CN101045048B - 线粒体营养素组合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种混合物的用途，所述的混合物含有：(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐；(b)一种或多种选自下组的线粒体营养素：乙酰肉碱或其生理学可接受的盐、维生素E或其生理学可接受的盐、生物素或其生理学可接受的盐、辅酶Q10或其生理学可接受的盐、或尼克酸或其生理学可接受的盐；所述的混合物可用于制备预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗的药物或膳食添加剂，或用于制备预防、改善或治疗细胞线粒体代谢紊乱的药物或膳食添加剂。本发明还公开了一种用于预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗的组合物，本发明的组合物能够显著预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗，仅需很小的施用剂量即可获得显著的效果。

Description

线粒体营养素组合物的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，更具体的，本发明涉及线粒体营养素及其组合物在防治胰岛素抵抗和/或糖尿病中的应用。 

背景技术

糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是当今对人类影响最大的疾病之一，主要有1型和2型两大类型。2型糖尿病对人类的危害更大，其患者占糖尿病患者总数的90％以上。2型糖尿病通常表现为高血糖症，导致体内代谢功能紊乱，继而引发包括神经***疾病、肾病、视网膜病、高甘油三酯血症、肥胖症和心血管疾病等被称为代谢功能综合症的并发症。由于糖尿病能引发多种并发症，目前其已经成为世界第五大致死性疾病。 

已有报道，线粒体功能紊乱是导致胰岛素抵抗和2型糖尿病的重要原因；并且，线粒体的代谢，包括肌肉和脂肪细胞中的糖和脂肪酸代谢在胰岛素抵抗和2型糖尿病人中明显受损(Lowell BB，Shulman GI.(2005)Mitochondrial dysfunction and type 2diabetes.Science.21；307(5708)：384-387)。有很多涉及线粒体生成的转录因子，包括线粒体转录因子A(mtTFA)，线粒体转录因子B1(mtTFB1)，B2，核呼吸因子(NRF1和NRF2)和***相关的受体-α(GoffartS，Wiesner RJ.(2003)Regulation and co-ordination of nuclear gene expression duringmitochondrial biogenesis.Exp Physiol.88(1)：33-40)。过氧化物激活酶转录因子-γ激活因子-1α(PGC-1α)是具有多重调节功能的转录因子，是调节线粒体生成的关键因素，PGC-1α刺激NRF1和mtTFA的表达，从而启动编码线粒体蛋白的核基因和线粒体基因的表达(Wilson-Fritch L等(2003)；Mitochondrial Biogenesis and Remodeling during Adipogenesis andin Response to the Insulin Sensitizer Rosiglitazone.Mol Cell Biol.23(3)：1085-94)。线粒体基因组和核基因组之间的作用依赖于NRF1和mtTFA的调控，NRF1调节核编码的线粒体基因的转录并上调mtTFA的表达，核mtTFA可上调线粒体内mtTFA的转录。噻唑烷二酮类药物，如比格列酮可显著上调PGC-1α的表达和线粒体DNA的拷贝，促进白色脂肪组织的氧化磷酸化和增加胰岛素的敏感性(Wilson-Fritch L等(2004)；Mitochondrial remodeling in adipose tissueassociated with obesity and treatment with rosiglitazone.J Clin Invest.114(9)：1281-9)。因此，促进PGC-1α的表达、增加线粒体的生成可提高胰岛素的敏感性和增加葡萄糖的利用，这是治疗和预防胰岛素抵抗和2型糖尿病的有效措施。 

此外，在2型糖尿病中，线粒体氧化应激会导致的线粒体的功能衰退(Gerbitz，KD等(1996)；Mitochondria and diabetes，Genetic，biochemical，and clinical implications of the cellularenergy circuit.Diabetes.45(2)：113-126)。由高脂血症所引发的线粒体氧自由基的产生会损伤胰岛β细胞，因为胰岛β细胞缺乏抗氧化酶的活性，易产生氧化损伤。因此，预防和治疗线粒体的氧化损伤也是预防和治疗2型糖尿病的重要措施。但是，尽管目前由高脂血症诱导的氧化应激导致胰岛β细胞功能损伤近年来备受关注，应用有效的抗氧化剂和营养素来修复游离脂肪酸所致的损伤却少见有报道。 

R-硫辛酸(R-LA)是参与线粒体代谢机制中的一种辅酶。能还原为二氢硫辛酸，为硫辛酸乙酰转移酶的辅酶，它很容易进行氧化还原反应，故可保护巯基酶免受重金属离子的毒害(Packer L等(1995)；Alpha-Lipoic acid as a biological antioxidant.Free Radic BiolMed.19(2)：227-50)。乙酰肉碱(ALC)是L-肉毒碱的乙酰基衍生物，能够运输长链脂肪酸到线粒体内β-氧化，合成ATP，并且能够清除过多的短-中长链的脂肪酸。尽管R-LA或/和ALC被证实能够在衰老和退行性疾病中改善线粒体功能和延缓线粒体的衰退。但是，人们对R-LA、ALC以及其它营养素对于线粒体的作用机制仍然了解甚少，并且至今还没有揭示R-LA、ALC以及其它营养素对于预防与改善糖尿病以及胰岛素抵抗方面的作用。 

此外，已有研究表明，摄入维生素E可降低患2型糖尿病的风险，GK大鼠(2型糖尿病模型)饲喂含有0，20或500mg/kg α-生育酚的食物时，胰岛素分泌显著增加，血糖水平明显下降。血液中脂质和脂过氧化物水平的提高是导致糖尿病患者心血管疾病发生的主要危险因素，而糖尿病患者口服维生素E可明显减低糖尿病患者体内脂过氧化物和脂质水平。 

综上所述，目前相关研究大多仅限于单个营养素的应用，对于这些物质组成的复合物治疗糖尿病未见有报道，并且，现有技术中单个施用所述营养素时，施用剂量都在200mg-2000mg/天或更多，施用剂量大且效果不明显，因此，目前迫切需要开发施用剂量低且效果更明显的预防和治疗糖尿病以及胰岛素抵抗的药物。 

发明内容

本发明的目的在于提供线粒体营养素的混合物在制备预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗的药物或膳食添加剂，或制备预防、改善或治疗细胞线粒体代谢紊乱的药物或膳食添加剂中的应用。 

在本发明的第一方面，提供一种混合物的用途，所述的混合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐； 

(b)一种或多种选自下组的线粒体营养素：乙酰肉碱或其生理学可接受的盐、维生素E或其生理学可接受的盐、生物素或其生理学可接受的盐、辅酶Q10或其生理学可接受的盐、或尼克酸或其生理学可接受的盐； 

其中，所述的混合物用于制备预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗的药物或膳食添加剂，或用于制备预防、改善或治疗细胞线粒体代谢紊乱的药物或膳食添加剂、或用于制备增强抗氧化能力的药物或膳食添加剂。 

在本发明的另一优选例中，所述的组分(b)是乙酰肉碱或其生理学可接受的盐。 

在本发明的另一优选例中，所述的混合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐； 

(b)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐，以及一种或多种选自下组的线粒体营养素：维生素E或其生理学可接受的盐、生物素或其生理学可接受的盐、辅酶Q10或其生理学可接受的盐、或尼克酸或其生理学可接受的盐。 

在本发明的第二方面，提供一种组合物，所述组合物用于预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗，并且所述的组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐； 

(b)一种或多种选自下组的线粒体营养素：乙酰肉碱或其生理学可接受的盐、维生素E或其 生理学可接受的盐、生物素或其生理学可接受的盐、辅酶Q10或其生理学可接受的盐、或尼克酸或其生理学可接受的盐。 

在本发明的一个优选例中，所述的组分(b)是乙酰肉碱或其生理学可接受的盐。 

在本发明的另一优选例中，所述的组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐； 

(b)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐，以及一种或多种选自下组的线粒体营养素：维生素E或其生理学可接受的盐、生物素或其生理学可接受的盐、辅酶Q10或其生理学可接受的盐、或尼克酸或其生理学可接受的盐。 

在本发明的另一优选例中，组分(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐的含量是10-200重量份； 

并且当含有组分(b)中所述的一种或多种线粒体营养素时，所述的线粒体营养素含量是：乙酰肉碱或其生理学可接受的盐10-200重量份、维生素E或其生理学可接受的盐20-200重量份、生物素或其生理学可接受的盐0.2-2重量份、辅酶Q10或其生理学可接受的盐10-200重量份、或尼克酸或其生理学可接受的盐5-300重量份； 

并且，所述组分之和占组合物总重量的10-100％。 

在本发明的另一优选例中，所述组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：10-200重量份；和 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：10-200重量份； 

并且，组分(a)+(b1)之和占组合物总重量的25-100％。 

在本发明的另一优选例中，所述组合物中还含有： 

(c1)维生素E或其生理学可接受的盐：20-200重量份； 

(d1)生物素或其生理学可接受的盐：0.2-2重量份；和 

(e1)辅酶Q10或其生理学可接受的盐：10-200重量份。 

在另一优选例中，组分(a)与(b1)的重量比为1∶10-10∶1；更优选的，组分(a)与(b1)的重量比为1∶5-5∶1；最优选的，组分(a)与(b1)的重量比为1∶3-3∶1，比如，组分(a)与(b1)的重量比可以是1∶1。 

在另一优选例中，组分(a)+(b1)之和占组合物总重量的40-99％；更优选的，组分(a)+(b1)之和占组合物总重量的50-90％。 

在另一优选例中，所述组合物中含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：10-200重量份； 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：10-200重量份； 

(c1)维生素E或其生理学可接受的盐：20-200重量份； 

(d1)生物素或其生理学可接受的盐：0.2-2重量份；和 

(e1)辅酶Q10或其生理学可接受的盐：10-200重量份。 

在另一优选例中，所述的组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：100重量份。 

在另一优选例中，所述的组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(c1)维生素E或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(d1)生物素或其生理学可接受的盐：1重量份；和 

(e1)辅酶Q10或其生理学可接受的盐：100重量份。 

在另一优选例中，所述的组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(c1)维生素E或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(d1)生物素或其生理学可接受的盐：1重量份；和 

(e1)尼克酸或其生理学可接受的盐：100重量份。 

在另一优选例中，所述的组合物中还含有： 

(g)药学上或食品学上可接受的载体或赋形剂：50-1000重量份。 

在本发明的另一优选例中，所述的组合物中还含有：药学上或食品学上可接受的载体或赋形剂。 

在本发明的另一优选例中，所述的药学上或食品学上可接受的载体或赋形剂的含量为50-1000重量份。 

在本发明的另一优选例中，所述的组合物为药物组合物；或为食物组合物。 

在本发明的另一优选例中，所述的组合物为单元剂型，每剂含有20-200mg组分(a)、和20-200mg组分(b)；更优选的，每剂含有30-150mg组分(a)、和30-150mg组分(b)。 

