CN105713911A - 牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法 - Google Patents

牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105713911A
CN105713911A CN201610113863.9A CN201610113863A CN105713911A CN 105713911 A CN105713911 A CN 105713911A CN 201610113863 A CN201610113863 A CN 201610113863A CN 105713911 A CN105713911 A CN 105713911A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sos1s
yeast
gene
sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610113863.9A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋甲福
高姣姣
刘晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201610113863.9A priority Critical patent/CN105713911A/zh
Publication of CN105713911A publication Critical patent/CN105713911A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程和生物技术领域，公开一种牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法，提供了SOS1s基因的重组载体、转化细胞、酵母突变体的转化及转化细胞的耐盐性分析。AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选：(1)SOS1s基因的克隆；(2)酵母表达载体pAG426GPD?SOS1s的构建；(3)4个SOS1s酵母转化细胞的耐盐性分析；(4)AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选。通过定点突变产生一系列AjSOS1muts并回补酵母突变体ANT3，发现AjSOS1序列中耐盐关键氨基酸位点，为菊花及其近缘种属植物耐盐分子机理的研究提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

Description

牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法
技术领域
本发明属于基因工程技术和生物技术领域，涉及一种通过氨基酸定点突变和回补酵母突变体筛选目的基因关键氨基酸位点的方法，具体涉及包括有AjSOS1、CrcSOS1、CcSOS1和CmSOS1基因(统称SOS1s)的重组载体、酵母突变体的转化、4个SOS1s转酵母细胞的耐盐性分析、AjSOS1定点突变的产生及AjSOS1muts酵母转化细胞Na+转运能力差异的比较分析。
背景技术
土壤盐渍化是影响农业生产中作物产量和品质的重要非生物胁迫之一。菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一，用途和栽培地域极广，具很高的观赏和经济价值，在现代花卉生产中占有十分重要的地位。然而切花菊设施栽培中土壤次生盐渍化及我国大面积盐渍土是制约菊花生产与园林应用的主要因子，菊花及其近缘种属植物耐盐机理研究及耐盐优异基因挖掘是加快耐盐菊花新品种培育的基础。
钠离子是盐土中的主要成分，植物中Na+的过量积累会扰乱细胞内的离子稳态，导致K+/Na+比率降低，膜电位消散，同时引起渗透胁迫和次生二级胁迫如氧化胁迫等，导致代谢酶活性和光合作用的减弱，从而使植物生长受到抑制，最终细胞死亡(Hasegawa等，2000；Tuteja等，2007；Zhu等，2001)。因此，在盐胁迫下，植物必须使细胞溶质内的Na+浓度最小化来抵御盐胁迫(Tester等，2003)。为了避免Na+在植株内的积累，植物逐渐形成了3种策略：1)限制Na+从土中进入植物根部；2)区域化Na+进入液泡；3)主动将Na+泵出细胞质(Apse等，2007；Munns等，2008；Rajendran等，2009)。多个离子转运体参与这些过程，其中最为显著的代表是Na+/H+反向转运体。迄今为止，研究最为清楚的两类Na+/H+反向转运体为NHE/NHX和NhaP/SOS1(Pardo等，2006；Tester等，2003)。质膜型Na+/H+逆向转运蛋白SOS1是一个Na+外排蛋白，参与Na+从细胞溶质中的排出和木质部长距离运输(Oh等，2009；Olias等，2009；Shi等，2000；Shi等，2002)。
拟南芥AtSOS1的克隆促进了多个物种细胞质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的分离和研究。近年来已有很多关于不同植物来源SOS1基因功能特性的研究，其中酵母缺失Na+转运***突变体中的异源表达已被成功用于鉴定和明确基因功能且是一种简单有效的了解植物蛋白特性的方法(Garciadeblás等，2007；Martínez-Atienza等，2007；Oh等，2009；Quintero等，2002；Takahashi等，2009；Tang等，2010；Xu等，2008)。在菊花极其近缘种属植物耐盐性的评价及耐盐机理研究方面，管志勇等(2010)以叶片形态为依据对菊花近缘种属32份种质的耐盐性进行了鉴定，发现芙蓉菊、牡蒿耐盐性极强；大岛野路菊耐盐性强；栽培菊花‘神马’对盐胁迫敏感等具有不同耐盐性的植物材料(管志勇等，2010)。但是目前关于这些植物材料的耐盐性分子机理的研究报道相对较少。
参考文献：
ApseMP,BlumwaldE.(2007).Na+transportinplants.FEBSLetters,581(12),2247-2254.
GarciadeblásB,HaroR,BenitoB.(2007).CloningoftwoSOS1transportersfromtheseagrassCymodoceanodosa.SOS1transportersfromCymodoceaandArabidopsismediatepotassiumuptakeinbacteria.Plantmolecularbiology,63(4),479-490.
