CN101023973A - 紫草多糖提取物、含紫草多糖提取物的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供紫草及其提取物紫草多糖在制备治疗***的药物中的应用。该药物可对人***瘤病毒(human papilloma virus,HPV)导致的***有资料作用,对HPV-DNA有杀灭作用。此外本发明还提供一种紫草多糖的提取和精致方法:取紫草,粉碎,加水,回流提取,将提取液浓缩,冷却,在快速搅拌下,加入乙醇,醇沉,静置,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于蒸馏水中,加热使其充分溶解后,离心,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入乙醇,醇沉,静置,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
Description
所属技术领域
本发明涉及医药领域,具体而言是涉及紫草多糖提取物、含紫草多糖提取物的组合物及其用途。
背景技术
***(condyloma acuminatum简称CA)又称为尖圭湿疣或性病疣(Venereal Warts)或生殖器疣(Genital Warts)、或***生殖器疣(Anogenital Warts),是一种主要发生在男女性外生殖器和***部位皮肤粘膜的疾病。其发病率逐年上升,已经占我国性传播疾病的第二位。并且该病有引起恶性肿瘤的危险,其严重的危害人体的健康,因此该病越来越引起人们的重视。
传统中医学认为***属于“千日疮”的范畴,又称“瘙疳”“瘙瘊”,其发病机理多为房事不洁或间接接触秽浊之晶,湿热淫毒侵入外阴皮肤粘膜,缠绵难去,且容易耗伤正气,导致正虚邪恋,故病情反复,难以治愈。
西医认为***的发病机理主要有两个方面:一方面认为***是由于人***瘤病毒(human papilloma virus,HPV),感染所引起的性传播疾病,人***瘤病毒为乳多空病毒科A属成员,广泛存在于自然界,它是一种小分子双链DNA病毒,据基因片断序列的多态性分型,目前已确定100余型,具有72个病毒壳微粒组成的20面体衣壳及含有7900个碱基的双链环状DNA,直径50-55nm。HPV基因组是双链环状DNA,以共价闭合的超螺旋结构、开放的环状结构、线性分子3种形式存在。HPV基因组编码为9个开放读码框架,分为3个功能区即早期转录区、晚期转录区和非转录区(控制区)。早期转录区又称为E区,由4500个碱基对组成,分别编码为E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8等8个早期蛋白,具有参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能。晚期转录区又称为L区,由2500个碱基对组成,编码2个衣壳蛋白即主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2,组成病毒的衣壳,且与病毒的增殖有关,非转录区又称为上游调节区、非编码区或长调控区,由1000个碱基对组成,位于E8和L1之间。该区含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV基因表达所必需的调控元件,以调控病毒的转录与复制。另一方面认为***发病与宿主的免疫状况有关。近年来对***的研究已从HPV转移到宿主一方,并发现宿主的免疫状况,尤其是细胞的免疫状况是影响***的发生和转归的重要因素。
人***瘤病毒是***瘤病毒科的成员,除了人***瘤病毒外,***瘤病毒科还包括牛***瘤病毒、狗口腔***瘤病毒、棉尾兔***瘤病毒、多***小鼠***瘤病毒和鹿***瘤病毒。目前已经弄清楚引起***的病因是***瘤病毒中的人***瘤病毒。人是人***瘤病毒的唯一的自然宿主,迄今为止,HPV尚无动物模型,无法进行体内药效学实验,目前,我们用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)进行体外药效学试验,PCR作为一种体外扩增特异核酸技术,已经广泛应用到临床检测以及科研的研究领域,其具有高度敏感性、特异性、操作简便、快速等特点,此技术已经应用于对***的临床检测及体外药效学的研究。
目前,西医对***的治疗的治疗方法主要包括CO2激光治疗、液氮冷冻、电灼、外科手术切除、干扰素、30%的双氯醋酸、5-氟尿嘧啶以及应用免疫调节剂。但这些治疗方法及药物仅能部分清除***疣体,不能从根本上治愈,复发率很高。
