CN101044162B - Glp-1类似物融合蛋白质制剂 - Google Patents

Glp-1类似物融合蛋白质制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供稳定溶液制剂，其包含GLP-1-Fc融合体，pH在约pH6至约pH8.5之间。与特定IgG4-Fc衍生物融合的类似物。当与pH在上述范围之外的GLP-1-Fc融合体相比时，这些制剂提供出乎意料的、相当高的化学稳定性。包含GLP-1-Fc融合体的制剂可用于治疗治疗糖尿病、肥胖、肠易激综合征以及通过降低血浆葡萄糖、抑制胃和/或肠运动、抑制胃和/或肠排空，或抑制食物摄入而受益的其他疾病。

Description

GLP-1类似物融合蛋白质制剂
技术领域
本发明涉及胰高血糖素样肽类似物，该胰高血糖素样肽类似物与蛋白质融合，所述蛋白质具有稳定融合蛋白质的作用。这些制剂可用于治疗糖尿病及其他多种疾病或紊乱。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及衍生物有希望在临床试验中治疗2型糖尿病。GLP-1诱导多种生物学效应，例如刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃运动或肠运动及诱导重量减轻。GLP-1的显著特征是其刺激胰岛素分泌而不伴有低血糖相关危险的能力，所述低血糖相关危险见于使用胰岛素治疗或通过增加胰岛素表达起作用的某些类型的口服治疗时。
GLP-1(1-37)活性很低，并且GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2这两种天然存在的截短的肽在体内被迅速清除，并且具有极短的体内半寿期这一事实限制了涉及GLP-1肽的治疗的有效性。已知内源性产生的二肽基肽酶IV(DPP-IV)通过去除N端组氨酸和丙氨酸残基而使循环GLP-1肽失活，这是体内短半寿期的主要原因。
已经采取多种途径以在保持生物学活性的同时延长GLP-1肽的清除半寿期或降低该肽从机体的清除。一条途径涉及将GLP-1肽与免疫球蛋白Fc部分融合。免疫球蛋白一般具有长体内循环半寿期。
例如，IgG分子在人体内具有高达23天的半寿期。免疫球蛋白Fc部分是这种体内稳定性的部分原因。在保留GLP-1分子生物学活性的同时，GLP-1-Fc融合蛋白质具有由免疫球蛋白Fc部分提供的稳定性的优点。
尽管此途径对于GLP-1疗法(参见WO 02/46227)是可行的，但是对多种融合蛋白质长时期反复施用时的抗原性存在普遍的顾虑。对于GLP-1-Fc融合体疗法，这尤其是一个顾虑，因为糖尿病患者一旦经诊断患有该疾病，就必须一生接受治疗。此外，如果Fc部分保留不需要的效应子功能，Fc融合蛋白质疗法可能是一个顾虑。该方法是PCT/US 04/15595(WO2005/000892)的焦点，其中通过鉴定特定GLP-1-Fc融合蛋白质克服了与施用GLP-1-Fc融合体相关的关于潜在免疫原性和效应子活性的问题，所述特定GLP-1-Fc融合蛋白质反复和长期施用后，诱导免疫反应风险降低并且不再具有效应子功能的。
对于在细菌细胞中合成产生或重组产生具有这种性质的融合蛋白质，在技术上过于庞大和复杂。这些融合蛋白质一般在诸如CHO、293或NS0的哺乳动物细胞中产生。观察到在哺乳动物细胞中产生的融合蛋白质比在细菌细胞中产生的非融合蛋白质更易于被内源蛋白酶降解以及化学改变。本发明试图解决这个问题。发现包含GLP-1-Fc融合体，缓冲在约pH6至约pH8.5之间的制剂提供增加的化学稳定性。
发明概述
为了克服GLP-1-Fc融合体化学稳定性的问题，本发明人开发了稳定的溶液制剂。具体地，发明人发现pH在约pH6至约pH8.5之间，优选在约pH6至约pH7.5之间，在约pH6至约pH7之间，在约pH6.5至约pH7.5之间，或在约pH6至约pH6.5之间，甚至更优选在约pH6或约pH6.5之间，包含治疗有效量的GLP-1-Fc融合体当与pH在上述范围之外的GLP-1-Fc融合体相比时，提供出乎意料的、相当高的化学稳定性。
本发明还包括治疗患有非胰岛素依赖性及胰岛素依赖性糖尿病、肥胖以及多种其他疾病和病症的方法，其包括施用GLP-1-Fc融合制剂。
发明详述
包含与免疫球蛋白Fc部分、免疫球蛋白Fc部分类似物或免疫球蛋白Fc部分的片段融合的GLP-1化合物的融合蛋白质。GLP-1化合物的C端和Fc部分的N端可以直接融合，或通过肽接头融合。这些融合蛋白质具有生物活性，并且与天然GLP-1相比具有延长的半寿期。GLP-1化合物部分由包含具有约25至约39个天然存在或非天然存在的氨基酸的多肽的融合蛋白质组成，具有与天然GLP-1(7-37)OH足够的同源性，该同源性使其通过与胰中β-细胞上的GLP-1结合显示促胰岛活性(insulinotropicactivity)。GLP-1化合物一般包含具有GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-37)OH类似物、GLP-1(7-37)OH的片段或GLP-1(7-37)OH类似物的片段的氨基酸序列的多肽。
可用于该制剂的融合蛋白质的实例包括含有GLP-1类似物的融合蛋白质，所述GLP-1类似物包含选自以下的序列：
a)(SEQ ID NO：1)
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly
其中Xaa8选自Gly和Val；
b)(SEQ ID NO：2)
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly
其中Xaa8选自Gly和Val；
c)(SEQ ID NO：3)
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro
其中Xaa8选自Gly和Val；
d)(SEQ ID NO：4)
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro
其中Xaa8选自Gly和Val；
e)(SEQ ID NO：5)
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly
其中Xaa8选自Gly和Val；
f)(SEQ ID NO：6)
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly
其中Xaa8选自Gly和Val；
该GLP-1类似物与免疫球蛋白Fc部分融合，其中免疫球蛋白Fc部分包含SEQ ID NO：7的序列
Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa80-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa230(SEQ ID NO：7)
其中
第16位的Xaa为Pro或Glu；
第17位的Xaa为Phe、Val或Ala；
