KR101908862B1 - 서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 지방간 억제용 약학 조성물 - Google Patents
서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 지방간 억제용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 지방간 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은, 지방산 산화 유전자의 발현을 증가시키면서도 세포독성은 나타내지 않으므로, 지방간 치료를 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 지방산 산화 유전자의 발현을 증가시키면서도 세포독성은 나타내지 않으므로, 지방간 치료를 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 간에서 지방 축적으로 발생하는 지방간 질환(fatty liver disease)에 대해 지방산 산화 활성화를 통해 중성지방 축적 저해 효능을 갖는 서목태 동충하초 발효추출물의 제조 방법과 이를 유효성분으로 하는 지방간 억제용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스핑고신 일인산 인산화 효소의 활성화를 통해 스핑고신 일인산의 증가가 간 내 지방산 산화를 증가시키도록 한 서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 지방간 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
현대사회에서 생활수준의 향상으로 과다영양섭취가 발생하고 있으나 운동부족과 소비열량이 적어 체내 과다 영양분의 축적으로 비만, 지방간, 인슐린 저항성, 심혈관 질환 등의 각종 대사이상 성인병의 발생이 증가하고 있다. 과영양으로 인한 성인병 중 지방간은 과도한 지방 및 알코올 섭취, 간의 중성지방 생합성 증가, 간으로부터의 중성지방 분비 감소 등으로 인해 간에서 중성지방의 축적으로 발생하며 간에서 축적된 지방이 5% 이상일 때 지방간으로 진단된다.
지방간 질환은 알코올 과다 섭취로 발생하는 알코올성 지방간 질환과 비만, 당뇨병, 고지혈증, 또는 약물섭취로 인한 비알코올성 지방간 질환으로 분류된다. 비알코올성 지방간질환은 음주 여부와 상관없이 간 내에 중성지방이 축적되는 질환으로 초기에 지방간증 (steatosis)로 나타나며 발전 시 지방간염 (steatohepatitis)으로 발전된다.
비알코올성 지방간증은 병리학적으로 간세포에 발생하는 지방적 (lipid droplet)의 크기에 따라 거대소포성 지방간증과 미세소포성 지방간증으로 구분되며 대부분의 비알코올성 지방간증은 거대 소포성으로 초기에는 일반적으로 특이한 증상이 없으나 만성적으로 서서히 진행되어 간기능이 점차적으로 나빠진다. 비알코올성 지방간증은 에너지소모의 불균형으로 인해 지방조직으로부터 간으로 이동되는 지방산이 증가하여 발생하며 지방산 산화능 감소와 중성지방 생합성 증가로 인한 간 내 지방축적이 원인이다. 따라서 지방산 산화 및 생합성 관련 효소의 발현을 조절하는 PPARα와 SREBP-1과 같은 핵수용체의 변화가 중요한 역할을 한다. 지방축적이 심한 지방간증은 지방간염으로 발전하며 염증반응이 심해지면서 간섬유화 (fibrosis)와 간경화 (cirrhosis)로 발전하게 된다. 따라서 초기 예후인 지방간증에서 간경변으로 발전하는 것을 예방하기 위해서는 간 내 지방적의 축적을 예방해야 하나 마땅한 치료법이 없다. 알코올성 지방간증으로 판명된 환자의 50%, 그리고 비알코올성 지방간으로 진단된 환자의 30%가 간경화로 발전하다는 사실을 감안한다면 지방간증은 매우 심각한 간질환으로 간주될 수 있다.
현재 특정적으로 지방간만을 약학적으로 치료하는 유효약제는 거의 없는 상태이며 운동과 식이요법을 추천하고 있으나 치료효율은 매우 낮아 다국적 제약회사에 의한 지방간 치료제 개발이 계속적으로 진행되고 있다. 당뇨병과 비만상태에서 관찰되는 인슐린저항성과 지방간과의 상관성이 보고되면서 당뇨병치료제 및 고중성지방치료제인 메트포민 (metformin)이나 PPARα활성화제인 fenofibrate가 지방간 치료에 처방되고 있다.
