上述DNA序列的上述植株及其后代。
14.利用如权利要求7至9所述的任一种方法获得的具有上述可在植物中表达的DNA序列的植株及其后代。
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