CN101037693A

CN101037693A - 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法

Info

Publication number: CN101037693A
Application number: CN 200610011493
Authority: CN
Inventors: 胡赞民; 杨大海; 胡军; 苏晓华; 陈宇红; 尹维波
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS; Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS; Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2006-03-15
Filing date: 2006-03-15
Publication date: 2007-09-19
Anticipated expiration: 2026-03-15
Also published as: CN100471953C

Abstract

本发明提供了一种新的CkNHX基因和其剪切修饰基因CkNHXn。该基因来源于灌木植物柠条(Caraganakorshinskii Kom)。该基因编码Na⁺/H⁺逆转运蛋白。利用所克隆得到的cDNA，构建了酵母表达载体和植物表达载体。利用酵母突变株通过互补实验验证了该基因的耐盐功能。此外，还获得了转基因植物。针对转化植株的抗盐性能的测试表明，该基因的转入可以使转基因植物具有抗盐性。

Description

新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn，以及培育耐逆植物的方法

技术领域

本发明涉及一种Na⁺/H⁺逆转运蛋白CkNHX以及修饰蛋白CkNHXn。具体地，本发明涉及一种来源于沙漠灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)的NHX类Na⁺/H⁺逆转运蛋白，命名为CkNHX，以及其修饰蛋白CKNHXn。本发明还涉及编码这类Na⁺/H⁺逆转运蛋白的基因，含有这类基因的载体，和利用这类基因培育耐盐植物的方法。

背景技术

由于生态环境的变化，加上干旱、少雨和土地的盐碱化，可导致可耕种土地的大面积盐渍化，严重影响人类的生存(Wang W X，Vinocur B，AltmanA(2003).Plant responses to drought，salinity and extremetemperatures：towards genetic engineering for stress tolerance.Planta，218：1-14)。如何改良盐碱地，维护生态环境，抑制水土流失，恢复植被，培育耐逆性植物是作物、林牧草育种的主要目标之一。尤其是传统的林木耐盐、抗旱抗逆品种(系)遗传改良途径主要采用杂交育种、选择育种等方法，但由于林木繁殖周期长，遗传杂合性高，许多性状的遗传机理不明，使得利用常规育种手段很难定向培育出具有耐盐性状的林木新品种。将基因工程技术与常规育种方法相结合，可望在培育出转基因的抗盐新树种，为我国西部长远、高效和持续育种提供保障。

Na⁺/H⁺逆转运蛋白基因编码的是定位于液泡膜上的一类离子膜转运蛋白，可以通过将钠离子在胞内区域化，维持胞内离子动态平衡，极大地消除这类离子胁迫对植物正常的生理代谢和细胞组织结构的影响和破坏，提高植物的耐逆性(Apse M P，Aharon G S，Snedden W A，Blumwald E(1999).Salttolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na⁺/H⁺antiporterin Arabidopsis.Science，285：1256-1258)。该类基因定位于植物液泡膜上，可增强植物的耐盐性(Venema K，Quintero F J，Pardo J M，and DonaireJ P(2002)The Aaradbidopsis Na+/H+exchanger AtNHX1 catalyzes lowaffinity Na+and K+transport in reconstituted liposomes.JBC 277(4)：2413-2418)。目前尚未检索到来自灌木植物柠条的编码NHX的基因CkNHX。

发明人从沙漠灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)分离、克隆到编码NHX类Na⁺/H⁺逆转运蛋白的基因，命名为CkNHX，所编码的蛋白命名为CkNHX。此外，对该蛋白进行了剪切修饰，构建了较CkNHX蛋白耐盐活性高的CkNHXn蛋白。此外，构建了分别适用于单、双子叶植物的表达载体，转化双子叶模式植物烟草和木本模式植物毛白杨。转基因植株具有明显的耐盐性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有较强耐盐性的CkNHX基因，该基因来源于柠条(Caragana korshinskii Kom)，其核苷酸序列与氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。应当指出的是，对本发明的NHX类Na⁺/H⁺逆转运蛋白进行一个或几个非保守区域氨基酸的替换、***或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而，本发明也包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％同源性，尤其具有至少95％的同源性，但同时具有柠条中CkNHX基因活性的功能类似物。

本发明的另一个目的是提供一种编码柠条CkNHX的基因，在SEQ ID NO：1中所示的基因为来源于柠条的NHX类基因，含有NHX类基因保守的Na_H_exchanger结构域序列，但不限于所列的序列。由于这类基因所编码的蛋白是定位于叶泡膜上的，是植物膜蛋白，目前在国际上较难获得这类纯化蛋白，但可以采用互补法来验证该基因所编码的蛋白功能。该基因的酵母功能互补实验表明该基因的转入的确可以提高酵母耐盐敏感菌株的耐盐性。

本发明的另一个目的是提供一种编码柠条CkNHXn的剪切基因，所述序列见SEQ ID NO：3，其编码的蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：4，其酵母互补实验呈现出较全长CkNHX蛋白强的耐盐活性。

