CN101033472A

CN101033472A - 产生聚谷氨酸的转基因植物

Info

Publication number: CN101033472A
Application number: CNA2006100586653A
Authority: CN
Inventors: 小野荣一郎; 干涉; 樽井裕; 谷口诚
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2006-03-06
Publication date: 2007-09-12
Also published as: JPWO2006117927A1; EP1854348A1; AU2006242770A1; WO2006117927A1; CA2600084A1; EP1854348A4; US20090126045A1

Abstract

本发明提供一种培育产生聚谷氨酸的转基因植物的方法及利用上述方法育出的转基因植物，并以此为目的。本发明的方法包含在植物体内导入编码聚谷氨酸合成酶A的核酸(pgsA)、编码聚谷氨酸合成酶B的核酸(pgsB)及编码聚谷氨酸合成酶C的核酸(pgsC)。

Description

产生聚谷氨酸的转基因植物

技术领域

本发明涉及一种产生聚谷氨酸的转基因植物及其育成方法。

背景技术

PGA(γ-聚谷氨酸)是芽孢杆菌属细菌生产的粘性大分子，是D及L谷氨酸在氨基和γ位的羧基间进行酰胺结合了的单链结构的高聚物。

目前地球上占40％的酸性土壤，是由于在气温较高的地区长期降下的酸雨使土壤中的碱基淋溶，造成了土壤酸性化。而且化学肥料的过量使用、作物收获时对碱性养分的争夺也是酸性化的重要原因。酸性土壤中大量存在的铝进行离子化，此铝离子的毒性也会引起植物的生长抑制。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中与PGA合成有关的基因由一个操纵子编码。PGA合成的必需基因是pgsA、pgsB、pgsC，3个基因(图1-3)不全部存在时不能合成PGA，其已在E.coli的转化***中得到了证实(Ashiuchi et al.1999)。从预想氨基酸序列中，推测上述全部3个基因均具有跨膜结构域(Ashiuchi及Misono 2002)。同时，还指出pgsB在酰胺连接酶上具有特征性ATP/GTP结合位点模体。

通过转化大肠杆菌的分离细胞膜组分的分析，证明pgsA、pgsB及pgsC的基因产物于细菌的细胞膜上局部存在，并具有PGA合成活性(Ashiuchi et al.2001)。为使原核生物的基因产物导入真核生物并具有正常的功能，基因产物应整合进膜结构。虽已知为得到真核生物的转基因植物的一般的方法，但是，在现实中始终未能成功地使某个特定的基因特别是在植物体中表达并能发挥功能，所以还需要种种有创造性地设想。

[专利文献1]

日本特开2003-420046号公报

[专利文献2]

日本特开2003-432383号公报

[非专利文献1]

Ashiuchi，M.，Nawa，C.，Kamei，T.，Song，J.J.，Hong，S.P.，Sung，M.H.，Soda，K.and Misono，H.(2001)Physiological and biochemial characteristics of poly-γ-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis.Eur.J.Biochem.268：5321-5328

[非专利文献2]

Horsch，R.B.，Fry，J.，Hoffmann，N.，Neidermeryer，J.，Rogers，S.G.and Fraley，R.T.(1988)Leaf disc transformation.Plant Mol.Biol.Mannual A5：1-9

[非专利文献3]

Johansen，L.K.and Carrington，J.C.(2001)Silencing on the spot.Induction and suppression ofRNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expressionsystem.Plant Physiol.126：930-938

[非专利文献4]

Yamaguchi，F.，Ogawa，Y，Kikuchi，M.，Yuasa，K.and Motai，H.(1996)Detection of γ-polyglutamic acid(γ-PGA)by SDS-PAGE.Biosci.Biotech.Biochem.60：255-258

[非专利文献5]

Yenofsky，R.L.，Fine，M.and Pellow，J.W(1990)A mutant neomycin phosphotransferase II gene reduces the resistance of transformants to antibiotic selection pressure.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3455-3439

[非专利文献6]

Ashiuchi et al.(1999)A poly-γ-glutamate synthetic system ofBacillus subtilis IFO 3336：genecloning and biochemical analysisof poly-γ-glutamate produced byEscherichia coli clone cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.263，387-393

[非专利文献7]

Ashiuchi及Misono 2002，Biochemistry and molecular genetics ofpoly-γ-glutamate synthesis.Appl.Microbiol.Biotechnol.59，9-14

[非专利文献8]

下西等，新·生物化学实验入门3(122-124页，化学同人，1996年)

[非专利文献9]

Hiei et al.，Plant J.，6，p.271-282(1994)

[非专利文献10]

Komari et al.，Plant J.，10，p.165-174(1996)

[非专利文献11]

van Engelen et al.TransgenicReaserch 4，288-290，1995

[非专利文献12]

Jefferson et al.，(1987)GUS fusion：β-glcosidase as a sensitiveand versatile gen fusion markerin higher plants.EMBO J.6，3901-3907)

[非专利文献13]

松本及町田(1990)植物转化法，现代化学，25～29

[非专利文献14]

荒木(2001)使用真空渗透法转化，细胞工程学别册植物细胞工程学系列15，109～113

[非专利文献15]

大隅(2001)农杆菌直接注入法，细胞工程学别册植物细胞工程学系列15，105～108

发明内容

本发明的目的是提供培育产生聚谷氨酸(PGA)的转基因植物的方法。本发明的方法包含在植物体内导入编码聚谷氨酸合成酶A的核酸(pgsA)、编码聚谷氨酸合成酶B的核酸(pgsB)及编码聚谷氨酸合成酶C的核酸(pgsC)。实际上，至今还未得到为发挥PGA合成活性功能的，pgsA、pgsB及pgsC基因表达的植物体，如能通过导入PGA生产基因获得具有PGA合成功能的转基因植物，不仅可提高植物的抗性，还可期望由植物自身改善环境。特别是，其转基因植物有可能具有与现有植物不同的功能。

芽孢杆菌属细菌在高等植物的根中分泌PGA时，可通过与铝离子的离子结合形成水溶性络合物，有防止根吸收铝离子的功效。同时，由于PGA不抑制硝态氮、磷酸、钾等植物营养元素的吸收，所以可减轻酸性土壤对植物的生长抑制。还因PGA具有粘性和保水性，如在叶中合成时，可提高植物的保水性，有可能获得抗旱性强的植物。

本发明方法的形态之一，是通过感染含有***了编码聚谷氨酸合成酶A的核酸(pgsA)、编码聚谷氨酸合成酶B的核酸(pgsB)及编码聚谷氨酸合成酶C的核酸(pgsC)中1种或多于1种核酸的载体的农杆菌，在植物中导入上述核酸。

pgsA、pgsB及pgsC3种核酸向植物的导入，优选通过以下a)到c)的任一过程进行。

a)使含有***了pgsA、pgsB及pgsC3种核酸的同一载体的农杆菌感染植物；

b)使含有分别***了pgsA、pgsB及pgsC的载体的3种农杆菌感染植物；或

C)使含有分别***了pgsA、pgsB及pgsC的载体的农杆菌感染植物，培育具有pgsA、pgsB及pgsC中1种或2种的转基因植物，并使这些转基因植物杂交。

本发明还提供由上述方法育成的产生聚谷氨酸的转基因植物。本发明的转基因植物优选烟草或拟南芥。

本发明者为解决上述问题锐意研究的结果，成功地育成了在植物体中产生聚谷氨酸(PGA)的转基因植物，使本发明的设想得以实现。

首先将编码PGA合成酶的3种基因(pgsA、pgsB及pgsC)分别从纳豆中存在的菌中经PCR、电泳提取、TA、克隆，整合进pGEM-T Easy载体中。测序后，用EcoRI切割整合到pGEM(T-BH)ΔSSS载体上，最后，用BamHI/SacI切割，整合到双元载体的pBI121上。感染植物时，利用可将质粒中的T-DNA整合进植物体的细菌农杆菌，将pBI121导入农杆菌后，使用以烟草为材料的叶盘法，以拟南芥为材料的真空渗透法(vacuuminfiltration)，育出使植物感染了的转基因植物。另外，在以烟草为材料时，通过在体细胞中可使转化瞬时表达的直接注入法检测3种基因的表达，并使用RT-PCR法检测育出的转基因植物中导入基因是否表达。

特别是制作在单一的植物转化用双元载体上整合了pgsA、pgsB及pgsC3种基因的构建物，使用利用农杆菌的叶盘法导入。其结果，可获得3种基因全被导入的转基因植物。

因此，本发明以提供培育产生聚谷氨酸的转基因植物的方法为目的。本发明的方法包含在植物体内导入编码聚谷氨酸合成酶A的核酸(pgsA)、编码聚谷氨酸合成酶B的核酸(pgsB)及编码聚谷氨酸合成酶C的核酸(pgsC)。

附图说明

图1表示pgsA基因的碱基序列和预测氨基酸序列。

图2表示pgsB基因的碱基序列和预测氨基酸序列。

图3表示pgsC基因的碱基序列和预测氨基酸序列。

图4图4表示与PGA代谢有关的B.subtilis染色体上ORF的结构。pgsA、pgsB及pgsC表示各自的PGA合成基因A、B及C的编码区域。Ywtc表示功能未知的基因。pgdS表示PGA的解聚酶。

图5图5表示在为使三种pgs基因组成性表达，在导入了基因的转基因烟草中导入基因的表达。具体地说，为检测导入的三种pgs基因的表达，在各pgs基因中使用特异性引物进行RT-PCR。其结果，鉴定了转基因烟草(PGSox.)的***10、11及21中三种pgs基因的异位表达(NT：非转化体、NtUBQ：烟草泛素基因(内部标准基因)。

图6图6是在图5中的鉴定了3种pgs基因异位表达的烟草转化***10、11及21的叶粗提取液中，通过Western印迹法检测PGS蛋白质积累的结果。

具体实施方式

编码聚谷氨酸合成用酶的核酸

在本发明中，为育成产生聚谷氨酸的转基因植物，在转基因植物中，以导入编码聚谷氨酸合成酶A的核酸(pgsA)、编码聚谷氨酸合成酶B的核酸(pgsB)及编码聚谷氨酸合成酶C的核酸(pgsC)的3种核酸为特征。为使植物体中产生聚谷氨酸，3种核酸需导入单一植物体中。

本发明可利用的核酸，包含基因组DNA(也包含与其对应的cDNA)、化学合成的DNA、由PCR扩增的DNA及其组合。

编码pgsA的核酸优选具有序列号2的碱基序列。编码pgsB的核酸优选具有序列号4的碱基序列。编码pgsC的核酸优选具有序列号6的碱基序列。这些作为与PGA合成有关的基因是从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中得到的核酸的碱基序列，例如，如Ashiuchiet al.1999所示。