在本发明的另一优选例中，每天服用所述单元剂型的组合物1-3剂；更优选的，每天服用所述单元剂型的组合物1-2剂。 

在本发明的另一优选例中，所述的组合物的剂型选自：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。 

在本发明的另一优选例中，所述的药学上或食品上学可接受的载体或赋形剂选自：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓/控释剂。 

在本发明的另一优选例中，所述的组合物与能量物质共同施用，所述的能量物质为碳水化合物。 

在本发明的另一优选例中，所述的组合物为一种膳食添加剂。 

在本发明的另一优选例中，所述的组合物被添加到水、非-橙汁饮品中，固体食品、烹饪菜肴中。 

在本发明的第三方面，提供一种混合物的用途，所述的混合物由(i)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐、(ii)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐构成，且组分(i)和(ii)的重量比为1∶20～20∶1，所述的混合物被用于制备预防、改善或治疗细胞线粒体代谢紊乱的药物；或被用于制备预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗的药物；或被用于制备增强抗氧化能力的药物或膳食添加剂。 

在本发明的另一优选例中，组分(i)的含量是10-200重量份，组分(ii)的含量是10-200重量份，并且所述组合物含有一种或多种选自下组的线粒体营养素：维生素E或其生理学可接受的盐、生物素或其生理学可接受的盐、辅酶Q10或其生理学可接受的盐、或尼克酸或其生理学可接受的盐。 

在本发明的第四方面，提供一种预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗的方法，包括给需要的受试者施加有效量的： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐； 

(b)一种或多种选自下组的线粒体营养素：乙酰肉碱或其生理学可接受的盐、维生素E或其 生理学可接受的盐、生物素或其生理学可接受的盐、辅酶Q10或其生理学可接受的盐、或尼克酸或其生理学可接受的盐。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1A显示了R-LA或/和ALC作用于脂肪细胞24小时后收集细胞，应用MitoTracker(100nM)探针孵育30分钟后，流式细胞分析荧光强度。曲线右移表示线粒体数目的增加。其中，a为R-LA作用，b为ALC作用，c为R-LA+ALC共同作用。并且，i为R-LA或/和ALC0.1μM，ii为R-LA或/和ALC 1μM，iii为R-LA或/和ALC 10μM，iiii为R-LA或/和ALC 100μM。图1B显示了3T3-L1脂肪细胞与不同浓度的R-LA或/和ALC孵育24小时后收集细胞，再于Mito Tracker(100nM)探针孵育30分钟后，流式细胞分析荧光强度；结果以相对于对照组细胞荧光强度的倍数来表示，取4次试验的结果的平均数±标准差作图，^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组相比有显著差异。 

图2A显示了电镜分析R-LA或/和ALC对于脂肪细胞线粒体的作用。其中，A为脂肪细胞线粒体的形态(放大倍数10,000)，脂肪细胞分化第8天，应用(ii)R-LA(10μM)，(iii)ALC(10μM)，(iiii)R-LA(10μM)+ALC(10μM)，对照组(i)未加药物。图2B显示了线粒体截面积和线粒体密度，取4次试验的结果的平均数±标准差作图，^*p＜0.05与对照组相比有显著差异。 

图3显示了R-LA或/和ALC调控线粒体传递复合物I、II、III蛋白，脂肪细胞与不同浓度的R-LA或/和ALC作用24小时后，应用免疫蛋白印迹的方法分析线粒体电子传递链复合物蛋白的表达。数值以相对于对照组的倍数表示，取3次试验的平均数±标准差表示，β-actin作为内参。^*p0.05，^**p＜0.01与对照组相比有显著差异。 

图4显示了R-LA或/和ALC对于PGC-1α的表达。脂肪细胞经应用不同浓度的R-LA或/和ALC作用24小时后与对照组相比，数值以相对于对照组的倍数表示，取3次试验的平均数±标准差表示，β-actin作为内参。^*p＜0.05，^**p＜0.01与对照组相比有显著差异。 

图5显示了R-LA或/和ALC刺激NRF1和NRF2的表达。脂肪细胞应用不同浓度的R-LA或/和ALC处理24小时，提取RNA。RT-PCR分析脂肪细胞中NRF1和NRF2 mRNA的表达。数值以相对于对照组的倍数表示，取4次试验的平均数±标准差表示，β-actin作为内参。^*p＜0.05表示与对照组相比NRF1有显著差异。#p＜0.05表示与对照组相比NRF2有显著差异。 

图6显示了凝胶阻滞电泳分析线粒体mtTFA结合蛋白的活性。放射自显影32P标记的mtTFA探针与线粒体抽提蛋白结合形成的复合物A：R-LA处理的脂肪细胞线粒体B：ALC处理的脂肪细胞线粒体；泳道6显示为竞争性的反应，应用50倍未标记的探针封闭后阻滞带消失，说明该带为特异性阻滞带。 

图7显示了LA和ALC对MIN6细胞胰岛素分泌的调节作用。MIN6细胞应用LA(10μM)或/和ALC(10μM)预处理6小时，然后加入油酸(0.4mM)共孵育72小时。胰岛素测定为基础胰岛素(葡萄糖2.8mM)和葡萄糖刺激(葡萄糖30mM)的胰岛素分泌，胰岛素分泌是以相对于正常对照组的基础胰岛素分泌的倍数表示，结果表示三次独立试验的均值(平均数±标准差)，胰岛素分泌以每毫克蛋白定量。*P＜0.05表示油酸组与对照组相比有显著差异，#P＜0.05，##P＜0.01表示加入LA，ALC的药物干预组与油酸组相比有显著差异。 

图8显示了葡萄糖刺激的ATP生成。MIN6细胞应用LA(10μM)或/和ALC(10μM)预处理6小时，然后加入油酸(0.4mM)共孵育72小时。细胞分别在含葡萄糖2.8mM或30mM的缓冲液中孵育1小时。然后裂解细胞，应用ATP生物荧光酶分析测定剂盒测定ATP的含量。含量以5次试验的均值表示(平均数±标准差)。*P＜0.05表示油酸组与对照组相比有显著差异，#P＜0.05表示加入LA或ALC的药物干预组与油酸组相比有显著差异 

图9显示了MIN6细胞UCP-2mRNA的表达。其中，A：MIN6细胞应用不同浓度的油酸处理72小时，提取RNA，定量PCR分析MIN6细胞中UCP-2mRNA的表达。数值以相对于对照组的倍数表示，取4次试验的平均数±标准差表示，β-actin作为内参，*P＜0.05表示油酸组与对照组相比有显著差异。B：MIN6细胞应用LA(10μM)或/和ALC(10μM)预处理6小时，然后加入油酸(0.4mM)共孵育72小时。应用定量-PCR分析UCP-2mRNA的表达，数值以相对于对照组的倍数表示，取4次试验的平均数±标准差表示，β-actin作为内参，*P＜0.05表示油酸组与对照组相比有显著差异，#P＜0.05表示加入LA，ALC的药物干预组与油酸组相比有显著差异。 

图10显示了免疫蛋白印迹分析MIN6细胞UCP-2蛋白的表达。其中，A：MIN6细胞应用不同浓度的油酸处理72小时，提取总蛋白，应用免疫蛋白印迹分析MIN6细胞UCP-2蛋白的表达，数值以相对于对照组的倍数表示，取3次试验的平均数±标准差表示，β-actin作为内参，*P＜0.05表示油酸组与对照组相比有显著差异。B：MIN6细胞应用LA(10μM)或/和ALC(10μM)预处理6小时，然后加入油酸(0.4mM)共孵育72小时。应用免疫蛋白印迹分析MIN6细胞UCP-2蛋白的表达，数值以相对于对照组的倍数表示，取3次试验的平均数±标准差表示，β-actin作为内参，*P＜0.05表示油酸组与对照组相比有显著差异，#P＜0.05表示加入LA或ALC的药物干预组与油酸组相比有显著差异。 

图11显示了MIN6细胞线粒体膜电位。其中，A：MIN6细胞应用(0.4mM)油酸处理72小时后，与JC-1(10μg/ml)，探针孵育30分钟，应用DAPI染细胞核，Zeiss数码相机摄片。B：MIN6细胞应用不同浓度的油酸处理72小时后，与JC-1(10μg/ml)，探针孵育30分钟，再重悬于KRBH缓冲液中，荧光酶标仪分析(FL1/FL2)的比值，数值以相对于对照组的倍数表示，取5次试验的平均数±标准差表示，*P＜0.05，**P＜0.01表示油酸组与对照组相比有显著差异。C：MIN6细胞应用不同浓度的LA，ALC预处理6小时，然后加入油酸(0.4mM)共孵育72小时后，与JC-1(10μg/ml)，探针孵育30分钟，荧光酶标仪分析(FL1/FL2)的比值，数值以相对于对照组的倍数表示，取5次试验的平均数±标准差表示，*P＜0.05表示油酸组与对照组相比有显著差异，#P＜0.05##P＜0.01表示加入LA，ALC的药物干预组与油酸组相比有显著差异。 

图12显示了透射电镜摄片(放大倍数10,000)示对照(A)和油酸刺激(B)。β-细胞经油酸刺激后分泌颗粒和线粒体明显减少。线粒体明显肿胀，缺乏，细胞核没有出现明显的固缩或染色体的片段。 

图13显示了活性氧的测定。A：MIN6细胞应用(0.4mM)油酸处理72小时后，与DCF-DA(10μM)探针孵育30分钟，流式细胞仪分析.曲线右移表示油酸刺激后活性氧产生增加a：阴性对照(未加探针)；b：正常对照；c：0.2mM油酸；d：0.4mM油酸；e：0.8mM油酸。B：MIN6细胞应用不同浓度的油酸处理72小时后，流式细胞仪分析，数值以相对于对照组的倍数表示，取5次试验的平均数±标准差表示，*P＜0.05，**P＜0.01表示油酸组与对照 

组相比有显著差异。C：MIN6细胞应用不同浓度的LA或/和ALC预处理6小时，然后加入油酸(0.4mM)共孵育72小时后，流式细胞仪分析，*P＜0.05表示油酸组与对照组相比有显著差异，#P＜0.05，##P＜0.01表示加入LA或ALC的药物干预组与油酸组相比有显著差异。 

图14显示了应用2-D-[3H]葡萄糖的方法评估营养素复合物对于胰岛素刺激的葡萄糖转运的效应。营养素复合物(0.1-1000μM)分别与脂肪细胞作用0.5小时，6小时，12小时，24小时和48小时，然后测定胰岛素刺激的葡萄糖转运。数值以相对于空白组的倍数表示(平均数±标准差)，*p＜0.05示实验组与空白组相比有显著差异。 