HasegawaPM,BressanRA,ZhuJK,BohnertHJ.(2000).PlantcellularandmolecularresponsestohighSalinity.AnnualReviewsofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,51(1),463-99.
Martínez-AtienzaJ,JiangX,GarciadeblasB,MenDozaI,ZhuJK,PardoJM,QuinteroFJ.(2007).Conservationofthesaltoverlysensitivepathwayinrice.PlantPhysiology,143(2),1001-1012.
MunnsR,TesterM.(2008).Mechanismsofsalinitytolerance.AnnualReviewofPlantBiology,59,651-681.
OhDH,LeidiE,ZhangQ,HwangSM,LiY,QuinteroFJ,JiangX,DUrzoMP,LeeSY,ZhaoY,BahkJD,BressanRA,YunDJ,PardoJM,BohnertHJ.(2009).LossofhalophytismbyinterferencewithSOS1expression.PlantPhysiology,151(1),210-222.
OliasR,EljakaouiZ,LiJ,DeMoralesPA,Marin-ManzanoMC,PardoJM,BelverA.(2009).TheplasmamembraneNa+/H+antiporterSOS1isessentialforsalttoleranceintomatoandaffectsthepartitioningofNa+betweenplantorgans.Plant,CellandEnvironment,32(7),904-916.
PardoJM,CuberoB,LeidiEO,QuinteroFJ.(2006).Alkalicationexchangers:rolesincellularhomeostasisandstresstolerance.JournalofExperimentalBotany,57(5),1181-1199.
QuinteroFJ,OhtaM,ShiH,ZhuJK,PardoJM.(2002).ReconstitutioninyeastoftheArabidopsisSOSsignalingpathwayforNa+homeostasis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,99(13),9061-9066.
RajendranK,TesterM,RoySJ.(2009).Quantifyingthethreemaincomponentsofsalinitytoleranceincereals.PlantCellandEnvironment,32(3),237-249.
ShiH,IshitaniM,KimC,ZhuJK.(2000).TheArabidopsisthalianasalttolerancegeneSOS1encodesaputativeNa+/H+antiporter.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,97(12),6896.
ShiH,LeeB,WuSJ,ZhuJK.(2002).OverexpressionofaplasmamembraneNa+/H+antiportergeneimprovessalttoleranceinArabidopsisthaliana.NatureBiotechnology,21(1),81-85.
TakahashiR,LiuS,TakanoT.(2009).IsolationandphysiologyofplasmamembraneNa+/H+antiportergenesfromsalt-sensitiveandsalt-tolerantreedplants.JournalofPlantPhysiology,166(3),301-309.
TangRJ,LiuH,BaoY,LvQD,YangL,ZhangHX.(2010).Thewoodyplantpoplarhasafunctionallyconservedsaltoverlysensitivepathwayinresponsetosalinitystress.PlantMolecularBiology,74(4-5),367-380.
TesterM,DavenportR.(2003).Na+toleranceandNa+transportinhigherplants.AnnalsofBotany,91(5),503-527.
TutejaN.(2007).ChapterTwenty-Four-MechanismsofHighSalinityToleranceinPlants.MethodsinEnzymology,428,419-438.
XuHX,JiangX,ZhanK,ChengX,ChenX,PardoJM,CuiD.(2008).FunctionalphysiologyofawheatplasmamembraneNa+/H+antiporterinyeast.ArchivesofBiochemistryandBiophysics,473(1),8-15.
ZhuJK.(2001).Plantsalttolerance.TrendsinPlantScience,6(2),66-71.
管志勇，陈素梅，陈发棣，尹冬梅，刘兆磊，唐娟，杨帆(2010)32个菊花近缘种属植物耐盐性筛选.中国农业科学,43(19),4063-4071.