1个或多于1个的密码子有时会编码同一个氨基酸，被称作遗传密码的简并。因此，与序列号2、4或6完全不一致的DNA序列有可能编码具有与序列号1、3或5完全相同的氨基酸序列的蛋白质。如此的突变体DNA序列可从沉默(silent)突变(例如，在PCR扩增中发生)产生，也可是野生型序列的有意的诱变产物。

pgsA基因优选编码序列号1中记载的氨基酸序列。pgsB基因优选编码序列号3中记载的氨基酸序列。pgsC基因优选编码序列号5中记载的氨基酸序列。但并不限于此，也可为具有1个或多于1个氨基酸序列缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要聚谷氨酸合成酶A、B、C3种具有产生聚谷氨酸的功能，即包含所有相同的蛋白质。本发明以在植物体中导入聚谷氨酸合成用的3种核酸为特征，只要3种核酸的序列编码与序列号1、3及5具有同等功能的氨基酸序列，则不限于序列号2、4及6。“氨基酸突变”从1个到多个，优选为1个到20个，更优选为1个到10个，最优选为1个到5个。

由pgsA基因编码的氨基酸序列与序列号1中记载的氨基酸序列至少应有约70％、优选为约80％或大于80％、更优选为90％或大于90％、特别优选为95％或大于95％、最优选为98％或大于98％的同一性。

由pgsB基因编码的氨基酸序列与序列号3中记载的氨基酸序列至少应有约70％、优选为约80％或大于80％、更优选为90％或大于90％、特别优选为95％或大于95％、最优选为98％或大于98％的同一性。

由pgsC基因编码的氨基酸序列与序列号5中记载的氨基酸序列至少应有约70％、优选为约80％或大于80％、更优选为90％或大于90％、特别优选为95％或大于95％、最优选为98％或大于98％的同一性。

氨基酸同一性的百分比可由视觉检查及数学计算测定。或2个蛋白质序列的同一性百分比也可根据Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Biol.，48：443-453，1970)的算法，并且通过使用可从威斯康星大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机·程序比较序列信息来测定。GAP程序的优选补缺参数(default parameter)中，包含：如(1)Henikoff，S及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)中记载的打分矩阵、blosum 62；(2)12的空位加权；(3)4的空位长加权；及(4)对末端空位无罚分。

也可使用本领域技术人员使用的序列比较的其他程序。同一性的百分比，例如可使用Altschul等在(Nucl.Acids.Res.25.，p.3389～3402，1997)中所述的BLAST程序与序列信息比较测定。该***可在因特网上从National Center for Biotechnology Information(NCBI)、或DNA Data Bank of Japan(DDBJ)的网页利用。由BLAST程序进行同源性鉴定的各种条件(parameter)在同网页有详细记载，虽可适宜变更一部分设定，但鉴定通常需使用补缺值(default值)进行。

本发明的方法中，优选聚谷氨酸合成酶A具有序列号1或与序列号1至少有70％同一性的氨基酸序列，聚谷氨酸合成酶B具有序列号3或与序列号3至少有70％同一性的氨基酸序列，聚谷氨酸合成酶C具有序列号5或与序列号5至少有70％同一性的氨基酸序列，并且，该聚谷氨酸合成酶A、B、C3种具有产生聚谷氨酸的功能。

即使是具有同样功能的蛋白质，由于品种来源不同，其氨基酸序列也存在不同，这是本领域技术人员众所周知的事实。只要聚谷氨酸合成酶A、B、C3种具有产生聚谷氨酸的功能，pgsA、pgsB及pgsC基因也包含分别如序列号2、4、6的碱基序列的同系物、突变体。

“产生聚谷氨酸”是指导入了该3种核酸后，在植物个体中，与非基因导入植物(非转基因植物)相比，可产生统计学上有显著差异的PGA。PGA原本是植物中不能产生的物质，本发明的转基因植物即使只产生极微量的PGA，与非转基因植物相比，仍可期待其能发挥有益的作用。并非限定，但由本发明育成的转基因植物在导入了该3种核酸后，可产生与非基因导入植物(非转基因植物)相比1.5倍、优选为2倍、更优选为3倍、特别优选为5倍、最优选为7倍的PGA。

本发明的优选编码聚谷氨酸合成酶A、B、C的核酸还包含序列号2、4或6的碱基序列在严谨条件下，例如，在中度或高度的严谨条件下可杂交的，且该聚谷氨酸合成酶A、B、C 3种具有产生聚谷氨酸功能的核酸。

“严谨条件下”是指在中度或高度的严谨条件下的杂交。具体地说，中度严谨条件，例如，根据DNA的长度，有一般技术的本领域技术人员可容易确定。基本的条件如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，第6-7章，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001中所示，有关硝酸纤维素滤膜，包含5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的前洗涤溶液，约40～50℃下的、约50％甲酰胺、2×SSC～6×SSC[或约42℃下约50％甲酰胺中的、Stark’s溶液(Stark’s solution)等的其他同样的杂交溶液]的杂交条件，及约60℃、0.5×SSC、0.1％SDS的洗涤条件的使用。优选的中度严谨条件包含约50℃、6×SSC的杂交条件。高度严谨条件也为例如根据DNA的长度，本领域技术人员可容易确定的条件。一般来说，这样的条件被定义为包含比中度严谨条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交(例如，约65℃、6×SSC至0.2×SSC，优选6×SSC、更优选2×SSC，最优选0.2×SSC的杂交)及/或洗涤，并伴随例如上述的杂交条件及约68℃、0.2×SSC、0.1％SDS的洗涤。杂交及洗涤的缓冲液中，可将SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH₂PO₄和1.25mM EDTA、pH 7.4)代替，洗涤在杂交结束后进行15分钟。

如本领域技术人员所知，以下也进一步描述，为了通过运用支配杂交反应和双链稳定性的基本原理而达到期望程度的严谨性，应对根据需要可调整洗涤温度和洗涤盐浓度有所了解(例如，可参考Sambrook等、2001)。使核酸与未知序列的靶核酸杂交时，假定杂交体的长度即是杂交核酸的长度。杂交已知序列的核酸时，杂交体的长度可通过鉴定联配核酸的序列，且具有最佳序列互补性的单数或复数的区域来确定。预测不足50个碱基对长度的杂交体的杂交温度，必须比杂交体的解链温度(T_m)低5-25℃，T_m可由以下等式确定。长度不足18个碱基对的杂交体，T_m(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。长度超过18个碱基对的杂交体，T_m＝81.5℃+16.6(log₁₀[Na⁺])+41(摩尔分数[G+C])-0.63(％甲酰胺)-500/n，此处，N为杂交体中的碱基数，[Na⁺]为杂交缓冲液中的钠离子浓度(1×SSC的[Na⁺]＝0.165M)。优选此杂交核酸分别至少为8个核苷酸(或更优选至少为15个核苷酸、或至少为20个核苷酸、或至少为25个核苷酸、或至少为30个核苷酸、或至少为40个核苷酸、或最优选至少为50个核苷酸)，或其至少具有杂交核酸长度的1％(更优选至少为25％、或至少为50％、或至少为70％、且最优选至少为80％)的长度，其与杂交核酸至少应有50％(更优选至少为70％、至少为75％、至少为80％、至少为85％、至少为90％、至少为95％、至少为97.5％、或至少为99％、且最优选至少为99.5％、)的序列同一性。此处的序列同一性如上述详细记载，可通过比较使重复部分与同一性最大化的同时，使序列缺口最小化地联配的杂交核酸序列来测定。

核酸同一性的百分数可通过视觉观察及数学计算测定。或2个核酸序列同一性的百分数可通过目测观察及数学计算测定，或更优选此比较可通过使用计算机·程序比较序列信息来进行。优选代表性的计算机·程序可为遗传学计算机·小组(GCG；威斯康星州麦迪逊)的威斯康星·软件包、型号10.0程序的“GAP”(Devereux等、1984、Nucl.Acids Res.12：387)。使用此“GAP”程序，除可进行2个核酸序列的比较以外，还可进行2个氨基酸序列的比较、核酸序列与氨基酸序列的比较。此处的“GAP”程序优选补缺值参数：包含(1)有关核苷酸的(包含同一物为1及非同一物为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG实行，和如Schwartz及Dayhoff主编的《多肽序列及结构图谱(Atlas of Polypeptide Sequence及Structure)》国立生物医学研究财团、353～358页、1979中的记载的，Gribskov及Burgess，Nucl.Acids Res.14：6745，1986的加权氨基酸比较矩阵；或其他的可比较的比较矩阵；(2)氨基酸各空位的30个罚分和各空位中对各记号追加的1个罚分；或核苷酸序列的各空位的50个罚分和各空位中对各记号追加的3个罚分；(3)对end空位无罚分：及(4)对长空位无最大罚分。本领域技术人员使用的其他序列比较程序均可使用，例如国立医学图书馆的网页：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html中可利用的BLASTN程序、型号2.2.7或UW-BLAST2.0算法。对于UW-BLAST2.0的标准的补缺值参数的设定，如以下网页http：//blast.wustl.edu中记载。特别是BLAST算法使用BLOSUM62氨基酸打分矩阵，可使用的选择参数如下：(A)包含为掩盖具有低组成复杂性的查询序列的区段[Wootton及Federhen的SEG程序由(Computersand Chemistry，1993)测定；也可参考Wootton及Federhen，1996《序列数据库中组成偏重区域的分析(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)》Methods Enzymol.266：544-71]，或含有短周期性内部重复的区段[由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序分析)的过滤(filter)，以及(B)为报告对数据库序列拟合的统计学上的显著性阈值，或根据E-分数(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，单纯偶然发现的拟合的期望概率；比由某个拟合引起的统计学上的显著差异E-分数阈值大时，不报告此拟合；优选E-分数阈值的数值为0.5，或优选按增加的顺序，为0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、或1e-100。

同样，本发明的核酸包含虽因1个或多个碱基的缺失、***或取代，而与序列号2、4、6的碱基序列不同，但聚谷氨酸合成酶A，B及C3种具有产生聚谷氨酸的功能的核酸。只要有产生聚谷氨酸的功能，对缺失、***或取代碱基的数量无特别限制，但优选为1个至数千个、更优选为1个至1千个、特别优选1个至500个、更特别优选1个至200个，最优选1个至100个。

将既定的氨基酸，例如可用具有同样物理化学特性的残基取代。如此保存的取代的例子中，包含将1个脂肪族残基相互取代，例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代；Lys及Arg、Glu及Asp、或Gln及Asn间从1个极性残基向其他残基的取代；或用芳香族残基以外的残基的取代，例如Phe、Trp或Tyr的相互取代。其他的保存的取代，例如，具有同样疏水特性的区域全部的取代是众所周知的。本领域技术人员通过众所周知的遗传工程的方法，使用Sambrook等(2001)(上述)等中记载的，例如定位诱变法，可进行所需的缺失、***或取代。