图15显示了各组大鼠经受试物(线粒体营养素)或生理盐水处理8周后，用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖。血糖值以平均值±标准差表示。与GK对照组相比，*p＜0.05，**P＜0.01。 

图16显示了各组大鼠经受试物(线粒体营养素)或生理盐水处理8周后，OGTT实验。实验前禁食16小时，50％葡萄糖水2g/kg灌胃，于服糖前和服糖后30、60、120分钟从后眼眶静脉丛取血，血糖用葡萄糖氧化酶法测定。血糖值以平均值±标准差表示。与GK对照组相比，*p＜0.05，**P＜0.01。 

图17显示了胸腺指数的测定结果，称重法测定脏器指数，胸腺指数值以平均数±标准误表示。与GK对照组相比，*p＜0.05。 

图18显示了脾脏淋巴细胞体外增殖能力，应用MTT法测定体外淋巴细胞的增殖能力。与GK对照组相比，*p＜0.05。 

图19显示了血浆中丙二醛含量的测定.血浆脂质过氧化水平测定血浆中TBARS的含量。与GK对照组相比，*p＜0.05。 

图20显示了血浆总抗氧化能力的测定。与GK对照组相比，*p＜0.05。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，将①R-硫辛酸、以及②选自下组的一种或多种线粒体营养素：乙酰肉碱、辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸联合应用，能够显著增加2型糖尿病和胰岛素抵抗相关的脂肪细胞线粒体的生成，以及修复胰腺β细胞的线粒体氧化损伤，从而可用于预防和改善2型糖尿病以及胰岛素抵抗，并且上述线粒体营养素的联合应用比单独使用可大大降低施用剂量。从而完成了本发明。 

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。 

如本文所用，术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其他本领域常用的添加剂。 

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。 

如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。 

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。 

本发明的线粒体营养素组合物中，各组分也可以以“生理学可接受的盐”或“生理学可接受的酸或碱衍生的盐”形式使用，或以“酰胺”的形式使用。所述的盐包括(但不限于)：与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。 

如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物、食物组合物和/或膳食添加剂，只要它们含有或基本上由①R-硫辛酸+乙酰肉碱构成、或含有或基本上由②R-硫辛酸+乙酰肉碱+辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸中的一种或多种构成。通常，①R-硫辛酸+乙酰肉碱、或②-硫辛酸+乙酰肉碱+辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸中的一种或多种的重量占组合物总重量的25-100％，较佳地40-99％，更佳地50-90％。 

如本文所用，“ALC”和“ALCAR”可互换使用，都是代表“乙酰肉碱”。 

如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。所述的单元剂型中含有对于预防、治疗、或改善糖尿病或胰岛素抵抗有效的本发明的组合物。 

如本文所用，“线粒体营养素”是指能够保护线粒体免受氧化损伤和能够提高线粒体功能的营养素，包括那些能够①保护线粒体免遭氧化应激，如抗氧化剂和金属螯合物；②修复线粒体膜；③功能性修复和防止线粒体氧化损害，如线粒体酶的底物或辅酶；和④诱导2期抗氧化酶的表达。 

如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克数表示重量(如1mg、1g、2g、5g、或1kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b为90％。 

本发明的组合物可直接用于预防、缓解或治疗2型糖尿病或胰岛素抵抗，或可与其它药物或膳食添加剂共同给药。 

线粒体营养素的组合物 

在本发明中，可有效用于预防、改善和治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病的线粒体营养素组合物包括：R-硫辛酸+选自下组的一种或多种线粒体营养素：乙酰肉碱、辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸。对于患有或易患胰岛素抵抗和2型糖尿病的哺乳动物，施用上述两种或两种以上所述的线粒体营养素制备成的组合物，能够获得显著增进的效果。所述的组合物为药物组合物；或为食物组合物。 

在本发明的一种优选例中，采用R-硫辛酸+乙酰肉碱联合应用、以及R-硫辛酸+乙酰 肉碱+辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸中的一种或多种联合应用的形式，比单独应用某一线粒体营养素在效果上大大提高，且在剂量上大大降低。此外，应理解，当采用①R-硫辛酸+乙酰肉碱的组合时，将辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸中的任何一种或多种加入到①中，可达到更优的效果。 

在本发明的一种优选方式中，采用选自以下的组分来配制所述的组合物：R-硫辛酸、乙酰肉碱的盐(盐酸盐)、辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸的盐(尼克酰胺)。 

在本发明的一种优选方式中，本发明的用于预防、改善或治疗2型糖尿病或胰岛素抵抗的组合物中，含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：10-200重量份； 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：10-200重量份； 

并且，组分(a)+(b1)之和占组合物总重量的25-100％；更特别的，组分(a)+(b1)之和占组合物总重量的40-99％；更优选的，组分(a)+(b1)之和占组合物总重量的50-90％。 

在本发明的一种优选方式中，组分(a)与(b1)以适当的比例存在，(a)与(b1)的重量比为1∶10-10∶1；更优选的，组分(a)与(b1)的重量比为1∶5-5∶1；最优选的，组分(a)与(b1)的重量比为1∶3-3∶1，比如，组分(a)与(b1)的重量比可以是1∶1。 

在本发明的一种优选方式中，所述组合物中还含有选自以下组分的一种或多种： 

(c1)维生素E或其生理学可接受的盐：20-200重量份； 

(d1)生物素或其生理学可接受的盐：0.2-2重量份； 

(e1)辅酶Q10或其生理学可接受的盐：10-200重量份；或 

(f1)尼克酸或其生理学可接受的盐：5-300重量份。 

也即，当组合物中含有组分(a)+(b1)时，其中可含有组分(c1)、组分(d1)、组分(e1)、或组分(f1)的一种或多种，比如，所述组合物包括但不限于：(a)+(b1)+(c1)的组合物、(a)+(b1)+(d1)的组合物、(a)+(b1)+(d1)的组合物、(a)+(b1)+(c1)+(d1)的组合、(a)+(b1)+(c1)+(d1)+(e1)、或(a)+(b1)+(c1)+(d1)+(f1)。 

作为本发明的一种特别优选的组合物，其含有组分如下：(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：10-200重量份；(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：10-200重量份；(c1)维生素E或其生理学可接受的盐：20-200重量份；(d1)生物素或其生理学可接受的盐：0.2-2重量份；和(e1)辅酶Q10或其生理学可接受的盐：10-200重量份。 

作为本发明的一种特别优选的组合物，所述的组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：100重量份。 

在另一优选例中，所述的组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(c1)维生素E或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(d1)生物素或其生理学可接受的盐：1重量份；和 

(e1)辅酶Q10或其生理学可接受的盐：100重量份。 

作为本发明的一种特别优选的组合物，所述的组合物含有： 

(a)R-硫辛酸或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(b1)乙酰肉碱或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(c1)维生素E或其生理学可接受的盐：100重量份； 

(d1)生物素或其生理学可接受的盐：1重量份；和 

(e1)尼克酸或其生理学可接受的盐：100重量份。 

作为本发明的一种特别优选的组合物，所述的组合物中还含有：药学上或食品学上可接受的载体或赋形剂：50-1000重量份。 

线粒体营养素组合物的施用剂量和剂型 

本发明将R-硫辛酸+选自下组的一种或多种线粒体营养素：乙酰肉碱、辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸联合应用，比单独施用单一的线粒体营养素效果更理想，并且，需要施用的剂量大大降低。 

在本发明的一种优选方式中，当将线粒体营养素硫辛酸+乙酰肉碱联合应用于人体时，硫辛酸+乙酰肉碱组合物的施用剂量为20-600mg/天；更优选的，组合物的施用剂量为30-400mg/天；最优选的，组合物的施用剂量为50-200mg/天。 

在本发明的另一种优选方式中，当将R-硫辛酸+乙酰肉碱+辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸中的一种或多种联合应用于人体时，所述组合物的施用剂量为20-700mg/天；更优选的，组合物的施用剂量为30-500mg/天；最优选的，组合物的施用剂量为50-200mg/天。 

当用于制备药物组合物或食物组合物时，所用的线粒体营养素组合物的有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。 

对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。 

当服用所述线粒体营养素时，优选同时服用能量物质，比如所述的能量为一种碳水化合物，从而提供辅助的能量，促进线粒体ATP的合成。 

在本发明的另一优选方式中，所述的组合物作为一种膳食添加剂，添加到水、非-橙汁饮品等饮料、固体食品、烹饪菜肴中，比如可添加到葡萄汁或苹果汁中。优选添加到可以提供至少50-150卡路里热量的膳食中。 

在本发明的另一优选方式中，所述的食品上学可接受的载体或赋形剂选自：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓/控释剂。 

在本发明的另一优选方式中，所述的组合物为单元剂型，每剂含有20-200mg组分(a)、和20-200m克组分(b)；更优选的，每剂含有30-150mg组分(a)、和30-150m克组分(b)。 

当将组合物制备成单元剂型时，每天服用所述单元剂型的组合物1-3剂；更优选的，每天服用所述单元剂型的组合物1-2剂。 

所述的线粒体营养素组合物可通过口服等途径给予。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素C、BHT和BHA。 

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。 

更优选的剂型是那些可以保证营养素缓慢而稳定地24小时补充给线粒体，一种方式是用合适的载体承载将线粒体营养素组合物，使得线粒体营养素组合物缓慢释放。比如以赋形剂(如羟丙甲基纤维素)作为包覆材料，将线粒体营养素包在其中，形成球状颗粒(包衣缓/控释制剂)；或将线粒体营养素载入骨架缓释片(如羟乙基纤维素)中(骨架型缓/控释制剂)。 

应理解，本发明的线粒体营养素组合物中还可含有其它人体所必需的或对人体有益的成份，比如可含有少量的维生素C、烟酰胺、泛素等。此外，根据医师的指导，本发明的线粒体营养素组合物也可与其它常规的糖尿病或胰岛素抵抗药物共同施用。 

本发明的线粒体营养素组合物的制备方法根据所需制备的剂型以及给药途径来决定，本领域技术人员在参考了本发明所提供的线粒体营养素的组合以及配比后，采用常规的药物组合物或食物组合物的制备方法即可制备出本发明的组合物。 

线粒体营养素混合物/组合物的用途 

本发明人首次证实了本发明的线粒体营养素混合物或组合物可用于制备预防、改善或治疗细胞线粒体代谢紊乱的药物或膳食添加剂；或者，本发明所述的线粒体营养素混合物或组合物可用于制备预防、改善或治疗2型糖尿病或胰岛素抵抗的药物或膳食添加剂；或者，本发明所述的线粒体营养素混合物或组合物可用于制备增强抗氧化能力的药物或膳食添加剂。 