中药紫草是紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物干燥的根,紫草的品种很多,其中药典收集的有2种即新疆紫草[Arnebia euchroma(Royle)Johnst]习称软紫草和内蒙紫草[Arnebia guttataBunge]。除药典已收载的以上二种紫草外,还有西藏紫草[Onosma hookeri clarke Var.LongiflorumDuthie],滇紫草[OnosmaPaniculataBur.etfranch.],习称大紫草。露蕊滇紫草[Ononsma exsertumHemsl]密花滇紫草[Onosma confertum W.W.Smith]。紫草在我国有悠久的药用历史,始载于《神农本草经》,列为中品,味甘、咸,性寒,入心、肝经,有凉血,活血,清热,解毒和透疹的作用。主治:血热毒盛,湿性斑疹,麻疹不透,疮疡,水火烫伤等。现代研究发现,从紫草中分离得到化学物质主要包括紫草萘醌类、酯类、生物碱类、苯酚及苯醌类、三萜酸及菑醇类、黄酮类以及多糖类物质。其中有活性的化学成分主要分两大类,一类是脂溶性很强的萘醌类色素及其衍生物,另一类是水溶性成分主要是紫草多糖。最为活性成分之一的紫草多糖具有抗病毒活性,抗炎的作用,能够激活巨噬细胞的吞噬功能,增强T淋巴细胞的数量和活性,增强DFH强度,促进T淋巴细胞免疫应答作用,具有促进机体特异性免疫和非特异性细胞免疫作用。目前主要利用其抗生育作用;抗炎作用、抗肿瘤、杀菌抗病毒;保肝和免疫调节的作用,也有报道紫草多糖具有抗单纯疱疹病毒I型(HSV-I)的作用,但在治疗人***瘤病毒所导致的***(condylomaacuminatum简称CA)疾病中尚未见报道。
发明内容
本发明目的是提供一种紫草多糖提取物。
本发明另一目的是提供一种利用该紫草多糖提取物制成的治疗***药物组合物。
本发明另一目的是提供该紫草多糖提取物在制备治疗***的药物中的应用
本发明紫草多糖提取物采用下述方法获得:
取紫草,回流进行提取,将提取液浓缩,冷却,加入乙醇,醇沉,静置,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于水中,加热使其充分溶解后,离心,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入乙醇,醇沉,静置,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
优选的本发明紫草多糖提取物采用下述方法获得:
取紫草25~100g,粉碎,加4~15倍量的水,75~110℃回流提取1~3次,每次0.5~1.5小时,将提取液浓缩至40~200mL,冷却,加入85%~99%的乙醇,使醇含量达到75%~84%,然后室温放置10小时以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于50mL~200mL的蒸馏水中,45~75℃加热使其充分溶解后,2000~5000转/分钟,离心5min~20min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入85%~99%的乙醇,使醇含量达到75%~84%,然后放置10小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
最佳的本发明紫草多糖提取物采用下述方法获得:
取紫草50g,粉碎,加15倍量的水,100℃回流提取3次,每次1小时,将提取液浓缩至90mL,冷却,在快速搅拌下,加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置24小时以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于100mL的蒸馏水中,60℃加热使其充分溶解后,3000转/分钟,离心15min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置24小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
本发明中,为了获得活性成分含量更高的紫草多糖提取物,可以对上述最佳方法获得的紫草多糖提取物采用下述方法进行精制:
将烘干的紫草多糖提取物加入无水乙醇50~200mL,然后搅拌浸润2~10min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法再洗涤2~4次,同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡2~4次,最后将得到的沉淀于40~80℃烘干,得到精制的紫草多糖提取物。。
进一步优选紫草多糖提取物的精致方法:
将烘干的紫草多糖提取物加入无水乙醇100mL,然后搅拌浸润5min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法再洗涤2次。同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡3次,最后将得到的沉淀于60℃烘干,得到精制的紫草多糖提取物。
本发明应用中,还可以进一步将上述方法获得的紫草多糖提取物进行精制,方法如下:
精密称取精制的紫草多糖提取物0.5~2g,加入200~1000mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭2~15g,充分混匀;放入50~95℃水浴锅中水浴10~60分钟;水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度;再重复上述脱色过程1~3次;
将脱色后的精制的紫草多糖提取物溶液定容,然后加入其体积1/8~1/2体积的三氯甲烷,再加入三氯甲烷1/8~1/2体积的正丁纯,将上述混合液剧烈振荡10~50分钟,2000~5000rp/min,离心0.5~4min,取上层水相;将上述过程重复1~3次;
