CN101031356A - 制备色谱基质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备交联多糖色谱基质的方法，该方法包括：提供至少一种可凝胶的多糖的水溶液，其中部分羟基被对亲核攻击不敏感的基团取代；提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；形成取代的多糖溶液的凝胶；和交联凝胶。本发明还包括用所制备的基质填充的色谱柱及其在例如蛋白质纯化中的用途。

Description

制备色谱基质的方法
技术领域
本发明涉及目标化合物，例如生物分子的分离和纯化，更具体地，涉及色谱基质，和制备其的新方法。本发明还包括该基质在液相色谱中的用途和用基质填充的色谱柱。
背景技术
近年来在生物技术领域的进步要求用于回收、纯化和分析生物学和生物化学物质，例如蛋白质的更快和更准确的技术，电泳和色谱法是两种常用的该类技术。
在电泳技术中，带电的微粒通过在电场中迁移分离。更具体地，将样品放置在软的固体支撑介质，例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶厚片上，随后将其放置在两个电极，正电荷阳极和负电荷阴极之间。在电流接通时，样品的每个组分将以由其净电荷和分子量决定的特定速率迁移。良好运转的电泳法的一种基本性质是它的熔融点，它影响由分离的凝胶斑中选取迁移的目标化合物的能力。因此，低熔融点凝胶通常是有利的，天然琼脂糖通常用于电泳凝胶，但它们也被提及包含某些问题。例如，尽管天然琼脂糖的粗糙孔结构对拆分大的大分子是杰出的，但必须制备用于较小分子的较小分子量琼脂糖，这通常通过增加凝胶的琼脂糖含量得到，然而产生了溶液的高粘度，致使凝胶的浇铸困难。为克服此类问题和其它问题，人们建议将改性琼脂糖用于电泳凝胶：
电泳法在US3956273(Guiseley)中讨论，它涉及用于电泳法或扩散相互反应，并且还用作增稠剂的琼脂糖或琼脂化合物。该类化合物用烷基和烯基改性以降低其形成凝胶和熔融温度，和与未改性的物质相比的增加其透明。更具体地，首先将琼脂或琼脂糖溶解在强碱中，随后加入合适的试剂以提供改性。可使用双官能团试剂，例如表氯醇，但仅在预防交联的条件下。
电泳法还在US5,143,646(Nochumson等)中讨论，它涉及电泳解析凝胶组合物，其含有多糖水凝胶，例如琼脂糖，它已被足够地衍生和解聚以降低其浇铸有效的粘度。公开的组合物不需要任何交联或聚合试剂。
此外，US 5,541,255(Kozulic)涉及用于电泳法的凝胶，更具体地，涉及交联的线性多糖聚合物。凝胶通过将多糖溶解在溶剂，例如水中，加入不带电荷，并且在与水接触时也不变成带电荷的交联剂，在静止状态下培养混合物以同时使多糖与交联剂反应和凝胶化产物成厚片而形成。根据US 5,541,255，现有技术的电泳凝胶不能重新溶解在水中，而US 5,541,255发明提供了水不可溶解的凝胶。这些性质是由于同时交联和凝胶化产生的，同时还由于交联剂与多糖的高比率。
在色谱法中，使两种互相不能溶解的相互相接触。更具体地，将目标化合物引入移动相，它与固定相接触，目标化合物随后在由移动相携带通过***时在固定和移动相之间进行一系列的相互作用。相互作用充分利用了样品中组分的物理或化学性质的差异。在液相色谱中，液体样品，任选与合适的缓冲剂混合构成移动相，它与称为分离基质的固定相接触。通常基质包含结合了配位体的载体，配位体是能够与目标化合物相互作用的基团。
分离基质通常基于由无机材料，例如二氧化硅或有机材料，例如合成或天然聚合物等制成的载体。合成聚合物，例如苯乙烯和二乙烯基苯通常用作载体，它们显示某些疏水性，例如大小排除色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)和逆相色谱法(RPC)。此外，合成聚合物由于其流动性有时优选于天然聚合物，合成聚合物由于通常比常用的天然聚合物载体更坚硬和耐压，因而是更有利的。