发明内容
针对目前菊花及其近缘种属植物耐盐性分子机理研究相对薄弱，而现有技术中缺少关于基因关键氨基酸筛选这方面的研究的技术问题，本发明的目的在于提供一种SOS1s基因重组表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种回补酵母突变体进行SOS1s基因功能验证的方法。
本发明的又一目的在于提供一种通过定点突变和回补酵母突变体快速筛选耐盐性关键氨基酸位点的方法。本发明通过氨基酸定点突变技术获得基因突变体，对突变体进行酵母回补实验比较其对Na+转运能力的差异，最终筛选目的基因的重要关键氨基酸位点，这种新的探索为菊花基因功能及耐盐机制的研究提供简单有效而实用的方法。
本发明的技术方案路线如下：
通过克隆菊花及其3种近缘种属植物的质膜型Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因，经过酵母表达载体pAG426GPD的构建及转化酵母突变体ANT3研究和比较SOS1s的功能，之后通过氨基酸定点突变的技术获得一系列AjSOS1muts，并进行酵母突变体回补比较其对Na+转运能力的差异，最终筛选出目的基因的重要关键的氨基酸位点。
本发明的目的具体通过以下技术手段实现：
一种SOS1s基因重组表达载体，该重组表达载体为将SOS1s基因通过双酶切、连接入Gateway入门载体pENTRTM1A，然后经LR重组反应转入到酵母表达载体pAG426GPD，获得SOS1s基因重组表达载体pAG426GPD-SOS1s；所述的SOS1s基因为如SEQIDNO.1所示的AjSOS1基因、如SEQIDNO.2所示的CrcSOS1基因、如SEQIDNO.3所示的CcSOS1基因或如SEQIDNO.4所示的CmSOS1基因。
上述的SOS1s基因重组表达载体，采用以下步骤制备：
(1)菊花及其3种近缘种属植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因的克隆
以芙蓉菊、牡蒿、大岛野路菊或栽培菊花‘神马’的植物根部为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设计特异引物：
上游引物F1：序列如SEQIDNO.5所示，
下游引物R1：序列如SEQIDNO.6所示；
上游引物F2：序列如SEQIDNO.7所示，
下游引物R2：序列如SEQIDNO.8所示；
以反转录的cDNA为模板，采用融合PCR的方法扩增，将以上游引物F1和下游引物R2高保真扩增的PCR产物连接到pEASYTM-BluntZeroCloningVector，最终获得包含有SOS1s基因的全长序列的阳性质粒pEASYTM-BluntZero-SOS1s；
(2)酵母表达载体pAG426GPD-SOS1s的构建
根据SOS1s基因的开放阅读框设计上下游引物，分别引入SalI和NotI酶切位点，上下游引物分别为：
SOS1s-Sal-F：序列如SEQIDNO.9所示，
SOS1s-Not-R：序列如SEQIDNO.10所示；
以步骤(1)获得的阳性质粒pEASYTM-BluntZero-SOS1s为模板进行高保真PCR扩增引入限制性酶切位点，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化特异性目的条带，将上述PCR凝胶纯化产物由SalI和NotI双酶切得到的SOS1s基因片段与由SalI和NotI双酶切的pENTRTM1A大片段连接、转化，提取阳性质粒pENTRTM1A-SOS1s，与酵母表达载体pAG426GPD质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒pAG426GPD-SOS1s。
上述的SOS1s基因重组表达载体，其所述的植物根部为在200mMNaCl处理下的植物根部。
包含有上述重组表达载体的转化细胞。
一种回补酵母突变体进行SOS1s基因功能验证的方法，该方法包括如下步骤：
(1)酵母细胞的转化
分别将权利要求1或2所述的SOS1s基因重组表达载体pAG426GPD-SOS1s和空载体pAG426GPD转化到酵母突变体菌株ANT3和G19感受态细胞中，涂布在相应缺陷的SD固体培养基上；
(2)PCR检测
挑取阳性单克隆于包含相应缺陷的SD液体筛选培养基中培养，根据SOS1s基因ORF框序列设计引物，引物序列为：
Mighty-F：序列如SEQIDNO.11所示，
Mighty-R：序列如SEQIDNO.12所示；
进行菌液PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
(3)酵母转化细胞Na+转运能力差异比较
将阳性酵母单克隆在SD缺陷和YPDA液体培养基中，扩大培养，对饱和细胞进行2×106cell/ml梯度稀释，取稀释菌液点到YPDA固体培养基和分别含有30、50及70mMNaCl的AP培养基上培养，30℃培养2-4d，比较其对Na+转运能力的差异。
一种通过定点突变和回补酵母突变体快速筛选耐盐性关键氨基酸位点的方法，该方法通过在AjSOS1基因的基础上进行定点突变获得AjSOS1muts，构建pAG426GPD-AjSOS1muts载体，通过在AP培养基中添加70mMNaCl评估酵母转化细胞的Na+转运能力，从而发现耐盐性关键的氨基酸位点。
上述的通过定点突变和回补酵母突变体快速筛选耐盐性关键氨基酸位点的方法，具体包括如下步骤：
(1)定点突变的产生
通过对4个SOS1s编码的蛋白进行同源比较，找出差异的氨基酸位点，设计突变引物，以提取的pENTRTM1A-AjSOS1质粒DNA为模板，在AjSOS1的基础上进行定点突变操作，用突变引物进行高保真PCR反应，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；在电泳检测有目的条带且条带大小正确的PCR产物中加入DpnI消化质粒模板，产物直接转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行测序确定突变位点的准确性；
(2)酵母表达载体的构建及酵母转化细胞的耐盐性比较
