CN101029077B - 基因重组胰岛素前体纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明基因重组的胰岛素前体的纯化方法，涉及到胰岛素前体在重组巴斯德毕赤酵母中的表达，其特征在于用活性炭做为吸附剂，结合阳离子层析去除发酵液中的色素并对活性蛋白进行纯化，其目标蛋白回收率达到85％以上，纯度95％以上，可达到完全脱色和维持较高的回收率及纯度的双重目的，具有工艺设备简单、活性蛋白纯度及回收率高，交换容量大，速度快、成本低等优点，可满足规模化生产的需要。
Description
技术领域
本发明属于一种胰岛素的生产方法，主要涉及基因重组的胰岛素前体蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达。
背景技术
从动植物中提取天然胰岛素满足不了临床需求，利用大肠杆菌，酿酒酵母，汉逊酵母等宿主表达重组胰岛素已见报道，但产量较低(＜0.5mg/mL)。人工合成的外源猪胰岛素基因在大肠杆菌，酿酒酵母等宿主中表达；其存在着易形成包涵体，表达产率不高及产生较多杂蛋白等不足。
用毕赤酵母作为表达***克服了上述不足。用毕赤酵母作为宿主可大大提高重组胰岛素的产量(≥1.0mg/mL)，具有良好的应用前景。但毕赤酵母发酵生产重组胰岛素过程中会产生大量色素和一些杂蛋白，色素的存在严重影响下游的分离纯化。因而脱色是毕赤酵母生产的重组胰岛素初步分离的主要任务。目前文献报道的脱色和分离方法一般采用HPLC，不利于大规模生产。而采用阳离子交换层析的方法并不能完全去除毕赤酵母发酵液中的色素，疏水层析虽然能去除大部分色素，但存在着交换容量较小，或结合力太弱，或活性回收率较低等不足，使其应用受到限制。凝胶过滤也能很好地去除色素，但存在着用于分级分离的介质受上样量的限制而不能应用于规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术的不足，提出一种基因重组的胰岛素前体纯化方法。
本发明基因重组的胰岛素前体纯化方法，主要涉及到重组猪胰岛素前体蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达，对于毕赤酵母作为表达***，发酵液含有大量的色素。这些色素不但种类多，而且量大。单单一两步脱色技术达不到脱色效果。而对于胰岛素前体这种生物活性蛋白，由于要保护生物活性，在工艺上许多环境条件受到限制，如pH值，温度，盐浓度，有机溶剂浓度等等易引起蛋白变性的因素都要严格把握。
本发明基因重组胰岛素前体基因重组纯化方法，为采用活性炭与阳离子交换层析在基因重组胰岛素前体分离和脱色的新工艺技术，首先利用活性炭对发酵上清进行预处理，然后经活性炭吸附柱与阳离子交换层析在基因重组胰岛素前体分离和脱色，其工艺路线和技术方案如下：
1工艺路线
基因重组毕赤酵母→摇瓶种→发酵罐→发酵液→加入活性炭→搅拌→离心→上清液→活性炭柱→透过液→阳离子柱层析→含基因重组胰岛素前体组分洗脱液→超滤脱盐→冷冻干燥→基因重组胰岛素前体
2、技术方案
1)本发明涉及的活性炭都经预处理。用≤0.5mol/L HC1在室温下浸泡＞12h，清水洗至中性，抽滤后晾干备用。
2)本发明中涉及的色素和蛋白的分子量较高，也含有小分子色素等杂质，故采用中孔和微孔混合型的活性炭。脱色过程中产生的活性炭微细粉末用微孔滤膜抽滤除去，这样不仅使测定的吸光值更能体现实际脱色效果，而且消除了它对后续纯化的影响。
3)本发明将发酵液调节到pH值在≤5的酸性条件下，远离目标蛋白的等电点，使蛋白不易被吸附。
4)第一次加入的活性炭采用粉状活性炭，加入量为处理液的1％-3％(重量)；一般不超过处理液的3％。搅拌均匀，处理时间5-10min，一般不超过10min。后经高速离心，20-30min，去除菌体细胞和活性炭，收集上清液。吸附大量色素的活性炭废弃，不回收。
5)本发明是在室温下，第二次加入的活性炭采用固定床吸附方式。加入的活性碳为粒状活性炭，加入的量不超过处理液的5％(重量)。在第一步活性炭去除大量色素后，在经过装有活性炭的圆筒形吸附柱中，处理液从上而下连续通过，与大量活性炭接触，在底部出口处达到很高的脱色率。活性炭与处理液的接触时间不超过30分钟。这种方法利于充分发挥活性炭的效能。使用后的活性碳经酸碱法再生回收。