天然聚合物，通常是多糖类，例如琼脂糖，作为分离基质的载体已经使用了十年，由于存在羟基，天然聚合物的表面通常是亲水的，基本上与蛋白质发生非特异相互作用。天然聚合物的另一优点是其无毒性，这在纯化用于人体内使用的药物或诊断分子中是尤其重要的。琼脂糖在升温下可溶解在水中，并随后在冷却到一定温度(凝胶点)时形成多孔凝胶。在加热时，凝胶将在某一温度(熔融点)下再次熔融。凝胶化作用包括多糖聚合物的螺旋体-螺旋体聚集，有时称为物理交联。为最佳化目标物质的传输速率和目标相互作用的区域，通常需要增加载体的多孔性，这可通过改变琼脂糖浓度实现。然而，另一考虑的基本参数是载体的流动性质。基质通常以微粒(球形或非球形)的填充床形式使用，当移动相被强制通过床层时，床层的背压由微粒之间的空隙通道控制。在低流量时，微粒可被视作不能压缩的，因而背压随流量线性增加。在较高流量下，微粒在液体静力学压力下开始变形，导致空隙通道的直径逐渐缩小，和背压的迅速增加。根据基质的刚性，在一定流量下，床层将倒塌，背压接近无穷大，除非由色谱法体系自动关闭。为改善刚性和琼脂糖的流动性质，它通常被交联，该交联在可获得的羟基之间发生，可用例如表氯醇得到。
US 4,973,683(Lindgren)涉及多孔多糖凝胶的交联，更具体地涉及改善刚性而减小多孔多糖凝胶的非特异相互作用的方法。方法包含提供琼脂糖凝胶和表示“单官能团”的试剂，它包含一个反应基团，例如卤素基团或环氧化物基团和一个双键。试剂与凝胶经其反应基团键合，双键随后被活化为环氧化物或表卤醇，它最终与琼脂糖上的羟基反应产生交联。
US 5,135,650(Hjerten等)涉及高可压缩色谱法固定相微粒，例如琼脂糖珠，它们对HPLC是足够刚性的，并无孔至溶质不可渗透的程度。更具体地，该珠状物由多孔琼脂糖珠产生，它与有机溶液接触到倒塌多孔性，随后在倒塌孔内的珠表面被交联以孔固定于其倒塌状态。或者，珠状物通过用可聚合的物质填充孔隙，其接枝与孔表面，进行接枝聚合。公开的发明的一项所述优点是一种固定相在高压下是有效的，在低压下也能够使用。
US 6,602,990(Berg)涉及制备多孔交联多糖凝胶的方法，其中将双官能交联剂加入多糖溶液中，使其经活性位置与多糖的羟基结合，随后由溶液形成多糖凝胶，然后将交联剂的失活位置活化，进行凝胶的交联。因此，与如上讨论的将交联剂加入多糖凝胶的方法相反，交联剂被引入多糖溶解中。双官能团着色剂包括一个活性位置，即能够与多糖的羟基反应的位置，例如卤化物和环氧化物，以及一个失活位置，即在活性位置反应的条件下不发生反应的基团，例如烷基。因此，现在的双官能团交联剂相应于用于上述讨论的US 4,973,683(Lindgren)中的“单官能团试剂”。由得到的凝胶组成的微粒显示出存在改善的承受高流量和背压的能力。采用US 6,602,990方法的缺点是需要使用溴活化交联剂。
最后，US 5,998,606(Grandics)涉及合成色谱法介质的方法，其中基质的交联和官能团化同时发生。更具体地，在聚合碳水化合物基质的表面提供的双键在金属催化剂存在下用表卤醇、羧基或磺酸盐活化以交联基质和官能团化。通过与含有卤素原子或环氧化物和双键的活化剂接触在基质表面提供双键。因此，US 5,998,606活化剂相应于US 4,973,683的单官能团试剂和US 6,602,990的双官能团交联剂。
因此，即使存在许多可用于生产交联多糖分离基质的方法，由于不同的应用将对基质提出不同的需求，因而在此领域仍需要可供选择的方法。
发明简述
在本发明的一个方面，其提供刚***联多糖色谱基质的方法。
在发明的另一方面，其提供制备高孔隙交联多糖色谱基质的方法。
在发明的具体方面，其提供制备刚***联多糖色谱基质的方法，该方法利用不同的材料和/或原料。在具体方面，提供了其中避免使用卤素，例如溴的方法。
在发明的另一方面，提供色谱基质，它由交联多糖微粒组成，可承受高流量和/或背压。
此外，在另一方面，提供含有交联多糖基质的一次性***，本发明的一次性***包含用微粒或膜充填的色谱柱，基本上是无菌的，可包含综合入方法所需的细节。