第18位的Xaa为Leu、Glu或Ala；
第80位的Xaa为Asn或Ala；以及
第230位的Xaa为Lys或缺失。
本发明的异源融合蛋白质GLP-1类似物部分的C端和Fc部分的N端优选通过富含G的肽接头的1、1.5或2个重复融合在一起，其中肽接头具有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：8)。
用于本发明制剂的融合蛋白质包含GLP-1类似物部分和Fc部分。GLP-1类似物部分和Fc部分分别包含对天然GLP-1序列和人IgG4序列的取代，这些取代为该蛋白质提供与天然GLP-1，或没有与Fc序列融合的GLP-1类似物相比增加的潜能和体内稳定性，以及降低了对人长期和反复施用后诱导抗体形成的潜力。
天然GLP-1在体内经过加工，从而从该分子切去前6个氨基酸。因此，按照本领域习惯将GLP-1的氨基端指定为7号，羧基端为37号。如SEQID NO：9中所示对该多肽中的其他氨基酸连续编号。例如，第8位为丙氨酸，第22位为甘氨酸。经过加工的肽可以在体内进一步修饰，从而去除C端甘氨酸残基并以酰胺基替代。因此，GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)酰胺代表该分子的两种天然形式。GLP-1(7-37)OH具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列：
7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly(SEQ ID NO：9)
相对于天然GLP-1(7-37)，融合蛋白质的GLP-1类似物部分包括第8、22和36位的三个初步取代。第8位的取代降低内源性酶二肽基-肽酶IV(DPP-IV)失活该类似物的速率。DPP-IV在第二和第三个氨基酸之间(第8和第9位之间)切割天然GLP-1，产生的分子活性较低。因此，可用于本发明制剂中的融合蛋白质是DPP-IV抗性的。第22位上的取代降低分子聚集的潜力，并增加分子的潜能。具有第36位及8和22位变化的类似物以及在整个融合蛋白质中第36位的取代降低融合蛋白质在人体反复和长期施用后诱导中和性免疫应答的危险。
GLP-1类似物C端优选为以下序列之一：Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：10)、Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：11)、Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro(SEQ IDNO：12)、Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO：13)、Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO：14)和Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly(SEQ IDNO：15).
可用于本发明制剂中的融合蛋白质含有来自人类IgG4，但是与野生型人类序列相比包括一个或多个取代的Fc部分。如此处所使用，免疫球蛋白的Fc部分具有免疫学领域通常赋予该术语的意义。具体地，该术语指不含有来自该抗体两个抗原结合区(Fab片段)的抗体片段。Fc部分由通过非共价相互作用和二硫键结合的抗体的两个重链恒定区组成。Fc部分可以包含铰链区，并经CH2和CH3结构域延伸到抗体C端。Fc部分还可以包含一个或多个糖基化位点。
有五种类型的具有不同效应子功能和药物动力学特性的人类免疫球蛋白。IgG是五种类型中最稳定的，在人体内具有约23天的血清半寿期。有四个IgG亚类(G1、G2、G3和G4)，各亚类具有称作效应子功能的不同生物学功能。这些效应子功能通常由与Fc受体(FcγR)的相互作用或通过结合C1q和固定补体介导。与FcγR的结合可以导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解，而与补体因子的结合可以导致补体介导的细胞溶解。在仅利用Fc部分延长其半寿期能力的Fc融合蛋白质的设计中，将效应子功能最小化是重要的。因此，可用于本发明制剂的融合蛋白质来自人类IgG4Fc区域，因其与其他IgG亚型相比结合FcγR和补体因子的能力降低。然而，已经表明IgG4耗竭人体中靶细胞[Issacs等人，(1996)Clin.Exp.Immunol.106：427-433]。因为融合蛋白质靶定胰β细胞以诱导胰岛素表达，所以在Fc融合蛋白质中使用来自IgG4的区域可以通过融合蛋白质与存在于胰β细胞上的GLP-1受体的相互作用引起针对胰β细胞的免疫应答。因此，作为融合蛋白质一部分的IgG4Fc区域含有消除效应子功能的取代。融合蛋白质的IgG4Fc部分可以含有一个或多个下列取代：在残基233处以脯氨酸取代谷氨酸，在残基234处以丙氨酸或缬氨酸取代苯丙氨酸，以及在残基235处以丙氨酸或谷氨酸取代亮氨酸(EU编号方式，Kabat，E.A.等人，(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Dept.of Health and Human Services，Bethesda，MD，NIH出版91-3242)。这些残基对应于SEQ ID NO：7中的第16、17和18位。另外，在对应于SEQ IDNO：7第80位的第297个残基(EU编号)上以Ala取代Asn而去除IgG4Fc区域中N-连接的糖基化位点是保证消除融合蛋白质残留效应子活性的另一条途径。
另外，融合蛋白质的IgG4Fc部分含有稳定重链二聚体结构和防止半IgG4 Fc链形成的取代。融合蛋白质优选以通过二硫键和多种非共价相互作用连接的二聚体存在。野生型IgG4含有在残基224处(EU编号)开始的Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys(SEQ ID NO：16)基序。单个GLP-1类似物-Fc链中的该基序与另一条GLP-1类似物-Fc链中的对应基序形成二硫键。然而，该基序中丝氨酸的存在引起单链融合蛋白质的形成。本发明包含Fc融合蛋白质，其中IgG4序列经过进一步修饰，从而以脯氨酸(SEQ ID NO：7中的第11个氨基酸残基)取代第228位(EU编号)的丝氨酸。
本文讨论的异源融合蛋白质的IgG4衍生的Fc部分中可以缺失存在于天然分子中的C端赖氨酸残基(SEQ ID NO：7第230位；将缺失的赖氨酸称为des-K)。在某些细胞类型(例如NS0细胞)中表达的，其中赖氨酸由C端密码子编码的融合蛋白质是不均一的，因为一部分分子将赖氨酸作为C端氨基酸，而一部分缺失赖氨酸。该缺失归因于某些类型的哺乳动物细胞表达过程中蛋白酶的作用。因此，为了避免这种异质性，Fc融合表达构建体优选缺乏C端赖氨酸密码子。