在本发明的实施例中，应用了2型糖尿病的细胞模型，研究了线粒体营养素改善和治疗糖尿病及胰岛素抵抗的机制。本发明人采用细胞(2型)糖尿病模型从线粒体形态学，呼吸链耗氧活性，线粒体关键酶活性，及线粒体生成相关的转录因子的变化，考察线粒体营养素对于细胞中线粒体形态，数目及功能的调控，对于细胞抗氧化***的作用及脂肪细胞对于胰岛素的敏感性和胰岛β细胞分泌功能的变化。 

首先，本发明证实，R-硫辛酸和乙酰肉碱促进脂肪细胞中线粒体的生成。本发明人建立3T3-L1脂肪细胞的模型，研究α-硫辛酸和乙酰肉碱两个线粒体营养素促进脂肪细胞线粒体生成的单一及协同效应。研究结果表明R-硫辛酸和乙酰肉碱联合低剂量组(0.1μM-100μM)可以显著刺激脂肪细胞中线粒体数目的增加，而单独应用营养素的作用不显著。同时单独应用R-硫辛酸和乙酰肉碱未能上调线粒体传递链复合物I，II蛋白的表达；而联合剂量组(0.1μM)，联合剂量组(1.0μM)可以分别增加线粒体传递链复合物I，II蛋白的表达。R-硫辛酸在10，100μM浓度时可以上调线粒体传递链复合物III的蛋白表达；乙酰肉碱在1.0μM浓度时可以增加复合物III的蛋白表达；而联合组(0.1-10μM)都可上调复合物III蛋白的表达。进一步探讨其调控机制发现，R-硫辛酸(1-10μM)，乙酰肉碱(0.1-10μM)分别上调转录因子PGC-1α的表达，R-硫辛酸和乙酰肉碱联合剂量组在(0.1-10μM)可促进PGC-1α的表达，尤其在10μM的浓度可显著增加PGC-1α的表达，效果优于单个剂量的应用。同时也发现R-硫辛酸和乙酰肉碱可上调NRF1，NRF2和mtTFA的表达。 

其次，本发明证实，R-硫辛酸和乙酰肉碱修复油酸诱导胰岛β细胞的线粒体损伤。本发明人开展了胰岛β细胞损伤中线粒体解偶联蛋白2(UCP2)的表达及其与胰岛素分泌关系的研究，并研究应用硫辛酸，乙酰肉碱两个线粒体营养素的单一及协同效应。采用油酸诱导胰岛β细胞损伤的体外模型，观察发现油酸慢性刺激抑制了葡萄糖刺激的胰岛素分泌，结果表明损伤模型中线粒体活性氧产生明显增加，持续的氧化应激状态促使线粒体跨膜电位下降； 同时可诱导线粒体的解偶联蛋白-2(UCP-2)的表达，导致线粒体内氧化磷酸化解耦联，线粒体内的ATP合成减少，据此可认为UCP-2是胰岛素分泌的负性调节因子。并且发现线粒体营养素R-硫辛酸和乙酰肉碱可以清除油酸导致的氧自由基过多产生，修复线粒体膜电位，在mRNA和蛋白质水平上抑制UCP-2的上调，从而提高葡萄糖刺激的线粒体内ATP的合成，增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌。而且本发明人观察到上述效应在R-硫辛酸(10μM)和乙酰肉碱(10μM)联合剂量组的作用效果明显优于单个营养素的应用。 

并且，本发明还进一步验证了线粒体营养素复合物R-硫辛酸+乙酰肉碱+辅酶Q10、生物素、维生素E、尼克酸中的一种或多种能够促进脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运。体外诱导3T3-L1前脂肪细胞成为脂肪细胞，观察不同浓度线粒体营养素复合物对脂肪细胞作用不同时间后，应用2-D-[³H]葡萄糖的方法评估营养素复合物对于胰岛素刺激的葡萄糖转运的效应。营养素复合物(10-100μM)作用半小时后可以显著增加胰岛素刺激的葡萄糖转运；此效应在10μM浓度下可持续达6小时。长时间效应(48小时)表现在100μM浓度下，可明显增加胰岛素刺激的葡萄糖转运。 

在前述细胞模型中，本发明人采用低剂量(如0.1μM、1μM、10μM)的R-硫辛酸+乙酰肉碱；或R-硫辛酸+乙酰肉碱+辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸中的一种或多种，即可获得显著的效果。因此，当将所述线粒体营养素组合物用于哺乳动物时，仅需施用低于单个线粒体营养素常用用量2-100倍(优选3-60倍；更优选5-30倍)的所述线粒体营养素组合物，即可达到优良的改善和治疗糖尿病的效果。 

应理解，尽管在具体实施方式中，本发明人列举了几种线粒体营养素的组合形式，但本领域人员也可由此推导：本发明的其它任何一种线粒体营养素的组合形式也是同样具有突出效果的。 

应用线粒体营养素组合物预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗的方法 

本发明的线粒体营养素组合物可有效地预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗，因此，本发明也提供了通过给需要的受试者施加有效量的所述组合物或混合物来预防、改善或治疗所述疾病的方法。 

当用于预防、改善或治疗糖尿病或胰岛素抵抗时，所用的线粒体营养素组合物的有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。 

本发明的主要优点在于：首次揭示将①R-硫辛酸、以及②选自下组的一种或多种线粒体营养素：乙酰肉碱、辅酶Q10、生物素、维生素E、或尼克酸联合应用，能够预防、改善和治疗2型糖尿病以及胰岛素抵抗。并且上述线粒体营养素的联合应用比单独使用可大大降低施用剂量，产生了突出的效果。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按 重量计算。 

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 

材料及通用方法 

1.材料 

抗PGC-1α购于美国Santa Cruz公司；抗β-actin购于美国Sigma公司；TRIzol购于美国Invitrogen公司；抗ComplexI，II，III的抗体购自美国invitrogen公司；逆转录酶试剂盒购于美国Promega公司；热启动Taq酶购于日本TaKaRa公司；NRF1，NRF2和β-actin引物由上海博亚公司合成；ALC购自Sigma公司；R-LA由K.Wessel，Variats博士赠送(或也可商购，如可购自上海新嵩巍有限公司)；其余的细胞培养的试剂均购自于美国Invitrogen公司。 

DMEM培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，JC-1购自于美国Invitrogen公司；小鼠胰岛素ELISA试剂盒购自于美国Linco公司；油酸，和抗-β-actin购自于美国Sigma公司；鼠抗兔的UCP-2多克隆抗体购自于美国Chemicon公司；H2DCF-DA购自于美国Calbiochem公司；AMV逆转录酶购自于美国Promega公司，PCR引物根据文献设计，由上海博亚生物技术公司公司合成；MIN6细胞受赠于日本京都大学Kazutomo Inoue博士(或可参见美国专利US5534404)。 

2.线粒体制备 

细胞用LA或/和ALC处理后，弃去培养液，用PBS充分清洗，差速离心分离线粒体。分离介质为0.21mol/L甘露醇，0.07mol/L蔗糖，1mmol/LEDTA，5mmol/L Tris-HCl(pH7.4)。所有操作均在4℃以下进行。 

3.线粒体体积的测定 

使用荧光探针Mito-Tracker Green FM特异性地进行线粒体的染色，测定线粒体的体积。细胞应用线粒体营养素作用后，胰酶消化，收集细胞，重悬于KRB缓冲液，再于Mito-Tracker Green FM(100nM)孵育30分钟，离心收集细胞，悬于KRB缓冲液中，流式细胞仪分析荧光强度(FACS Calibur Becton Dickinson)。 

4.统计学处理 

两组数据比较采用t检验，多组数据采用ANOVA作统计学处理，结果用平均值±标准差表示，以P＜0.05表示差异显著性。 

实施例1联合应用R-M和ALC促进脂肪细胞线粒体数目增多 

1.脂肪细胞培养和脂肪细胞分化 

3T3-L1前脂肪细胞(购自于ATCC公司，Cat.No.CL-173)(Wilson-Fritch L等(2003)；Mitochondrial Biogenesis and Remodeling during Adipogenesis and in Response to the InsulinSensitizer Rosiglitazone.Mol Cell Biol.23(3)：1085-94)用完全培养液(DMEM+10％FBS+100u/ml青、链霉素)，在37℃孵箱(5％二氧化碳，95％空气)中培养，每2天换液1次。待细胞生长至完全融合后2天(第0天)，开始诱导分化，具体步骤为：将培养液换成含0.5mM IBMX、0.25μM***和1μM胰岛素的完全培养液；48小时后，撤去IBMX和***，使完全培养液中只含有1μM胰岛素；2天后换液，撤去胰岛素，使用不含有任何诱导剂的完全培养 基；以后每2天换液1次，直至第8天95％以上细胞已分化为成熟的脂肪细胞。 

2.流式细胞分析R-LA和ALC对脂肪细胞线粒体数目的影响 

为了确定R-LA或/和ALC能否刺激脂肪细胞线粒体的增生，本发明人应用线粒体特异性荧光探针MitoTracker Green FM(购自Molecular Probes)，该探针能够聚集在线粒体内，不受线粒体膜电位的干扰，因此能够定量脂肪细胞内的线粒体数量，细胞分化第8天，脂肪细胞与R-LA或/和ALC作用24小时，R-LA或ALC在0.1-100μM时能够增加荧光强度并呈现剂量依赖关系，但没有显著差异，然而，联合应用R-LA和ALC(0.1-100μM)可以显著增加荧光强度，较单独应用R-LA或ALC有显著差异，结果见图1A和图1B。 

因此，可见联合应用R-LA和ALC(0.1-100μM)能够显著促进脂肪细胞线粒体数目增多，且联合应用R-LA和ALC比单独应用R-LA或ALC的更有效。并且，很低的联用剂量(0.1μM R-LA+0.1μM ALC)即可达到比单独使用较高剂量的R-LA或ALC更有效的效果。 

3.电镜观察联合应用R-LA和ALC对脂肪细胞线粒体形态等的影响 

脂肪细胞分化第8天应用R-LA(10μM)或/和ALC(10μM)作用24小时后，2.5％戊二醛过夜固定，细胞经10g/L锇酸后固定、丙酮脱水、浸透、树脂包埋、超薄切片、铀-铅复染、透射电镜下观察。计数并观察10个脂肪细胞，定量线粒体数目和线粒体的截面积。 

结果见图2。图2A中，A为脂肪细胞线粒体的形态(放大倍数10,000)，脂肪细胞分化第8天，应用(ii)R-LA(10μM)，(iii)ALC(10μM)，(iiii)R-LA(10μM)+ALC(10μM)，对照组(i)未加药物。图2A显示R-LA(10μM)或/和ALC(10μM)可以改变线粒体的大小和结构，在R-LA作用的细胞中，线粒体分布在整个细胞中呈现出致密和相互连接的状态，在ALC作用的细胞，线粒体显示出致密，但线粒体更短，少一些接触，特别是含有丰富的基质层，在正常的细胞中少见，但在R-LA或ALC处理的细胞中较为普遍。 