这些和其它目的可如所附的权利要求中所定义实现，本发明的其它目的和优点由如下详细描述将是明显的。
定义
术语分离“基质”是指由多孔或非多孔的连接了配位体的固体载体组成的材料，在色谱法领域，基质有时称为树脂或介质。
术语“目标化合物”是指在方法中是所需目标的任何化合物或其它实体。
术语“配位体”以其常规方式用于本文，即对于化学实体，它们能够与目标化合物相互作用，例如能够与带相反电荷的目标化合物在离子交换过程中相互作用的带电基团。
Kav是凝胶过滤参数(大小排除色谱法)，定义为(Ve-Vo)/(Vt-Vo)，其中Ve是测试分子峰的洗脱体积，Vo是柱的空隙体积，Vt是总床层体积。Kav是具体测试分子可达到的固定相部分的数量。
Kav DX是葡聚糖分子的KAV。在实施例中，可使用分子量为110kD、500kD和1000kD的葡聚糖。
术语“凝胶熔融点”有时在本文表示“凝胶温度”，是指溶液的聚合物物理相互作用形成固体凝胶的温度。术语“可凝胶化”是指能够形成物理凝胶。
用于本文的术语“交联剂”包括能够在聚合物之间形成交联链的化学实体；以及在合适的试剂，例如γ射线和电子轰击存在下能够提供聚合物链交联的试剂。
术语“基本上无菌”在本文中是指基本上没有可存活的微生物存在。
术语“杀菌”在本文中是指制备没有可存活的微生物的物体的方法。
发明详述
在一方面，本发明涉及制备交联多糖色谱基质的方法，该方法包括：
(a)提供至少一种可凝胶的多糖的水溶液，其中至少部分羟基被对亲核攻击不敏感的基团取代；
(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝胶；和
(d)交联凝胶。
在具体实施方案中，方法包括：
(a)提供至少一种可凝胶的多糖的水溶液，在水溶液中用对亲核攻击不敏感的基团取代多糖的至少部分羟基；
(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝胶；和
(d)交联凝胶。
在上述方法中，“对亲核攻击不敏感的”是指在取代后多糖中得到的基团的性质。
因此，在第一实施方案中，原料是聚取代的多糖，而在具体实施方案中，发明还包括取代多糖的羟基。如本领域技术人员已知的那样，在多糖的所有表面上存在可得到的羟基，因此取代基将存在于孔隙表面以及基质的内表面上。更具体地，提供的多糖已经用对亲核攻击不敏感的基团取代。因此，该基团不与羟基反应，因而有时本文表示为“非反应基团”或简单地为取代基。相对种类的基团，即在本文中是“反应的”基团是亲核基团或是易于转化成亲核基团的基团，例如烷基(易于环氧化)、环氧化物、表卤醇、α，β-不饱和羰基，它们均易于羟基反应。通过使用非反应基团，取代基的聚合物的稳定性被改善，更容易控制随后的交联步骤。在本发明中多糖中取代的羟基的部分为约10％，例如约5％，更具体地为约2％。因此，在一项实施方案中，被取代的羟基部分为1-20％，例如2-10％，更具体地为2-5％。
在本发明方法的一项实施方案中，非反应取代基选自醚、酯、酰胺和黄酸盐。在一项实施方案中，在多糖上存在的取代基是醚，例如烷基醚，例如甲基、乙基、丙基和丁基醚；羟基醚，例如羟基丙基和羟基丁基醚；甘油；低聚甘油(oligoglycerol)；低聚乙二醇或上述任何一种的聚醚。在有利的实施方案中，多糖的部分羟基被羟基乙基醚基团取代。
在另一实施方案中，在多糖中存在的非反应取代基是酯，例如烷基酯和羟基烷基酯。
在另一实施方案中，在多糖上存在的非反应取代基是酰胺，例如尿素或尿素衍生物。
在另一实施方案中，在多糖上存在的非反应取代基是黄酸盐或黄酸酯。
聚取代的多糖是商业上可得到的，例如由Cambrex Biopro-ducts，USA。在本发明的最佳实施方案中，取代的多糖是羟基乙基琼脂糖。改性多糖的方法是本领域技术人员容易获得的，参见例如US3,956,273，它涉及含有该取代的多糖的电泳凝胶。如US 3,956,273中所讨论的那样，多糖的取代降低了其凝胶温度，这被预期干扰产物的孔结构分布，显然是减弱结合的信号。然而，本发明显示相反的结果，与相应的由非取代的多糖制备的交联产物相比，本发明制备的色谱基质显示改善的流动性，参见如下实验部分。