因此，本发明方法的一个形态中，聚谷氨酸合成酶A具有序列号1或序列号1中1个或多于1个的氨基酸残基缺失、附加或取代的氨基酸序列，聚谷氨酸合成酶B具有序列号3或序列号3中1个或多于1个的氨基酸残基缺失、附加或取代的氨基酸序列，聚谷氨酸合成酶C具有序列号5或序列号5中1个或多于1个的氨基酸残基缺失、附加或取代的氨基酸序列，并且，该聚谷氨酸合成酶A、B、C3种具有产生聚谷氨酸的功能。

核酸向植物体的导入

在本发明中，把编码聚谷氨酸合成酶的核酸A、B及C导入植物的方法无特别限定，可根据植物的种类使用公知的方法。通过基因工程的方法进行转导时，可使用任何适合的表达***。重组表达载体包含在适当的转录或翻译控制核苷酸序列，例如在来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因等上连接的，包含导入植物的编码聚谷氨酸合成酶的核酸A、B及C的核酸，并使其起作用。

控制序列包含例如转录启动子、操作子或增强子、mRNA脂质体结合位点以及调节转录及翻译起始及终止的适当的序列。核苷酸序列是在控制序列对该DNA序列有功能地相连时连接，并可发挥作用。所以，启动子核苷酸序列是只要该启动子核苷酸序列调节DNA序列的转录，就能在DNA序列连接，并可发挥作用。在植物中给予复制能力的复制起点及鉴定转化体的选择基因，一般被掺入在表达载体中。选择性标记可通过通常方法使用常用的标记。例如，四环素、氨苄青霉素、或卡那霉素或新霉素、潮霉素或壮观霉素等的抗生物质抗性基因等。

特别是，可将根据需要编码适当的信号肽(野生型或突变型)的序列掺入表达载体中。使信号肽(分泌前导leader)的DNA序列融合到阅读框内的核酸序列，DNA首先转录，且mRNA可翻译到含有信号肽的融合蛋白质上。

将在基因的DNA片段整合到质粒等载体上的方法，例如可例举为Sambrook，J.，and Russell，D.W.(2001).Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的方法。未简便起见，可使用市场销售的ligationkit(例如宝酒造制等)。如此得到的重组载体(例如重组质粒)导入宿主细胞的植物中。

载体可通过在本领域可容易获得的重组载体(例如质粒DNA等)中，利用通常方法连接所需基因以进行制作。使用本发明申请的核酸向植物转化时，植物转化用载体特别重要。只要具有在植物细胞中表达该基因，生产该蛋白质的能力，对植物用载体无特别限定，例如，可例举为pBI221、pBI121(以上为Clontech公司制)、及从中派生的载体。另外，特别是在单子叶植物的转化中可例举为pIG121 Hm、pTOK233[以上Hiei等，Plant J.，6，271～282(1994)]、pSB424[Komari等，Plant J.，10，165～174(1996)]等。

转基因植物可由在上述载体的β-葡糖醛酸苷酶(GUS)基因位点上替换本发明申请的核酸片段，以构建植物转化用载体，并将其导入植物中来调整。植物转化用载体最好至少包含启动子、翻译起始密码子、所需基因(聚谷氨酸合成基因A、B或C的核酸序列或其一部分)、翻译终止密码子及终止子。另外，也可适当含有编码信号肽的DNA、增强子序列、所需基因的5’侧及3’侧的非翻译区域、选择性标记等。只要启动子、终止子在植物细胞中起作用，对其并无限制，但作为组成性表达的启动子，除可例举为预先整合在上述载体的35S启动子外，还有肌动蛋白、泛素基因的启动子等。

本说明书实施例2中使用的pB1121载体，带有在植物细胞内高水平组成性表达导入基因的来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，导入的pgsB由RT-PCR证明了的RNA转录。同时，为筛选向植物体的载体导入，在pBI121中通过NOS启动子调节下的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因，赋予Kan抗性。Yenofsky等(1990)报道了因pBI121的NPTII基因中存在点突变，所以Kan抗性弱。但是，本发明中用100μg/ml的卡那霉素可容易地进行筛选，所以可毫无问题地使用pBI121载体。

将质粒导入宿主细胞的方法一般的可例举为Sambrook，J.等(2001)(上述)记载的磷酸钙法或氯化钙/氯化铷法、电穿孔法、电子注射法、PEG等化学处理的方法及基因枪法等的方法等。

特别是向植物体的基因导入法可例举为使用农杆菌的方法[Hieiet al.，Plant J.，6，p.271～282(1994)、Komari et al.，Plant J.，10，p.165～174(1996)]、电穿孔法、PEG法、显微注射法、themicrocollision method等。只要是向所需植物中导入核酸的方法均无特别限制。

本发明中优选使用农杆菌法。更具体地说，通过感染含有***了编码聚谷氨酸合成酶A的核酸(pgsA)、编码聚谷氨酸合成酶B的核酸(pgsB)及编码聚谷氨酸合成酶C的核酸(pgsC)中1种或多于一种的核酸的载体的农杆菌，向植物中导入上述核酸。

更优选pgsA、pgsB及pgsC3种核酸向植物体的导入，可通过以下a)到c)的任一过程进行。

b)使具有分别***了pgsA、pgsB及pgsC的载体的3种农杆菌感染植物；或

C)使具有分别***了pgsA、pgsB及pgsC的载体的农杆菌感染植物，育成具有pgsA、pgsB及pgsC中1种或2种的转基因植物，并使这些转基因植物杂交。

本发明的方法也包含b)过程的改变，例如使***了pgsA、pgsB及pgsC中2种(例如pgsA+pgsB)的载体，和***了剩余的1种(例如pgsC)的载体的2种农杆菌感染到植物的形态。

本发明的方法也包含c)过程的改变，例如首先使具有***了pgsA、pgsB及pgsC中2种，(例如pgsA+pgsB)的载体的农杆菌感染到单一植物上，育成具有pgsA、pgsB及pgsC中2种(例如pgsA+pgsB)的转基因植物，同时使具有***了剩余1种(例如pgsC)载体的农杆菌感染植物，育成具有剩余1种(例如pgsC)的转基因植物，并使两者的转基因植物杂交的形态。育成具有2种核酸的转基因植物时，可使用含有2种核酸的载体，或也可使具有各自载体的2种农杆菌感染同一植物。

本发明的方法中，优选利用过程a)，即pgsA、pgsB及pgsC3种核酸全部***同一载体的形式。

并非限定，使用农杆菌向植物中的***基因的一般方法，例如可如下西等、新·生物化学实验入门3、(122-124页、化学同人、1996年)、Hiei et al.，Plant J.，6，p.271～282(1994)、Komari et al.，Plant J.，10，p.165～174(1996)等中所述。

首先需制成含有欲***的所需核酸片段的质粒载体。其质粒载体可使用例如SB11、pSB22、pBI121[Jefferson etal.，(1987)GUS fusion：β-glcosidase as a sensitive and versatile gen fusion marker in higher plants.EMBO J.6，3901～3907]、pSPB176(日本特开2003-432383)、pSPB541(日本特开2003-420046号公报)、pSFL203(日本特开2003-420046号公报)等。或本领域技术人员可以上述质粒载体为基础，自行构建适当的载体。之后，使用含有***核酸的重组载体转化大肠杆菌(例如DH5α、JM109、MV1184等，所有的均可从例如TAKARA公司购入)。

进一步，使用转换了的大肠杆菌，将农杆菌菌株优选与辅助大肠杆菌菌株同时，根据例如Ditta et al(1980)的方法，进行三亲杂交(tri-parental mating)。并非限定，农杆菌可使用例如Agrobacterium tumefaciens菌株LBA4404/pSB1、LBA4404/pNB1、LBA4404/pSB3等。所有的在上述的Komari et al.，Plant J.，10，p.165～174(1996)中均记载了质粒图谱，本领域技术人员例如可通过自行构建载体来使用。并非限定，辅助大肠杆菌例如可使用DH1、pRK2013(可由Clontech公司获得)等。另外，虽不属于一般情况，也有可将保有pRK2073的大肠杆菌作为辅助大肠杆菌使用的报道。

本发明中，农杆菌感染植物可使用公知的方法进行。优选从含有叶盘法[松本及町田(1990)植物转化法、现代化学、25～29]、真空渗透法[荒木(2001)利用真空渗透法转化、细胞工程别册植物细胞工程系列15、109～113]、以及直接注入法[大隅(2001)农杆菌直接注入法、细胞工程别册植物细胞工程系列15、105～108]的群中，根据转化植物等的需要适宜选择。最优选使用叶盘法(实施例14)。

本说明书实施例中使用烟草的转化，一般使用叶盘法。并有此方法中，使用茄科、十字花科、豆科、菊科、锦葵科、伞形科、杨柳科等较容易获得转化个体的报道(Horsch et al.1988)。在本说明书中的实施例中，可发现每1叶切片有1.5～2个左右的Kan抗性个体的再生。再生个体中可看出约30％有异常茎叶体的形成，但与正常再生个体相比，异常再生体的生长速度慢，移植时可除去，所以对转基因植物的育成无影响。另外，因为此异常茎叶体在作为对照的用带有GUS基因的pBI121进行转化时也同等频率地出现，所以其不是由导入基因形成的表现型，而是由体细胞再生时会一定频率出现的形态异常。并且再生芽向新的培养基、或无激素培养基中移植后的生长，其形态、速度与对照转化体基本相同，至少未看出由于各自基因的导入而产生的变化。

将农杆菌注入烟草植物的展开叶中时，在叶肉细胞中导入的基因会瞬时进行基因表达(Johansen and Carrington2001)。此报道中指出，注入持有不同基因的农杆菌时，也许因一个叶肉细胞中导入了感染有复数个农杆菌的基因，所以可表达复数个基因的效果。

在本说明书的实施例中，虽使用真空渗透法向拟南芥进行基因导入，但在出现数枚玫瑰花结状叶的阶段，除叶片的宽度略比野生株的窄以外，未发现其他的形态异常。

聚谷氨酸合成酶A、B及C基因及/或聚谷氨酸表达的确认

由本发明的方法育成的转基因植物中，聚谷氨酸合成酶A、B及C基因及/或聚谷氨酸表达的鉴定可使用公知的方法进行。

聚谷氨酸合成酶A、B及C基因表达的鉴定可使用核酸扩增的方法进行。优选3种基因中2种或以上，更优选3种基因全部的表达被鉴定。

核酸扩增反应包含例如聚合酶链反应(PCR)[Saiki R.K.，et al.，Science，230，1350～1354(1985)]、连接酶链反应(LCR)[Wu D.Y.，et al.，Genomics，4，560～569(1989)]及以转录为基础的扩增[KwohD.Y.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，1173～1177(1989)]等需温度循环的反应，以及链替代扩增反应(SDA)[Walker G.T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，392～396(1992)]、自主序列复制(3SR)[Guatelli J.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，1874～1878(1990)]及Qβ复制酶扩增***[Lizardi等、BioTechnology 6，p.1197～1202(1988)]等的恒温反应。另外也可利用欧洲专利第0525882号中所述通过靶核酸与突变序列的竞争扩增的以核酸序列为基础的扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification：NASABA)反应等。优选PCR法。