本领域的普通技术人员可以理解，对本发明的基因进行一个或几个核苷酸的替换、***或缺失所得到的具有其相同功能的类似物同样也包含在本发明的范围内。

本发明的再一个目的是提供一种培育耐盐植株的方法，该方法包括用本发明的基因CkNHX或CkNHXn构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成植株。

本发明的又一个目的是提供一种包含本发明基因CkNHX或CkNHXn的表达载体。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如pBIN19，pBI121，pB221，含DRE、ARE元件的启动子以及用于单子叶植物微弹轰击的载体。载体还可包括3’非翻译区域。3’非翻译区域是指一种基因的部分，它含有一种包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA前体加工或基因表达的DNA片段。本发明的CkNHX基因的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。

本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)和Ubiqutin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

本发明的表达载体在需要时也可包括增强子，不论是翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码区域的阅读框同向，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的或合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域，或来自结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同样，可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如荧光酶)来识别的化合物的酶，或抗化学试剂(例如除萎剂)。另外，也可不用任何筛选标记。

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔、激光穿孔等导入植物细胞。

可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，例如：杨树、豆科灌木、禾本科牧草和作物(小麦、玉米、水稻)、苜蓿、大豆、油菜、棉花、花生等。

附图说明

图1.CkNHX基因cDNA全长序列，SEQ ID NO：1。

图2.CkNHX基因所编码的氨基酸序列，SEQ ID NO：2。

图3.CkNHX所编码膜蛋白的跨膜和磷酸化位点分布的拓扑图，其中圆圈所示的为磷酸化位点，斜体数字为磷酸化的氨基酸位点，其余为可能的跨膜处氨基酸位点；CYT表示为胞质界面；VAC表示叶泡内面。

图4.CkNHXn基因ORF核苷酸序列，SEQ ID NO：3。

图5.CkNHXn基因所编码的氨基酸序列，SEQ ID NO：4。

图6.CkNHX基因5’UTR核苷酸序列，SE9 ID NO：12。

图7.CkNHX基因3’UTR核苷酸序列，SEQ ID NO：13。

图8.CkNHX的酵母表达载体pYES2-NHX的构建图。

图9.CkNHXn的酵母表达载体pYES2-NHXn的构建图。

图10.转CkNHX和CkNHXn基因的酵母耐盐互补实验。

图11.CkNHX植物表达载体pCkNHX构建图。

图12.农杆菌转染CkNHX的烟草植株，转基因烟草筛选所用抗生素浓度，Kan 600mg/L，Cb 500mg/L。

图13.CkNHX转基因烟草的PCR鉴定。

图14.CkNHX转基因烟草的RT-PCR鉴定。

图15.烟草植株的耐盐性实验，(A)：野生烟草的耐盐试验；(B)：转CkNHX的烟草300mM的NaCl耐受试验。

具体实施方式

下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员应当理解，下述实施例不是用于限制的目的，本发明的实质性的保护范围由后附的权利要求所限定。

实施例中所用试剂如下：

高保真度Pyrobest Taq、Premix Ex Taq、AMV、RNA酶抑制剂、各种限制性内切酶、One Step RNA PCR试剂盒、pMD18-T Vector购自大连宝生(TaKaRa)公司；DNA纯化回收试剂盒购自鼎国生物技术公司；T4 DNA连接酶和RNase A购自MBI公司；ABA、DNase(RNase free)购自Sigmag公司。

实施例1、柠条CkNHX基因的克隆

取生长2-3个月的柠条幼苗(购自中科院新疆吐鲁番沙漠植物园柠条种子萌发而成)为材料，用100uM ABA(Sigma公司)过夜诱导。取叶片，洗净后，放入经DEPC处理、灭菌后的匀浆器中，加入TRIzol(Invitrogen)研磨、匀浆，室温放置5分钟，加入氯仿抽提两次，取上清，用异丙醇沉淀总RNA，空气干燥后，溶于适量DEPC水。以带polyT的引物进行逆转录获得cDNA。

polyT的引物序列如下：

Oligo dT-Primer：5’-CGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ IDNO：5)

RT反应条件如下：

DEPC水 85uL

RNase抑制剂(40U/uL) 5uL

Oligo dT-Primer 10uL

RNA 10uL

总共 110uL

于65℃温浴10分钟，立即于冰上淬冷，然后加入

MgCl₂ 40uL

10XRNA Buffer 20uL

dNTP mixture 20uL

AMV 10uL

总共 90uL

反应体积总共 200uL

反应条件为1.30℃，10ain；2.42℃，1h；3.99℃，5min；4.5℃，5min。

取适量上述逆转录产物以下9对引物(三条正向引物与三条反向引物组合)进行PCR扩增(所设计引物为巢式PCR扩增引物，所获得扩增片段互有重叠)。

正向引物：

L1 5’-GCAGGGTTTCAGGTGAAAAAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：6)

L2 5’-GAAAAATGGAAGTTTGTTAGTGATAGTCC-3’(SEQ ID NO：7)

L3 5’-CACCATGTCGGGGCACACTCAAC-3’(SEQ ID NO：8)

反向引物：

R1 5’-GTACAATGATGATGATGATGGGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：9)