提取成功突变的阳性质粒pENTR1A-AjSOS1mut，运用重组酶LR将阳性质粒重组到酵母表达载体pAG426GPD，重组反应构建重组表达载体pAG426GPD-AjSOS1muts，回补酵母突变体进行Na+转运能力差异比较分析。
上述的通过定点突变和回补酵母突变体快速筛选耐盐性关键氨基酸位点的方法，其所述回补酵母突变体进行Na+转运能力差异比较分析的过程为：
(1)酵母细胞的转化
分别将重组表达载体pAG426GPD-AjSOS1muts和空载体pAG426GPD转化到酵母突变体菌株ANT3和G19感受态细胞中，涂布在相应缺陷的SD固体培养基上；
(2)PCR检测
挑取阳性单克隆于包含相应缺陷的SD液体筛选培养基中培养，根据AjSOS1基因ORF框序列设计引物，引物序列为：
Mighty-F：序列如SEQIDNO.11所示，
Mighty-R：序列如SEQIDNO.12所示；
进行菌液PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
(3)酵母转化细胞Na+转运能力差异比较
将阳性酵母单克隆在SD缺陷和YPDA液体培养基中，扩大培养，对饱和细胞进行2×106cell/ml梯度稀释，取稀释菌液点到YPDA固体培养基和含有70mMNaCl的AP培养基上培养，30℃培养2-4d，比较其对Na+转运能力的差异。
上述的重组表达载体和转化细胞在回补酵母突变体及筛选基因关键位点中的应用。
上述的回补酵母突变体进行SOS1s基因功能验证的方法在筛选基因关键位点上的应用。
上述的定点突变及其酵母转化细胞Na+转运能力差异比较的方法在筛选基因关键位点上的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过对4个SOS1s酵母转化细胞的耐盐性分析，结果显示4个SOS1s均能回补酵母突变体ANT3对Na+的转运功能，在含盐培养基上酵母细胞表达AjSOS1长势最好，CrcSOS1次之，CcSOS1长势弱于CrcSOS1，强于CmSOS1，而CmSOS1长势最差。另外，通过定点突变产生一系列AjSOS1muts并回补酵母突变体ANT3，发现AjSOS1序列中耐盐关键氨基酸位点：如G13E、T26S、F143I、V238L、Y463H、E512G、Y549H、S639L、A919T、YG927HS、G982V、A1027V、N1109K和G1127A等，为菊花及其近缘种属植物耐盐分子机理的研究提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。
附图说明
图14个Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因氨基酸序列比对
图2pAG426GPD-SOS1s质粒SalI和NotI双酶切验证
1-4：分别为对pAG426GPD-AjSOS1、pAG426GPD-CrcSOS1、pAG426GPD-CcSOS1和pAG426GPD-CmSOS1质粒SalI和NotI双酶切检测；M：DL5000。
图34个SOS1s基因对盐敏感酵母突变体的功能分析
a：YPDA培养基(0mMNaCl)；b、c和d分别为含30、50和70mMNaCl的AP培养基。
图4部分重组质粒pAG426GPD-AjSOS1muts用SalI和NotI进行双酶切检测
M：DL15000；1：pAG426GPD载体质粒；2：pAG426GPD质粒SalI和NotI双酶切检测；3：某一pAG426GPD-AjSOS1muts质粒；4-15：部分pAG426GPD-AjSOS1muts重组质粒SalI和NotI进行双酶切检测。
图5用TMPRED软件预测的AjSOS1二级结构及其定点突变的氨基酸
图6SOS1s和AjSOS1muts对酵母突变体ANT3的回补分析
a-c：YPDA培养基(0mMNaCl)；d-f：AP培养基含70mMNaCl
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1.
(1)菊花及其3种近缘种属植物SOS1s基因的克隆
采用Trizol试剂(TaKaRa)，依照说明书对200mMNaCl处理下的耐盐性极强的芙蓉菊、牡蒿；耐盐性强的大岛野路菊和对盐胁迫敏感的栽培菊花‘神马’【管志勇.32个菊花近缘种属植物耐盐性筛选.中国农业科学(2010).】4种植物的根部总RNA进行提取，以Oligod(T)18作为反转录引物，根据M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)说明进行反转录获得第一链cDNA模板，根据菊花文库中该基因的序列信息，采用Premier5.0软件设计特异引物：
上游引物F1：序列如SEQIDNO.5所示，
下游引物R1：序列如SEQIDNO.6所示；
上游引物F2：序列如SEQIDNO.7所示，
下游引物R2：序列如SEQIDNO.8所示；
以反转录的cDNA为模板，采用融合PCR的方法进行PCR反应，50μL反应体系：10×PCRBuffer5.0μL，F1、R1或F2、R2引物各2.0μL(10μmolL-1),dNTPmix4.0μL(2.5mmolL-1)，TaqDNAPolymerase0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O37.8mL；反应程序：95℃预变性5min，95℃解链45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，USA)进行回收，然后引物F1和R2按照上述体系和程序进行PCR反应和凝胶回收，扩增的PCR产物连接到pEASYTM-BluntZeroCloningVector，获得的阳性质粒pEASYTM-BluntZero-SOS1s，最终获得AjSOS1、CrcSOS1、CcSOS1和CmSOS1基因(统称SOS1s)序列，序列测定为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。
(2)酵母表达载体pAG426GPD-SOS1s的构建
根据4个SOS1s基因的开放阅读框(ORF)设计上下游引物，分别引入SalI和NotI酶切位点，上下游引物分别为：