PCR法可利用以从聚谷氨酸合成酶A、B及C基因的编码区域或其附近区域的碱基序列中选择的、约14至约30个碱基序列为基础育成的引物，例如可以从转基因植物的叶、愈伤组织等中提取的RNA为模板来进行(RT-PCR)。作为内部对照，可将用于转化的植物野生型中一般大范围表达的基因，例如，烟草的泛素基因、肌动蛋白基因等的表达作为指标。优选在本发明育成的转基因植物中，聚谷氨酸合成酶A、B及C基因在RNA水平上为内部对照基因的1/10或大于1/10、1/5或大于1/5、1/2或大于1/2、与内部对照基因同等程度、2倍或以上、5倍或以上表达。

在使用本发明的方法育成的转基因植物中，聚谷氨酸表达的鉴定可使用公知的方法进行。聚谷氨酸在溶液中分泌时，可通过加水分解的谷氨酸的HPLC分析(Aschiuchi et al.1999)，或使用亚甲蓝染色的SDS-PAGE(Yamaguchi et al.1996)进行检测。

在本发明中，期望在转基因植物的组织内生物合成PGA。因此，不需分离来源于植物的细胞壁成分及蛋白质等，检测生物合成的PGA时，优选使用免疫化学的方法检测。例如，并非限定，包含使用识别PGA的多克隆抗体(抗血清)或单克隆抗体的Western分析[斑点印迹、原位(in situ)印迹法]等。

使用PGA，可通过通常方法制作识别PGA的多克隆抗体(抗血清)。例如，可将RIBI佐剂(MRL+TDM乳液)、韦氏完全佐剂或不完全佐剂、或明矾等的辅佐剂的混合物，作为免疫用抗原，通过动物免疫得到PGA。免疫动物可使用该领域常用的动物，例如可例举为小鼠、大鼠、兔子、山羊、马等。免疫可一次或适当间隔、优选1星期至5星期间隔多次进行。

在本说明书的实施例中，将粘性低且不易引起肿胀的RIBI佐剂与PGA混合，每隔2星期通过皮下注射反复向小鼠投药，配制多克隆抗体(实施例11)。

识别PGA的单克隆抗体也同样可通过公知方法制作。制造单克隆抗体时，至少需下述的操作过程。(a)作为免疫用抗原使用的邻苯二甲酸酯半抗原与高分子化合物结合体的制作；(b)动物免疫；(c)血液的采取、测定、及抗体产生细胞的配制；(d)骨髓瘤细胞的配制；(e)抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合及杂交瘤的选择性培养；(f)产生目的抗体的杂交瘤的筛选及细胞克隆；(g)通过杂交瘤的培养或向动物移植杂交瘤，制备单克隆抗体；以及(h)已制备的单克隆抗体反应性的测定等。

制作产生单克隆抗体的杂交瘤的通常方法，例如，如杂交瘤技术(Hybridoma Techniques)、美国冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory，1980年版)中记载。利用了抗体的PGA的免疫化学的检测可根据公知方法进行。

在下述的本实施例中，曾尝试通过斑点印迹法检测PGA，但由于当初获得的抗血清的效价低，未能检测出在硝酸纤维素膜上直接转移的PGA。因此，开发了使用可溶性碳化二亚胺EDC[1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐]与BSA偶联，通过BSA结合于膜上的方法。

由本发明育成的转基因植物与非基因导入植物(非转基因植物)相比，是产生、积累了统计学上有显著差异的PGA的植物。PGA是原本植物中不能产生的物质，本发明的转基因植物即使只产生极微量的PGA，与非转基因植物相比也能期待其可起到有益的作用。例如，可使用上述免疫化学的方法检测出PGA的产生。

并非限定，通过本发明育成的转基因植物与非基因导入植物(非转基因植物)相比，可检测出1.5倍、优选为2倍、更优选为3倍、特别优选为5倍、最优选为7倍的PGA的产生。

转基因植物

本发明还提供通过本发明的方法育成的产生聚谷氨酸的转基因植物，并以此为目的。

通过本发明的方法获得的植物的种类无特别限定。优选从含有烟草、拟南芥、稻、黄豆、百脉根、矮牵牛、蓝猪耳以及番茄的群中选择。更优选从含有烟草、拟南芥、稻、黄豆及百脉根的群中选择。最优选为烟草或拟南芥。

本发明中对转基因植物的状态无特别限定。优选为成体、种子或愈伤组织的任一状态。更优选成体。

实施例

以下通过实施例具体说明本发明，但其不限定本发明的技术范围。本领域技术人员根据本说明书的记载，可容易地对本发明加以修饰·变更，其也包含于本发明的技术范围内。

实施例1PGA合成基因的分离

本实施例中，从纳豆菌中分离了合成PGA的3种基因(PGA合成基因)pgsA、pgsB及pgsC。

首先，将市场销售的纳豆1粒放入1ml的蒸馏水中，剧烈搅拌调配纳豆菌的悬浮液。在1μl悬浮液中，加入Advantage cDNA polymerase Mix 0.2μl、10×polymerase buffer 1μl、DNTPs(2mM dATP dCTP dGTP dTTP each)1μl、pgsA、pgsB、pgsC分别为50μM的正向引物、反向引物(序列号7-12)总共0.5μl，用灭菌水补足，使总量达10μl，进行94℃2分钟1次、94℃30秒、59℃30秒、72℃60秒的PCR循环33次，再进行72℃5分钟的延伸。

加入6×Loading Dye 2μl，用凝胶板(1×TAE2％、AgaroseS)进行电泳后，浸入溴化乙锭溶液(0.2μl/ml)中30分钟，切下用UV可观察到扩增带部分的凝胶。

加入为凝胶重量3倍或大于3倍的洗脱液(NaI：Sodium Iodide)，50℃下放置10分钟。凝胶全部溶解后，加入5μl涡流混合后的Glass milk，缓慢回转搅拌的同时放置30分钟(或凝胶的量少时，也可用手振动5分钟)。15,000转速离心1分钟后，弃上清。加入New Wash(乙醇与水的混合物)180-200μl，用移液管混合，15,000转速离心1分钟后，弃上清，重复3次此操作。50℃下干燥沉淀20分钟。再加入15μl蒸馏水，15,000转速离心1分钟后，回收上清。进行同样操作，得到20μl的DNA溶液。

实施例2向DNA片段序列测定用载体的整合

本实施例中，为进行序列分析，将从琼脂糖凝胶中纯化的***DNA(PgsA、PgsB、PgsC各种)整合到pGEM-T EasyVector[普洛麦格(Promega)公司制]。

***DNA通过Taq聚合酶的作用附加A突出端。因此，载体DNA需补平末端，再进一步附加粘性末端(-T)。因普洛麦格公司制并于市场销售的pGEM-T Easy Vector已进行了上述处理，所以可直接用于以下的克隆。

对于载体DNA 0.5μl，加入2×ligation buffer 5μl、***DNA 3.5μl、T4 DNA ligase1μl，使总量达10μl，置于4℃下反应过夜。反应后，将250μl感受态细胞加入到经连接了的反应液中并轻微混合，静置于冰上20分钟。之后，进行42℃、50秒的热休克后，立即放回冰上静置2分钟。在其样品中，加入SOC培养基(2％胰蛋白胨、5％酵母浸出物、10mM NaCl、2.5mM KCl、20mM MgCl₂、20mM葡萄糖、pH 7.0)，充分搅拌，在37℃下、一定间隔时间颠倒混合，培养90分钟。在LB琼脂培养基(Φ95mm；1.5％琼脂、1％细菌培养用胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、5mM NaCl、pH 7.0、200μg/ml氨苄青霉素、0.4mM IPTG、50μg/ml X-Gal)中接种200μl的转化后的大肠杆菌，于37℃下过夜培养。从其平板培养皿上生长的菌落中进行蓝/白选拔，为确定在白色或浅蓝色的菌落中是否真正存在***片段，将载体中含有的序列T7和Sp6-2(序列号13，14)作为引物进行了PCR。

实施例3***DNA的碱基序列分析

本实施例中，对整合进pGEM-T Easy Vector的PGA合成酶基因的DNA碱基序列进行了测定。详细地说，为进行PCR后，首先将经电泳确认了扩增带的菌落5ml悬浮于LB培养基中，37℃培养过夜。将培养液离心、集菌、使用MagExtractor-Plasmid-Kit进行纯化DNA、测序。

首先在大肠杆菌团粒中加入150μl的再悬浮液，用移液管充分悬浮。之后加入150μl的溶解液，将离心管颠倒搅拌，在冰上静置5分钟。加入120μl的中和液，将离心管颠倒搅拌，再在冰上静置5分钟。进行20,000×g、5分钟离心，并将上清移入其它的离心管中。在其离心管中加入500μl吸附液，30μl的磁珠II，搅拌60秒后，将离心管固定于磁性表座(the magnetic stand)上，使磁珠靠近磁石，轻摇磁性表座，使附在盖上的溶液落下。用移液管去除上清。加入70％乙醇720μl，搅拌30秒后，再与上述同样在磁性表座上去除上清。重复2次此操作。加入99％乙醇500μl，搅拌30秒后，20,000×g离心1分钟。用磁性表座去除上清后，在37G下、干燥磁珠1小时。加入洗脱液50μl，搅拌60秒后，20,000×g离心5分钟，用磁性表座回收40μl上清，作为以下的质粒样品使用。

使用Thermo sequenase Cycle Sequencing Kit(USB Corporation)，配制解读序列用的序列试剂。在1个质粒样品5.55μl中，加入ReactionBuffer 1μl、10mM T7-Cy5引物(序列号13)0.6μl、10mM SP6-2Cy5.5引物(序列号14)1μl、Thermo Sequenase DNA polymerase 0.85μl，充分混合后，各2μl分装到4支0.5ml的微量离心管中，在其中各加入2μl ddA Termination Mix、ddT Termination Mix、ddG Termination Mix、ddC Termination Mix，使总量达4μl，并充分混合。铺上石蜡油后，将其置于95℃下预热2分钟，再进行95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟的反应60个循环。反应后，加入3μl的Loading Dye，用75℃温育2分钟后，在冰上充分冷却。将其作为序列测定用试剂放入序列分析仪(Long Read Tower^TM DNA序列分析仪；Amersham)中，解读序列。

pgsA、pgsB、pgsC的碱基长度分别为1149、1185、461bp，编码了380、393、153氨基酸长度的多肽(图1-3)。均与用Bacillus subtilis IFO3336株(Bacillus natto)报道的序列基本完全一致(Ashiuchi et al.1999)。通过SOSUI算法(SOSUI：http//：sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp)，可预想pgsA、pgsB、pgsC多肽分别有1、1、5处的跨膜结构域(图1-3的框内部分)。另外，从模体鉴别(PROSITE PS00061，http：//motif.genome.ad.jp/)中，也证明了pgsBの56～63氨基酸部分中有ATP/GTP结合位点模体的存在(图2的有下线的部分)。