本文讨论的GLP-1类似物部分的C端氨基酸优选通过富含甘氨酸的接头与IgG4Fc类似物部分的N端融合。可以通过加入小的肽接头防止潜在的不必要的结构域相互作用来优化融合蛋白质的体内功能和稳定性。另外，富含甘氨酸的接头提供了一定的结构柔性，使GLP-1类似物部分可以与靶细胞(例如胰β细胞)上的GLP-1受体有效地相互作用。然而，这些接头可以显著增加融合蛋白质体内免疫原性的危险。因此，优选不多于必要的长度，以防止不期望的结构域相互作用和/或优化生物学活性和/或稳定性。优选的富含甘氨酸的接头包括序列：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO：8)。尽管在融合蛋白质中可以使用该接头的更多拷贝，优选使用该接头的单拷贝以最小化与长期和反复施用有关的免疫原性的危险。
优选的GLP-1-Fc融合蛋白质包括下列蛋白质：Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)、Gly8-Glu22-Gly30-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，N297A)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A、N297A)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4(S228P)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4(S228P、F234A、L235A)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4(S228P、N297A)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4(S228P、F234A、L235A、N297A)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P、F234A、L235A)、Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P、N297A)和Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P、F234A、L235A、N297A)、以及上述所有蛋白质的Val8和des-K形式。
本文使用的指特定融合蛋白质的命名法定义如下：融合蛋白质GLP-1部分的特定取代以被取代的特定氨基酸跟随残基编号来表示。GLP-1(7-37)表示成熟融合蛋白质的GLP-1部分以第7位的His开始，以第37位的Gly结束。L  指具有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：8)的接头。L前紧邻的数字指将GLP-1部分与Fc部分分开的接头的数目。指定为1.5L的接头指序列Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：17)。IgG4指如SEQ ID NO：7所指定的人IgG4Fc序列的类似物。异源融合蛋白质IgG4Fc部分的取代显示于圆括号中。野生型氨基酸以其常用缩写表示，其后跟随使用EU编号***的在整个IgG4序列中的位置号，随后为该位置以常用缩写表示的被取代的氨基酸。
本发明的融合蛋白质具有生物学活性。生物学活性指该融合蛋白质体内结合并激活GLP-1受体并引起反应的能力。反应包括但是不限于胰岛素的分泌、胰高血糖素的抑制、抑制食欲、体重减轻、诱导过饱、抑制凋亡、诱导胰β细胞增殖及胰β细胞分化。对有代表性的一些GLP-1融合蛋白质测试体外和体内活性。已说明基于融合蛋白质与人类GLP-1受体相互作用并将其活化的能力的体外活性(参见PCT/US 04/15595(WO2005/000892))。使用过表达人类GLP-1受体的HEK293细胞。在这些细胞中，GLP-1受体的活化引起腺苷酸环化酶的活化，该酶的活化又诱导由环AMP应答元件(CRE)驱动的报告基因的表达。
调节GLP-1-Fc融合制剂的pH，以提供GLP-1-Fc融合体的可接受稳定性、维持其溶解度和促胰岛活性，并为可肠胃外施用。GLP-1-Fc融合制剂的pH优选调节在约pH6至约pH8.5之间，优选在约pH6至约pH7.5之间，在约pH6至约pH7之间，在约pH6.5至约pH7.5之间，或在约pH6至约pH6.5之间，甚至更优选在约pH6或约pH6.5之间。
包含本发明GLP-1-Fc融合体的制剂可任选包含可药用缓冲液。但是，该缓冲液的选择和浓度应当为使该制剂可调节至上述范围的选择和浓度，以提供可接受的稳定性和促胰岛活性。可药用缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液如磷酸氢二钠、TRIS、乙酸盐如乙酸钠、柠檬酸盐如柠檬酸盐钠、酒石酸钠(sodium tartarate)、诸如组氨酸、赖氨酸或精氨酸的碱性氨基酸，或诸如甘氨酸及甘氨酰甘氨酸的中性氨基酸。其他可药用缓冲液是本领域已知的。该缓冲液优选选自柠檬酸盐、磷酸盐和TRIS。本领域的技术人员将认识到缓冲液的选择是基于上述pH范围和缓冲液的pKa。缓冲液的浓度优选在约1mM至30mM之间。该浓度更优选在约4mM至14mM之间，或在约5mM至20mM之间。该浓度甚至更优选在约10mM至20mM之间。该浓度甚至更优选是约10mM或约20mM。
本发明的制剂可任选包含防腐剂。但是，防腐剂的选择和浓度应当为使该制剂可调节至上述范围的选择和浓度，以提供可接受的稳定性和促胰岛活性。防腐剂是指加入药用制剂，作为抗微生物剂的化合物。肠胃外制剂必须遵守防腐剂效力的准则，成为可商业获得的多用产品。本领域已知的防腐剂中在肠胃外制剂中有效并可接受的是酚类防腐剂、对羟基苯甲酸烷基酯、苯甲醇、氯代丁醇、间苯二酚和其他类似的防腐剂，以及它们的多种混合物。酚类衍生物的实例包括甲苯酚类和苯酚，或者甲苯酚类和苯酚的混合物。甲苯酚类的实例包括间甲苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、氯代甲苯酚或其混合物。对羟基苯甲酸烷基酯指C1至C4烷基对羟基苯甲酸酯或其混合物。对羟基苯甲酸烷基酯的实例包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯。防腐剂的浓度是本领域的技术人员已知的。该浓度必须足以维持抑止微生物生长的防腐剂效力。
优选的防腐剂是间甲苯酚或苯酚。通常，间甲苯酚的浓度在约2.0至约8.0mg/mL之间、约2.5mg/mL至约4.5mg/mL之间和约2.0mg/mL至约4.0mg/mL之间。制剂中防腐剂的最优选浓度为约2.7mg/mL。在另一实施方案中，苯酚的浓度在约2.0mg/mL至约10.0mg/mL之间以及约4.0mg/mL至约8.0mg/mL之间。该制剂中防腐剂的最优选浓度为约5.0mg/mL。