SOS1s-Sal-F：序列如SEQIDNO.9所示，
SOS1s-Not-R：序列如SEQIDNO.10所示；
以步骤(1)获得的阳性质粒pEASYTM-BluntZero-SOS1s为模板进行高保真PCR扩增引入限制性酶切位点，50μL反应体系：5×PhusionHFPCRBuffer10.0μL，SOS1s-Sal-F、SOS1s-Not-R引物各1.0μL，dNTPmix1.0μL(10.0mmolL-1)，DMSO1.5μL，PhusionDNAPolymerase0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O34.0μL；反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，反应30个循环；72℃延伸7min，PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，USA)回收。
同时对PCR凝胶纯化产物和Gateway入门载体pENTRTM1A用SalI和NotI双酶切，双酶切体系20μL：10×FastDigestBuffer2.0μL，PCR凝胶纯化产物或质粒pENTRTM1A1.0μL，SalI1.0μL，NotI1.0μL，ddH2O15.0μL；37℃酶切1h；分别将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收pENTRTM1A载体大片段和目的基因SOS1s片段。用T4DNA连接酶(Fermentas)连接两个回收的产物，连接反应体系10μL：10×T4DNAligaseBuffer1μL，SOS1s片段6μL，pENTRTM1A载体大片段2μL，T4DNA连接酶1μL；22℃连接1h，取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，获得pENTRTM1A-SOS1s质粒。
将pENTRTM1A-SOS1s质粒与pAG426GPD载体质粒进行LR重组反应，反应体系5μL：pENTRTM1A-SOS1s质粒3μL，pAG426GPD载体质粒1μL，LR重组酶1μL；25℃反应1h，产物直接转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取pAG426GPD-SOS1s质粒，测序验证，并对重组质粒用SalI和NotI进行双酶切验证，电泳检测结果如图2所示，表明4个SOS1s已成功重组到pAG426GPD载体。
(3)酵母细胞的转化及4个SOS1s酵母转化细胞的耐盐性分析
分别从SD-His-和SD-His-/Leu-的固体平板培养基上挑取G19(△ena1::HIS3::ena4)和ANT3(△ena1::HIS3::ena4，△nha1::LEU2)酵母单菌落于1mLSD-His-和SD-His-/Leu-液体培养基中剧烈振荡打散菌块，转移到20mLSD-His-和SD-His-/Leu-液体培养基中。250rpm，30℃培养至稳定期(OD600>1.5)，转移到100mLSD-His-和SD-His-/Leu-液体培养基中，250rpm，30℃培养至OD600＝0.4-0.6，离心收集菌体，悬浮于30mL灭菌ddH2O，再次离心收集菌体，加如1.5mL1×TE/LiAC溶液悬浮，分装100μL/管备用，本试验所涉及的pAG426GPD载体和酵母突变体菌株G19和ANT3均为本领域技术人员公知的常规菌株。
用沸水煮鲑鱼精DNA(10ug/μL)10-20min,冰上放置10min。取10μL鲑鱼精DNA加入100μL酵母感受态细胞中，分别在G19感受态细胞中加入5μL空载体质粒pAG426GPD和在ANT3感受态细胞中加入5μL空载体质粒pAG426GPD或酵母表达载体pAG426GPD携带SOS1s目的基因的待转化质粒，涡旋混匀，加入100μLTE/LiAc/PEG溶液，高度涡旋10s。30℃，200rpm，振荡培养30min。加入20μLDMSO，42℃热激15min，置于冰上1-2min。12000rpm离心1min室温，去上清，重悬于200μL1×TE溶液中。取适量的菌液涂布到相应氨基酸缺陷的平板上，30℃倒置培养2-3d。挑取单克隆于相应缺陷的SD液体筛选培养基中培养，用MightyAmpDNAPolymeraseVer.2(TaKaRa)进行菌液PCR检测，引物分别为：
Mighty-F：序列如SEQIDNO.11所示，
Mighty-R：序列如SEQIDNO.12所示；
反应体系25μL：2×MightyAmpBufferVer.212.5μL，Mighty-F、Mighty-R引物各1μL，菌液模板1μL，MightyAmpDNAPolymerase0.3μL，ddH2O9.2μL。扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min，35个循环；68℃延伸10min，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
将阳性酵母单克隆在SD缺陷和YPDA液体培养基中，30℃，220rpm扩大培养，对饱和细胞进行2×106cell/ml梯度稀释，取5.0μl稀释菌液点到YPDA固体培养基和分别含有30、50及70mMNaCl的AP培养基上(包括10mMarginine、8mMH3PO4、2mMMgSO4、0.2mMCaCl2、2％glucose、部分维生素和微量元素，pH6.5)培养(该AP培养基的配制方法为本领域技术人员所公知)，30℃培养2-4d左右，比较其对Na+转运能力的差异。结果如图3所示，在YPDA(0mMNaCl)培养基上，所有酵母细胞生长良好且无差异。在含不同浓度NaCl的AP培养基上，4个SOS1s酵母表达细胞的长势均优于突变体细胞，在70mMNaCl培养基中长势差异最显著，其中酵母细胞表达AjSOS1长势最好，CrcSOS1生长次之，CcSOS1长势弱于CrcSOS1，强于CmSOS1，而CmSOS1长势最差。表明酵母突变体细胞中表达耐盐植物中的SOS1s比盐敏感植物中的SOS1s耐盐性更强。