동충하초 (Cordyceps militaris)는 사상균의 일종인 동충하초균이 곤충에 감염되어 성장한 약용버섯으로 한국, 일본, 중국, 네팔 등에 분포되어 있다. 동충하초 추출물은 항염증 및 림프종, 백혈병, 방광암 등 항암활성과 면역력 조절 및 강화에 효과적이다. 그러나 자연산 동충하초는 희귀하고 자연에서 대량 채취가 어렵기 때문에 발아시킨 서목태 (쥐눈이콩, Rhynchosia Nulubilis Soybean)를 기주로 하여 동충하초를 재배하였다. 이렇게 기주를 달리하여 배양된 서목태 동충하초 (Cordyceps militaris grown on Rhynchosia Nulubilis Soybean)는 곤충을 기주로 하여 생장하는 자연 채취 동충하초와 비교했을 때 생리활성에 대한 차이점이 아직 규명되어 있지 않다.
우리나라는 된장, 간장 및 김치 등과 같은 발효식품을 많이 섭취하고 있으며 전통발효식품은 많은 건강 효과가 있다고 알려져 왔다. 특히 유산균에 의한 식품의 발효는 보존, 맛, 향, 질감 뿐 아니라 소화능과 천연대사산물과 같은 생리활성을 상승시키며 유산균으로 발효한 식품은 기존의 식품보다 생리활성 물질이 증가되고 면역력을 높인다는 연구결과가 있다. 그러나 서목태 동충하초를 유산균으로 발효한 추출물의 비알코올성 지방간 경감 및 치료 효능에 대해서는 아직까지 알려진 바 없다.
관련 종래기술로서 미국공개특허 제2013-0259894호(2014.02.15.)는 중국에서만 시판이 승인되는 동충하초인 Cordyceps synensis 균사체 분말에 대한 간섬유증 및 비알코올성 지방간 질환 방지 효능에 대한 조성물을 개시한 바 있다.
Food Chem Toxicol. 2013;60:52-7
Chin Med. 2009;4:12
본 발명은 상기한 종래 기술의 요망에 부응하기 위하여 발명된 것으로서, 본 발명은 서목태 동충하초 미생물 발효 추출물이 스핑고신 인산화 효소의 발현을 상승시키고, 간세포 내 지방산 산화를 증가시켜 지방간 치료에 유용한 서목태 동충하초 발효 추출물의 비알코올성 지방간 예방 및 개선용 식품 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 제1 실시예에 의한 서목태 동충하초 발효 추출물의 비알코올성 지방간 예방 및 개선용 식품 조성물 및 이의 제조방법은, a) 서목태 동충하초를 증류수로 105℃에서 2시간 열수 추출한 다음, 그 추출액에 유산균(Pediococcus pentosaceus ON188)을 접종하여 24시간 동안 발효한 후 100℃의 열탕 조건에서 10분간 가열한 후 3분간 초음파 처리하는 단계; 및 b) 상기 발효된 서목태 동충하초 발효 추출물을 열수로 추출하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법에 의하면, 지방산 산화 유전자의 발현을 증가시키면서도 세포독성은 나타내지 않으므로, 지방간 치료를 목적으로 유용하게 사용될 수 있는 효과를 가지고 있다.
도 1은 본 발명의 간세포에 (A) 자연산 동충하초(C. militaris), (B) 서목태 동충하초(GSC) 열수 추출물 또는 (C) 서목태 동충하초 발효 추출물(GSC-ON188)의 세포 생존율을 도시한 막대그래프이고,
도 2는 본 발명의 간세포에 (A) 자연산 동충하초(C. militaris), (B) 서목태 동충하초(GSC) 열수 추출물 또는 (C) 서목태 동충하초 발효 추출물(GSC-ON188)의 지방산 산화 유전자의 발현 변화를 도시한 막대그래프이며,
도 3은 본 발명의 간세포에 (A) 자연산 동충하초(C. militaris), (B) 서목태 동충하초(GSC) 열수 추출물 또는 (C) 서목태 동충하초 발효 추출물(GSC-ON188)의 생합성 유전자의 발현 변화와, (D) 세포 내 S1P의 농도 변화 및, (E) 세포 내의 단백질 발현 변화를 도시한 막대그래프이며,
도 4는 본 발명의 간세포에 지방산 처리하여 세포 내 지방적을 발생시키고 서목태 동충하초 미생물 발효 추출물을 처리하여 지방적의 축적을 염색으로 관찰한 사진이며,
도 5는 본 발명의 서목태 동충하초 미생물 발효추출물을 용량별로 고지방식이에 혼합하여 마우스에 4주간 섭취시켰을 때 (A) 마우스의 체중변화와 (B) 식이섭취율을 도시한 그래프이며,