所得到的凝胶的交联可用本领域任何已知的方法进行，例如加入与多糖的羟基反应的交联剂。
在第一实施方案中，交联是使用交联剂的已知两步法，交联剂含有一个反应基团，例如环氧化物，和一个可活化的基团，例如烯丙基，如例如参见在上述讨论的US 4,973,683中所描述的。
在另一实施方案中，交联在单一步骤中进行，加入含有两个反应基团的交联剂。因此，在该实施方案中，不需要活化交联剂。
如上所述使用的常用交联剂的实例包括异氰酸酯、环氧化物、甲醇基化合物、表卤醇、烷基卤化物或Michael加成接受剂(例如乙烯基磺酸酯)。用于本方法的交联剂是易于由商业来源获得的。
正如已知的那样，γ-射线或电子轰击可用于活化交联剂的可活化基团，在具体实施方案中，γ-射线或电子轰击用于提供多糖聚合物的交联。
在一种实施方案中，非反应取代基，即对亲核攻击不敏感的基团在交联后断裂，应当理解，断裂该基团的方式取决于基团的性质，本领域技术人员能够容易地选择用于每种情况的合适条件。在有利的实施方案中，非反应取代基是酯基，它随后通过水解断裂。如下文所讨论，多糖的可获得的羟基随后进一步官能团化至色谱基质的所需种类。
然而，即使在本方法中多糖的非反应取代基的主要作用是使得多糖溶液形成存在如实验部分所示改善的流动性质的特定交联凝胶，但它们也可用于进一步的官能团化。在一种有利的实施方案中，非反应取代基和任何残留的非取代的羟基均被官能团化。该官能团化可用进入离子交接基质的带电基团、显示生物学亲和力进入亲和力基质的基团、进入固定金属亲和力色谱法(IMAC)基质的螯合基团或进入疏水相互作用色谱法(HIC)基质的疏水基团提供。在具体实施方案中，官能团是离子交接配位体，其选自季铵(Q)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基氨基丙基(ANX)、磺基丙基(SP)和羧基甲基(CM)。因此，在另一实施方案中，非反应取代基在随后的步骤中用于连接色谱法配位体，在该实施方案中，取代基有利的是醚基。将该官能团连接于载体的方法是本领域技术人员已知的，包含在先的取代基烯丙基化和使用标准试剂和条件(参见例如Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia和Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992)。在特定实施方案中，非反应取代基构成配位体，例如通过提供与目标物质的疏水相互作用。在该HIC色谱法中，举例性的取代基可以是烷基醚基。
在具体实施方案中，用于隔开配位体与凝胶表面的基团在上述配位体偶合之前的步骤中偶合至多糖。该间隔基团称为延伸剂、柔性臂、触角等，可以是直链或支链的。适用于多糖基基质的常用亲水延伸剂是葡聚糖，它在商业上以各种分子量得到。另一种延伸剂基于合成聚合物或共聚物。技术人员可容易地用已知方法将配位体经延伸剂连接于本发明的色谱基质。此外，色谱基质可含有刺激响应聚合物，它是已知在物理刺激，例如光、磁场、温度、pH等下发生物理或化学改变的聚合物，参见例如US6,641,735(Japan Chemical InnovationInstitute)。正如已知的那样，该改变可用于影响或改善配位体的结合和/或释放。
此外，本领域已知多糖的凝胶点可通过在多糖聚合物中加入官能团改性。因此，在具体实施方案中，多糖的非反应取代基被官能团化以改变多糖的凝胶点。官能团化可加入如上所述的任何已知的基团，非反应取代基和任何残留的未取代羟基的任一或两者均官能团化到此目的。本发明包含通过本发明改性得到的多糖凝胶，例如琼脂糖的任何新形式。