R2 5’-AGATGGCTTATGGTACACGGCCTTCTCG-3’(SEQ ID NO：10)

R3 5’-CTTCTCAACGCCATTGATGACCATTG-3’(SEQ ID NO：11)

PCR条件

1. 95℃ 1min

2. 94℃ 30s

3. 60℃ 40s

4. 72℃ 2min 2 29个循环

5. 72℃ 10min

6. 4℃ 终止反应

将PCR产物(L1分别与R1、R2、R3组合扩增的片段分别约为1.5Kb；L2分别与R1、R2、R3组合扩增的片段分别约为0.8Kb；L3分别与R1、R2、R3组合扩增的片段分别约为0.5Kb)分别连接到pUCm-T载体(MBI公司)上用于测序，将上述9个测序序列采用本领域公知公用的DNAMAN软件进行序列拼接后，在万维网上NCBI数据库中与已知NHX类基因(AF515632)进行比对分析，确证上述PCR克隆到的是NHX类基因片段。

再以这段经拼接的序列为模板设计以下引物分别从上述逆转录反应片段中进行5’、3’-RACE扩增，获得基因5’和3’端序列(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)。具体方法操作参见BD Biosciences Clontech的BDSMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Cat.No.634914)。

5’-RACE引物

5’-CGCCCAGTTCCAGTGGCCCAATATCCA-3’(SEQ ID NO：14)

3’-RACE引物

5’-CTTGGAAGAGCAGCTTTTGTTTTCCCC-3’(SEQ ID NO：15)

在基因5’和3’序列的基础上，设计以下特异性引物采用高保真Pyrobest Taq进行PCR扩增获得基因ORF全长。

正向引物(含BamH I酶切位点，以下划线示出)

5’-GCC GGATCCCGTCTTTCTCCTCTGTCTC-3’(SEQ ID NO：16)

反向引物(含Sac I酶切位点，以下划线示出)

5’-CGCG GAGCTCAATGATGATGATGATGGGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：17)

PCR反应条件如下：

上述逆转录cDNA模板质粒 1μL

正反向引物各 1μL

dNTP 2μL

ddH₂O 13.8μL

Pyrobest Taq 0.2μL

10×buffer 2μL

Total： 20μL

PCR程序为：

a)95℃ 2min

b)94℃ 30s

c)55℃ 1min

d)72℃ 3min 2 29cycles

e)72℃ 10min

f)4℃ pause

所获得的CkNHX基因cds全长序列为2547bp(SEQ ID NO：1)，含有1618bp开放阅读框架，编码539个氨基酸组成的多肽(SEQ ID NO：2)，其5’端为652bp，3’端为262bp，并将其克隆入pMD18-T Vector中。

实施例2、CkNHXn基因的构建

参考文献报道(Yamaguchi T，Apse M P，Shi H Z，and Blumwald E(2003).Topological analysis of a plant vacuolar Na+/H+antiporter revealsa lumihal C terminus that regulates antiporter cation selectivity.PNAS.100(21)：12510-12515)，利用下述引物将第435位氨基酸后加上终止密码子形成C端截短的CkNHXn(即将第435位后肽段去处)(参见图3)。所用引物为：

正向引物为(含Sac I位点)

5’-CGCGCC GAGCTCATGGCTTTTGAAATTGTCT-3’(SEQ ID NO：18)

反向引物为(含Xba I位点)

5’-CCGCGC TCTAGACTAAGTCATCAAACCAAACACC-3’(SEQ ID NO：19)

采用高保真度Pyrobest Taq，以上述逆转录产物为模板进行PCR扩增，方法同前。获得了约为1.3kb大小片段的CkNHXn基因(SEQ ID NO：3)，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。将该基因连入pMD18-T Vector，测序验证后采用Sac I和Xba I进行双酶切，连入用同样酶双切的pYES载体(Invortrogene)，构建成pYES-NHXn酵母表达载体(参见图9)。

实施例3、用于酵母功能互补实验

1.酵母表达载体的构建

按常规分子生物学手段(F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，精编分子生物学实验指南。科学出版社，2001)，以PCR技术在CkNHX编码区域以及CkNHXn编码区域两端分别引入Sac I和Xba I位点，采用Sac I和Xba I双酶切，然后连入用同样酶双切的pYES2.0(Invortrogene)，构建成pYES-NHX和pYES-NHXn两个酵母表达载体。其构建图谱如图8、9所示，经酶切、PCR鉴定和测序确保***片段无误后，转入盐敏感酵母突变体ANT3(详见参考文献：Quintero FJ，Blattb MR，and Pardo JM(2000).Functional conservationbetween yeast and plant endosomal Na⁺/H⁺antiporters.FEBS Lett 471，224-228)。具体操作参照Invortrogene pYES2.0protocol，Cat No.V825-20。