도 6은 본 발명의 서목태 동충하초 발효추출물을 용량별로 고지방식이에 혼합하여 마우스에 4주간 섭취시키고 나서 분리한 (A) 간 조직의 지방적 변화와 (B) 지방조직 내 지방세포의 크기를 염색으로 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 간세포에 (A) 자연산 동충하초(C. militaris), (B) 서목태 동충하초(GSC) 열수 추출물 또는 (C) 서목태 동충하초 발효 추출물(GSC-ON188)의 지방산 산화 유전자의 발현 변화를 도시한 막대그래프이며,
도 3은 본 발명의 간세포에 (A) 자연산 동충하초(C. militaris), (B) 서목태 동충하초(GSC) 열수 추출물 또는 (C) 서목태 동충하초 발효 추출물(GSC-ON188)의 생합성 유전자의 발현 변화와, (D) 세포 내 S1P의 농도 변화 및, (E) 세포 내의 단백질 발현 변화를 도시한 막대그래프이며,
도 4는 본 발명의 간세포에 지방산 처리하여 세포 내 지방적을 발생시키고 서목태 동충하초 미생물 발효 추출물을 처리하여 지방적의 축적을 염색으로 관찰한 사진이며,
도 5는 본 발명의 서목태 동충하초 미생물 발효추출물을 용량별로 고지방식이에 혼합하여 마우스에 4주간 섭취시켰을 때 (A) 마우스의 체중변화와 (B) 식이섭취율을 도시한 그래프이며,
도 6은 본 발명의 서목태 동충하초 발효추출물을 용량별로 고지방식이에 혼합하여 마우스에 4주간 섭취시키고 나서 분리한 (A) 간 조직의 지방적 변화와 (B) 지방조직 내 지방세포의 크기를 염색으로 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 첨부된 도면들에서 구성에 표기된 도면번호는 다른 도면에서도 동일한 구성을 표기할 때에 가능한 한 동일한 도면번호를 사용하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 아울러 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다.
[제1실시예]
도 1은 AML-12 간세포에 (A) 자연산 동충하초(C. militaris), (B) 서목태 동충하초(GSC) 열수 추출물 또는 (C) 서목태 동충하초 발효 추출물 (GSC-ON188)을 처리한 후 24시간 경과 후에 측정한 세포 생존율을 나타낸다. 결과는 매개체 대조군(vehicle-treated control)과의 상대적인 백분율로 표시하였으며 평균 ㅁ 표준오차로 나타내었다.
도 2는 AML-12 간세포에 (A) 자연산 동충하초(C. militaris), (B) 서목태 동충하초(GSC) 열수 추출물 또는 (C) 서목태 동충하초 발효 추출물 (GSC-ON188)을 처리한 후 24시간 후 지방산 산화 유전자인 CPT1의 mRNA 발현 변화를 real-time PCR로 측정한 결과를 나타낸다. 양성대조군으로 PPARα 활성화제인 WY-14643을 처리하였다. 데이터는 평균 ㅁ 표준오차로 표시하였다(*p＜0.05 vs. 매개체 대조군).
도 3은 AML-12 간세포에 (A) 자연산 동충하초(C. militaris), (B) 서목태 동충하초(GSC) 열수 추출물 또는 (C) 서목태 동충하초 발효 추출물 (GSC-ON188)을 처리한 후 24 시간 후 sphingosine 1-phosphate (S1P) 생합성 유전자인 SPHK2의 mRNA 발현 변화를 real-time PCR로 측정한 결과를 나타낸다. GSC-ON188 24시간 처리 후 (D) 세포 내 S1P의 농도 변화와 (E) 세포 내 CPT1, SPHK2, PPARα의 단백질 발현 변화를 나타낸다. 양성대조군으로 PPARα 활성화제인 WY-14643을 처리하였다. 데이터는 평균 ㅁ 표준오차로 표시하였다(*p＜0.05 vs. 매개체 대조군).
도 4는 AML-12 간세포에 지방산인 oleic acid를 처리하여 세포 내 지방적을 발생시키고 서목태 동충하초 미생물 발효 추출물을 처리하여 지방적의 축적을 Oil Red O 염색으로 관찰하였다. 양성대조군으로 PPARα 활성화제인 WY-14643을 처리하였다.