多糖可选自琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、胶质、淀粉、壳聚糖、konjac、凝胶多糖、角叉胶、gellan和藻酸盐。在本发明方法的有利实施方案中，多糖是琼脂糖。在本文中，应当理解术语“琼脂糖”包含可能提供本发明牟改善刚性凝胶的任何衍生物或改性琼脂糖。在具体实施方案中，本方法利用两种或多种如上举例的多糖的混合物。
在具体实施方案中，多糖的熔融点和/或凝胶温度比相应的未取代多糖低至少约1℃。
本发明的另一方面是制备交联多糖色谱基质的方法，该方法包括：
(a)提供至少一种可凝胶的多糖的水溶液，其中部分羟基被烯丙基化；
(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝胶；和
(d)交联凝胶，期间步骤(a)的烯丙基不参与。
因此本领域技术人员应当理解交联通过利用不在步骤(a)中不被烯丙基化的羟基提供，优选通过与上述合适的交联剂反应。因此，本文中的术语“部分”羟基理解为是指“某些但不是全部”。上述的交联方法同行地适用于此实施方案。通过进行仅交联凝胶的步骤(d)，得到与常规交联基质相比存在本文的改善刚性优点的色谱基质。
因此，这方面不同于如上讨论的US 6,602,990(Berg)，其中将双官能团交联剂加入多糖溶液，使其经活性位置结合于多糖的羟基。由US 6,602,990，显然上述双官能团交联剂是例如烯丙基基团。
然而，根据本发明的此方面，在凝胶前加入的烯丙基不用于凝胶的交联，而是在凝胶后有利于转化为亲水基团，例如羟基。因此，烯丙基可以在单独的步骤，例如通过与硫代甘油或巯基乙醇反应转化为羟基，在交联后除去。该反应是在游离基条件下的加成，这是本领域技术人员容易进行的已知反应。
在另一实施方案中，在凝胶后在多糖上提供烯丙基，这不用于随后的交联，烯丙基可如上述非反应取代基中所述被官能团化。
在本发明方法的具体实施方案中，除了烯丙基，可凝胶的多糖包含被不对亲核攻击敏感的基团。
因此，本发明的通常概念是在液滴形成和凝胶前将基团加入多糖，加入的基团提供具有与不加入该基团的相应产物不同性质的最终产物。由上述方面，该基团是醚基团，它不对亲核攻击敏感，烯丙基基团或它们的组合。
在本方法的一项实施方案中，色谱基质由多孔的，基本上球形的微粒组成，微粒的平均粒径可以是10-300μm，优选30-200μm或更优选45-165μm，例如约45μm直径。该多孔的多糖载体容易地由本领域技术人员根据标准方法制备，例如逆悬浮凝胶法(S Hjerten：BiochimBiophys Acta 79(2)，393-398(1964))。例如，在制备琼脂糖时，通过首先在高于特定多糖的熔融点以上的温度下将琼脂糖溶解或分散在含水溶剂，例如水或任何其它常用溶剂中得到多糖溶液的基本上球形的液滴。如果需要，可加入porogen以确保产物的所需多孔性。在未取代多糖的情况下，它随后如上所述被取代。溶解的取代的多糖随后用常用有机溶剂，例如甲苯或庚烷在搅拌下乳化，随后降低温度至低于多糖的凝胶化点，例如室温。所生产的微粒可洗涤以除去任何痕量溶剂和如上所述交联。因此，在本方法的一项实施方案中，溶解在取代多糖在有机溶剂中乳化。在另一实施方案中，通过将在含水介质中的热凝胶化聚合物组合物喷洒到常温空气中，使雾状的组合物在空气中凝胶化得到多糖溶液的基本上球形液滴，如US 6,248,268(FMCCorporation)中所公开，该文献列为本文参考文献。在具体实施方案中，多糖的水溶液通过加热提供，通过降低温度形成凝胶。
在本方法的一项实施方案中，在凝胶化前加入porogen以提供合适的孔径，合适的porogens是本领域技术人员已知的。在本文中，色谱基质可显示至少约90％的孔隙率，例如约94％，更具体地为约96％。
本发明还包含提供用交联多糖色谱基质填充的基本上无菌柱的方法。更具体地，本方法包括：
(a)提供至少一种可凝胶化多糖的水溶液；
(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝胶；
(d)交联凝胶；
(e)在色谱柱中填充交联凝胶；和
(f)通过辐射、蒸汽或高压锅消毒填充的柱。