本发明的制剂可任选包含等渗剂。但是，等渗剂的选择和浓度应当为使该制剂可调节至上述范围的选择和浓度，以提供可接受的稳定性和促胰岛活性。等渗剂是生理耐受性化合物，且赋予制剂合适的张力以阻止穿过细胞膜的净水流。这类化合物的实例包括甘油、诸如NaCl的盐以及诸如葡萄糖、甘露糖醇和蔗糖的糖类。这些化合物一般以已知的浓度用于这类目的。可加入一种或多种等渗剂来调节离子强度或张力。
优选的等渗剂是NaCl。NaCl的浓度优选在约10mg/mL至500mg/mL之间、更优选在约50mg/mL至200mg/mL之间，最优选为约150mM。在另一实施方案中，优选的等渗剂是甘露糖醇。甘露糖醇的浓度优选在约1％重量(w)/体积(v))至10％(w/v)之间，更优选在约2％(w/v)至8％(w/v)之间。在另一实施方案中，优选的等渗剂是甘油。甘油的浓度优选在约12mg/mL至25mg/mL之间，优选在约12mg/mL至20mg/mL之间，更优选为约17mg/mL。
本发明的制剂可任选包含增溶剂(solubility enhancer)。但是，增溶剂的选择和浓度应当为使该制剂可调节至上述范围的选择和浓度，以提供可接受的稳定性和促胰岛活性。增溶剂提供稳定性，以使GLP-1-Fc融合体在贮存的条件下，长期保持可溶。增溶剂优选是烟酰胺。通常，烟酰胺的浓度在0.01至2摩尔之间。烟酰胺浓度的其他优选范围是：0.05摩尔至1.5摩尔之间、0.1摩尔至1.0摩尔之间、0.1摩尔至0.5摩尔之间、0.5摩尔至1.0摩尔之间以及0.15摩尔至0.25摩尔之间。
可任选在制剂中加入其他添加剂，例如可药用加溶剂，如Tween(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween
Figure B2005800355972D00112
(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、Tween
Figure B2005800355972D00113
(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、PluronicF(聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)。加溶剂优选是Tween
Figure B2005800355972D00115
或Tween
Figure B2005800355972D00116
通常。Tween
Figure B2005800355972D00117
或Tween
Figure B2005800355972D00118
的浓度在0.001％至0.05％之间。Tween或Tween
Figure B2005800355972D001110
浓度的其他优选范围在0.005％至0.05％之间、0.0075％至0.05％之间以及0.01％至0.05％之间。
可以通过具有普通技能的内科医生已知有效的任意途径施用该制剂。外周肠胃外一种此类方法。医学文献中通常将肠胃外施用理解为通过消毒注射器或一些其他机械装置例如注射泵向机体注射剂型。外周肠胃外可以包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用途径。
该制剂也可以改变，以经非肠胃外途径(口、直肠、经鼻或下呼吸道途径)施用。这些非肠胃外途径中，优选下呼吸道途径和口服途径。
包含GLP-1-Fc融合体的制剂可以用于治疗多种疾病和病症。GLP-1-Fc融合体首先通过作用于被称为“GLP-1受体”的受体而发挥其生物学作用。因此可以用GLP-1-Fc融合体治疗患有对GLP-1受体刺激或对GLP-1化合物施用直接(favorably)应答的疾病和/病症的受试者。将这些受试者称为“需要GLP-1化合物治疗”或“需要GLP-1受体刺激”。这些受试者包括患有非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、中风(参见WO00/16797)、心肌梗死(参见WO 98/08531)、肥胖(参见WO 98/19698)、手术后分解代谢改变(参见美国专利号6,006,753)、功能性消化不良和肠易激综合征(参见WO 99/64060)的受试者。这些受试者也包括需要以GLP-1化合物预防性治疗的受试者，例如具有发展为非胰岛素依赖性糖尿病危险的受试者(参见WO 00/07617)。患有糖耐量异常或空腹葡萄糖异常的受试者、体重超出受试者身高和体形的正常体重约25％的受试者、部分胰切除的受试者、父母一方或双方患有非胰岛素依赖性糖尿病的受试者、妊娠期糖尿病的受试者，以及患有急性或慢性胰腺炎受试者具有发展为非胰岛素依赖性糖尿病的危险。
本文描述的制剂中GLP-1-Fc融合体的有效量是施用于需要GLP-1受体刺激的受试者时，引起所希望的治疗和/或预防效果而不导致不可接受的副作用的量。“所希望的治疗性效果”包括下列一项或多项：1)疾病或病症相关症状的改善；2)疾病或病症相关症状发作的延迟；3)与没有治疗相比增长的寿命；以及4)与没有治疗相比更好的生活质量。例如，用于糖尿病治疗的GLP-1-Fc融合体的“有效量”是与没有治疗相比引起对血糖浓度的更佳控制，从而导致糖尿病并发症(例如视网膜病、神经病或肾脏疾病)发作延迟的量。用于预防糖尿病的GLP-1-Fc融合体的“有效量”是与没有治疗相比延缓血糖水平升高发作的量，所述发作需要以抗低血糖药物例如磺酰脲类、噻唑烷二酮、胰岛素和/或双胍类治疗。
有效将患者血糖正常化的融合蛋白质的剂量取决于许多因素，其中包括但不限于受试者的性别、体重和年龄、无法调节血糖的严重性、施用途径和生物利用率、融合蛋白质药物代谢动力学图谱、潜能和剂型。剂量可以为0.01至1mg/kg体重之间，优选0.05至0.5mg/kg体重之间。
优选每两周一次或每周一次施用融合蛋白质。取决于所治疗的疾病，可能有必要更频繁地施用该融合蛋白质，例如每周两至三次。
现在仅以非限制性实例参考下列实施例对本发明进行描述。
实施例
GLP-1受体体外激活试验
使用CRE-BLAM***将表达人类GLP-1受体的HEK-293细胞以20,000至40,000细胞/孔/100μl含10％FBS的DMEM培养基接种到多聚-d-赖氨酸包被的96孔黑色透明底平板中。接种后一天，轻轻倾去培养基，加入80μl无血清的DMEM培养基。接种后第三天，将20μl含0.5％BSA、含有不同浓度的多种GLP-1-Fc融合蛋白质的无血清DMEM培养基加入各孔，以制备剂量反应曲线。通常，使用含有3纳摩尔至30纳摩尔GLP-1Fc融合蛋白质的14种稀释液来产生剂量反应曲线，从该曲线可以确定EC50值。和融合蛋白质孵育5小时后，加入20μl β-内酰胺酶底物(CCF2/AM，PanVera LLC)，并持续孵育1小时，此时在细胞荧光计上测定荧光。在Zlokarnik等人，(1998)，Science，278：84-88中进一步描述了该测定。
GLP-1受体体外激活试验