(4)AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选
1)定点突变的产生
通过对4个SOS1s基因编码的氨基酸序列进行同源比对(如图1所示)，由核苷酸位点变化共导致AjSOS1和CrcSOS1，CcSOS1和CmSOS1有18个氨基酸位点差异，采用定点突变QuikChangePrimerDesign网站设计突变引物，以提取的pENTR1A-AjSOS1质粒DNA为模板，此外，CmSOS1和其它三个SOS1s不一致的有1个氨基酸位点，在pENTR1A-CcSOS1质粒的基础上进行定点突变，依据快速定点突变试剂盒说明书进行操作(Stratagene，LaJolla，CA，USA)，用突变引物(SEQIDNO.13-SEQIDNO.50)进行高保真PCR反应，50μL反应体系：10×ReactionBuffer5.0μL，上游和下游引物各2.0μL(10μmol)，dNTPmix1.0μL(10.0mM)，高保真酶1.0μL(2.5U/μL，ThermoScientific，USA)，质粒模板2μL，ddH2O37.0μL；反应程序：95℃预变性30s，95℃解链30s，55℃退火1min，68℃延伸7min，14-16个循环。反应结束后，冰上放置2min，取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在电泳检测有目的条带且条带大小正确的剩余45μLPCR产物中加入1μLDpnI消化质粒模板，37℃反应1h后，直接转化DH5α，37℃过夜培养。挑取阳性单克隆进行测序以确定突变的准确性。提取成功突变的阳性质粒pENTR1A-AjSOS1mut，运用重组酶LR将阳性质粒重组到酵母表达载体pAG426GPD，重组反应同步骤(2)。提取重组质粒pAG426GPD-AjSOS1mut，用内切酶SalI和NotI进行双酶切验证，结果表明AjSOS1muts已成功构建到载体pAG426GPD(图4)。
2)AjSOS1muts在酵母中的功能分析
所有AjSOS1muts转化酵母突变体进行Na+转运能力差异比较分析的具体方法同步骤(3)，在含70mMNaCl的AP培养基上进行点布实验。结果如图6所示，转化突变体G13E、T26S、F143I、V238L、Y463H、E512G、Y549H、S639L、A919T、YG927HS、G982V、A1027V、N1109K和G1127A等酵母细胞的生长弱于转化CmSOS1酵母细胞，甚至不能回补酵母ANT3菌株的生长缺陷。由此可见，这些突变体不能介导酵母突变体对Na+的外排，是AjSOS1耐盐关键的氨基酸位点。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的实例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种SOS1s基因重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体为将SOS1s基因通过双酶切、连接入Gateway入门载体pENTRTM1A，然后经LR重组反应转入到酵母表达载体pAG426GPD，获得SOS1s基因重组表达载体pAG426GPD-SOS1s；所述的SOS1s基因为如SEQIDNO.1所示的AjSOS1基因、如SEQIDNO.2所示的CrcSOS1基因、如SEQIDNO.3所示的CcSOS1基因或如SEQIDNO.4所示的CmSOS1基因。
2.根据权利要求1所述的SOS1s基因重组表达载体，其特征在于：采用以下步骤制备：
(1)菊花及其3种近缘种属植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因的克隆
以芙蓉菊、牡蒿、大岛野路菊或栽培菊花‘神马’的植物根部为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设计特异引物：
上游引物F1：序列如SEQIDNO.5所示，
下游引物R1：序列如SEQIDNO.6所示；
上游引物F2：序列如SEQIDNO.7所示，
下游引物R2：序列如SEQIDNO.8所示；
以反转录的cDNA为模板，采用融合PCR的方法扩增，将以上游引物F1和下游引物R2高保真扩增的PCR产物连接到pEASYTM-BluntZeroCloningVector，最终获得包含有SOS1s基因的全长序列的阳性质粒pEASYTM-BluntZero-SOS1s；
(2)酵母表达载体pAG426GPD-SOS1s的构建
根据SOS1s基因的开放阅读框设计上下游引物，分别引入SalI和NotI酶切位点，上下游引物分别为：
SOS1s-Sal-F：序列如SEQIDNO.9所示，
SOS1s-Not-R：序列如SEQIDNO.10所示；
以步骤(1)获得的阳性质粒pEASYTM-BluntZero-SOS1s为模板进行高保真PCR扩增引入限制性酶切位点，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化特异性目的条带，将上述PCR凝胶纯化产物由SalI和NotI双酶切得到的SOS1s基因片段与由SalI和NotI双酶切的pENTRTM1A大片段连接、转化，提取阳性质粒pENTRTM1A-SOS1s，与酵母表达载体pAG426GPD质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒pAG426GPD-SOS1s。
3.包含有如权利要求1所述重组表达载体的转化细胞。
4.一种回补酵母突变体进行SOS1s基因功能验证的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)酵母细胞的转化
分别将权利要求1或2所述的SOS1s基因重组表达载体pAG426GPD-SOS1s和空载体pAG426GPD转化到酵母突变体菌株ANT3和G19感受态细胞中，涂布在相应缺陷的SD固体培养基上；
(2)PCR检测
挑取阳性单克隆于包含相应缺陷的SD液体筛选培养基中培养，根据SOS1s基因ORF框序列设计引物，引物序列为：
Mighty-F：序列如SEQIDNO.11所示，