2.酵母耐盐功能互补实验

1)将空载pYES2.0、pYES-NHX、pYES-NHXn分别转入酵母突变体ANT3(Jose M.Pardo博士馈赠，参见文献Quintero FJ，Blattb MR，andPardo JM(2000).Functional conservation between yeast and plantendosomal Na⁺/H⁺antiporters.FEBS Lett 471，224-228)，并于基本SC培养基(详细配方参照Invortrogene pYES2.0protocol，CatNo.V825-20)中30℃培养过夜，稀释到0.3OD，在含有2％半乳糖和1％棉子糖诱导SC培养基(详细配方参照Invortrogene pYES2.0protocol，Cat No.V825-20)中，诱导培养4-6hr。

2)将诱导后的菌液进行10倍系列梯度稀释(1×、10×、100×、1000×及5000×)，点4μl于70mM NaCl的选择性SC平板培养基(详细配方参照Invortrogene pYES2.0protocol，Cat No.V825-20)上，30℃培养4-5天，观察照相。结果见图10。

由于所获得盐敏感酵母突变体ANT3对盐敏感(即不耐盐)，而一旦在该酵母菌株中转入耐盐基因，可以增强该菌株的耐盐能力。在图10中，第一行为含有空载体pYES2.0的酵母突变体ANT3在70mM NaCl培养基上的生长情况。可见在菌液稀释10倍、100倍时，其仍然可以生长；但稀释1000倍和5000倍时，则不能生长。而转入有pYES-NHX和pYES-NHXn的菌株在1000倍和5000倍稀释时，仍然可以生长，且第三行的pYES-NHXn菌株在稀释1000倍时与pYES-NHX相比生长状况较好。这个酵母互补实验表明CkNHX和CkNHXn两个基因序列的转入可增强该盐敏感酵母突变体ANT3对盐的耐受性。这两个基因片段所表达的蛋白均具有耐盐能力，且表达部分缺失序列CkNHXn具有比CkNHX更强的耐盐性。

实施例4、用于转化的植物表达载体的构建

CkNHX表达载体的构建按常规分子生物学手段进行(F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，精编分子生物学实验指南。科学出版社，2001)。以实施例1中扩增得到的CkNHX基因为模板，PCR扩增该基因的ORF(采用pyrobestTaq(TaKaRa公司))。

所用引物如下：

正向引物(含BamH I位点)：

5’-CGCC GGATCCATGGCTTTTGAAATTGTCTCAA-3’(SEQ ID NO：20)

反向引物(含Sac I位点)：

5’-GTCA GAGCTCTCAACGCCATTGATGACCATT-3’(SEQ ID NO：21)

PCR反应体系及条件同前。

获得约1.6Kb PCR产物片段，回收。采用BamH I和Sac I双酶切，将其***pBI121双元表达载体(Chen PY，Wang CK，Soong SC，To KY(2003)Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application incloning T-DNA insertion from transgenic plants.Molecular Breeding11：287-293)中CaMV 35S启动子后面，得到一个双元表达载体，其图谱如图11所示，经测序鉴定***片段无误后，转化农杆菌LBA4404(Hoekema A，Hirsch PR，Hooykaas PJJ，Schilperoort RA(1983)A binary plant vetorstrategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacteriumtumefaciens Ti-plasmid.Nature 303：179-180)，再提质粒，经酶切、PCR确认后，证明成功转化入农杆菌中，该表达载体可直接用于植物，如烟草、毛白杨、禾本科牧草等植物的转化。

实施例5、CkNHX基因的烟草转化

1.植物材料的准备

在不含激素的MS培养基上(刘敏著，花卉组织培养与工厂化生产，地质出版社，2006年6月，19-20页)培养烟草(W38)(中科院植物所)的无菌苗，培养温度为25-28℃。

2.农杆菌的培养

将含有目的表达载体的农杆菌接种到20ml(30mg/L Str、50mg/L Kan)YEP液体培养基(详细配方参照Invortrogene pYES2.0 protocol，CatNo.V825-20)中，28℃，220rpm摇菌16-18h，使农杆菌培养至对数期OD₆₀₀值0.6-0.8。

取菌液1-2mL转入40mL不含抗生素的YEP中，28℃，220rpm摇菌过夜。

3.转化

将菌液倒入无菌培养皿中(40mL/per)，把刚划好伤口的叶片，放入菌液中侵染10-20min后，用无菌水漂洗一下，将叶片上的菌液用灭菌滤纸稍吸干，转入不加抗生素的MS培养基上(刘敏著，花卉组织培养与工厂化生产，地质出版社，2006年6月，19-20页)。浸染过的叶片接种在MS培养基上，平放并稍捻入培养基，28℃暗培养条件下共培养2-4天，直至可看见农杆菌菌斑。

4.选择培养：

立即将共培养的、可看见农杆菌菌斑的转化叶片放入含抗生素(Cb500mg/L、Kan 500mg/L)的筛选分化培养基中，筛选培养3-4周。待出芽后，转入含抗生素(Cb 500mg/L、Kan 500mg/L)的生根培养基中。获得转基因植株如图12。