使用CRE-荧光素酶***将稳定表达人类GLP-1受体的HEK-293细胞以30,000个细胞/孔/80μl低血清的DMEM F12培养基接种于96孔板中。接种后一天，将溶于0.5％BSA的待测蛋白质的20μl等分试样与细胞混合并孵育5小时。对于每种待测蛋白质，一般以5×浓度制备含有3pM至3nM的12个稀释物后加入细胞，从而产生剂量反应曲线，从中确定EC50值。孵育后，将100μl荧光素酶直接加入各板，轻轻混合2分钟。将板置入Tri-lux发光计并计算荧光素酶表达引起的光输出。
Tween、NaCl和pH对Gly 8 -Glu 22 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、 F234A、L235A)稳定性的影响
测定Tween-20(±0.01％)、NaCl(0、150和500mM)和pH(6.5、7.5和8.5)对0.5mg/mL的Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)化学稳定性的影响。分别混合2x缓冲贮存液及含有溶于20mM磷酸盐、20mM Tris，pH 7.5中的1mg/mL Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)溶液来制备这些条件的完全基质(full matrix)。终溶液通过0.2微米的Millex-GV滤器最后滤进HPLC小管并在37℃孵育。取出周期性时间点，并通过大小排阻层析、反相层析和凝胶电泳分析。
鉴定样品A-R(均含有0.5mg/mL Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)、20mM磷酸盐和20mM Tris)的制剂组分
  制剂编号   Tween-20(％)   NaCl(mM)   pH
  A   0   0   6.5
  B   0   0   7.5
  C   0   0   8.5
  D   0   150   6.5
  E   0   150   7.5
  F   0   150   8.5
  G   0   500   6.5
  H   0   500   7.5
  I   0   500   8.5
  J   0.01   0   6.5
  K   0.01   0   7.5
  L   0.01   0   8.5
  M   0.01   150   6.5
  N   0.01   150   7.5
  O   0.01   150   8.5
  P   0.01   500   6.5
  Q   0.01   500   7.5
  R   0.01   500   8.5
通过大小排阻HPLC监视的多种GLP-Fc溶液条件
在37℃的主峰变化百分比
  制剂编号--＞   A   B   C   D   E   F
  时间(周，在37℃)
  0   98.96   98.96   98.96   98.96   98.96   98.96
  0.57   98.87   98.73   98.95   98.89   98.89   98.58
  1   98.36   98.63   98.69   98.39   98.4   98.48
  2   97.9   98.39   98.53   98.09   98.2   98.25
  3   97.77   98.39   98.74   98.01   97.94   98.32
  制剂编号--＞   G   H   I   J   K   L
  时间(周，在37℃)
  0   98.96   98.96   98.96   98.96   98.96   98.96
  0.57   98.85   98.69   98.37   98.67   98.42   98.63
  1   98.53   98.5   98.13   98.2   98.33
  2   98.27   98.02   98.28   97.54   97.81   98.13
  3   98.19   97.96   98.22   97.42   97.74   98.15
  制剂编号--＞   M   N   O   P   Q   R
  时间(周，在37℃)
  0   98.96   98.96   98.96   98.96   98.96   98.96
  0.57   98.25   98.24   97.91   98.15   98.15   97.79
  1   97.78   97.85   98   97.88   97.8   97.6
  2   97.28   97.48   97.66   97.73   97.81   97.47
  3   96.94   97.18   97.52   97.49   97.53   97.22
通过反相HPLC监视的多种GLP-Fc溶液条件在37℃的主峰变化百分比
  制剂编号--＞   A   B   C   D   E   F
  时间(周，在37℃)
  0   78.2   78.2   78.2   78.2   78.2   78.2
  0.57   77.3   77.1   75.8   77.9   75.3   76.4
  1   70.2   69.4   69.2   73.4   73.6   69.1
  2   67.2   66.1   62   73.3   67.5   63.6
  3   65.2   62.6   57.3   66   61.2   58.8
  制剂编号--＞   G   H   I   J   K   L
  时间(周，在37℃)
  0   78.2   78.2   78.2   78.2   78.2   78.2
  0.57   77.4   76.9   75.8   74.9   75.3   75.4
  1   72.6   73.3   72.5   69.5   69   70.7
  2   73.2   66.6   65.8   65.4   63.9   61.96
  3   64.8   62.4   58.9   63.6   60.4   57.7
  制剂编号--＞   M   N   O   P   Q   R
  时间(周，在37℃)
  0   78.2   78.2   78.2   78.2   78.2   78.2
  0.57   76.2   75.9   73.9   75   72.9   75.3
  1   71.4   72.3   69.8   75.7   71.2   71
  2   67.5   63.5   59.4   65.2   68.5   61.4
通过大小排阻或反相HPLC线性降低率
(每周在37℃孵育的主峰变化百分比)