在具体实施方案中，本发明的方法包括一个步骤，其中将本发明得到的交联色谱基质填充在色谱柱中。在一项实施方案中，填充的柱随后进行消毒。在另一项实施方案中，本方法包括单独的多糖色谱基质的消毒和无菌填充入消毒过的填充柱中。根据此方面的色谱柱是一种通常称为一次性柱或有时称为“单用色谱柱”，对医学和/或诊断产品是尤其有利的。在本文中，应理解术语“单用”是指一次或有限数量的使用，例如1-3次使用。
在另一实施方案中，在本发明的方法中，步骤(b)被提供多糖膜的步骤替代。在具体实施方案中，膜被消毒，适用于单用色谱法。
本发明的第二方面是如上所述生产的色谱基质。在一项实施方案中，色谱基质由基本上球形的微粒组成，对110kDa的葡聚糖，显示至少约0.4，优选＞0.5的Kav值。
在另一实施方案中，色谱基质包含膜或过滤器。在另一实施方案中，色谱基质包含整体。在另一实施方案中，色谱基质包含表面、碎片、纤维等。
在具体方面，本发明的色谱基质根据上述步骤(a)-(f)制备。
本发明的第三方面是用如上所述制备的基质填充的色谱柱。在有利的实施方案中，柱由任何常规材料，例如生物适用的塑料，例如聚丙烯或玻璃制造。柱可以是适用于实验室规模或大规模纯化的尺寸。在具体实施方案中，本发明的柱用luer适配器、管状连接器和半球形帽组成。因此，本发明还包括由在单独间隔内的如上所述用色谱基质填充的色谱柱、至少一个缓冲器和用于纯化目标化合物的书面说明组成的成套用具。本发明还包括包含在任何其它形式中的色谱基质，例如在柱或容器、在间歇容器中的微粒的流化床或施用于表面，例如膜或碎片。
如上明显的是，在一项实施方案中，本发明的方法得到基本上无菌的填充色谱柱。因此，本发明色谱柱的具体实施方案是一次性或单一使用形式，其是基本上无菌。无菌或基本上无菌形式用于医药工业方法，例如其中纯度是至关重要的药物的纯化中是尤其有利的。
其它实施方案是成套装置，其包括本发明的色谱柱。成套装置可包括填充的色谱柱、管和缓冲器，装置可以基本上无菌形式提供，其中部件可以是预先装配的。
目标可以是任何生物学化合物，其选自肽、蛋白质，例如受体和抗体、核酸，例如DNA，例如质料，RNA和寡核苷酸、病毒、prions、细胞，例如原核或真核细菌、碳水化合物和其它有机分子，例如药物候选等。在具体实施方案中，目标是诊断标记。因此，用本色谱基质纯化的目标化合物可以是例如医学化合物，例如蛋白质和抗体药物、诊断化合物，例如抗原或诊断抗体，和用于治疗的细胞，例如干细胞。
本发明的最后方面是如上所述制备的色谱基质在由液体中纯化、分离或除去一种或多种目标化合物的用途。因此，这方面是如上所述的液体色谱法的方法，包括吸附目标化合物至本发明的色谱基质，和任选地选择性脱附目标的随后步骤，通常称为梯度洗提。如果需要，在吸附和洗提之间提供一个或多个洗涤步骤。此外，本用途是用于目标化合物的延迟，在此情况下，与其它组分相比，目标化合物选择性地在柱上延迟。在此情况下，不需要洗提步骤以释放目标，除非柱被再生用于其它用途。如色谱法领域已知的那样，通过填充床的压降会是主要问题，尤其是在大规模制备性色谱柱的操作中。因素，例如填充床的形状和长宽比，以及色谱基质的流动性将影响压降。本发明显示与根据标准方法制备的相应基质相比，根据本发明制备的琼脂糖色谱基质允许明显增加的流速。因此，在本用途的一项实施方案中，至少约300cm/h的液体流用于由对110kDa的葡聚糖显示至少约0.4的Kav值的基本上球形微粒组成的基质。
本发明的另一方面是本色谱基质在食品工业中用于纯化和/或分离目标化合物的用途。因此，该用途可以是例如包含由乳水中纯化乳蛋白质。与常规色谱基质相比，使用本发明色谱基质的优点是改善基质的刚性，它允许以经济流速和成本通常需要的大体积操作。
最后，根据本发明得到的色谱基质的另一具体用途是由加工液体中除去少量污染物，例如病毒或朊病毒。在此实施方案中，色谱基质可以是微粒或膜，优选单一使用的种类以能够安全处置使用的基质的污染物。