实施例4转化用载体(pBI121)的构建

进行实施例3的序列测定后，在本实施例中为导入农杆菌制成转化植物用的载体，将***DNA(PgsA、PgsB、PgsC分别)从用实施例2制成的pGEM-T Easy Vector转移到pGEM(T-BH)ΔSSS载体，之后再转移到pBI121载体。

首先，在实施例2的pGEM-T Easy Vector DNA溶液8μl中，加入High Buffer 1μl、限制性内切酶EcoRI 1μl，制成10μl，在37℃下反应2小时。之后，为进行连接，与上述同样提取纯化DNA。在用限制性内切酶切割的***DNA 6μl中，加入2×ligation buffer 1μl、DNA ligase 1μl、同样用EcoRI切割后脱磷酸化的pGEM(T-BH)ΔSSS载体2μl，使总量为10μl，再在4℃下反应过夜。

在250μl感受态细胞中加入连接后的反应液进行转化，在加入了SOC培养基的LB琼脂培养基中接种，37℃培养过夜。从其平板上长出的菌落中进行蓝/白选择，为鉴定，将T7和pgsA、pgsB、pgsC各自该当部位的反向作为引物进行PCR，选择T7侧***了基因的正义序列5’側的结构。

其次将用PCR、电泳确认的该菌落在LB培养基上增殖，纯化质粒DNA。在提取的DNA 40μl中加入Low Buffer 5μl、限制性内切酶SacI 5μl，使总量达50μl，再于37℃下反应2小时。进一步在此样品50μl中加入High Buffer10μl、限制性内切酶BamHI 5μl，使总量达100μl，再于37℃下反应2小时。之后通过电泳分离用SacI、BamHI切割的***片段，与上述同样提取DNA。在用限制性内切酶切断了的DNA7μl中加入2×ligation buffer 2μl、DNAligase 1μl、同样用SacI、BamHI切断的pBI121 10μl，使总量达20μl，于4℃下反应一夜。反应后，对于连接后的反应液，把250μl感受态细胞中加入了SOC培养基后的物质，接种于含有抗生物质卡那霉素的LB琼脂培养基中，37℃下培养过夜。为确认其平板上生长的菌落，将pBI-L与pgsA、pgsB pgsC的各自该当位点的反向作为引物，分别进行94℃2分钟1次、94℃30秒、66℃30秒、72℃60秒5次、94℃30秒、63℃30秒、72℃60秒5次、94℃30秒、59℃30秒、72℃60秒28次的PCR。

实施例5向农杆菌的导入

通过与接合传递用的辅助大肠杆菌共存，使大肠杆菌中的载体向农杆菌转移。

首先在含有100μg/ml卡那霉素的3ml的LB液体培养基中，悬浮上述经PCR、电泳确认了转化的大肠杆菌的菌落。振荡培养过夜后，分取200μl进行离心(9,000×g、1分钟)。去除上清，加入LB液体培养基200μl后再进行2次离心操作，除去抗生物质。在此样品20μl中加入同样配制的辅助大肠杆菌(DH1、pRK2013株)20μl、农杆菌悬浮液(LBA4404株)20μl，搅拌后在LB琼脂培养基中接种。在28℃下培养过夜。将制成的菌落在LB琼脂培养基1ml中悬浮。将此样品在LB液体培养基中稀释500倍后，涂布于含有100μg/ml卡那霉素、100μg/ml链霉素的LB琼脂培养基上，在28℃下培养2夜。进行PCR、电泳，鉴定导入农杆菌的DNA。

实施例6通过叶盘法感染植物体

以烟草为材料，使用叶盘法，使导入了靶DNA的农杆菌感染植物体。真核生物与原核生物不同，ORF以各自的mRNA表达，其操纵子的形态不能合成蛋白质，所以需将各自的基因分别导入不同的植物体中，再通过杂交以期培育具有复数个基因的植物体，因此试育了转化植物。

首先使1cm左右方块的烟草切片浮在蒸馏水上后，将叶的内侧向上，放入含有1μg/ml BA、0.1μg/ml NAA的MS琼脂培养基(1×MS培养基、3％蔗糖、0.8％琼脂)中，用外科胶带加封，置于25℃下培养3日。将切片移入茶叶篦子上，在用含有100μg/ml卡那霉素、100μg/ml链霉素的LB液体培养基、28℃下振荡培养过夜的实施例5的农杆菌悬浮液中浸入3分钟。再将切片移入含有1μg/ml BA、0.1μg/ml NAA的MS琼脂培养基中，用外科胶带加封后，暗室培养3日。移入含有1μmol/ml BA、0.1μg/ml NAA和200μg/ml卡那霉素、300μg/ml羧苄青霉素的MS琼脂培养基中。用外科胶带加封后，8/16小时的光暗周期下培养2～3星期。

将叶切片置于Kan培养基中，经大约3星期的光暗条件的培养时，从切片的切口处及操作中张开的孔穴中，可发现多数菌落的形成。因出现了部分呈绿色、认为是Kan抗性的菌落，所以切下此部分，在Kan培养基中进一步培养。

选择长出绿色小芽的个体，切除芽周围的愈伤组织和叶片后，再移入含有1μmol/ml BA、0.1μg/ml NAAと100μg/ml卡那霉素、300μg/ml羧苄青霉素的MS琼脂培养基中，用外科胶带加封。在放入了含有100μg/ml卡那霉素、150μg/ml羧苄青霉素的MS琼脂培养基的管状瓶(Φ39mm)中，移入切除了愈伤组织部分的个体，培养至出根。移栽入土中，覆盖塑料薄膜放置数日后，除去塑料薄膜进行培育，回收种子。

详细地说，因从导入了pgsA、pgsB的愈伤组织中再生出复数的绿色的芽，所以将其移入不含激素的培养基中促其发根。在导入了pgsB的芽中确认了发根。对于pgsC导入，确认了有Kan抗性菌落的出现和认为是抗性芽的结构。导入了pgsA、pgsB时，虽出现了显示异常形态的芽，但在导入作为对照的pBI121时也有发现，所以认为是由愈伤组织再生植物时一般可见之暂时现象，事实上，从一旦完全再生的芽中并未形成显示异常的器官。

从Kan抗性愈伤组织的发育中，为鉴定通过叶盘法导入了pgsB基因的烟草愈伤组织中pgsB基因的表达，根据下述实施例10的方法进行了RT-PCR。

在逆转录中，使用具有与mRNA的poly(A)链互补的oligo(T)的CDS-PRIM(序列号15)。同时，为确认不是以混合存在的DNA为模板的PCR，使用RNase处理的RNA作为阴性对照进行逆转录。使用pgsB的正向及反向引物(序列号9，10)作为PCR的引物扩增时，在所有的泳道中均观察到了扩增带。这是因为有较多量的DNA混合存在而进行的PCR扩增，所以，以pgsB正向引物和与CDS-PRIM的5’侧部分中相同的SMART-PR(序列号16)作为引物进行PCR扩增时，RNase处理的RNA的逆转录产物不扩增，而未经RNase处理的RNA的逆转录产物可确认显示了与用量有依存关系的信号的扩增带。从中可证明，导入了pgsB基因的烟草叶片及愈伤组织中，pgsB基因的mRNA进行了表达。

实施例7通过真空渗透法感染植物体

以拟南芥为材料，使用真空渗透法使导入了靶DNA的农杆菌感染植物体。具体地说，尝试了使农杆菌浸润·感染到Arabidopsisthaliana Col的花序上，用在种子形成初期的细胞中直接导入基因的方法导入PGA合成基因。

首先，在盖网的土壤中播种拟南芥种子，当花茎高度达数厘米时，为使其高度一致，在一定高度进行摘心，去除小花芽。使盆内土充分吸水，继续培养1星期，使花茎再次伸长。摘除已开了的花。将在含有100μg/ml卡那霉素、100μg/ml链霉素的L B液体培养基28℃下、振荡培养过夜的实施例5的农杆菌的悬浮液集菌，在悬浮用培养基(1/2MS盐、1/2 Gamborg B5维生素、5％蔗糖、0.5g/l MES、BAP 10ml/l、0.02％ Silwet L-77)中悬浮，使OD600达到0.8。分取在400ml烧杯中，将盆倒置使植物体浸入悬浮液。放入干燥器，10分钟减压放置。之后去掉多余的悬浮液，横放在盘中，在盘中滴下少量的蒸馏水、盖上覆盖物放置1日。去除覆盖物，将盆立起，1星期不浇水培育后，用稀释了1000倍的花宝(HYPONeX)进一步培养2-3星期。收获角果，与硅胶袋一起放置，收获其中的种子。将80～100μl的干燥种子置于70％乙醇中2分钟，放置于5％次氯酸钠0.1％Tween 20中15分钟，用灭菌水清洗3-5次后，悬浮于0.1％琼脂水溶液(无菌)9ml中。在含有100μg/ml卡那霉素、100μg/ml羧苄青霉素的选择培养基(MS盐、Gamborg B5 vitamin、1％蔗糖、0.5g/l MES、0.8％琼脂)中摊开，用外科用胶带加封，于4℃静置1星期。之后在24℃下培养1星期，将抗性植物移入与上述同样的选择培养基中。真叶展开5、6枚时，移入土壤中，收获种子。

因从pgsC试导入的植物采收的种子中，得到了在Kan培养基上生长的具有绿色子叶·真叶的新芽，所以现正使用蛭石进行培养。对于pgsA及pgsB，正处于选择抗性植物的过程中。

实施例8通过直接注入法感染植物体

在本实施例中，以烟草为材料，使用直接注入法使导入了靶DNA的农杆菌感染植物体。已知在丁香酮(syringone)存在下培养的农杆菌注入烟草叶中时，感染叶肉细胞并瞬间表达导入基因(Johansen and Carrington 2001)。此方法证明，一个植物细胞中可感染复数的农杆菌，使不同的基因同时导入·表达，所以，本研究通过使分别具有pgsA、pgsB、pgsC的农杆菌同时感染植物，检测其能否瞬间在叶肉中同时表达。

首先将用含有100μg/ml卡那霉素、100μg/ml链霉素、20μM乙酰丁香酮的L B液体培养基28℃下，振荡培养过夜的实施例5的农杆菌悬浮液集菌，将10mM MgCl₂、10mM MES(pH 5.7)、150μM乙酰丁香酮再悬浮，使OD₆₀₀为0.5。常温培养3小时后，在烟草的叶片中用注射针扎孔，用1ml结核菌素注射器注入叶肉中。3日后，切离回收叶片，在-80℃冷冻保存后，用于下述的RNA提取。另外，将其叶片用经液氮冷却的研钵细心研磨，放入15ml TUBE中，再加入100mM MES(pH 4.5)3ml。将其移入1.5ml微量离心管，2,000×g、4℃、离心10分钟，分开上清和沉淀。将上清保存于-20℃，沉淀部分中加入100mMMES(pH 4.5)150μl，在-20℃保存，用于下述的PGA检测。