图2B显示了线粒体截面积和线粒体密度，取4次试验的结果的平均数±标准差作图， ^*p＜0.05与对照组相比有显著差异，可见联合应用R-LA和ALC对线粒体能够显著增加线粒体的截面积和密度。 

同时，本发明人分析观察了10个细胞，结果表明在ALC作用的细胞中，ALC并不增加线粒体的面积和数目，R-LA有增加线粒体数目和面积的倾向，但无显著差异，联合应用R-LA和ALC可以显著增加线粒体的面积；增加平均线粒体的数目(P＜0.05)，较对照组增加了187.8％±24，P＜0.05。 

实施例2脂肪细胞中R-LA和ALC能增加线粒体电子传递链复合物的表达 

本实施例中，采用免疫蛋白印迹分析R-LA或/和ALC能否增加线粒体电子传递链的复合物I，II，III的蛋白表达。 

免疫蛋白印迹方法如下：对细胞联合或单独施用R-LA或/和ALC 24小时后，弃去培养液，用PBS充分清洗，加入细胞裂解液，用细胞刮匙刮下细胞，冰上孵育30分钟，1,3000r/min4℃离心10分钟，收集上清即为细胞蛋白提取液。应用Bradford法进行总蛋白定量，-80℃保存。蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，转移至固相支持体硝酸纤维素膜上，室温下封闭1小时，加入一抗PGC-1α(1∶1000)，β-actin(1∶5000)，complex I(1∶1000)，complex II(1∶1000)，complex III(1∶1000)，4℃孵育过夜，洗膜，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的抗体)，室温孵育1小时，ECL发光，X线胶片感光。应用NIH Image图像分析软件对蛋白条带的密度进行半定量分析。 

结果见图3，免疫蛋白印迹分析结果显示，10μM-100μM的R-LA能够增加复合物III的表达，1.0μM ALC能够增加复合物III的表达，联合应用R-LA和ALC(0.1+0.1μM)能显著增加复合物I的表达(p＜0.05与对照组相比)，R-LA和ALC(1.0+1.0μM)能显著增加复合物II的表达(p＜0.05与对照组相比)，R-LA和ALC(0.1+0.1，1+1，和10+10μM)能显著增加复合物III的表达(p＜0.05与对照组相比)。 

可见低剂量的R-LA和ALC即可显著增加复合物I、II、III的表达，因此联合应用R-LA和ALC比单独使用可很大程度地降低使用剂量，并且达到更好的效果。 

实施例3 R-LA和ALC对于脂肪细胞PGC-1α蛋白的表达 

PGC-1α是能够促进线粒体生成和线粒体脂肪酸氧化的辅助增强子，脂肪细胞与R-LA或/和ALC作用24小时后，应用免疫蛋白印迹的方法(方法同实施例2中所述)观察PGC-1α的表达。 

结果见图4，显示R-LA和ALC能够上调PGC-1α，从1-100μM，最大效应发生在1.0+1.0μM，R-LA能够从1-100μM上调PGC-1α，最大效应发生在10μM；ALC能够从0.1-10uM上调PGC-1α；联合应用R-LA和ALC上调PGC-1α显示出钟形曲线，最大效应发生在1.0+1.0μM；而100+100μM未显示出显著效应。 

因此可见，仅需很低剂量的R-LA和ALC联合应用即可发挥显著的作用，大大促进PGC-1α蛋白的表达，剂量过高反而作用不明显。 

实施例4脂肪细胞中R-LA和ALC诱导线粒体生成基因的表达 

为了明确R-LA或ALC促进脂肪细胞线粒体生成的分子机制，本发明人在转录水平上进一步考察涉及到线粒体生成的基因。应用RT-PCR的方法观察脂肪细胞NRF1和NRF2在转录水平上的表达。 

总RNA抽提和RT-PCR：按试剂盒说明，用TRIzol试剂提取细胞的总RNA，用紫外分光光度仪测定RNA的纯度和含量。按照常规的方法设计引物序列，引物由上海赛百盛公司合成，具体引物序列如下： 

NRF1(GenBank No NM_010938)的上游序列： 

5’-CGCAGCACCTTTGGAGAA-3’(SEQ ID NO：1)； 

NRF1的下游序列： 

5’-CCCGACCTGTGGAATACTTG-3’(SEQ ID NO：2)； 

NRF2(GenBank No NM_010902)的上游序列： 

5’-ATGGATTTGATTGACATCCTT-3；(SEQID NO：3)； 

NRF2的下游序列： 

5’-ATGTTTTTCTTTGTATCTGG-3’(SEQ ID NO：4)； 

β-actin(GenBank NO NM_007)的上游序列： 

5’-ACGGCCAAGTCATCACTATTG-3’(SEQ ID NO：5)； 

β-actin的下游序列： 

5’-AGCCACCGATCCACACAGA-3’(SEQ ID NO：6)。 

RT反应1μg总RNA合成cDNA。总体积20μl，42℃反应60min，95℃反应5分钟。合成的cDNA，使用Takara公司的DDR305A Ex Taq(Hot start version)进行PCR扩增，PCR扩增反应总体积50ul，变性95℃1min；退火58℃1min；延伸72℃1min；共 进行30次循环，末次循环后延伸8min.取扩增反应液10ul进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下观察并拍照记录。 

结果见图5，应用上述RT-PCR的方法观察脂肪细胞NRF1和NRF2在转录水平上的表达，1-100μM R-LA显著刺激了脂肪细胞NRF1在转录水平上的表达(图5A，p＜0.01，与对照组相比有显著差异)，10-100μM R-LA显著刺激了脂肪细胞NRF2 mRNA的表达(p＜0.05，与对照组相比有显著差异)。1-10μM ALC也能够刺激NRF1的表达，但未能够刺激NRF2的表达(图5B)。 

实施例5脂肪细胞中R-LA和ALC对于转录因子mtTFA的调控 

本发明采用凝胶阻滞电泳的方法来测定R-LA和ALC对于转录因子mtTFA的调控。 

凝胶阻滞电泳按照(Kanazawa A，Nishio Y，Kashiwagi A，Inagaki H，Kikkawa R，HoriikeK(2002).Reduced activity of mtTFA decreases the transcription in mitochondria isolated fromdiabetic rat heart.Am J Physiol Endocrinol Metab.282(4)：E778-85.)所报道的方法进行。mtTFA(GenBank NO：AY769440)的寡核探针5’-TTTCCTCCTAACTAAACCCTCTTTAC-3’(SEQ IDNO：7)，5’-GTAGGCAAGTAAAGAGGGTTTAGTTA-3’(SEQ ID NO：8)。放射性[α-32P]ATP(3,000Ci/mmol，Amersham Biosciences)标记，在反应体系中共孵育线粒体蛋白(100μg/ml polydI-dC，10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl，0.5mM EDTA，0.5mM dithiothreitol，1mM MgCl2)，通过4％非变性聚丙烯酰胺电泳分离，真空干燥凝胶后，使用增感屏在-70℃用X射线胶片曝光过夜。 

转录因子mtTFA可以调控核基因编码的线粒体蛋白的生成，以及调控线粒体DNA的转录和复制。本发明人观察了脂肪细胞经R-LA或/和ALC处理24小时后应用EMSA方法检测mtTFA的表达，0.1-100μM R-LA显著刺激了脂肪细胞mtTFA的表达；0.1-100μM ALC显著刺激了脂肪细胞mtTFA的表达；为确证mtTFA的特异性，本发明人应用50倍未标记的探针封闭后阻滞带消失，说明该带为特异阻滞带，见图6。 

实施例6 R-LA和ALC逆转油酸所致的MIN6细胞葡糖糖刺激的胰岛素分泌下降 

1.MIN6细胞的培养以及试验分组 

MIN6细胞以高糖培养基培养，培养基成分为：Dulbecco’s modified Eagle’smedium(DMEM)含15％胎牛血清(FBS)，25mM葡萄糖，2mM谷氨酸盐，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素。MIN6细胞生长到70％时，进行低糖过夜，使用的低糖培养基成分为：DMEM含11mM葡萄糖，1％牛血清白蛋白(BSA)，2mM谷氨酸盐，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素。低糖过夜后，分组如下： 

①正常对照组：低糖无血清培养基处理72小时； 

②正常加药组：低糖无血清培养基含不同浓度的硫辛酸(0.1μM-1000μM)和/或不同浓度的乙酰肉碱(0.1μM-1000μM)处理72小时； 

③油酸组：低糖无血清培养基含不同浓度的油酸(0.2-0.8mM)处理72小时； 

④油酸加药组：先以低糖无血清培养基含不同浓度的硫辛酸(0.1μM-1000μM)和/或不同浓度的乙酰肉碱(0.1μM-1000μM)预处理6小时；再加入油酸(0.4mM)共同处理72小时。 

2.MIN6细胞的胰岛素分泌测定 

MIN6细胞经不同药物处理后，移去培养基，以KRB缓冲液(118mM NaCl，4.7mM KCl，2.5mM CaCl₂，1.2mM KH₂PO₄，1.2mM MgSO₄，24mM NaHCO₃)洗两次，再以KRB缓冲液温育30 分钟，加入葡萄糖，至葡萄糖终浓度分别为2.8mM或30mM，以测定基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌，1小时后收集上清，应用小鼠胰岛素ELISA试剂盒进行定量。 

3.R-LA和ALC对油酸所致MIN6细胞葡糖糖刺激的胰岛素分泌的影响 

MIN6细胞经0.4mM油酸处理72小时后，基础胰岛素分泌(2.8mM葡萄糖刺激)没有很大的改变。在30mM葡萄糖刺激下，正常胰岛素分泌较基础胰岛素分泌增加了4倍左右，而经油酸作用后的MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌明显下降，仅较基础胰岛素分泌增加了2倍左右(见图7)。应用R-硫辛酸(10μM)或乙酰肉碱(10μM)预处理后，可改善由油酸所导致的GSIS的下降(p＜0.05与油酸组相比)。联合应用R-硫辛酸和乙酰肉碱(10μM)可显著提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌(p＜0.01与油酸组相比)。 

因此可见，R-硫辛酸和乙酰肉碱逆转油酸所致的MIN6细胞葡糖糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)下降。 