Figure B2005800355972D00171
大小排阻HPLC方法：
将样品注射到在1xPBS、pH 7.4和10％(v/v)乙腈流动缓冲液(A-泵缓冲液)中预平衡的Tosohas TSK3000-SW-XL(5微米，7.8x300毫米)柱上。无梯度缓冲液以0.5mL/分钟流动，在214nm处检测蛋白质。
反相HPLC方法：
将样品注射到在0.1％(v/v)TFA流动缓冲液(A-泵缓冲液)中预平衡的Zorbax 300SB-C8(4.6x50毫米)柱上。B-泵缓冲液由乙腈中的0.085％(v/v)TFA组成。运行以下梯度并在214nm处检测物质。
  时间   ％B-泵缓冲液
  0   30
  5   30
  35   45
  40   90
  45   90
  50   25
  65   25
凝胶电泳方法：
用4x NuPage LDS样品缓冲液稀释时间点(1x终浓度)并95℃加热5分钟。冷却的样品上样到4-12％bis-tris NuPage凝胶上。该凝胶在MOPS缓冲液中以恒定电压(200伏)电泳50-60分钟，用SimplyBlue SafeStain染色。
Gly 8 -Glu 22 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)的稳定性和 Tween-20的影响：
通过在加压条件(accelerated stress condition)(37℃下，在PBS中用疏水搅拌棒搅拌)下监视350nm处浊度的增加，在pH 7.5的1x PBS中评定Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)的稳定性。
Tween-20降低聚集的作用
  溶液加入物   350nm处浊度≥0.05OD的时间
  无   ＜6小时
  0.001％Tween-20   16小时
  0.005％Tween-20   27小时
  0.01％Tween-20   ＞65小时
  0.02％Tween-20   ＞65小时
  溶液加入物   350nm处浊度≥0.05OD的时间
  0.05％Tween-20   ＞65小时
Gly 8 -Glu 22 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)的溶解度作为溶 液pH的函数：
通过用不同pH值的多种缓冲液稀释贮存液，使溶液平衡，离心除去任何沉淀物质，然后分析保留有溶解的蛋白质浓缩物的上清液来确定Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)的溶解度作为溶液pH的函数。冰冻在PBS中的原液蛋白质(Stock protein)在约pH 8的水中透析。透析后，该原液蛋白质通过0.22微米的Millex-GV滤器过滤，并使用洗净的Ultrafree离心装置浓缩至大约12mg/mL(4ml，5000道尔顿MWCO，7000xG)。该浓缩的溶液用2x贮存缓冲液1∶1稀释(终体积为50μL，在0.5mL的微量离心管中)，并使其在室温平衡15-30分钟。离心(14,000xG，5分钟)该溶液以沉淀任何不溶物质。移出10μL上清液，和pH 8的40μL水合并。每个样品进行两个平行测定。通过反相HPLC，对照标准曲线确定可溶GLP-Fc的浓度。
溶液条件对溶解度的影响
Figure B2005800355972D00191
Figure B2005800355972D00201
通过反相HPLC监视溶液pH对稳定性的影响：
在调节至大约pH 8的水中透析Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P、F234A、L235A)。透析后，过滤(0.22微米的Millex-GV滤器)该原液蛋白质，并使用洗净的Ultrafree离心装置浓缩至大于2mg/mL。通过UV测定最终蛋白质浓度，并通过将2x制剂贮存缓冲液稀释至1x以保持1mg/mL的最终蛋白质浓度来产生不同制剂。检查溶液的pH，如果需要就调节。这些溶液最终滤进(0.2微米的Millex-GV滤器)灭菌的1.8mL带帽HPLC小管中。这些小管置于37℃，吸出时间点并通过反相、大小排阻和凝胶电泳分析。给出通过大小排阻层析和反相HPLC监视的主峰变化百分比。通过拟合37℃下的孵育时间与大小排阻和反相HPLC数据的主峰纯度的图获得的线性降低率用表格表示。
鉴定制剂参数
  制剂编号   PH   缓冲液(10mM)   加入物
  3C   3.0   柠檬酸盐   无
  4C   4.0   柠檬酸盐   无
  5C   5.0   柠檬酸盐   无
  6C   6.0   柠檬酸盐   无
  6CN   6.0   柠檬酸盐   150mM NaCl
  6CC   6.0   柠檬酸盐   3mg/mL间甲苯酚
  6P   6.0   磷酸盐   无
  7P-R1   77..0   磷酸盐   无，1号平行
  7P-R2   7.0   磷酸盐   无，2号平行
  7P-R3   7.0   磷酸盐   无，3号平行
  7PN   7.0   磷酸盐   150mM NaCl
  7PC   7.0   磷酸盐   3mg/mL间甲苯酚
  8P   8.0   磷酸盐   无
  8T   8.0   Tris   无
在37℃贮存的主峰变化百分比。通过大小排阻层析分析数据。
  时间(周)   3C   4C   5C   6C   6CN   6CC   6P
  0.43   43.81   0   94.27   95.74   94.37   94.45   94.7
  1   40.13   0   93.14   94.73   92.98   92.79   93.85
  2.43   36.26   0   91.72   94.22   92.29   90.77   93.1
  3.43   35.85   0   91.27   93.84   91.51   89.44   92.51
  时间(周)   7P-R1   7P-R2   7P-R3   7PN   7PC   8P   8T
  时间(周)   3C   4C   5C   6C   6CN   6CC   6P
  0.43   95.98   95.95   96.02   93.93   95.86   95.89   97.08
  1   95.22   95.03   95.22   92.95   95.18   95.26   96.92
  2.43   94.71   94.5   94.84   91.76   94.76   94.94   97.05
  3.43   94.05   93.65   94.09   91.24   94.02   94.67   97.02
在37℃贮存的主峰变化百分比。通过反相层析分析数据。
  时间(周)   3C   4C   5C   6C   6CN   6CC   6P