将以上纯化后的精制的紫草多糖提取物水溶液定容,然后加入85~99%的乙醇,使纯含量达到75~84%,然后将其静置12小时以上,然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇,得到纯化后的精制的紫草多糖提取物。
本发明应用中,最佳的将上述方法获得的紫草多糖提取物进行精制,方法如下:
精密称取精制的紫草多糖提取物1g,加入500mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭6g,充分混匀;放入80℃水浴锅中水浴30分钟;水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度;再重复上述脱色过程一次;
将脱色后的精制的紫草多糖提取物溶液定容,然后加入其体积1/4体积的三氯甲烷,再加入三氯甲烷1/4体积的正丁纯,将上述混合液剧烈振荡30分钟,3000rp/min,离心1min,取上层水相;将上述过程重复1次;
将以上纯化后的精制的紫草多糖提取物水溶液定容,然后加入95%的乙醇,使纯含量达到80%,然后将其静置48h以上,然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇,得到纯化后的精制的紫草多糖提取物。
本发明提供了一种治疗尖锐性湿疣的药物组合物,可以用包含用上述方法获得的治疗有效量的紫草多糖提取物和药剂学上可接受的载体制成。
本发明治疗尖锐性湿疣的药物组合物,该药物组合物可以是上述方法获得的紫草多糖提取物与药剂学上可接受的载体制成药剂学上任何一种制剂。
本发明治疗尖锐性湿疣的药物组合物,可以用包含治疗有效量的按照上述方法获得的紫草多糖提取物,或者是精制的紫草多糖提取物和药学上可接受的载体按照常规制剂方法制备成常规制剂。
本发明治疗尖锐性湿疣的药物组合物,组合物中紫草多糖提取物占重重量的1%~99%。
优选的本发明治疗尖锐性湿疣的药物组合物,组合物中紫草多糖提取物占重重量的5%~50%。
最佳的本发明治疗尖锐性湿疣的药物组合物,组合物中紫草多糖提取物占重重量的8%~33%。
本发明治疗尖锐性湿疣的药物组合物,所述的可接受的载体选自淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素(Avicel,MCC)、硫酸钙、磷酸氢钙及药用碳酸钙、甘露醇、蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、甲基纤维素和乙基纤维素(MC;EC)、羟丙基甲基纤维素(HpMC)、明胶溶液、蔗糖溶液、聚乙烯吡咯烷酮(pVp)的水溶液或醇溶液、酒石酸、柠檬酸、富马酸、甜菊糖、蛋白糖、高果糖、甜蜜素、苯甲醇、苯乙醇、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、磷酸、枸橼酸、叔丁基对甲酚(BHT)、吐温-80、赤藓糖醇、山梨醇、果糖、D-核糖酸-γ-内酯、低熔点琼脂糖、***胶、木糖醇、棉子糖、葡萄糖、苹果酸、异麦芽醇、乳糖醇、糊精、麦芽糖、硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、微粉硅胶水、天然粘土硅胶铝镁、大豆磷脂、蛋黄磷脂、泊洛沙姆、甘油单油酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、硬脂酸、硬脂醇、硬脂酸甘油酯、凡士林、液体石蜡、月桂氮革酮、甘油、十二烷基硫酸钠、羟苯甲酯、羟苯丙酯、羟苯乙酯、十六醇、十八醇、丙二醇、羊毛脂、聚山梨酯80、油酸山梨坦、山梨酸、蜂蜡、石蜡、平平加O(peregol O)、蓖麻油、三乙醇胺、乳化剂OP中的一种或几种。
本发明治疗尖锐性湿疣的药物组合物,可以是口服制剂、外用制剂。
优选的本发明药物组合物,其药剂的剂型是片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、喷雾剂、滴丸剂、外用霜剂或者洗液。
本发明还提供了紫草多糖提取物在制备治疗***的药物中的应用。
本发明还提供了紫草多糖提取物在制备治疗人***瘤病毒所致的***药物中的应用。
本发明中所述的紫草多糖提取物为紫草粗多糖、以及进一步精制的紫草粗多糖、纯化后的紫草多糖。
本发明通过试验发现,紫草多糖具有治疗尖锐锐湿疣,特别是治疗人***瘤病毒所致的***的作用,本发明仅仅提供一种紫草多糖的提取方法及其紫草多糖在治疗尖锐锐湿疣,特别是治疗人***瘤病毒药物中的应用,但这并非对本发明的限制。对于用其他方法获得紫草多糖,其在制备治疗尖锐锐湿疣,特别是治疗人***瘤病毒药物中的应用均在本发明保护范围内。
本发明中所选用的紫草可以是目前常用的紫草,如是药典收集的新疆紫草[Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst]习称软紫草和内蒙紫草[Arnebia guttata Bunge]。还可以是西藏紫草[Onosma hookeri clarke Var.Longiflorum Duthie],滇紫草[OnosmaPaniculataBur.etfranch.],习称大紫草,露蕊滇紫草[Ononsma exsertum Hemsl]密花滇紫草[Onosma confertum W.W.Smith]。