도 5는 서목태 동충하초 미생물 발효추출물을 용량별로 고지방식이에 혼합하여 8주령 C57BL6 마우스에 4주간 섭취시켰을 때 (A) 마우스의 체중변화와 (B) 식이섭취율을 나타낸다. 데이터는 평균 ㅁ 표준오차로 표시하였다(*p＜0.05 vs. 고지방식이 대조군).
도 6은 서목태 동충하초 발효추출물을 용량별로 고지방식이에 혼합하여 8주령 C57BL6 마우스에 4주간 섭취시키고 나서 분리한 (A) 간 조직의 지방적 변화와 (B) 지방조직 내 지방세포의 크기를 Hematoxylin & Eosin 염색으로 나타내었다.
본 발명의 제1실시예에 따라, a) 서목태 동충하초를 증류수로 105℃에서 2시간 열수 추출한 다음, 그 추출액에 유산균(Pediococcus pentosaceus ON188)을 접종하여 24시간 동안 발효한 후 100℃의 열탕 조건에서 10분간 가열한 후 3분간 초음파 처리하는 단계; 및 b) 상기 발효된 서목태 동충하초 발효 추출물을 열수로 추출하는 단계를 포함하는 열수 추출물의 제조 방법이 제공된다.
상기 단계 a)의 발효는 2 ~ 10시간 동안 수행될 수 있고, 상기 단계 b)의 추출은 30분 ~ 5시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따라, 상기 서목태 동충하초의 발효 열수 추출물을 포함하는 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서목태 동충하초의 발효 추출물의 열수 추출물을 포함하는 지방간 치료용 식품 및 약학 조성물이 제공된다.
상기 열수 추출물은 SPHK1, SPHK2, CPT1, ACOX1 및 PPARα로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있고, 간조직 내 지방적(lipid droplet)의 감소를 가져올 수 있으며, 지방조직에서 지방세포의 크기를 감소시킬수 있으며, 세포독성을 나타내지 않을 수 있다.
본 발명은 a) 서목태 동충하초를 고상 발효시키는 단계; 및 b) 상기 발효된 서목태 동충하초를 열수로 추출하는 단계를 포함하는 서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법을 제공한다. 상기 발효 온도는 37 ℃, 발아시간은 48시간 일 때 바람직하게 수행될 수 있다.
상기 단계 a)의 발효는 24 ~ 48시간 동안 수행될 수 있고, 48시간 동안 발효시킴으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 단계 b)의 추출은 6시간 ~ 24시간 동안 수행될 수 있고, 1시간 동안 가열함으로써 바람직하게 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발효된 서목태 동충하초 열수 추출물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 발효된 서목태 동충하초 발효 추출물을 포함하는 지방간 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 함유되는 서목태 동충하초 발효 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 서목태 동충하초 발효 추출물은 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 서목태 동충하초 발효추출물을 0.001 내지 90% 중량백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 열수 추출물은 TNFα, IL-1β 및 iNOS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있고, pJNK, pERK 및 pp38로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있으며, 세포독성을 나타내지 않을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 서목태 동충하초 추출물의 준비
서목태 동충하초 (GRC. Cordyceps militaris grown on germinated Rhynchosia nulubilisa, Kucati: 0093)은 (주) 세포활성연구소 (성남시, 경기도)에서 재배한 것을 준비하였다.
열수 추출물의 제조를 위해, 서목태동충하초 원물을 121℃에서 15분간 멸균처리하여 발효에 이용하였다. 발효를 위해 양파로부터 유래한 유산균인 Pediococcus pentosaceus ON188를 접종하여 48시간 동안 37℃에서 발효하였다. 다음 서목태 동충하초 발효물 100g을 열수 500 ml에 넣고 24시간 동안 추출하였다. 이후 동결건조하여 최종 추출된 분말은 분석 시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
2. 세포 배양 및 세포 생존율 분석
AML-12 간세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 획득하였다. 세포는 10 % FBS(fetal bovine serum), 100 U/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신으로 보충된 고함량 글루코스(glucose)의 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 5 % CO2 조건하의 37 ℃의 습한 기온 조건하에서 6-웰 플레이트에 8ㅧ105 cells 접종하여 24시간 동안 배양하여 준비하였다. 다양한 농도의 서목태 동충하초 발효추출물을 세포에 처리하고 24시간 후에 세포에 XTT(2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide)를 처리하여 450㎚에서 흡광도를 분광기에서 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.