  0.43   34.04   39.35   51.93   57.96   57.29   58.42   55.76
  1   26.64   39.48   49.85   58.49   53.32   55.87
  2.43   33.09   40.36   44.61   52.05   51.24   51.34   49.44
  3.43   28.17   28.51   36.78   48.4   50.43   50.42   49.84
  时间(周)   7P-R1   7P-R2   7P-R3   7PN   7PC   8P   8T
  0.43   55.74   55.36   55.01   56.09   58.67   49.14   54.44
  1   53.72   54   53.22   52.4   55.96   46.84   54.48
  2.43   45.7   47   45.97   47.07   51.49   38.7   51.22
  3.43   44.16   42   43.22   42.62   49.74   34.25   47.89
通过大小排阻或反相HPLC监视的37℃下的降低率
Figure B2005800355972D00221
Figure B2005800355972D00231
序列表
<110>伊莱利利公司
<120>GLP-1类似物融合蛋白质制剂
<130>X-17003
<150>60/641690
<151>2004-12-22
<160>17
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa选自Gly和Val
<400>1
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly
            20                  25                  30
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa选自Gly和Val
<400>2
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Gly Gly
            20                  25                  30
<210>3
<211>31
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa选自Gly和Val
<400>3
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro
            20                  25                  30
<210>4
<211>31
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa选自Gly和Val
<400>4
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro
            20                  25                  30
<210>5
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa选自Gly和Val
<400>5
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly
            20                  25                  30
<210>6
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa选自Gly和Val
<400>6
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Gly
            20                  25                  30
<210>7
<211>230
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是Pro或Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa是Phe、Val或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是Leu、Glu或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(80)..(80)
<223>第80位的Xaa是Asn或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(230)..(230)
<223>第230位的Xaa是Lys或缺失
<400>7
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            20                  25                  30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        35                  40                  45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    50                  55                  60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa
65                  70                  75                  80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                 85                  90                  95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        115                 120                 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