在烟草叶上用注射针扎孔，用注射器以pgsA+pgsB、pgsB+pgsC、pgsC+pgsA、pgsA+pgsB+pgsC的组合注入农杆菌。3日后从叶中提取RNA，通过RT-PCR，鉴定导入基因中mRNA是否进行了转录。PCR引物，使用pgsA、pgsB、pgsC的正向引物(序列号分别为7、9、11)与用于逆转录的引物的一部分具有同源性的SMART-PR(序列号16)。在电泳中，只观察到弥散条带(smear)，而未得到预想分子量的扩增带。

使用由下述实施例11制成的抗PGA多克隆抗血清鉴定了PGA有无生产。因当初配制的抗血清的效价低，所以未能检测出直接在膜上斑点印迹的PGA。因此，利用由EDC交联，BSA与各种蛋白质(包含PGA的检测)生成凝集物的性质，使用EDC，使烟草提取液中的PGA和BSA形成共价键。然后，通过离心分离上清和沉淀。

将各自等倍、1/10、1/100倍的交联体样品转移到膜上。通过使用ABC法进行免疫化学检测，可观察到等倍、1/10倍的沉淀部样品的浅色显色。

实施例9转基因植物的RNA提取

为检测通过实施例6～8转化的个体中导入基因的RNA表达，提取了RNA。

将转化了的个体的愈伤组织部分或叶片，用在经液氮冷却后的研钵细心研磨。然后加入RNA提取Buffer(100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 9.0)、10mM EDTA、3％ SDS)3ml、苯酚(0.5M Tris-HCl、pH 8.0饱和)1ml，于室温下振荡20分钟。之后加入氯仿∶异戊醇混合液1ml(v/v、24∶1)剧烈悬浮后，2,000×g、室温离心20分钟。注意不能吸入中间层的蛋白质沉淀的同时，将水相(上层)移入灭菌后的带盖离心管中，在其中加入1/3倍量的10M LiCl、50mMEDTA(pH 8.0)200μl，-20℃静置过夜。再用2,000×g、4℃、离心60分钟，完全除去上清后，加入沉淀2M LiCl、50mM EDTA(pH 8.0)1ml，-20℃静置1小时。再用2,000×g、4℃、离心60分钟，完全除去上清后，加入灭菌水400μl，溶解沉淀，将溶液移入1.5ml的微量离心管中。根据苯酚·氯仿提取法，进行核酸的纯化。加入3M乙酸钠(pH 5.2)20μl、99％乙醇1ml，充分混合后，-20℃静置过夜。15,000rpm、4℃、离心30分钟，将产生的沉淀用70％乙醇洗涤后，完全去除乙醇，将沉淀风干后，加入50μl灭菌水使其溶解。

实施例10检测RNA表达的RT-PCR法

为检测导入基因的表达，以如上提取的RNA为模板，进行RT-PCR法。

首先为测量溶液中RNA的量，将1μl溶解于1ml的灭菌水中，再用分光光度计测量吸光度。A₂₆₀＝20时，将RNA的量作为1mg/ml计算浓度。

其次为进行RNA的逆转录，在RNA 2μl(5mg/ml)中加入CDS prim(序列号15)1μl，使总量为5μl，轻微离心后，进行95℃下5分钟的预热。于50℃冷却后，加入dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM)10μl、5×RT Buffer 4μl、RNA抑制剂0.5μl、transcriptase ReverTraAce(TOYOBO)1μl，再于50℃、60分钟温育。

在制成的样品1μl中，加入rTaq polymerase 0.05μl、10×polymerase buffer 1μl、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM)1μl、25mM MgCl₂ 1μl、pgsA、pgsB、pgsC各自的10μM引物foward(序列号7、9、11)与10μM、SMART-PR 2M(序列号16)总共0.5μl，再用灭菌水使总量达10μl，进行94℃2分钟1次、94℃30秒、59℃30秒、72℃90秒的PCR循环33次，进行延伸。将此物与上述同样进行电泳，用UV鉴定扩增带。

实施例11使用小鼠的单克隆抗体的制作

为制成针对PGA的抗体，使用小鼠制作了单克隆抗体。

在干固的RIBI佐剂(MRL+TDM乳液)中，加入PBS(100mM podium phosphate、150μM NaCl pH 7.2)2ml，用回转板回转数分钟充分悬浮。在佐剂200μl中将PGA(PBS中10mg/ml)按1∶1(v/v)加入。第一次在用70％乙醇消毒后的小鼠的腹部2处进行皮下注射，各100μl。之后，每隔2星期在1处进行150μl皮下注射。第3次注射后一星期，切开小鼠的尾巴进行采血。将此血放置30分钟凝固，10,000rpm、离心10分钟。取上清，加入等量的PBS后作为抗血清用于以下实验。

实施例12PGA与BSA的结合蛋白质的配制

进行Western印迹法时，为使硝酸纤维素膜与PGA结合，使用EDC，配制与BSA的结合蛋白质。

将结合缓冲液(0.1M MES，pH 4.5)200μl中溶解的BSA 2mg与结合缓冲液500μl中溶解的PGA 2mg混合。

加入10mg/ml EDC[1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐]100μl，常温反应2小时。15,000rpm、离心1分钟，弃上清。将结合缓冲液用移液管混合，再离心，弃上清。重复3次此操作。加入PBS 1ml且充分悬浊后，作为PGA-BSA结合蛋白质用于实施例13的实验。

实施例13使用小鼠血清的PGA的免疫学检测

使用实施例11的血清和实施例12的结合蛋白质，通过ABC法进行斑点印迹。即，将天然的PGA作为抗原，与佐剂同时对小鼠反复进行皮下注射，并尝试将抗PGA血清的抗原抗体反应用斑点印迹法检测。

首先将硝酸纤维素膜切成适当大小，将用PBS稀释了1倍、10倍、100倍的PGA-BSA结合蛋白质转移到膜上，静置至干燥。将膜用UV照射30秒放入透析袋中，加入轻微离心的饱和酪蛋白500μl，封口室温振荡30分钟。从透析袋中去除酪蛋白，加入用酪蛋白稀释200倍的血清，封口室温振荡30分钟。之后，将从透析袋中取出的膜用加入了PBST(PBS中、0.1％ Tween20)3ml的Tupper洗膜5分钟，反复3次。在新的透析袋内放入膜，加入用酪蛋白溶液稀释的0.6％的2次抗体(在马中制成的生物素化万能性抗体)500μl，封口室温振荡30分钟。将从袋内取出的膜用加入了PBST 3ml的Tupper洗涤膜5分钟，反复3次。在新的袋内放入膜，加入预先将500μl的酪蛋白中混合抗生物素蛋白(ABC-AP REAGENT A)3μl和生物素化碱性磷酸酯酶(ABC-AP REAGENT B)3μl并静置30分钟后的产物，封口室温振荡30分钟。将从袋内取出的膜用加入了PBST 3ml的Tupper洗膜5分钟，反复3次。用放入了100mM Tris-HCl的Tupper洗膜5分钟，将膜放入新的袋内，加入用100mM Tris-HCl稀释了的1.2％(v/v)基质(BCIP、NBT、MgCl₂)500μl后，封口，置于暗处显色过夜。

开始时在膜上直接转移PGA，并反复数次实验欲检测出反应，但均未检测出信号。用酰胺黑染色探讨其原因时，认为是因当初抗体的效价低，加之PGA与膜的结合弱，操作中从膜中游离了。因此，用EDC使PGA与BSA以共价键式结合，通过BSA与膜结合时，在含有2.5mg/ml PGA的BSA复合体的2μl斑点上，观察到了强的信号。在0.25mg/ml PGA中观察到极弱的信号，而在0.025mg/ml PGA和阴性对照的2mg/ml BSA中未观察到信号。

最早使用的1次抗血清是抗原投给后第9星期的血清，其之前的血清中未发现信号。因PGA是可溶性的比较单纯的多肽，所以效价很难提高。为得到反应性高的抗血清，持续投给抗原(PGA)的结果，得到了效价高的抗血清，即使PGA和BSA不交联时，在膜上也可检测出信号。

实施例14在植物细胞中pgs基因组的功能分析

为明确上述三种聚谷氨酸生物合成酶基因(pgsA，pgsB，pgsC)在植物细胞中的功能，育出了三种pgs基因组成性表达的转化烟草(N.tabaccum)。

将含有实施例2中制成的各pgs基因的质粒载体(pGEM-T EASY，Promega公司)0.1ng作为模板，用以下的条件通过PCR进行扩增。PCR反应液(50μl)含有包含各pgs基因的质粒0.1ng、1×KOD plus buffer(TOYOBO)、0.2mM dNTPs、包含限制性内切酶酶切位点的引物(序列号17～22)各0.4pmol/μl、1mM MgSO₄、KOD plus DNA polymerase 1U。94℃反应5分钟后，进行94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟的反应30个循环。将此含有各pgs基因全长的扩增片段***到pCR-blunt II TOPO载体(Invitrogen公司)的多克隆位点上，得到TOPO-pgsA(pSPB2667)、TOPO-pgsB(pSPB2668)及TOPO-pgsC(pSPB2669)。通过primer walking法，鉴定这些亚克隆后的pgs基因的碱基序列，且通过PCR确认了无变异。

序列号17：(BamHI-pgsA-FW)

5’-agg gga tcc acg atg aaa aaagaa ctg agc ttt cat gaa-3’

序列号18：(SacI-pgsA-RV)

5’-agg gag ctc tta ttt aga ttttag ttt gtc act atg atc a-3’

序列号19：(BamHI-pgsB-FW)

5’-agg gga tcc gca atg tgg ttactc att ata gcc tgt gct-3’

序列号20：(XhoI-pgsB-RV)

5’-agg ctc gag cta gct tac gagctg ctt tac ctt gta tt-3’

序列号21：(KpnI-pgsC-FW)

5’-agg ggt acc gac atg ttc ggatca gat tta tac atc gca-3’

序列号22：(BamHI-pgsC-RV)

5’-agg gga tcc tta aat taa gtagta aac aaa cat gat-3’。

将pSPB2668用BamHI及XhoI酶切后得到的含有pgsB的ORF的约1.2kbDNA片段，与植物转化用双元载体pSPB176(日本特开2003-432383号公报、van Engelen et al.Transgenic Reaserch 4，288～290，1995)的BamHI位点及SalI位点连接，得到双元载体pSPB2672。pSPB176的多克隆位点在CaMV35S启动子和NOS终止子之间，在此位点***的片段，在植物细胞内CaMV35S启动子的控制下组成性超表达。

其次将pSPB2667用BamHI及SacI酶切后得到的含有pgsA的ORF的约1.1kbDNA片段，与pSPB541(日本特开2003-420046号公报)的BamHI位点及SacI位点连接，得到pUC载体pSPB2670。pSPB541的BamHI及SacI位点在CaMV35S启动子和NOS终止子之间，在此位点***的片段，在植物细胞内CaMV35S启动子的控制下组成性超表达