3. RNA 분리 및 실시간 RT-PCR 방법
RNA 추출 키트(intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 AML-12 간세포로부터 총 RNA를 분리하였다. iScript cDNA 생합성 키트(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 PCR 유전자 증폭기(thermal cycler)로 cDNA(First-strand cDNA)를 합성하였다. PCR 조건은 25℃에서 5분, 42℃에서 30분, 8℃에서 5분 그리고 이후 4℃에서 유지하는 것으로 하였다. RT-PCR 분석은 PCR 시스템(Step-One Plus Real-Time PCR System, Applied Biosystems Ins, Carlsbad, CA)에서 프라이머 및 SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR Green Master Mix, TaKaRa, Japan)를 사용하여 수행하였다. RT-PCR의 조건은 초기 95℃에서 5분을 유지한 다음 95 ℃에서 5분, 60℃에서 15분, 72℃에서 45분, 95℃에서 15분, 60℃에서 1분을 40주기로 하여 수행하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 1에 정리하였다. 상기 유전자들의 발현은 β-actin을 기준으로 정상화하였다.
| 유전자 | 프라이머 서열 | |
| CPT1 | 정방향 | CTT CCA AGG CAG AAG AGT GGG |
| 역방향 | GAA CCT TGG CTG CGG TAA GAC | |
| PPARα | 정방향 | ATC CAC GAA GCC TAC C |
| 역방향 | CAC ACC GTA CTT TAG CAA G | |
| SPHK2 | 정방향 | AGA CGG GCT GCT TTA CGA G |
| 역방향 | CCT GCT CAA ACC CGC CAT | |
| β-actin | 정방향 | GAC GTT GAC ATC CGT AAA G |
| 역방향 | CAG TAA CAG TCC GCC T | |
4.
스핑고신
일인산
측정 방법
AML-12 세포에 다양한 농도의 서목태 동충하초 발효추출물을 처리하고 24시간 동안 배양 후 세포를 분쇄한 후 스핑고지질을 분리한 후 고속액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS/MS)를 활용하여 정량하였다.
5. 웨스턴 블로팅 분석 방법
세포를 10 mM Tris (pH 7.8), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 인산가수분해효소 억제제(phosphatase inhibitors) 및 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitors)를 포함하는 용균 버퍼에서 균질화시킨 후 용해물(lysate)을 원심분리하여 세포 파쇄물 및 파쇄되지 않은 세포를 제거하였다. 단백질 분석 키트(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 750nm에서 흡광도를 측정함으로써 단백질의 농도를 정량하였다. 단백질 30㎍을 10% SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리하였고, 상기 겔 내의 단백질은 PDVF 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 단백질에 특이적인 1차 항체를 연결시키고, 쥐-특이적 또는 토끼-특이적 2차 항체를 인큐베이션하였다. 상기 단백질에 대한 관점을 강화된 화학발광 키트(BioRad, Hercules, CA) 및 화학발광 영상화 장치(Vilber Lourmat, Sint-Denijs-Westrem, Belgique)를 사용하여 시각화하였다. CPT1, SPHK2, PPARα, β-actin (Cell signaling, Danvers, MA)에 대한 1차 항체가 사용되었다.
6. 마우스 동물실험
8주령 C57BL6 마우스에 2주간 60% kcal 고지방식이를 섭식시킨 후, 60% 고지방식이에 다양한 농도 (50, 100, 200 mg/kg/day, n=7)로 서목태 동충하초 발효추출물을 혼합하여 4주간 섭식시켰다. 이때 대조군으로서 일반식이 (NC)와 PPARα활성화제인 fenofibrate(20mg/kg/day)를 혼합한 60% kcal 고지방식이를 섭식시켰다. 4주 섭식 동안 매주 체중과 식이섭취량을 측정하였으며 4주 섭식후 마우스에서 간조직과 지방조직을 분리하여 병리분석에 사용하였다.
7. 병리 분석
마우스에서 분리한 간 조직과 지방조직은 포르말린에 24시간 고정시킨 후 파라핀 블록을 만들고 5 μm 두께의 절편을 준비하여 Hematoxylin & eosin에 염색하였다. 이때 간조직의 지방적 축적과 지방조직의 세포크기를 현미경으로 관찰하였다.