Mighty-R：序列如SEQIDNO.12所示；
进行菌液PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
(3)酵母转化细胞Na+转运能力差异比较
将阳性酵母单克隆在SD缺陷和YPDA液体培养基中，扩大培养，对饱和细胞进行2×106cell/ml梯度稀释，取稀释菌液点到YPDA固体培养基和分别含有30、50及70mMNaCl的AP培养基上培养，30℃培养2-4d，比较其对Na+转运能力的差异。
5.一种通过定点突变和回补酵母突变体快速筛选耐盐性关键氨基酸位点的方法，其特征在于：该方法通过在AjSOS1基因的基础上进行定点突变获得AjSOS1muts，构建pAG426GPD-AjSOS1muts载体，通过在AP培养基中添加70mMNaCl评估酵母转化细胞的Na+转运能力，从而发现耐盐性关键的氨基酸位点。
6.根据权利要求5所述的通过定点突变和回补酵母突变体快速筛选耐盐性关键氨基酸位点的方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：
(1)定点突变的产生
通过对4个SOS1s编码的蛋白进行同源比较，找出差异的氨基酸位点，设计突变引物，以提取的pENTRTM1A-AjSOS1质粒DNA为模板，在AjSOS1的基础上进行定点突变操作，用突变引物进行高保真PCR反应，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；在电泳检测有目的条带且条带大小正确的PCR产物中加入DpnI消化质粒模板，产物直接转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行测序确定突变位点的准确性；
(2)酵母表达载体的构建及酵母转化细胞的耐盐性比较
提取成功突变的阳性质粒pENTR1A-AjSOS1mut，运用重组酶LR将阳性质粒重组到酵母表达载体pAG426GPD，重组反应构建重组表达载体pAG426GPD-AjSOS1muts，回补酵母突变体进行Na+转运能力差异比较分析。
7.根据权利要求6所述的通过定点突变和回补酵母突变体快速筛选耐盐性关键氨基酸位点的方法，其特征在于所述回补酵母突变体进行Na+转运能力差异比较分析的过程为：
(1)酵母细胞的转化
分别将重组表达载体pAG426GPD-AjSOS1muts和空载体pAG426GPD转化到酵母突变体菌株ANT3和G19感受态细胞中，涂布在相应缺陷的SD固体培养基上；
(2)PCR检测
挑取阳性单克隆于包含相应缺陷的SD液体筛选培养基中培养，根据AjSOS1基因ORF框序列设计引物，引物序列为：
Mighty-F：序列如SEQIDNO.11所示，
Mighty-R：序列如SEQIDNO.12所示；
进行菌液PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
(3)酵母转化细胞Na+转运能力差异比较
将阳性酵母单克隆在SD缺陷和YPDA液体培养基中，扩大培养，对饱和细胞进行2×106cell/ml梯度稀释，取稀释菌液点到YPDA固体培养基和含有70mMNaCl的AP培养基上培养，30℃培养2-4d，比较其对Na+转运能力的差异。
8.权利要求1或2中所述的重组表达载体和权利要求3中所述的转化细胞在回补酵母突变体及筛选基因关键位点中的应用。
9.权利要求4所述的回补酵母突变体进行SOS1s基因功能验证的方法在筛选基因关键位点上的应用。
10.权利要求5、6或7所述的定点突变及其酵母转化细胞Na+转运能力差异比较的方法在筛选基因关键位点上的应用。
CN201610113863.9A 2016-02-29 2016-02-29 牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法 Pending CN105713911A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610113863.9A CN105713911A (zh) 2016-02-29 2016-02-29 牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610113863.9A CN105713911A (zh) 2016-02-29 2016-02-29 牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105713911A true CN105713911A (zh) 2016-06-29

Family

ID=56157198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610113863.9A Pending CN105713911A (zh) 2016-02-29 2016-02-29 牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105713911A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110256544A (zh) * 2019-05-30 2019-09-20 内蒙古大学 NsNHX1蛋白质及其相关生物材料在培育耐逆型杨树中的应用
CN111088260A (zh) * 2020-01-16 2020-05-01 南京农业大学 萝卜耐盐基因RsNHX1及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101037693A (zh) * 2006-03-15 2007-09-19 中国科学院遗传与发育生物学研究所 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法
CN101358192A (zh) * 2008-08-29 2009-02-04 华东师范大学 日本结缕草Na+/H+逆向转运蛋白基因ZjNHX1及其编码蛋白与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101037693A (zh) * 2006-03-15 2007-09-19 中国科学院遗传与发育生物学研究所 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法