再其次，将pSPB2669用KpnI及BamHI酶切后得到的含有pgsC的ORF的约0.45kbDNA片段，与pSFL203(日本特开2003-420046号公报)的KpnI位点及BamHI位点连接，得到pUC载体pSPB2673。pSFL203的KpnI及BamHI位点在CaMV35S启动子和NOS终止子之间，在此位点***的***片段，在植物细胞内CaMV35S启动子的控制下组成性超表达。

之后，将上述pSPB2673用PacI酶切后得到的含有35S启动子、pgsC及NOS终止子的约1.5kb的片段，***到上述pSPB2672载体的PacI位点，得到双元载体pSPB2674。本双元载体通过使用了上述序列号19及22的PCR，与pgsB相同，鉴定出了转录报告中***了pgsC。

将上述的pSPB2670用AscI酶切后得到的含有35S启动子、pgsA及NOS终止子的约2.1kb的片段，***到上述pSPB2674载体的AscI位点，最后得到了组成性表达pgsA、pgsB及pgsC的双元载体pSPB2680。本双元载体是通过使用了上述序列号17及20的PCR，与pgsB相同，鉴定出了转录报告中***了pgsA。

根据公知的方法[下西等，新·生物化学实验入门3.化学同人(122～124页)]，使用pSPB2680转化农杆菌(菌株：Aglo)，使具有此pSPB2680的转化体农杆菌感染烟草叶盘。并通过卡那霉素选拔，得到最终独立的20***的转基因烟草。

之后，从此转基因烟草中，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司)提取totalRNA后，以此totalRNA1μg为模板，根据制造者推荐的条件进行逆转录反应[SuperScript^TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)]，得到cDNA。接下来，用此cDNA，使用序列号17-22的引物，通过RT-PCR进行表达分析。PCR反应液(25μl)包含各cDNA 1μl、1×Ex-Taq buffer(TaKaRa)、0.2mM dNTPs、引物各0.2pmol/μl及Ex-Taqpolymerase 1.25U。在94℃反应3分钟后，进行94℃1分钟、53℃1分钟、72℃2分钟的反应28个循环。

为比较表达量而作为内部标准基因的烟草泛素基因(NtUBQ存取号：U66264)，使用含有序列号23及24中所示的核苷酸序列的引物(分别为NtUBQ-FW及NtUBQ-RW)进行扩增。

序列号23NtUBQ-FW

5’-ggaatgcaga tcttcgtcaa-3’

序列号24NtUBQ-RW

5’-cctagaaacc accacgga-3’。

将RT-PCR产物用1％琼脂糖进行电泳，通过溴化乙锭染色，分析增殖片段。其结果如图5所示。用转基因烟草(PGSox.)的转化***10、11及21鉴定了三种pgs基因的异位表达。同时，在对照的非转基因烟草(NT)中，未发现pgs基因的表达。如此，得到了3种pgs基因共表达的转基因烟草。另外，除此以外，还得到表达了3种pgs基因中2种的4个，表达了1种的4个。

特别是在鉴定了3种pgs基因异位表达的转化***的叶粗提取液中，使用Western印迹法鉴定了免疫学上pgs蛋白质的积累。Western印迹法具体如下进行。

1.边加入液氮边研磨植物。

2.在冰上，加入100mM MES 3ml。

3.15,000rpm、离心10分钟。

4.将上清用MES稀释后作为Western印迹法的样品。

5.在硝酸纤维素膜^*1上转移2μl，放置30分钟左右。

6.放入透析袋(厚塑料袋)，加入适量酪蛋白饱和液^*2(膜全部浸入)，室温振荡30分钟。

7.弃除酪蛋白饱和液，适量加入1次抗体(将血清用酪蛋白饱和液稀释200倍)，室温振荡30分钟。

8.取出膜，浸入适量PBST(PBS中加入0.1％Tween20)，振荡洗涤5分钟。

9.将8重复3次。

10.将2次抗体液[以2次抗体(BIOTINYTED UNIVERSAL ANTIBODY^*3)3μl中，加入酪蛋白饱和液0.5ml的比例加入]放入新的透析袋中，室温振荡30分钟。

11.取出膜，浸入适量PBST，振荡洗涤5分钟。

12.将11重复3次。

13.制作抗生物素蛋白、生物素混合液[对于抗生物素蛋白(ABC-AP-A^*3)3μl、生物素(ABC-AP-B^*3)3μl，加入酪蛋白饱和液0.5ml]，放置30分钟后，放入新的透析袋中，室温振荡30分钟。

14.取出膜，浸入适量PBST，振荡洗涤5分钟。

15.将11重复3次。

16.将膜浸入适量100mM Tris-Hcl中，振荡洗涤5分钟。

17.将基质液[对于基质1(BCIP-1^*3)6μl、基质2(BCIP-2^*3)6μl、基质3(BCIP-3^*3)6μl，加入100mM Tris-Hcl 0.5ml]放入新的透析袋中，室温放置过夜。

*1使用MSI公司的NITORO PLUS。

*2将酪蛋白(乳制)在PBS中饱和溶解。酪蛋白使用和光纯药工业株式会社的制品。

*3使用the VECTASTAIN公司的ABC system。

结果如图6所示。如图6所示，鉴定了转化***10、11及21均有pgs蛋白质的积累。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>用于生产聚谷氨酸的转基因植物(Transgenic plant forproducing polyglutamic acid)

<130>042410

<160>24

<210>1

<211>380

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>1

Met Lys Lys Glu Leu Ser Phe His Glu Lys Leu Leu Lys Leu Thr Lys

1 5 10 15

Gln Gln Lys Lys Lys Thr Asn Lys His Val Phe Ile Ala Ile Pro Ile

20 25 30

Val Phe Val Leu Met Phe Ala Phe Met Trp Ala Gly Lys Ala Glu Thr

35 40 45

Pro Lys Val Lys Thr Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ser Ala Ser Phe Val

50 55 60

Gly Asp Ile Met Met Gly Arg Tyr Val Glu Lys Val Thr Glu Gln Lys

65 70 75 80

Gly Ala Asp Ser Ile Phe Gln Tyr Val Glu Pro Ile Phe Arg Ala Ser

85 90 95

Asp Tyr Val Ala Gly Asn Phe Glu Asn Pro Val Thr Tyr Gln Lys Asn

100 105 110

Tyr Lys Gln Ala Asp Lys Glu Ile His Leu Gln Thr Asn Lys Glu Ser

115 120 125

Val Lys Val Leu Lys Asp Met Asn Phe Thr Val Leu Asn Ser Ala Asn

130 135 140

Asn His Ala Met Asp Tyr Gly Val Gln Gly Met Lys Asp Thr Leu Gly

145 150 155

160

Glu Phe Ala Lys Gln Asn Leu Asp Ile Val Gly Ala Gly Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Asp Ala Lys Lys Lys Ile Ser Tyr Gln Lys Val Asn Gly Val Thr

180 185 190

Ile Ala Thr Leu Gly Phe Thr Asp Val Ser Gly Lys Gly Phe Ala Ala

195 200 205

Lys Lys Asn Thr Pro Gly Val Leu Pro Ala Asp Pro Glu Ile Phe Ile

210 215 220

Pro Met Ile Ser Glu Ala Lys Lys His Ala Asp Ile Val Val Val Gln

225 230 235

240

Ser His Trp Gly Gln Glu Tyr Asp Asn Asp Pro Asn Asp Arg Gln Arg

245 250 255

Gln Leu Ala Arg Ala Met Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ile Ile Val Gly

260 265 270

His His Pro His Val Leu Glu Pro Ile Glu Val Tyr Asn Gly Thr Val

275 280 285

Ile Phe Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Phe Asp Gln Gly Trp Thr Arg

290 295 300

Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Gln Tyr His Leu Lys Lys Asn Gly Thr

305 310 315

320

Gly Arg Phe Glu Val Thr Pro Ile Asp Ile His Glu Ala Thr Pro Ala

325 330 335

Pro Val Lys Lys Asp Ser Leu Lys Gln Lys Thr Ile Ile Arg Glu Leu

340 345 350

Thr Lys Asp Ser Asn Phe Ala Trp Lys Val Glu Asp Gly Lys Leu Thr

355 360 365

Phe Asp Ile Asp His Ser Asp Lys Leu Lys Ser Lys

370 375 380

<210>2

<211>1149

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>2

caaacgatga aaaaagaact gagctttcat gaaaagctgc taaagctgac aaaacagcaa

60

aaaaagaaaa ccaataagca cgtatttatt gccattccga tcgtttttgt ccttatgttc

120

gctttcatgt gggcgggaaa agcggaaacg ccgaaggtca aaacgtattc tgacgacgta

180

ctctcagcct catttgtagg cgatattatg atgggacgct atgttgaaaa agtaacggag

240

caaaaagggg cagacagtat ttttcaatat gttgaaccga tctttagagc ctcggattat

300

gtagcaggaa actttgaaaa cccggtaacc tatcaaaaga attataaaca agcagataaa

360

gagattcatc tgcagacgaa taaggaatca gtgaaagtct tgaaggatat gaatttcacg

420

gttctcaaca gcgcaaacaa ccacgcaatg gattacggcg ttcagggcat gaaagatacg

480

cttggagaat ttgcgaagca aaaccttgat atcgttggag cgggatacag cttaagtgat

540

gcgaaaaaga aaatttcgta ccaaaaagtc aacggggtaa cgattgcgac gcttggcttt

600

accgatgtgt ccgggaaagg tttcgcggct aaaaaaaata cgccgggcgt gctgcccgca

660

gatcctgaaa ttttcatccc tatgatttca gaagcgaaaa aacatgctga cattgttgtt

720

gtgcagtcac actggggcca agagtatgac aatgatccaa acgaccgcca gcgccagctt

780

gcaagagcca tgtctgatgc gggagctgac atcatcgtcg gccatcatcc gcacgtctta

840

gaaccgattg aagtatataa cggaaccgtc attttctaca gcctcggcaa ctttgtcttt

900

gaccaaggct ggacgagaac aagagacagt gcactggttc agtatcacct gaagaaaaat

960

ggaacaggcc gctttgaagt gacaccgatc gatatccatg aagcgacacc tgcacctgtg

1020

aaaaaagaca gccttaaaca gaaaaccatt attcgcgaac tgacgaaaga ctctaatttc

1080

gcttggaaag tagaagacgg aaaactgacg tttgatattg atcatagtga caaactaaaa

1140

tctaaataa 1149

<210>3

<211>393

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>3

Met Trp Leu Leu Ile Ile Ala Cys Ala Val Ile Leu Val Ile Gly Ile

1 5 10 15

Leu Glu Lys Arg Arg His Gln Lys Asn Ile Asp Ala Leu Pro Val Arg

20 25 30

Val Asn Ile Asn Gly Ile Arg Gly Lys Ser Thr Val Thr Arg Leu Thr

35 40 45

Thr Gly Ile Leu Ile Glu Ala Gly Tyr Lys Thr Val Gly Lys Thr Thr

50 55 60

Gly Thr Asp Ala Arg Met Ile Tyr Trp Asp Thr Pro Glu Glu Lys Pro

65 70 75 80

Ile Lys Arg Lys Pro Gln Gly Pro Asn Ile Gly Glu Gln Lys Glu Val

85 90 95

Met Arg Glu Thr Val Glu Arg Gly Ala Asn Ala Ile Val Ser Glu Cys

100 105 110

Met Ala Val Asn Pro Asp Tyr Gln Ile Ile Leu Gln Glu Glu Leu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Ile Gly Val Ile Val Asn Val Leu Glu Asp His Met Asp