实施例7 R-硫辛酸和乙酰肉碱提高MIN6细胞葡萄糖刺激的ATP生成 

1.葡萄糖刺激的ATP生成 

胞浆内ATP的测定应用ATP荧光酶的分析测定试剂盒测定(Patane G等；Diabetes.；51(9)：2749-56，2002)。细胞生长于96孔板中，经上述药物处理后，吸弃上清，应用无糖的缓冲液平衡2小时，再分别与含有葡萄糖(2.8mM或30mM)孵育1小时，裂解细胞，取80μl裂解上清液与100μl的含有荧光酶的反应液(10mg/ml)作用，应用酶标仪读取数值。 

结果见图8，在正常基础的葡萄糖(2.8mM)水平孵育1小时，油酸处理组并没有改变胞浆内ATP的含量，经应用R-硫辛酸和乙酰肉碱预处理组胞浆内ATP的含量也没有改变。正常MIN6细胞在高糖(30mM)条件下孵育1小时后，可显著提高胞浆内ATP的含量(由2.30±0.57到4.10±0.43nmol/mg蛋白，P＜0.01)，但高糖并没有刺激油酸组胞浆内ATP的含量(由2.27±0.34到2.53±0.52nmol/mg蛋白)。应用R-硫辛酸(10μM)或乙酰肉碱(10μM)预处理后，可显著提高油酸组ATP的含量，联合应用R-硫辛酸和乙酰肉碱(10μM)的效应与单独应用相比效应略强。 

实施例8 R-LA和ALC对于MIN6细胞UCP-2的影响 

1.总RNA的提取和定量PCR 

按试剂盒说明，用TRIzol试剂提取细胞的总RNA，用紫外分光光度仪测定RNA的纯度和含量。引物序列的设计参考文献，引物由上海赛百盛公司合成。UCP-2(GenBank NO：NM_011671)引物上游序列5’-GTC GGA GAT ACC AGA GCA CT-3’(SEQ ID NO：9)；UCP-2下游序列 5’-GTG ACC TGC GCT GTG GTA CT-3’(SEQ ID NO：10)；β-actin(GenBank NONM_007)下游序列 5’-ACG GCC AAG TCA TCA CTA TTG-3’(SEQ ID NO：11)；和β-actin引物上游序列5’-AGC CAC CGA TCC ACA CAG A-3’(SEQ ID NO：12)。RT反应1ug总RNA合成cDNA。总体积20ul，42℃反应60min，95℃反应5min。合成的cDNA，使用Takara公司的DDR305A Ex Taq(Hot start version)进行PCR扩增(Bio-rad iCycler定量PCR仪)。PCR产物通过SYBR Green I染料荧光检测定量。 

2.免疫蛋白印迹的分析 

各种处理因素作用后，弃去培养液，用PBS充分清洗，加入细胞裂解液，用细胞刮匙刮下细胞，冰上孵育30分钟，1,3000r/min 4℃离心10分钟，收集上清即为细胞蛋白提取液。应用Bradford法进行总蛋白定量，-80℃保存。蛋白用12％SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，转移至固相支持体硝酸纤维素膜上，室温下封闭1小时，加入一抗 (UCP-2多克隆抗体1∶1000，β-actin单克隆抗体1∶5000)，4℃孵育过夜，洗膜，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的抗体)，室温孵育1小时，ECL发光，X线胶片感光。应用NIH Image图像分析软件对蛋白条带的密度进行半定量分析。 

3.R-LA和ALC对于MIN6细胞UCP-2的影响 

MIN6细胞经应用油酸(0.2-0.8mM)处理72小时后刺激UCP-2 mRNA的表达。0.4mM OA刺激后可产生最大效应发生(312％±5％，p＜0.05油酸组与正常对照组相比)，见图9A。经应用线粒体营养素(R-LA 10μM)处理后可显著下调油酸刺激的UCP-2mRNA的表达达117％±11％(p＜0.05与油酸组相比)，见图9B。ALC 10μM处理后可显著下调油酸刺激的UCP-2mRNA的表达达77.5％±4％(p＜0.05与油酸组相比)。然而，联合应用R-硫辛酸和乙酰肉碱(10μM)组并没有改变UCP-2mRNA的表达，见图9B。 

同步观察UCP2在蛋白水平上的改变，应用免疫蛋白印迹的方法，观察到油酸可增加UCP-2蛋白的表达，0.4mM的油酸可产生最大的效应，见图10A。分别应用R-LA和ALC 10，100μM预处理后可降低UCP-2蛋白的表达，并呈现剂量效应，联合应用组也显著抑制了UCP-2蛋白的表达，见图10B。并且，联合应用比单独应用R-LA或ALC 10抑制程度更大。 

因此可见，单个R-LA或ALC在转录水平上调控UCP-2mRNA的表达，而联合应用R-LA和ALC在翻译水平上调控UCP-2蛋白的表达。 

实施例9 R-LA和ALC可修复线粒体膜电位 

1.线粒体膜电位分析 

JC-1是反映线粒体膜电位的特异性探针，红色荧光与绿色荧光的比值可以作为线粒体膜电位的指标。MIN6细胞在24孔板中培养72小时后，弃去上清，PBS洗两次，收获细胞到洁净的1.5ml EP管中，加入JC-1染料至终浓度10μg/mL，避光孵育15分钟后，加入等量PBS 500g离心洗两次，弃去上清，以0.5ml PBS重悬后以流式细胞仪进行分析。 

2.R-LA和ALC对线粒体膜电位的影响 

MIN6细胞经72小时油酸的慢性刺激，应用JC-1探针检测到线粒体跨膜电位下降，见图11A，0.2mM到0.8mM的油酸都不同程度抑制了线粒体跨膜电位，见图11B。 

由图11B可知，MIN6细胞经0.4mM的油酸处理72小时后，使得JC-1的比值下降达40％(P＜0.05油酸组与正常对照组相比)。而R-LA和ALC的保护效应见图11C，应用R-LA和ALC(1uM-100μM)预处理组可以修复线粒体的膜电位，联合剂量组亦显示出保护效应，尤其是100μM联合组的效应更强于单个用药。 

可见，联合应用R-LA和ALC可很好地修复线粒体膜电位，并且联合应用比单独应用体现出更佳的线粒体膜电位修复性能。 

实施例10 R-LA或ALC可逆转因油酸处理导致的线粒体体积减小 

1.透射电镜观察 

MIN6细胞经不同药物处理后，2.5％戊二醛过夜固定，细胞经10g/L锇酸后固定、丙酮脱水、浸透、树脂包埋、超薄切片、铀-铅复染、透射电镜下观察(Hayakawa T，et al 1998).胰腺β细胞表现特征性的分泌颗粒，计数并观察5个MIN6细胞，定量线粒体数目和线粒体的截面积。 

2.R-LA或ALC对于油酸处理导致的线粒体异常的影响 

MIN6细胞经油酸处理72小时后，线粒体明显肿胀，峭消失，溶酶体扩大和出现帽状或 环状的破碎的线粒体，见图12A和12B。 

定量分析显示油酸组细胞线粒体截面积较正常对照组明显降低(正常对照组β-细胞截面积为2.4mm²，而油酸刺激组为1.7mm²；P＜0.05)，两组间细胞大小和数目无改变；正常对照组β-细胞平均线粒体数目为10.9，而油酸刺激组为9.7；正常对照组β-细胞平均胞浆面积为22.4mm²，而油酸刺激组为23.5mm²；因此，正常对照组β-细胞平均线粒体体积较油酸刺激组平均线粒体体积大29.2％。应用R-LA或ALC预处理组可以促使平均线粒体体积较油酸刺激组增大15％或17％。 

因此可见，对MIN6细胞进行R-LA和ALC预处理可逆转因油酸处理导致的线粒体体积数目降低以及体积减小。 

实施例11 R-LA和ALC可以清除油酸导致的氧自由基过多产生 

1.活性氧的测定 

应用分子探针2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐(H₂DCF-DA)标记外膜成纤维细胞，H₂DCFDA能自由透过细胞膜，在胞浆内被酯酶分解成二氢-二氯荧光黄，后者被过氧化氢转化为发荧光的2’，7’-二氯荧光黄(DCF)，通过流式细胞仪测定荧光产物的荧光强度，进行相对定量分析。MIN6细胞经不同处理后，再与H₂DCFDA(10μM)孵育30分钟后，胰酶消化，收集后，计数10,000个活细胞，流式细胞仪检测和分析(FACS Calibur Becton Dic kinson)。 

2.R-LA和ALC对油酸导致的氧自由基过多的影响 

MIN6细胞经不同浓度的油酸处理72小时后，DCF-DA检测活性氧生成增加并呈现出剂量依赖关系，见图13A。1.0-1000μM的R-硫辛酸抑制由油酸刺激的活性氧产生；1000μM的乙酰肉碱也可抑制活性氧产生；联合应用R-LA和ALC可以抑制活性氧的产生，作用与R-LA单独应用相似，1000μM联用时，效果显著，见图13C，且联合应用比单独应用效果更佳。因此可见，R-LA和ALC可以显著清除油酸导致的氧自由基过多产生。 

实施例12线粒体营养素组合物促进脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运 

在本实施例中，将R-硫辛酸，乙酰肉碱，辅酶Q10，生物素和维生素E制成组合物，观察线粒体营养素组合物促进脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运。所述组合物共分成若干组，见表1。 

表1 

	0.1μM组	1.0μM组	10μM组	100μM组	1000μM组
						R-硫辛酸	0.1μM	1.0μM	10μM	100μM	1000μM
乙酰肉碱	0.1μM	1.0μM	10μM	100μM	1000μM
						辅酶Q10	0.1μM	1.0μM	10μM	100μM	1000μM
生物素	0.1μM	1.0μM	10μM	100μM	1000μM
						维生素E	0.1μM	1.0μM	10μM	100μM	1000μM

体外诱导3T3-L1前脂肪细胞成为脂肪细胞，观察不同浓度线粒体营养素复合物对脂肪细胞作用不同时间后，应用2-D-[³H]葡萄糖的方法评估营养素复合物对于胰岛素刺激的葡萄糖转运的效应。 

结果见图14，营养素复合物(10-100μM)作用半小时后可以显著增加胰岛素刺激的葡萄糖转运；此效应在10μM浓度下可持续达6小时。长时间效应(48小时)表现在100μM浓度下，可明显增加胰岛素刺激的葡萄糖转运。 

实施例13线粒体营养素组合物的配方 

本发明人还配制了其它多种线粒体营养素组合物，配方如表2所示。 

表2(单位：重量份) 

	R-硫辛酸	乙酰肉碱	辅酶Q10	生物素	维生素E	尼克酸
							配方1	100	100	100	0	0	0
配方2	60	60	60	1.0	0	0
							配方3	40	40	40	0.5	40	0
配方4	30	30	30	0.5	30	20