8. 통계 처리
모든 결과는 평균 ㅁ 표준오차(SEM)로 표현하였다. 시험은 적어도 세 번씩 독립적으로 수행하였다. 결과는 t 테스트(Student's t-test)를 사용하여 분석하였고 p 값(p value)이 0.05보다 적으면 통계적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
<시험예>
1. 서목태 동충하초 발효추출물의 세포생존율
서목태 동충하초 추출물(GSC)과 서목태 동충하초 발효추출물(GSC-ON188)의 세포독성을 평가하기 위해 GSC와 GSC-ON188이 세포 생존율에 영향을 미치는 지를 시험하였다. AML-12 간세포를 0, 5, 10, 25, 50 및 100㎍/㎖의 동충하초 추출물과 함께 24시간 동안 배양하였다. 세포 생존율은 세포 증식 분석 키트(Wel gene Inc, Korea)를 사용하여 XTT 분석을 통해 측정하였다. 대조군인 자연산 동충하초 (C. militaris) 추출물과 GSC 추출물은 모두 세포독성을 나타내지 않았다(도 1의 A와 B).
또한 GSC-ON188 추출물도 세포독성을 나타내지 않았다(도 1의 C). 이러한 결과로 서목태 동충하초 추출물과 서목태 동충하초 발효추출물이 모두 세포독성을 전혀 나타내지 않는다는 것을 제시할 수 있다.
2. 서목태 동충하초 발효추출물의 지방산 산화 유전자 발현 증가 효능
서목태 동충하초 발효추출물의 세포독성이 없는 것을 관찰하고 간세포에서 지방산산화를 증가시키는지에 대해 확인하고자 하였다. AML-12 간세포에 C. militaris, GSC 및 GSC-ON188 추출물을 다양한 농도로 처리하고 24 시간 후 mRNA를 분리하여 발현변화를 관찰하였다. 이때 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 control(Con)과 양성대조군인 PPARα 활성화제 WY-14643(WY)을 처리한 군을 사용하였다. WY-14643을 처리한 간세포에서 지방산 산화 유전자인 CPT1이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2).
C. militaris와 GSC를 처리한 간세포에서는 CPT1의 mRNA 발현이 증가하지 않은 반면(도 2의 A와 B), GSC-ON188을 처리한 간세포에서는 CPT1의 발현이 대조군에 비해 4-5배 증가하였다(도 2의 C). 이러한 결과는 자연산 동충하초, 서목태 동충하초와 달리 서목태 동충하초 발효추출물이 간세포에서 지방산 산화를 크게 증가시킨다는 것을 증명하고 있다.
어떤 기전을 통해 GSC-ON188이 지방산 산화능을 증가시키는지 규명하기 위해 sphingosine 1-phosphate(S1P) 합성 효소인 SPHK2의 발현을 측정하였다.
C. militaris와 GSC를 처리한 간세포에서는 SPHK2의 mRNA 발현이 증가하지 않은 반면(도 3의 A와 B), GSC-ON188을 처리한 간세포에서는 SPHK2의 발현이 대조군에 비해 5배 정도 증가하였다(도 3의 C).
또한 세포 내 S1P를 측정한 결과 GSC-ON188 처리시 대조군에 비해 72% 증가한 것을 관찰하였다(도 3의 D). 또한 CPT1, SPHK2, PPARα의 단백질 발현증가가 GSC-ON188에 의해 일어나는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 GSC-ON188이 SPHK2의 발현 증가를 통해 간에서 지방산 산화를 증가하는 신호전달물질인 S1P를 증가시키고 지방산 산화 유전자인 CPT1의 발현이 증가된다는 것을 증명하고 있다(Hepatology. 2015.62(1):135-46).
3. 서목태 동충하초 발효추출물에 의한 간세포 내 지방축적 억제 효능
지방산 산화 유전자의 발현증가가 정말 세포내 지방축적을 저해하는지 규명하기 위해 AML-12 간세포에 oleic acid 지방산을 처리하였다. Oleic acid 처리 (+FA(oleic acid))후 oil red O로 세포 내 축적된 중성지방을 측정한 결과 처리하지 않은 대조군 (Control) 보다 지방적이 염색되어 더 붉은 색을 띄는 것을 관찰할 수 있었다. 반면 양성대조군인 WY-14643으로 처리된 세포의 경우(+FA +WY)는 지방적이 현저히 감소되어 있었으며, GSC-ON188 (+FA +ON188)을 처리한 세포에서도 지방적이 현저히 감소된 것을 발견할 수 있었다. 따라서 GSC-ON188은 지방산 산화 유전자의 발현증가를 통해 세포내 지방적의 감소에 기여한다.