CN101358192A (zh) * 2008-08-29 2009-02-04 华东师范大学 日本结缕草Na+/H+逆向转运蛋白基因ZjNHX1及其编码蛋白与应用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. SONG等: ""Isolation and characterisation of Chrysanthemum crassum SOS1, encoding a putative plasma membrane Na+/H+ antiporter"", 《PLANT BIOLOGY》 *
GAO,J.J: ""Artemisia chinensis putative plasma membrane Na(+) /H(+) antiporter (SOS1) mRNA, complete cds"", 《GENBANK DATABASE》 *
GAO,J.J: ""Artemisia japonica putative plasma membrane Na(+) /H(+) antiporter (SOS1) mRNA，complete cds"", 《GENBANK DATABASE》 *
GAO,J.J: ""Chrysanthemum x morifolium putative plasma membrane Na(+) /H(+) antiporter (SOS1) mRNA, complete cds"", 《GENBANK DATABASE》 *
孔广超等主编: "《《小黑麦生理生态及遗传育种研究与应用》》", 30 November 2011 *
孙燕主编: "《微生物学实验指导》", 31 August 2015 *
朱睦元等: "《现代遗传学实验》", 31 May 2009 *
杜翠红等主编: "《酶工程》", 31 October 2014 *
管志勇等: ""32个菊花近缘种属植物耐盐性筛选"", 《中国农业科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110256544A (zh) * 2019-05-30 2019-09-20 内蒙古大学 NsNHX1蛋白质及其相关生物材料在培育耐逆型杨树中的应用
CN111088260A (zh) * 2020-01-16 2020-05-01 南京农业大学 萝卜耐盐基因RsNHX1及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. AtHMA1 contributes to the detoxification of excess Zn (II) in Arabidopsis
US8168864B2 (en) Transgenic pollen expressing exogenous plant vacuolar pyrophosphatase and methods for increasing seed production in plants
CN107937416A (zh) 提高水稻氮肥利用效率和产量的基因及其应用
CN104302773A (zh) 增加植物对热胁迫的耐受性及氨基酸含量的方法
CN102498125A (zh) 植物中锌缺乏及耐受性的调控
CN107326032A (zh) 一种用于修复镉污染土壤并提高植物耐镉的基因及应用
CN107557368A (zh) 非生物胁迫耐性提高的植物和方法
Dinesh Babu et al. A short review on sugarcane: its domestication, molecular manipulations and future perspectives
Abrol et al. Photosynthesis: Photoreactions to plant productivity
CN105705643A (zh) 非生物胁迫抗性
CN103554240B (zh) 与植物吸收钾离子的能力相关的蛋白GhKT2及其编码基因和应用
CN107974459A (zh) 提高植物非生物胁迫耐性的构建体和方法
CN105713911A (zh) 牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法
US8697950B2 (en) Vacuolar pyrophosphatases and uses in plants
CN103694327B (zh) 植物耐旱相关蛋白dsm1及其编码基因和应用
CN103849605B (zh) 一种培育抗性植物的方法及其专用蛋白和基因
Li et al. Isolation and comparative analysis of two Na+/H+ antiporter NHX2 genes from Pyrus betulaefolia
CN114032245B (zh) 基因VLNHX3D在调节植物细胞Na+和/或K+浓度中的应用
CN105441458B (zh) 盐芥耐低磷基因ThPHT1-1及重组载体及应用
KR100990333B1 (ko) 보리 유래의 ｎｈｘ 유전자, 이를 이용하여 식물의 내염성을 증진시키는 방법, 및 상기 방법을 이용하여 내염성이 증진된 형질전환 식물체
CN107266542A (zh) 厚藤IpLEA基因及其编码蛋白和应用
CN104140462A (zh) 植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用
CN106967736A (zh) 水稻OsMts1基因及其编码蛋白与应用
CN105906695A (zh) 一种苦豆子水通道蛋白及其编码基因及应用
CN107176983B (zh) 蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160629