采用配方1、配方2、配方3、配方4的线粒体营养素组合物，本发明人进行了如前所述的葡萄糖转运试验、ATP生成试验，以及测定了它们对线粒体数量、体积等产生的变化，发现上述配方的组合物能够产生协同效应，特别是在低剂量组合时，效果显著优于单个营养素的应用。 

此外，上述各配方可单独施用，或者与适量的药学上或食品上可接受的载体混合，制备成药品或膳食添加剂。 

实施例14线粒体营养素组合物对于II型糖尿病GK鼠的作用 

GK鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供)是一个自发的II型糖尿病模型，其特征有：葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损，β细胞数目减少，肝糖生成过多，肌肉和脂肪组织中度胰岛素抵抗。 

实验方法：选择雄性4周GK大鼠48只，按血糖水平随机分为模型对照组、匹格列酮组、线粒体营养素复方低剂量组与线粒体营养素复方高剂量组，每组各12只；另设周龄匹配的Wistar大鼠为正常对照组。各组动物分别每天灌胃相应受试物或生理盐水，同时喂饲普通饲料。具体分组情况如下： 

1)正常对照组Wistar鼠(雄性12只)：灌胃生理盐水 

2)模型对照组GK鼠(雄性12只)：灌胃生理盐水 

3)低剂量营养素组(雄性12只)： 

R-硫辛酸    50mg/kg/d 

乙酰肉碱    100mg/kg/d 

生物素      0.1mg/kg/d 

尼克酰胺    15mg/kg/d 

4)高剂量营养素组(雄性12只)： 

R-硫辛酸    500mg/kg/d 

乙酰肉碱    1000mg/kg/d 

生物素      1mg/kg/d 

尼克酰胺    150mg/kg/d 

5)匹格列酮组(雄性12只)：10mg/kg/d 

各组大鼠自由摄入食水，控制昼夜节律为12h∶12h，室温为18～25℃，同时喂饲普通饲料。饲料由斯莱克实验动物中心提供，总热量为15.36KJ/g，其中蛋白质21％、碳水化合物55％、脂肪6％，及微量的维生素(A，D，B1，B2，B12，K3，E，生物素(饲料中生物素添加剂量0.01mg/kg，大鼠每天的饲料进食量为10-20g。实际每天从饲料中获得生物素的量约为营养 素低剂量组合的1/100))。 

实验过程中检测各组葡萄糖耐量实验(OGTT)、胸腺指数、ConA对小鼠胸腺淋巴细胞增殖的影响、以及血浆中丙二醛(MDA)和血浆总抗氧化能力。 

OGTT实验：试验前禁食16h，50％葡萄糖水2g/kg灌胃，于服糖前和服糖后30、60、120min从后眼眶静脉丛取血，血糖用常规的葡萄糖氧化酶法测定。 

胸腺指数测定：称重法测定脏器指数。脏器指数＝(脏器重量/体重)×1000。 

ConA对小鼠脾/胸腺淋巴细胞增殖的影响：戊巴比妥钠麻醉大鼠，无菌取出胸腺，制成淋巴细胞悬液，将此悬液用RPMI 1640完全培养液配成2×106/mL的淋巴细胞悬液，加12个复孔(100ul/孔)，其中8孔每孔含Con A(终浓度20ug/ml)的RPMI-1640培养液100ul，混匀后置37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，每孔加入5mg/mL MTT液40μL，继续培养4h，加入10％SDS液(0.01mol/L HCl配制)每孔100μL，过夜之后测570nm吸光值，参考波长630nm.每孔A值＝A570nm-A630nm；细胞增值倍数＝(测定孔A值-对照孔A值)/对照孔A值。 

丙二醛(MDA)的检测：血浆脂质过氧化水平测定血浆中TBARS的含量。取新鲜分离的血浆80ul，操作严格按照试剂盒说明书(购自南京建成生物公司)，测定A532nm处的吸光值。 

血浆总抗氧化能力的检测：机体防御体系的抗氧化能力的强弱与疾病的程度存在着密切联系，测定原理为机体有许多抗氧化物质，能使Fe³⁺还原为Fe²⁺，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力。取新鲜分离的血浆40ul，操作严格按照试剂盒(购自南京建成生物公司)说明书，测定A520nm处的吸光值。 

结果 

(1)药物干预前血糖和OGTT：从后眼眶静脉丛取血，血糖用葡萄糖氧化酶法测定。药物干预前GK大鼠的随机血糖显著高于正常对照组Wistar大鼠(p＜0.01)，OGTT服糖后2h＞11.1mmol/L，按照国际通用大鼠糖尿病诊断标准，判定模型建立成功。 

(2)药物干预后血糖和OGTT：各组大鼠药物干预后每月检测空腹血糖和糖耐量实验，结果如图15和图16。结果显示：GK模型组与正常对照组相比，空腹血糖显著高于正常对照组wistar大鼠(p＜0.05)，GK大鼠经线粒体营养素处理8周后，低剂量营养素组空腹血糖与GK模型组相比明显降低(p＜0.01)，糖尿病模型组大鼠的糖耐量严重受损，与wistar对照组相比有显著性差异(p＜0.01)，线粒体营养素处理8周后，低剂量营养素组，高剂量营养素组与GK对照组相比，糖负荷后30，60，90，120分钟血糖水平显著降低(P＜0.01＝。 

(3)药物干预后大鼠胸腺淋巴细胞功能：各组大鼠药物干预后检测胸腺淋巴细胞功能。结果见图17和图18，表明：GK模型组较Wistar对照组的胸腺细胞体外增殖能力和胸腺指数显著降低(p＜0.05，p＜0.01)，同时外周T淋巴细胞亚群分布异常，CD4/CD8比例增加，与Wistar对照组相比有显著性差异(p＜0.01)。低剂量组显著增加了胸腺细胞体外增殖能力(与GK组相比，p＜0.01)，低剂量组和匹格列酮组胸腺指数亦显著增加(与GK组相比，p＜0.05)，高剂量组未显示出效应；匹格列酮组和高剂量组对于胸腺细胞体外增殖能力无影响。上述数据表明低剂量组合能改善糖尿病大鼠的细胞免疫状况。 

(4)药物干预后大鼠血液抗氧化能力：各组大鼠药物干预后检测血浆的抗氧化能力。结果见图19和图20，表明：GK模型组较Witar对照组的血浆中产生的脂质过氧化产物(丙二醛)明显增多(p＜0.05)，总抗氧化能力显著降低(p＜0.01)。药物干预后，低剂量组与GK模型组相比较血 浆中脂质过氧化产物的产生明显减少(p＜0.05)，总抗氧化能力增加(p＜0.05)；匹格列酮组的抗氧化能力也显著提高，但高剂量组血浆的抗氧化能力无显著改善。表明低剂量组可以增强体内的抗氧化能力。 

讨论 

尽管有研究报道线粒体功能紊乱是胰岛素抵抗和2型糖尿病主要的致病因素，然而进一步关于通过调节线粒体功能来防治胰岛素抵抗和2型糖尿病生成却未见有报道，为了明确线粒体生成在2型糖尿病及胰岛素抵抗中的作用，寻找有效的药物来预防糖尿病的发生，本发明人采用被广泛用于脂肪细胞分化和观察胰岛素效应的细胞模型3T3-L1细胞株，深入研究了R-硫辛酸和乙酰肉碱的联合应用、以及R-硫辛酸、乙酰肉碱与其它辅酶Q10、生物素、维生素E等营养素联合应用在3T3-L1脂肪细胞线粒体生成中的作用。 

线粒体生成减少和线粒体酶活性的降低与衰老及很多疾病的发病有关，比如糖尿病及其并发症(Chabi B，Adhihetty PJ，Ljubicic V，Hood DA 2005.How is mitochondrial biogenesisaffected in mitochondrial disease？Med Sci Sports Exerc.37(12)：2102-10)。线粒体生成和氧化磷酸化的激活伴随线粒体基因组的转录和复制，是细胞分化的调控者。脂肪组织中线粒体的生成的分子机制仍然未阐述清晰，有研究报道PGC-1α参与调控脂肪和肌肉组织的线粒体生成。PGC-1α在氧化磷酸化代谢及线粒体生成中发挥重要作用，并且可以在转录水平上调控线粒体抗氧化防御体系，PGC-1α的下调可以降低线粒体“解毒蛋白”的表达(Valle I等，2005.PGC-1alpha regulates the mitochondrial antioxidant defense system in vascular endothelial cells.Cardiovasc Res.66(3)：562-73)。PGC-1α被认为是诱导线粒体生成的关键，它可以启动促进线粒体生成的转录因子的表达。PGC-1α可以刺激NRF1和NRF2的基因表达，特别是PGC-1α可以与NRF1结合在mtTFA的启动子部位，mtTFA可以直接调控线粒体DNA的转录和复制(Choi YS等(2004)，Regulation of mitochondrial transcription factor A expression by high glucose.Ann NY Acad Sci.1011：69-77)。PGC-1α可以调控脂肪酸的运输和脂肪酸的β-氧化(Patti ME等(2003)，Coordinated reduction of genes of oxidative metabolism in humans with insulin resistanceand diabetes：Potential role ofPGC1 and NRF1.Proc Natl Acad Sci U S A.100(14)：8466-71)。在肌肉组织中，持久的耐力训练和β-肾上腺素的激活可以刺激PGC-1α的表达，增加线粒体的生成和脂质的氧化。 

通过调控PGC-1α的通路增加线粒体的生成被认为是预防和改善胰岛素抵抗，糖尿病和肥胖的关键(McCarty MF.(2005)，Up-regulation of PPARgamma coactivator-1 alpha as a strategyfor preventing and reversing insulin resistance and obesity.Med Hypotheses.64(2)：399-407)。已有几种药物被测试研究，诸如metformin和5-aminoimidazole-4-carboxamideribonucleoside，塞唑烷二酮类药物中的比格列酮，β肾上腺素受体激动剂CL-316，243，和***相关受体-a。 

食品的添加剂可能是预防和治疗糖尿病的一种补充，特别是针对于防治糖尿病的并发症。以下是在试验或临床上被证实的有效的矿物质，维生素和辅酶：钒，铬，镁，锌，硒，铜，vit E，vitC，辅酶Q10，尼克酰胺，核黄素，黄酮类。本发明人认为R-LA和ALC是重要的线粒体营养素。近年来临床试验中发现R-LA和ALC可以预防和治疗糖尿病及其并发症。两种药物都可以提高胰岛素的敏感性，近期研究也显示可以改善代谢综合征并发的心血管症 状。然而，对于R-LA和ALC促进线粒体生成未见有报道，特别是对于两者在线粒体生成方面的协同性的研究。 