最后，在一项实施方案中，根据本发明方法制备的基质用作细胞培养的载体。在有利的实施方案中，所述载体是基本上球形载体微粒的形式，它适用于固定于表面的悬浮培养。如此培养的细胞可用作，例如在细胞治疗方案中的医学物质。基质的其它用途是用于将酶固定以生产生物催化剂。
                        实验部分
提供实施例仅用于举例说明用途，不构成对所附的权利要求中定义的本发明的限制。如下和在说明书其它部分给出的所有参考文献列为本文参考文献。
材料/研究单元
表氯醇
硼氢化钠
硫酸钠
方法
实施例1：交联琼脂糖珠的制备
将7g羟基乙基琼脂糖(NuSieveTM GTG，Cambrex)在沸水浴中在搅拌下溶解于200ml蒸馏水中30分钟。将溶液加入保持在60℃的1.5L平底玻璃容器中，容器含有2g三甘油于二异硬脂酸酯(PrisorineTM3700，Uniqema)在300ml甲苯中的溶液。在加入过程中搅拌速率(40mm涡轮搅拌器)为400rpm，随后增加到650rpm 20分钟，和800rpm 20分钟。随后通过在30分钟时间内将容器由60℃冷却到20℃凝胶化羟基乙基琼脂糖液滴。加入1L乙醇，容器中的物质搅拌15分钟，随后放置以沉降。倾析上清液，小珠在G3玻璃过滤漏斗中用乙醇和水洗涤。回收小珠的模式直径用Malvern Mastersizer光衍射装置测量为99μm。
将285g上述得到的小珠加入烧瓶中，用双桨搅拌器在200rpm下搅拌。加入137g硫酸钠，通过在200rpm搅拌下加热到50℃溶解。持续搅拌30分钟，随后达到目标温度50℃。加入10.7ml 50％NaOH，随后加入0.4g硼氢化钠。随后在7h内用DosimatTM泵(进料速率：50％NaOH-0.129ml/min，表氯醇0.190ml/min)泵送54ml 50％NaOH和80ml表氯醇。反应混合物以200rpm在50℃搅拌过夜。随后凝胶浆料用60％乙酸中和至pH 5.1，凝胶在玻璃过滤器中用水洗涤。最终将小珠通过40-160μm筛筛分。
实施例2：交联琼脂糖珠的制备
含有取代琼脂糖的凝胶形式的小珠根据实施例1制备。
小珠随后根据实施例1中的相同方法交联，只是温度始终保持在70℃。
实施例3：压力流动性能
将上述得到的小珠填充到HR 5/5柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)中，柱连接于P-900泵(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。将50％的乙醇溶液以0.5ml/min的最初流量泵送通过柱，流量随后以每30s 0.5ml/min的步骤增加直至观察到急剧的背压增加。在观察到压力增加前的最高流量为所测凝胶的最大流量，结果在如下表1中说明。
实施例4：孔隙率测定
将小珠填充入HR10柱中，得到15cm的床层高度。将柱安装在带有LCC Plus/FPLC Director、P-500泵和MV-7 UV-M检测器的FPLC***中。注射入染色的葡聚糖样品(0.1％溶液，0.2ml)，用0.05Mtris 0.15M NaCl，pH 8,0以0.2ml/min(15cm/h)流量洗脱。作为参考，柱填充(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)，以相同方式评价。结果在如下表1中说明。
结果
                                        表1
  样品   交联温度   最大流量(ml/min)   Kav*Dx1400kD   Kav*Dx500kD   Kav*Dx110kD
  实施例1   50℃   5.0   0.18   0.65   0.77
  实施例2   70℃   8.5   0.05   0.63   0.76
  SepharoseTM 4FF   -   3.5   0.06   0.56   0.69