    130                 135                 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                 165                 170                 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
            180                 185                 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
        195                 200                 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
225                 230
<210>8
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>9
<211>31
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>9
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>10
Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly
1               5
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>11
Trp Leu Lys Asn Gly Gly Gly
1               5
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>12
Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro
1               5
<210>13
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>13
Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro
1               5
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>14
Trp Leu Val Lys Gly Gly
1               5
<210>15
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>15
Trp Leu Lys Asn Gly Gly
1               5
<210>16
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>16
Pro Pro Cys Pro Ser Cys
1               5
<210>17
<211>22
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建物
<400>17
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            20

Claims (12)

1.稳定溶液制剂，其包含治疗有效量的GLP-1-Fc融合体，pH在pH6至pH8.5之间，其中GLP-1-Fc融合体由选自如下序列的GLP-1类似物：
a)SEQ ID NO：1
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly其中Xaa8选自Gly和Val；
b)SEQ ID NO：2
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly
其中Xaa8选自Gly和Val；
c)SEQ ID NO：3
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro
其中Xaa8选自Gly和Val；
d)SEQ ID NO：4
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro
其中Xaa8选自Gly和Val；
e)SEQ ID NO：5
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly
其中Xaa8选自Gly和Val；
f)SEQ ID NO：6
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly
其中Xaa8选自Gly和Val；
与所述GLP-1类似物融合的SEQ ID NO：7序列编码的免疫球蛋白Fc部分
Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa80-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa230，SEQ ID NO：7
其中：
第16位的Xaa为Pro或Glu；
第17位的Xaa为Phe、Val或Ala；
第18位的Xaa为Leu、Glu或Ala；
第80位的Xaa为Asn或Ala；以及
第230位的Xaa为Lys或缺失；
任选地如SEQ ID NO：8：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser所示的肽接头组成，
其中所述肽接头的N端甘氨酸直接与所述GLP-1类似物的C端氨基酸残基融合，所述肽接头的C端丝氨酸直接与所述Fc部分的N端丙氨酸融合。
2.权利要求1的稳定溶液制剂，其中所述pH在pH6至pH7.5之间。
3.权利要求2的稳定溶液制剂，其中所述pH在pH6至pH7之间。
4.权利要求3的稳定溶液制剂，其中所述pH在pH6至pH6.5之间。
5.权利要求4的稳定溶液制剂，其中所述pH为pH6。
6.权利要求4的稳定溶液制剂，其中所述pH为pH6.5。
7.权利要求1的稳定溶液制剂，其中所述制剂进一步包含Tween
8.权利要求1的稳定溶液制剂，其中所述制剂进一步包含Tween
Figure F2005800355972C00032
9.权利要求1的稳定溶液制剂，其中所述制剂进一步包含NaCl。
10.权利要求1的稳定溶液制剂，其中所述制剂进一步包含间甲苯酚。
11.权利要求1的稳定溶液制剂，其中所述制剂进一步包含Tween
Figure F2005800355972C00033
NaCl和间甲苯酚。
12.权利要求1的稳定溶液制剂，其中所述制剂进一步包含Tween
Figure F2005800355972C00034
NaCl和间甲苯酚。
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