白色脂肪组织是重要的内分泌器官，参与调控整个机体的代谢和胰岛素的敏感性。线粒体生成可能是调控机体代谢及胰岛素敏感性的关键。本发明人的研究发现，脂肪细胞经应用R-LA或/和ALC处理24小时后可显著增加线粒体的体积，增加线粒体电子传递链的复合物I，II，III蛋白的表达，这些变化伴随着促进线粒体生成的转录因子的表达。包括PGC-1α，mtTFA，NRF1和NRF2。 

联合应用R-LA和ALC在0.1和1uM低剂量显示出显著的协同效应，几乎是单独应用R-LA或ALC的10倍，R-LA和ALC可以上调mtTFA的表达，mtTFA的转录部分受NRF1和NRF2的调节，NRF1和NRF2在mRNA上的上调与之相一致。 

白色脂肪组织中线粒体的生成和重塑可增加脂肪酸的氧化和提高耗氧量，R-LA和ALC的效应可以预见为直接或间接改变机体的能量代谢和胰岛素的敏感性。本发明人的研究结果显示应用R-LA和ALC作用于3T3-L1脂肪细胞不仅可以增加胰岛素的敏感性，增加线粒体的密度和改变线粒体的结构，R-LA和ALC两者的协同效应显示了促线粒体生成的作用，但两者间如何相互作用的机制仍然需要进一步探讨。 

本发明人观察到R-LA或/和ALC可以增加PGC-1α，NRF1和NRF2的表达，根据文献以及实验，提示R-LA和ALC通过上调PGC-1α的表达，促使脂肪组织线粒体的生成；也即R-LA或/和ALC通过激活PGC-1α，然后协同促进线粒体的生成和线粒体蛋白的合成。R-LA或/和ALC增加PGC-1α的表达和线粒体传递链蛋白的表达，可以增加白色脂肪组织氧化磷酸化的能力。值得注意的是增加线粒体脂肪酸氧化的能力与脂肪组织脂质的合成是相平行的。 

另一方面，游离脂肪酸可抑制胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降，伴随线粒体活性氧的增加，膜电位的下降，UCP-2蛋白的上调和降低葡萄糖刺激的ATP合成。这些结果表明油酸导致的线粒体功能紊乱是2型糖尿病的胰岛β细胞功能紊乱的主要原因，应用线粒体营养素R-LA和ALC预防性干预可修复胰岛β细胞功能。本发明人的研究首次报道了R-LA和ALC对于2型糖尿病的胰岛β细胞的保护效应，提示日常添加上述线粒体营养素可有效预防和延缓2型糖尿病的胰岛β细胞功能紊乱。 

长期过量的游离脂肪酸可加重线粒体电子传递链的电子漏，使得线粒体膜超极化产生活性氧，大量的氧自由基会损伤胰岛β细胞并可能引起细胞的死亡。高血糖，高血脂和肥胖可以引发葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降，胰岛β细胞损伤，这是2型糖尿病的主要特征。本发明人的研究结果显示，活性氧和UCP-2的上调在游离脂肪酸诱导的β细胞损伤中占有重要的作用。该结论不仅在高游离脂肪酸所导致的线粒体功能的紊乱的作用中得到证实而且在应用线粒体营养素R-LA和ALC的保护效应中也得到证实。 

本发明人的研究证实，长期在高血糖、高血脂的条件下可以抑制MIN6细胞胰岛素的分泌。应用R-LA和ALC干预性治疗可以改善油酸抑制的胰岛素分泌。胰岛β细胞98％的ATP来源于线粒体的供给，线粒体ATP是葡萄糖刺激的胰岛素分泌和线粒体氧化磷酸化的调控者。直接测定细胞内的ATP含量证实油酸长期刺激可导致葡萄糖刺激的ATP合成下降而应用R-LA和ALC可以提高ATP的合成，结果表明线粒体功能的紊乱可抑制胰岛素的分泌。 

脂毒性增加了胰岛β细胞线粒体氧化磷酸化解耦联，解耦联蛋白(UCP)位于线粒体的内膜，参与调控细胞内ATP的合成。UCP-2被激活时使质子从线粒体基质泄露到线粒体内膜 外，进而使糖代谢与ATP合成解偶联。氧化应激可促使UCP-2表达增加，是胰岛β细胞抵御氧化损伤的适应性机制。然而，另一方面，对于胰岛β细胞来说，UCP-2的上调使得线粒体氧化磷酸化解耦联，葡萄糖刺激的ATP合成下降。并且，使胰岛β细胞高表达UCP-2可降低葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降；在UCP-2基因敲除的小鼠中，胰岛素分泌可增加，并可以修复葡萄糖刺激的胰岛素分泌的下降(Joseph JW等(2002)；Uncoupling Protein 2 KnockoutMice Have Enhanced Insulin Secretory Capacity After a High-Fat Diet.Diabetes 51(11)：3211-9)。因此，UCP-2是胰岛素分泌的负性调控因子。 

本发明人的实验发现，油酸的长期刺激可以上调UCP-2在mRNA和蛋白水平上的表达，UCP-2使得氧化磷酸化解耦联，上调的UCP-2抑制了葡萄糖刺激的ATP合成，从而抑制了葡萄糖刺激的胰岛素分泌，R-LA和ALC的干预性处理，可以增加ATP的合成，修复葡萄糖刺激的胰岛素分泌。R-LA或ALC的干预性处理，可有效抑制油酸刺激的UCP-2在mRNA和蛋白水平上的上调，有趣的是联合应用R-LA和ALC并没有能够抑制UCP-2在mRNA水平上的表达，但有效抑制了其在蛋白水平上的表达，提示线粒体单个营养素在转录水平上调控，而联合应用营养素在翻译水平上进行调控。 

氧化应激与高游离脂肪酸水平相关。尤其活性氧是诱发2型糖尿病胰岛β细胞功能损伤的主要原因。线粒体电子传递链是哺乳动物产生氧自由基的主要部位，同时也是降低氧化损伤和清除氧自由基的主要靶点(Poitout，Vincent DVM.(2002)Lipid partitioning in thepancreatic[beta]cell：physiologic and pathophysiologic implications.Current Opinion inEndocrinology & Diabetes.9(2)：152-159)。先前的试验表明线粒体是MIN6细胞产生活性氧的主要部位，本发明人检测到MIN6细胞线粒体活性氧的产生主要依赖于油酸的长期刺激，同时也观察到R-LA和ALC的预处理可以降低油酸诱导的活性氧的产生，从而对MIN6细胞有保护作用。油酸慢性刺激可显著增加活性氧的产生，这是诱发线粒体功能紊乱(ATP合成下降，膜电位下降，线粒体结构变化，伴随着胰岛素分泌的下降)的主要原因。 

线粒体营养素R-LA和ALC修复油酸抑制MIN6细胞胰岛素分泌主要在于能够清除线粒体氧自由基的产生和促使能量的合成。R-LA用于治疗糖尿病的并发症，主要用于糖尿病的神经病变通过改善胰腺和外周组织葡萄糖的转运和代谢。然而，联合应用R-LA和ALC治疗糖尿病未见有报道，本发明人的研究表明ALC类似于R-LA可以有效的保护MIN6细胞油酸所诱导的线粒体的氧化损伤和抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，两者联合应用效果更佳。 

综上，游离脂肪酸可抑制胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降，伴随线粒体活性氧的增加，膜电位的下降，UCP-2蛋白的上调和降低葡萄糖刺激的ATP合成。这些结果表明油酸导致的线粒体功能紊乱是2型糖尿病的胰岛β细胞功能紊乱的主要原因，应用线粒体营养素R-LA和ALC预防性干预可修复胰岛β细胞功能。本发明人的研究首次报道了R-LA和ALC对于2型糖尿病的胰岛β细胞的保护效应，提示日常添加上述线粒体营养素可有效预防和延缓2型糖尿病的胰岛β细胞功能紊乱。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

序列表 

<110>中国科学院上海生命科学研究院 

<120>线粒体营养素组合物在防治胰岛素抵抗和糖尿病中的应用 

<130>066570 

<150>CN200610025091.X 

<151>2006-03-27 

<160>12 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>1 

cgcagcacct ttggagaa                                                    18 

<210>2 

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<212>DNA 

<213>人工序列 

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<223>引物 

<400>2 

cccgacctgt ggaatacttg                                                  20 

<210>3 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>3 

atggatttga ttgacatcct t                                                21 

<210>4 

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<213>人工序列 

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<223>引物 

<400>4 

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<210>5 

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<213>人工序列 

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<223>引物 

<400>5 

acggccaagt catcactatt g                                                21 

<210>6 

<211>19 

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<213>人工序列 

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<223>引物 

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agccaccgat ccacacaga                                                   19 

<210>7 

<211>26 

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<213>人工序列 

<220> 

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<223>寡核苷酸探针 

<400>7 

tttcctccta actaaaccct ctttac                                           26 

<210>8 

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<212>DNA 

<213>人工序列 

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<223>寡核苷酸探针 

<400>8 

gtaggcaagt aaagagggtt tagtta                                           26 

<210>9 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

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gtcggagata ccagagcact                                                   20 

<210>10 

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<223>引物 

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gtgacctgcg ctgtggtact                                                   20 

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acggccaagt catcactatt g                                                21 

<210>12 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>12 

agccaccgat ccacacaga                                                    19 

Claims (6)

1.一种混合物在制备预防、改善或治疗2型糖尿病的药物或膳食添加剂的用途，其特征在于，所述的混合物含有：

R-硫辛酸或其生理学可接受的盐10-200重量份、乙酰肉碱或其生理学可接受的盐10-200重量份、生物素或其生理学可接受的盐0.2-2重量份和尼克酸或其生理学可接受的盐5-300重量份；所述组分之和占混合物总重量的10-100％。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的混合物还含有：维生素E或其生理学可接受的盐20-200重量份和辅酶Q10或其生理学可接受的盐10-200重量份。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物用于预防、改善或治疗2型糖尿病，并且所述的组合物含有：

R-硫辛酸或其生理学可接受的盐10-200重量份、乙酰肉碱或其生理学可接受的盐10-200重量份、生物素或其生理学可接受的盐0.2-2重量份和尼克酸或其生理学可接受的盐5-300重量份；所述组分之和占组合物总重量的10-100％。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中还含有维生素E或其生理学可接受的盐20-200重量份和辅酶Q10或其生理学可接受的盐10-200重量份。

5.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中还含有：药学上或食品学上可接受的载体或赋形剂。

6.一种混合物在制备预防、改善或治疗2型糖尿病的药物或膳食添加剂的用途，其特征在于，所述的混合物由10-200重量份R-硫辛酸或其生理学可接受的盐、10-200重量份乙酰肉碱或其生理学可接受的盐、0.2-2重量份生物素或其生理学可接受的盐和5-300重量份尼克酸或其生理学可接受的盐构成。

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