分化培养基组成：

含6-BA 2mg/L，NAA 0.1mg/L，羧苄青霉素500mg/L，卡那霉素300mg/L的MS培养基。

生根培养基组成：

含NAA 0.1mg/L，羧苄青霉素500mg/L，卡那霉素300mg/L的MS培养基。

实施例6、转CkNHX基因的烟草转化株鉴定

1)转CkNHX烟草植株基因组DNA的PCR检测

采用CTAB法(F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，精编分子生物学实验指南。科学出版社，2001)提取植物总DNA，采用前面载体构建所述引物(SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21)进行PCR检测，结果如图13。可见在DNAMarker约1.6kb处具有明显PCR扩增条带，其中第8泳道为阴性对照(野生W38烟草基因组DNA)；第5泳道为阳性对照(以质粒pCkNHX为模板)；第6泳道为负对照(以水为模板)；第7泳道为DNA MarkerDGL2000(由上至下DNA大小为19325，2000，1600，1000，750，500，250，100bp)；第1-4和9-12泳道为烟草转化植株基因组DNA的PCR产物。这表明所获得的烟草转化株已含有该基因片段。

2)烟草转CkNHX苗RT-PCR检测

对前面所检测到的阳性转化植株进行CkNHX的RT-PCR检测，考察转化植株中CkNHX转录情况。按照常规技术，采用Trizol试剂提取转化植株的RNA，采用TakaRa公司的one-step RT-PCR试剂盒进行RT-PCR检测，其结果见图14。第1泳道为DNA MarkerDGL2000(由上至下DNA大小为19325，2000，1600，1000，750，500，250，100bp)；第2-11为阳性烟草转化植株RT-PCR产物；第12泳道为阴性对照(野生W38烟草)，其中以烟草的Actin引物进行转录表达检测(约为1Kb)，CkNHX转录带在约1.6Kb位置。

该图表明在所检测的阳性烟草转换株中均有烟草Actin的转录(约0.9kb)，而转化株2，5，6，7，8，9，10中可见1.6Kb处该CkNHX转录带。这表明CkNHX在这些转化株中已获得转录。

所用烟草Actin引物序列如下，所有操作按TakaRa公司的one-stepRT-PCR试剂盒(DRR024A)操作说明进行。

正向引物：

5’-GCTGGATTTGCTGGTGATGAT-3’(SEQ ID NO：22)

反向引物：

5’-CGATC TGCAATGCCAGGAA-3’(SEQ ID NO：23)

实施例7、CkNHX基因烟草转化株的耐盐性鉴定

将PCR和RT-PCR验证的烟草植株，在添加了不同浓度(100、200、300、400mM NaCl)NaCl的培养基(MS)上进行耐盐试验。以同样发育期的对照野生植株在100、200、300、400mM NaCl的培养基上进行耐盐试验，以42天为期观察耐盐性(图15A)。结果表明野生植株在42天培养时间内，可耐受200mM NaCl；而一旦盐浓度超过300mM到400mM时，植株无法生根并开始黄化，以致死亡。

图15B是前面所验证了的CkNHX转化植株的耐盐实验。可见即使加入300mM的NaCl，转入CkNHX的烟草仍可正常发育、生根，生长。这说明将CkNHX基因转入烟草，可以提高烟草受体的耐盐性。

现有技术中目前尚未有通过转基因的手段获得可耐受300mM的NaCl的转基因植株。

IB056039-序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

中国林业科学研究院林业研究所

<120>IB056039

<130>新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn，以及培育耐逆植物的方法

<160>23

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2547

<212>DNA

<213>柠条(Caragana korshinskii Kom)