6)本发明中结合了阳离子交换的柱层析方法。让不带电荷的色素直接穿透，带电荷的色素与目标蛋白一起被吸附，通过改变洗脱条件，把色素和目标蛋白分开，得到高纯度的目标蛋白。用阳离子交换层析(SP)一步可去除大部分色素，同时浓缩样品。
7)本发明采用的超滤技术。将阳离子交换层析收集的目标蛋白溶液经截留分子量≤5KDa中空纤维或超滤膜组件中脱盐。收集浓缩液。在达到脱盐及交换缓冲液目的的同时进一步去除残余的色素，解决了脱色问题。
8)本发明将收集的超滤后的浓缩液真空冷冻干燥。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
本发明的目标蛋白回收率达到85％以上，纯度95％以上，可达到完全脱色和维持较高的回收率及纯度的双重目的。和其它纯化脱色方法相比，本发明具有工艺设备简单、活性蛋白纯度及回收率高，交换容量大，速度快、成本低等优点，可满足规模化生产的需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
1将预处理的粉末状活性炭，过60目筛后，称取20克，加到2升的发酵液中。玻璃棒搅拌10分钟，然后经8000转的高速离心机离心，时间20分钟，收集上清液1L。
2将预处理的粒状活性炭(20mm×40mm)，称30克，装在20cm×2.6cm玻璃柱上。用1％醋酸水溶液清洗后，用泵将收集的上清液导入柱中，控制流速在3mL/min。上样完后再用1％醋酸水溶液将样品也从活性炭柱中顶出。收集穿透液1.2L.
3阳离子填料sp550EC，取100mL装于20cm×2.6cm玻璃柱。
平衡液为pH4.0，50mmolNaAc-HAC
洗涤液为pH4.0，50mmolNaAc-HAC+0.1mol/L NaCl+40％乙醇
洗脱液为pH4.0，50mmolNaAc-HAC+0.5mol/L NaCl+40％乙醇
上样样品为经过活性炭柱的基因重组胰岛素前体收集液1.2L。流速控制为10ml/min。柱子经平衡液平衡3个柱体积(BV)后上样，再用洗涤液洗涤10BV，再用洗脱液过柱，收集洗脱峰为基因重组的胰岛素前体，共收集220ml。再生条件为：1mol/L NaCl，5BV→0.2mol/L NaOH，5BV→纯水，5BV→平衡液，5BV
4将阳离子交换层析收集的目标蛋白溶液经截留分子量3KDa中超滤膜组件。将小分子的杂蛋白和色素滤出。用pH值为3的醋酸缓冲液进行交换，得到浓缩的脱盐的基因重组胰岛素前体酸性溶液100mL。
5将超滤浓缩液真空冷冻干燥得到基因重组胰岛素前体样品。
检测结果：
将上述实施例各步得到的溶液，在波长420nm处检测吸光值。并在waters的HPLC的分析仪器上检测样品浓度和纯度，其比较整个工艺步骤的纯化脱色效果，详见下表。
Claims (6)
1.一种基因重组胰岛素前体纯化方法，其工艺过程如下：基因重组毕赤酵母→摇瓶种→发酵罐→发酵液→加入活性炭搅拌→离心→上清液→活性炭柱→透过液→阳离子柱层析→含胰岛素前体的组分→洗脱液→超滤脱盐→冷冻干燥→胰岛素前体。
2.根据权利要求1所述的基因重组胰岛素前体纯化方法，其特征于：其活性炭是用≤0.5mol/LHCl在室温下浸泡＞12h，清水洗至中性，抽滤后晾干的方法进行预处理。
3.根据权利要求1所述的基因重组胰岛素前体纯化方法，其特征于：发酵液调节pH值在≤5的酸性条件。
4.根据权利要求1所述的基因重组胰岛素前体纯化方法，其特征于：发酵液处理，以重量计，加活性炭量为发酵液的1-3％。
5.根据权利要求1所述的基因重组胰岛素前体纯化方法，其特征于：上清液通过一个装有活性炭的圆筒形吸附柱中，活性炭的量以重量计不小于待处理的上清液的3％，处理液从上而下连续通过，与活性炭接触，其接触时间≤30分钟。
6.根据权利要求1所述的基因重组胰岛素前体纯化方法，其特征于：超滤脱盐是将阳离子交换柱层析收集的基因重组胰岛素前体收集液经截留分子量≤5KDa的柱层析用中空纤维或超滤膜组件中脱盐。
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