*Kav值根据Gel Filtration Principles and Methods，Pharmacia LKBBiotechno-logy 1991(ISBN 91-97-0490-2-6)测定。
根据本发明生产的小珠具有比参考琼脂糖基质SepharoseTM 4FF较大的孔，允许相当高的流量。

Claims (26)

1.制备交联多糖色谱基质的方法，该方法包括：
(a)提供至少一种可凝胶的多糖的水溶液，其中至少部分羟基被对亲核攻击不敏感的基团取代；
(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝胶；和
(d)交联凝胶。
2.制备交联的多糖色谱基质，该方法包括：
(a)提供至少一种可凝胶的多糖的水溶液，在水溶液中用对亲核攻击不敏感的基团取代多糖的至少部分羟基；
(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝胶；和
(d)交联凝胶。
3.权利要求1或2的方法，其中对亲核攻击不敏感的基团选自醚、酯、酰胺和黄酸盐。
4.制备交联多糖色谱基质的方法，该方法包括：
(a)提供至少一种可凝胶的多糖的水溶液，其中部分羟基被烯丙基化；
(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝胶；和
(d)交联凝胶，期间步骤(a)的烯丙基不参与。
5.权利要求4的方法，其中步骤(a)的烯丙基在步骤(c)前转化或脱除。
6.权利要求4或5的方法，其中除烯丙基外，可凝胶的多糖含有被对亲核攻击不敏感的基团取代的羟基。
7.权利要求6的方法，其包含如权利要求1-3的任何一项定义的步骤。
8.上述权利要求的任何一项的方法，其中溶解的取代多糖在有机溶剂中乳化。
9.上述权利要求的任何一项的方法，其中在凝胶化前加入porogen。
10.上述权利要求的任何一项的方法，其中多糖的水溶液通过加热得到，通过降温形成凝胶。
11.上述权利要求的任何一项的方法，其中多糖是琼脂糖。
12.上述权利要求的任何一项的方法，其中多糖的凝胶点比相应的未取代多糖低至少约1℃。
13.上述权利要求的任何一项的方法，其中交联步骤包括加入交联剂。
14.上述权利要求的任何一项的方法，其中对亲核攻击不敏感的基团在交联后断裂。
15.权利要求14的方法，其中对亲核攻击不敏感的基团是通过水解断裂的酯基。
16.上述权利要求的任何一项的方法，其包括在交联后连接色谱法配位体和凝胶多糖的羟基的随后步骤。
17.上述权利要求的任何一项的方法，其包括连接色谱法配位体和凝胶多糖的烯丙基的随后步骤。
18.制备基本上无菌的交联多糖色谱基质的方法，该方法包括：
(a)提供至少一种可凝胶化多糖的水溶液；
(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝胶；
(d)交联凝胶；
(e)在色谱柱中填充交联凝胶；和
(f)通过辐射、蒸汽或高压锅消毒填充的柱。
19.制备基本上无菌的色谱柱的方法，其包括根据权利要求1-18的任何一项的方法，随后将所得到的交联色谱基质填充到色谱柱中，随后进行消毒。
20.权利要求1-17的任何一项的方法，其中步骤(b)被提供取代的多糖溶液的多糖膜的步骤替代。
21.制备基本上无菌的多糖膜的方法，其包括权利要求20的方法，随后消毒。
22.根据上述权利要求的任何一项的方法定义生产的，含有基本上球形微粒的多孔交联多糖色谱基质。
23.权利要求22的基质，其中在微粒中对110kD的葡聚糖，Kav是至少约0.5。
24.用如权利要求1-18的任何一项定义制备的或在权利要求22-23中定义的色谱基质填充的色谱柱。
25.权利要求22或23的色谱柱用于由液体中纯化、分离或除去目标化合物的用途。
26.权利要求25的用途，其中至少约300cm/h的液体流用于由对110kDa的葡聚糖显示至少约0.5的Kav值的基本上球形微粒组成的基质。
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