<400>1

cccgtctttc tcctctgtct ctttctttct gtccacacca cacggctctc cctctctctc 60

tecctctctc tctctctcta aacctttgtc ttccattttc tctatatttc cagagctttc 120

gttgccctct ctttctctca ctgtgactca aattaataaa aaaaatatct cttaattttc 180

tttccttttc gatttctcgt tccttttcca gctacctccc ttgagcttca cgtttatttt 240

aattctatta atccctgctc tgttggttca ttctctattt tcgtcttcgt ttcgagcttg 300

atccctgcat aattgttttg gtggaacaat tgcagagagc tgaaaagtgt tccaatttaa 360

cgggaattcg aacagggggt tggttcttag ctttctctgt tcgaattctt tggacgttgg 420

gttccttgtg tttttttaaa tactcagaaa aatcacagac tcttcttcgc aatgctgcta 480

tcaagctttc tgagattctt ttgttgacga gatctgaagg ttcttaaaat ggatagctcg 540

gaaacataaa tttggatcat ttatactgga ctttgaactt ggcaactaag caataatctg 600

aatctgtgtt taaatctgct tttgcaatta tttattgtgg agggtggacg agatggcttt 660

tgaaattgtc tcaaaattgc aaaatctatc cacttctgac catgcctccg tagtctccat 720

gaacttgttt gtggcacttc tatgtgcttg tattgtagtt ggccatcttc ttgaggagaa 780

tcggtggatg aatgagtcca tcactgccct tttgattggt ctttgcactg gcataatcat 840

tttgctgttt agtggtggta aaagctcgca tattcttgtt ttcagtgaag atcttttctt 900

tatatacctt ctgccgccta taatattcaa tgctgggttt caggtgaaaa agaagcagtt 960

ttttgtcaac ttcatcacta tcgtgtcgtt tggggctatt ggtacattag tatcgtgtgt 1020

catcataact ttgggtgtta tgtatgcttt taagaggatg gatattgggc cactggaact 1080

gggcgattat ctagcaattg gagcaatatt tgccgcgaca gattctgttt gcacgttgca 1140

ggtgctaaat caggatgaga cacctttgct gtacagtctt gtatttgggg agggtgttgt 1200

IB056039-序列表

gaacgatgct acatcagtgg tgcttttcaa tgcaatccaa agctttgacc tcaaccgact 1260

taactcttta attgctttgc actttttggg caatttcttg tatttgttta ttgcaagcac 1320

actgcttgga gttttgacag gtctgttcag tgcttacgtt attaaaaagc tgtacattgg 1380

caggcactct acagatcgtg aggttgctct tatgatgcta atggcatacc tctcctacat 1440

gctggctgaa ttaagctatc tgagtggcat tctcactgta ttcttttgtg ggattgtcat 1500

gtctcattat acttggcata atgtgactga gagttcaaga atcactacca agcatgcttt 1560

tgctaccttg tcgtttgttg ctgagatatt tatcttcctt tatgttggta tggatgccct 1620

ggacattgaa aaatggaagt ttgttagtga tagtcctgga acatctgtag cagcaagttc 1680

agtattgttg ggtctagtcc ttcttggaag agcagctttt gttttcccct tatccttctt 1740

atccaacttg accaaaaaat caccgtatga gaaaatctcc ttcagacagc aagtgatcat 1800

ttggtgggct ggtcttatga gaggtgctgt ttcaatggca ctcgcttata atcagttcac 1860

catgtcgggg cacactcaac tgcgatgcaa tgcaatcatg atcactagca ccatcactgt 1920

tgtgcttttc agcacagtgg tgtttggttt gatgactaag ccactcataa ggcttttact 1980

acctcatcct aaagcgacaa acagcatgac aaccacagaa tcatctactc caaaatcagc 2040

cattgtccca cttctaggaa gtgcccaaga ttctgaagcc gatcttgatg gccatgagat 2100

tcatcgtccg agcagtattc gtgccttact atccactcca acgcacactg ttcatcgatt 2160

atggcgaagg tttgatgatt cattcatgcg tcctgttttt ggtggcaggg gttttgttcc 2220

tgtggaacct ggctcaccaa gtgaacgcaa tggtcatcaa tggcgttgag aagaaagcca 2280

tgaaatatgt aatgtgtgtt gtaaactacg tatgattgta tgatttgtga agatcaagca 2340

atgtatgtat aataagaatc acgtaatgaa attttgttta gttttttgtg tagctagtac 2400

gagaaggccg tgtaccataa gccatctctg cctcttctgt aaactacaat atttattaga 2460

ttctctgacc catcatcatc atcattgtac taaaaatttg attagctgaa gctaaatatt 2520

ttcctttcca caaaaaaaaa aaaaaaa 2547

<210>2

<211>538

<212>PRT

<213>柠条(Caragana korshinskii Kom)

<400>2

Met Ala Phe Glu Ile Val Ser Lys Leu Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asp

1 5 10 15

His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu Cys Ala

20 25 30

Cys Ile Val Val Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Met Asn Glu

35 40 45

Ser Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Leu Cys Thr Gly Ile Ile Ile Leu

50 55 60

IB056039-序列表

Leu Phe Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Ile Leu Val Phe Ser Glu Asp

65 70 75 80

Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Gly Phe

85 90 95

Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Val Asn Phe Ile Thr Ile Val Ser

100 105 110

Phe Gly Ala Ile Gly Thr Leu Val Ser Cys Val Ile Ile Thr Leu Gly

115 120 125

Val Met Tyr Ala Phe Lys Arg Met Asp Ile Gly Pro Leu Glu Leu Gly

130 135 140

Asp Tyr Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys

145 150 155 160

Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu Phe

180 185 190

Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Asn Arg Leu Asn Ser Leu Ile Ala

195 200 205

Leu His Phe Leu Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Ile Ala Ser Thr Leu

210 215 220

Leu Gly Val Leu Thr Gly Leu Phe Ser Ala Tyr Val Ile Lys Lys Leu

225 230 235 240

Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met Met Leu

245 250 255

Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Ser Tyr Leu Ser Gly

260 265 270

Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr Thr Trp

275 280 285

His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Ile Thr Thr Lys His Ala Phe Ala

290 295 300

Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu Ile Phe Ile Phe Leu Tyr Val Gly Met

305 310 315 320

Asp Ala Leu Asp Ile Glu Lys Trp Lys Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly

325 330 335

Thr Ser Val Ala Ala Ser Ser Val Leu Leu Gly Leu Val Leu Leu Gly

340 345 350

Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Thr Lys

355 360 365

IB056039-序列表

Lys Ser Pro Tyr Glu Lys Ile Ser Phe Arg Gln Gln Val Ile Ile Trp

370 375 380

Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn

385 390 395 400

Gln Phe Thr Met Set Gly His Thr Gln Leu Arg Cys Asn Ala Ile Met

405 410 415

Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Val Val Phe Gly

420 425 430

Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro His Pro Lys Ala

435 440 445

Thr Asn Ser Met Thr Thr Thr Glu Ser Ser Thr Pro Lys Ser Ala Ile

450 455 460

Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Gln Asp Ser Glu Ala Asp Leu Asp Gly

465 470 475 480

His Glu Ile His Arg Pro Ser Ser Ile Arg Ala Leu Leu Ser Thr Pro

485 490 495

Thr His Thr Val His Arg Leu Trp Arg Arg Phe Asp Asp Ser Phe Met

500 505 510

Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Val Glu Pro Gly Ser

515 520 525

Pro Ser Glu Arg Asn Gly His Gln Trp Arg

530 535

<210>3

<211>1305

<212>DNA

<213>柠条(Caragana korshinskii Kom)

<400>3

atggcttttg aaattgtctc aaaattgcaa aatctatcca cttctgacca tgcctccgta 60

gtctccatga acttgtttgt ggcacttcta tgtgcttgta ttgtagttgg ccatcttctt 120

gaggagaatc ggtggatgaa tgagtccatc actgcccttt tgattggtct ttgcactggc 180

ataatcattt tgctgtttag tggtggtaaa agctcgcata ttcttgtttt cagtgaagat 240

cttttcttta tataccttct gCcgcctata atattcaatg cagggtttca ggtgaaaaag 300

aagcagtttt ttgtcaactt catcactatc gtgtcgtttg gggctattgg tacattagta 360

tcgtgtgtca tcataacttt gggtgttatg tatgctttta agaggatgga tattgggcca 420

ctggaactgg gcgattatct agcaattgga gcaatatttg ccgcgacaga ttctgtttgc 480

acgttgcagg tgctaaatca ggatgagaca cctttgctgt acagtcttgt atttggggag 540

ggtgttgtga acgatgctac atcagtggtg cttttcaatg caatccaaag ctttgacctc 600

aaccgactta actctttaat tgctttgcac tttttgggca atttcttgta tttgtttatt 660

IB056039-序列表

gcaagcacac tgcttggagt tttgacaggt ctgttcagtg cttacgttat taaaaagctg 720

tacattggca ggcactctac agatcgtgag gttgctctta tgatgctaat ggcatacctc 780

tcctacatgc tggctgaatt aagctatctg agtggcattc tcactgtatt cttttgtggg 840

attgtcatgt ctcattatac ttggcataat gtgactgaga gttcaagaat cactaccaag 900

catgcttttg ctaccttgtc gtttgttgct gagatattta tcttccttta tgttggtatg 960

gatgccctgg acattgaaaa atggaagttt gttagtgata gtcctggaac atctgtagca 1020

gcaagttcag tattgttggg tctagtcctt cttggaagag cagcttttgt tttcccctta 1080

tccttcttat ccaacttgac caaaaaatca ccgtatgaga aaatctcctt cagacagcaa 1140

gtgatcattt ggtgggctgg tcttatgaga ggtgctgttt caatggcact cgcttataat 1200

cagttcacca tgtcggggca cactcaactg cgatgcaatg caatcatgat cactagcacc 1260

atcactgttg tgcttttcag cacagtggtg tttggtttga tgtag 1305

<210>4

<211>434

<212>PRT

<213>柠条(Caragana korshinskii Kom)

<400>4

Met Ala Phe Glu Ile Val Ser Lys Leu Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asp

1 5 10 15

His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu Cys Ala

20 25 30

Cys Ile Val Val Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Met Asn Glu

35 40 45

Ser Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Leu Cys Thr Gly Ile Ile Ile Leu

50 55 60

Leu Phe Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Ile Leu Val Phe Ser Glu Asp

65 70 75 80

Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Gly Phe

85 90 95

Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Val Asn Phe Ile Thr Ile Val Ser

100 105 110

Phe Gly Ala Ile Gly Thr Leu Val Ser Cys Val Ile Ile Thr Leu Gly

115 120 125

Val Met Tyr Ala Phe Lys Arg Met Asp Ile Gly Pro Leu Glu Leu Gly

130 135 140

Asp Tyr Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys

145 150 155 160

IB056039-序列表

Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu Phe

180 185 190

Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Asn Arg Leu Asn Ser Leu Ile Ala

195 200 205

Leu His Phe Leu Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Ile Ala Ser Thr Leu

210 215 220

Leu Gly Val Leu Thr Gly Leu Phe Ser Ala Tyr Val Ile Lys Lys Leu

225 230 235 240

Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met Met Leu

245 250 255

Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Ser Tyr Leu Ser Gly

260 265 270

Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr Thr Trp

275 280 285

His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Ile Thr Thr Lys His Ala Phe Ala

290 295 300

Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu Ile Phe Ile Phe Leu Tyr Val Gly Met

305 310 315 320

Asp Ala Leu Asp Ile Glu Lys Trp Lys Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly

325 330 335

Thr Ser Val Ala Ala Ser Ser Val Leu Leu Gly Leu Val Leu Leu Gly

340 345 350

Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Thr Lys

355 360 365

Lys Ser Pro Tyr Glu Lys Ile Ser Phe Arg Gln Gln Val Ile Ile Trp

370 375 380

Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn

385 390 395 400

Gln Phe Thr Met Ser Gly His Thr Gln Leu Arg Cys Asn Ala Ile Met

405 410 415

Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Val Val Phe Gly

420 425 430

Leu Met

<210>5

<211>36

IB056039-序列表

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgagcggccg cccgggcagg tttttttttt tttttt 36

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcagggtttc aggtgaaaaa gaagca 26

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gaaaaatgga agtttgt tag tgatagtcc 29

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

caccatgtcg gggcacactc aac 23

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gtacaatgat gatgatgatg ggtcagag 28

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

IB056039-序列表

<400>10

agatggctta tggtacacgg ccttctcg 28

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cttctcaacg ccattgatga ccattg 26

<210>12

<211>652

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

cccgtctttc tcctctgtct ctttctttct gtccacacca cacggctctc cctctctctc 60

tccctctctc tctctctcta aacctttgtc ttccattttc tctatatttc cagagctttc 120

gttgccctct ctttctctca ctgtgactca aattaataaa aaaaatatct cttaattttc 180

tttccttttc gatttctcgt tccttttcca gctacctccc ttgagcttca cgtttatttt 240

aattctatta atccctgctc tgttggttca ttctctattt tcgtcttcgt ttcgagcttg 300

atccctgcat aattgttttg gtggaacaat tgcagagagc tgaaaagtgt tccaatttaa 360

cgggaattcg aacagggggt tggttcttag ctttctctgt tcgaattctt tggacgttgg 420

gttccttgtg tttttttaaa tactcagaaa aatcacagac tcttcttcgc aatgctgcta 480

tcaagctttc tgagattctt ttgttgacga gatctgaagg ttcttaaaat ggatagctcg 540

gaaacataaa tttggatcat ttatactgga ctttgaactt ggcaactaag caataatctg 600

aatctgtgtt taaatctgct tttgcaatta tttattgtgg agggtggacg ag 652

<210>13

<211>278

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gaagaaagcc atgaaatatg taatgtgtgt tgtaaactac gtatgattgt atgatttgtg 60

aagatcaagc aatgtatgta taataagaat cacgtaatga aattttgttt agttttttgt 120

gtagctagta cgagaaggcc gtgtaccata agccatctct gcctcttctg taaactacaa 180

tatttattag attctctgac ccatcatcat catcattgta ctaaaaattt gattagctga 240

agctaaatat tttcctttcc acaaaaaaaa aaaaaaaa 278

<210>14

IB056039-序列表

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cgcccagttc cagtggccca atatcca 27

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

cttggaagag cagcttttgt tttcccc 27

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gccggatccc gtctttctcc tctgtctc 28

<210>17

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

cgcggagctc aatgatgatg atgatgggtc agag 34

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cgcgccgagc tcatggcttt tgaaattgtc t 31

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

IB056039-序列表

<400>19

ccgcgctcta gactaagtca tcaaaccaaa cacc 34

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

cgccggatcc atggcttttg aaattgtctc aa 32

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gtcagagctc tcaacgccat tgatgaccat t 31

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gctggatttg ctggtgatga t 21

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

cgatctgcaa tgccaggaa 19

Claims

1.一种来源于灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)的NHX类Na+/H+逆转运蛋白，其氨基酸序列由SEQ ID NO：2或4所示或由在SEQ ID NO：2或4的序列上进行一个或几个非保守区域氨基酸的替换、***或缺失所得到的序列所示。

2.编码权利要求1的逆转运蛋白的基因。

3.权利要求2的基因，其核苷酸序列由SEQ ID NO：1或3所示，或由在SEQ ID NO：1或3的序列上进行一个或几个核苷酸的替换、***或缺失所得到的具有相同功能的序列所示。

4.一种表达载体，其包含权利要求2或3的基因。

5.权利要求4的表达载体，其是双元农杆菌载体或植物表达载体。

6.权利要求5的表达载体，其中所述植物表达载体含DRE和/或ABRE元件的启动子。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的表达载体。

8.权利要求7的宿主细胞，其是大肠杆菌细胞、酵母细胞或农杆菌细胞。

9.权利要求2或3的基因在转化植物获得转基因植物中的应用。

10.权利要求9的应用，其中所述植物选自单子叶植物或双子叶植物。

11.权利要求10的应用，其中所述单子叶植物选自由小麦、玉米、水稻、禾本科牧草组成的组，所述双子叶植物选自由杨树、大豆、棉花和油菜组成的组。

12.权利要求2或3的基因在提高植物抗逆境胁迫中的应用。

13.权利要求12的应用，其中所述逆境胁迫为盐胁迫。

14.一种培育抗逆境胁迫的植物的方法，包含构建含权利要求2或3的基因的植物表达载体；用所述构建的植物表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成转基因植株。