4. 고지방식이 섭식 마우스에서 서목태 동충하초 발효추출물에 의한 지방간 억제 효능
간세포에서 관찰된 지방산 산화증가를 확인하기 위해 8주령 수컷 C57BL6 마우스(쥐)에 고지방식이(HFD)를 2주간 섭식시킨 후 고지방식이에 GSC-ON188를 50,100, 200 mg/kg/day로 혼합하여 4주간 섭식시켰다. 이때 대조군으로 일반식이군 (NCD)과 양성대조군으로 PPARα활성화제인 fenofibrate 20 mg/kg/day (를 섭취시킨 마우스 군을 사용하여 비교하였다. 섭식시킨 4주간 일반식이군(NCD)은 현저히 낮은 체중을 보였으나 고지방식이군(HFD)은 시간이 지남에 따라 체중이 급격히 증가하였다. GSC-ON188 50, 100 mg/kg/day 군은 고지방식이군과 체중에 큰 차이를 보이지 않았으나 200 mg/kg/day을 복용한 마우스는 유의적인 체중의 감소를 나타내었다(도 5의 A).
그리고 fenofibrate 복용 마우스는 현저한 체중의 감소를 나타내었는데 이는 먹이섭취량의 감소로 인한 것으로 판단된다(도 5의 B). 먹이 섭취에 있어서 다른 마우스군들은 큰 차이를 보이지 않았다(도 5의 B).
마우스의 간조직을 분리하여 Hematoxylin & Eosin으로 염색하였을 때 고지방식이군은 일반식이군과 달리 간조직에 지방적을 축적하였으며 간세포 내에도 지방이 축적된 병리적 형태를 보였다. 그러나 대조군인 일반식이와 fenofibrate 복용군은 일반적 간조직의 병리적 형태를 보였다(도 6의 A).
GSC-ON188을 복용한 마우스의 간조직은 50 mg/kg/day 용량에서는 일부 지방적이 조직 내에 축적된 형태를 보였으나 고지방식이군보다 그 크기는 작았다. GSC-ON188 복용량이 높아지면서 일반식이군과 유사한 간조직의 형태를 보였으며 지방적이 사라진 형태를 관찰하였다(도 6의 A).
한편 복부지방조직을 분리하여 Hematoxylin & Eosin으로 염색하였을 때 고지방식이군은 일반식이군보다 지방세포의 크기가 현저히 큰 것을 관찰할 수 있었으며 양성 대조군인 fenofibrate 복용군은 지방세포의 크기가 현저히 작아져 있는 것을 관찰할 수 있었다. GSC-ON188을 복용한 마우스는 지방세포의 크기가 용량이 높아짐에 따라 현저히 작아지는 것으로 보아 지방세포 내 지방의 축적이 GSC-ON188에 의해 현저히 억제되는 것으로 판단된다. 따라서 서목태 동충하초 발효추출물은 지방간의 억제와 지방세포의 분화 및 성장을 억제하는 것으로 판단된다.
이상에서와 같이, 본 발명의 상세한 설명에서 구체적인 실시예에 관해 설명하였으나, 본 발명의 기술이 당업자에 의하여 용이하게 변형 실시될 가능성이 자명하며, 이러한 변형된 실시예들은 본 발명의 특허청구범위에 기재된 기술사상에 포함된다할 것이다.
Claims (8)
- a) 서목태 동충하초를 증류수로 105℃에서 2시간 열수 추출한 다음, 그 추출액에 유산균(Pediococcus pentosaceus ON188)을 접종하여 24시간 동안 발효한 후 100℃의 열탕 조건에서 10분간 가열한 후 3분간 초음파 처리하는 단계; 및
b) 상기 발효된 서목태 동충하초 발효 추출물을 열수로 추출하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단계 a)의 발효가 24 ~ 48시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단계 b)의 추출이 6 ~ 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 서목태 동충하초 발효 추출물의 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 서목태 동충하초 발효 추출물을 포함하는 식품 조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 서목태 동충하초 발효 추출물을 포함하는 지방간 억제용 약학 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 서목태 동충하초 발효 추출물이 CPT1, SPHK2 및 PPARα로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 지방간 억제용 약학 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 서목태 동충하초 발효 추출물이 sphingosine 1-phosphate 생합성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 지방간 억제용 약학 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 서목태 동충하초 발효 추출물이 세포독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 지방간 억제용 약학 조성물.
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