130 135 140

Val Met Gly Pro Thr Leu Asp Glu Ile Ala Glu Ala Phe Thr Ala Thr

145 150 155

160

Ile Pro Tyr Asn Gly His Leu Val Ile Thr Asp Ser Glu Tyr Thr Glu

165 170 175

Phe Phe Lys Gln Lys Ala Lys Glu Arg Asn Thr Lys Val Ile Ile Ala

180 185 190

Asp Tyr Ser Lys Ile Thr Asp Glu Tyr Leu Arg Lys Phe Glu Tyr Met

195 200 205

Val Phe Pro Asp Asn Ala Ser Leu Ala Leu Gly Val Ala Gln Ala Leu

210 215 220

Gly Ile Asp Glu Glu Thr Ala Phe Lys Gly Met Leu Asn Ala Pro Pro

225 230 235

240

Asp Pro Gly Ala Met Arg Ile Leu Pro Leu Ile Ser Pro Ser Glu Pro

245 250 255

Gly His Phe Val Asn Gly Phe Ala Ala Asn Asp Ala Ser Ser Thr Leu

260 265 270

Asn Ile Trp Lys Arg Val Lys Glu Ile Gly Tyr Pro Thr Asp Asp Pro

275 280 285

Ile Ile Ile Met Asn Cys Arg Ala Asp Arg Val Asp Arg Thr Gln Gln

290 295 300

Phe Ala Asn Asp Val Leu Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Glu Leu Ile Leu

305 310 315

320

Ile Gly Glu Thr Thr Glu Pro Ile Val Lys Ala Tyr Glu Glu Gly Lys

325 330 335

Ile Pro Ala Asp Lys Leu His Asp Leu Glu Tyr Lys Ser Thr Asp Glu

340 345 350

Ile Met Glu Leu Leu Lys Lys Arg Met His Asn Arg Val Ile Tyr Gly

355 360 365

Val Gly Asn Ile His Gly Ala Ala Glu Pro Leu Ile Glu Lys Ile His

370 375 380

Glu Tyr Lys Val Lys Gln Leu Val Ser

385 390

<210>4

<211>1185

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>4

gcaatgtggt tactcattat agcctgtgct gtcatactgg tcatcggaat attagaaaaa

60

cgacgacatc agaaaaacat tgatgccctc cctgttcggg tgaatattaa cggcatccgc

120

ggaaaatcga ctgtgacaag gctgacaacc ggaatattaa tagaagccgg ttacaagact

180

gttggaaaaa caacaggaac agatgcaaga atgatttact gggacacacc ggaggaaaag

240

ccgattaaac ggaaacctca ggggccgaat atcggagagc aaaaagaagt catgagagaa

300

acagtagaaa gaggggctaa cgcgattgtc agtgaatgca tggctgttaa cccagattat

360

caaatcatcc ttcaggaaga acttctgcag gccaatatcg gcgtcattgt gaatgtttta

420

gaagaccata tggatgtcat ggggccgacg cttgatgaaa ttgcagaagc gtttaccgct

480

acaattcctt ataatggcca tcttgtcatt acagatagtg aatataccga gttctttaaa

540

caaaaagcaa aagaacgaaa cacaaaagtc atcattgctg attactcaaa aattacagat

600

gagtatttac gtaaatttga atacatggta ttccctgata acgcttctct ggcgctgggt

660

gtggctcaag cactcggcat tgacgaagaa acagcattta agggaatgct gaatgcgccg

720

ccagatccgg gagcaatgag aattcttccg ctgatcagtc cgagcgagcc tgggcacttt

780

gttaatgggt ttgccgcaaa cgacgcttct tctactttga atatatggaa acgtgtaaaa

840

gaaatcggtt acccgaccga tgatccgatc atcatcatga actgccgcgc agaccgtgtc

900

gatcggacac agcaattcgc aaatgacgta ttgccttata ttgaagcaag tgaactgatc

960

ttaatcggtg aaacaacaga accgatcgta aaagcctatg aagaaggcaa aattcctgca

1020

gacaaactgc atgatctaga gtataagtca acagatgaaa ttatggaatt gttaaagaaa

1080

agaatgcaca accgtgtcat atatggcgtc ggcaatattc atggtgccgc agagccttta

1140

attgaaaaaa tccacgaata caaggtaaag cagctcgtaa gctag 1185

<210>5

<211>152

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>5

Asn Ala Asp Met Phe Gly Ser Asp Leu Tyr Ile Ala Leu Ile Leu Gly

1 5 10 15

Val Leu Leu Ser Leu I le Phe Ala Glu Lys Thr Gly Ile Val Pro Ala

20 25 30

Gly Leu Val Val Pro Gly Tyr Leu Gly Leu Val Phe Asn Gln Pro Val

35 40 45

Phe Ile Leu Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Leu Thr Tyr Val Ile Val

50 55 60

Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Phe Met Ile Leu Tyr Gly Arg Arg Lys Phe

65 70 75 80

Ala Ala Met Leu Ile Thr Gly Ile Val Leu Lys Ile Ala Phe Asp Phe

85 90 95

Leu Tyr Pro Ile Ala Pro Phe Glu Ile Ala Glu Phe Arg Gly Ile Gly

100 105 110

Ile Ile Val Pro Gly Leu Ile Ala Asn Thr Ile Gln Lys Gln Gly Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Phe Gly Ser Thr Leu Leu Leu Ser Gly Ala Thr Phe Ala

130 135 140

Ile Met Phe Val Tyr Tyr Leu Ile

145 150

<210>6

<211>461

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>6

aaatgcagac atgttcggat cagatttata catcgcacta attttaggtg tactactcag

60

tttaattttt gcggaaaaaa cagggatcgt gccggcagga ctggttgtac cgggatattt

120

aggacttgtg tttaatcagc cggtctttat tttacttgtt ttgctagtga gcttgctcac

180

gtatgttatc gtgaaatacg gtttatccaa atttatgatt ttgtacggac gcagaaaatt

240

tgctgccatg ctgataacag ggatcgtcct aaaaatcgcg tttgattttc tatacccgat

300

tgcaccattt gaaatcgcag aatttcgagg aatcggcatc atcgtgccag gtttaattgc

360

caataccatt cagaaacaag gtttaaccat tacgttcgga agcacgctgc tattgagcgg

420

agcgaccttt gctatcatgt ttgtttacta cttaatttaa t 461

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>设计寡核苷酸引物用于PCR扩增(Designed oligonucleotide asa primer for PCR amplification)

<400>7

caaacgatga aaaaagaact cagct 25

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>8

ttatttagat tttagtttgt cactatgatc 30

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>9

gcaatgtggt tactcattat agcct 25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>10

ctagcttacg agctgcttta ccttg 25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>11

aaatgcagac atgttcggat cagat 25

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>12

ttaaattaag tagtaaacaa acatgatagc 30

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>13

taatacgact cactataggg cga 23

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

″v″at the position 41 means any of″a″or″g″or″c″

″n″at the position 42 means any of″a″or″g″or″c″or″t/u″

<400>14

cgccaagcta tttaggtgac tttttttttt tttttttttt vn 42

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>设计寡核苷酸引物用于PCR扩增(Designed oligonucleotide asa primer for RT-PCR amplification)

<400>15

aagcagtggt aacaacgcag agtac 25

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>16

aagcagtggt aacaacgcag agt 23

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>17

aggggatcca cgatgaaaaa agaactgagc tttcatgaa 39

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>18

agggagctct tatttagatt ttagtttgtc actatgatca 40

<210>19

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>19

aggggatccg caatgtggtt actcattata gcctgtgct 39

<210>20

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>20

aggctcgagc tagcttacga gctgctttac cttgtatt 38

<210>21

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>21

aggggtaccg acatgttcgg atcagattta tacatcgca 39

<210>22

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>22

aggggatcct taaattaagt agtaaacaaa catgat 36

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>23

ggaatgcaga tcttcgtcaa 20

<210>24

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<400>24

cctagaaacc accacgga 18

Claims

1.培育产生聚谷氨酸的转基因植物的方法，其包含在植物体内导入编码聚谷氨酸合成酶A的核酸pgsA、编码聚谷氨酸合成酶B的核酸pgsB及编码聚谷氨酸合成酶C的核酸pgsC的方法。

2.权利要求1中所述的方法，其聚谷氨酸合成酶A具有序列号1或序列号1中1个或多于1个的氨基酸残基缺失、附加或取代的氨基酸序列，聚谷氨酸合成酶B具有序列号3或序列号3中1个或多于1个的氨基酸残基缺失、附加或取代的氨基酸序列，聚谷氨酸合成酶C具有序列号5或序列号5中1个或多于1个的氨基酸残基缺失、附加或取代的氨基酸序列，并且，该聚谷氨酸合成酶A、B、C3种具有产生聚谷氨酸的功能。

3.权利要求1中所述的方法，其聚谷氨酸合成酶A具有序列号1或与序列号1至少有70％同一性的氨基酸序列，聚谷氨酸合成酶B具有序列号3或与序列号3至少有70％同一性的氨基酸序列，聚谷氨酸合成酶C具有序列号5或与序列号5至少有70％同一性的氨基酸序列，并且，该聚谷氨酸合成酶A、B、C3种具有产生聚谷氨酸的功能。

4.权利要求1～3中任一项所述的方法，其通过感染含有***了编码聚谷氨酸合成酶A的核酸pgsA、编码聚谷氨酸合成酶B的核酸pgsB及编码聚谷氨酸合成酶C的核酸pgsC中1种或多于1种核酸的载体的农杆菌，将上述核酸导入植物。

5.权利要求4中所述的方法，pgsA、pgsB及pgsC3种核酸向植物的导入，通过以下a)到c)的任一过程进行

6.权利要求4或5中所述的方法，其通过从含有叶盘法、真空渗透法及直接注入法的群中选择的方法使农杆菌感染植物。

7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其植物从含有烟草、拟南芥、稻、黄豆及百脉根的群中选择。

8.产生聚谷氨酸的转基因植物，其通过权利要求1～7中任一项所述的方法育成。

9.权利要求8中所述的转基因植物，其为成体、种子或愈伤组织的状态。

10.权利要求8或9中所述的转基因植物，其为烟草或拟南芥。