本发明中所选用的紫草为药典收集的新疆紫草[Arnebia euchroma(Royle)Johnst]。
本发明中活性成分紫草多糖提取物的制备过程中,其所用原料药及其提取溶剂的用量比例在生产时可按照相应的比例增大或减少,如大规模生产时,原料药可以以公斤或以吨为单位,溶剂可以以升为单位;小规模生产也可以以克或毫升为单位,重量可以增大或减小,但各组成之间的配比比例不变。为了进一步说明本发明药物中活性成分紫草多糖提取物、紫草粗多糖、紫草多糖粉末的有益效果,以及紫草多糖的药理实验来说明本发明药物的有益效果,试验例二所用的紫草多糖按照实施例1方法获得。
试验例一.紫草粗多糖的提取
(一)提取方法
本实验采用水提醇沉法提取紫草多糖,在预试验基础上,通过正交试验优选紫草多糖的提取条件,同时用苯酚-硫酸法测定紫草多糖的含量。
1.仪器样品及试剂
紫外分光光度计(Ultrospec.4000 UV/visible spectrophotometer),旋转蒸发仪。
95%的乙醇(医用),无水乙醇(广州化学试剂厂),丙酮(天津永大化学试剂开发中心),石油醚(广州化学试剂厂),苯酚(广州化学试剂厂),浓硫酸(广州化学试剂厂),均为分析醇。
无水葡萄糖对照品(由中国生物制品检定所提供)。
新疆紫草(购自广东省中医院中药房)。
2溶液的配制
2.1.5%的苯酚溶液的配制:取苯酚100g,加铝片0.1g,NaHCO30.05g,蒸馏,收集182℃馏分,称取7.5g,加入150mL的蒸馏水溶解,置棕色瓶内。
2.2标准曲线的制备:
精密称取葡萄糖对照品50mg,105℃干燥至恒重,放入50mL的容量瓶中,加少量的水,使其溶解,然后定容至刻度,配成1mg/mL的葡萄糖溶液,精密量取葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL分别置于10mL的容量瓶中,加入蒸馏水定容至刻度,分别取以上溶液2mL放入试管中,再分别加入5%的苯酚溶液1mL,混匀,然后用移液管加入浓硫酸5mL,充分混匀,冷却后,放入100℃水浴15分钟,然后取出,放置室温。
在490nm处测定吸光度,同时用蒸馏水做一空白。结果浓度在10-140μg/mL范围内呈线性关系,实验数据做回归处理的回归方程y=0.0134x+0.038,r=0.99944。见图1。
2.3加样回收率
用移液枪精确量取浓度为280μg/mL,400μg/mL,600μg/mL,低中高三个浓度提取的紫草多糖溶液各3份,按照标准曲线的制备方法测定其多糖含量,然后在低浓度3份紫草多糖溶液各分别加入葡萄糖50μg,中浓度中加入70μg葡萄糖,高浓度中加入85μg的葡萄糖,按照标准曲线的制备方法测定其多糖含量,然后根据两次的结果计算回收率的平均值99.47%,RSD=3.2%(n=9)
2.4稳定性实验
取样品溶液在按标准曲线项的制备方法测定其吸光度,每隔0.5h测定一次,结果表明4h内,稳定性良好。
2.5精密度实验
精密称取同一样品溶液,按标准曲线项的方法连续测定6次,其吸收值分别为.0131,0.130,1.132.1.130,1.129,1.131,RSD=0.8%(n=6)
3.紫草多糖的提取
3.1为了提高紫草多糖的提取率,采用正交设计优化紫草多糖的提取条件,根据预实验的结果确定因素和水平,因素为提取次数(A),提取时间(B),固液比(C),误差(D),平均分为3个水平,见下表1
表1:因素水平表
水平 | 因素 | |||
A | B | C | D | |
1 | 1 | 0.5 | 1∶8 | |
2 | 2 | 1.0 | 1∶10 | |
3 | 3 | 1.5 | 1∶15 |
3.2提取方法
3.2.1提取
按L9(34)的正交表实验内容,取新疆紫草,剪成碎片,各称取50g,100℃回流进行提取,方法如下:将提取液浓缩至90mL,到室温后,在快速搅拌下,加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置24h以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于100mL的蒸馏水中,60℃加热使其充分溶解后,3000转/分钟,离心15min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置24小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,
3.2.2精制
将烘干的紫草粗多糖加入无水乙醇100mL,然后搅拌浸润5min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法再洗涤2次。同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡3次,最后将得到的沉淀于60℃烘干,得到紫草粗多糖。
3.2.3多糖含量的测定
精确称取以上紫草粗多糖10mg,放入10mL的容量瓶中,放入少量蒸馏水,使其溶解,然后定容至刻度。用移液管精确吸取以上配置的溶液2mL,再加入1mL蒸馏水,加入5%苯酚溶液1mL,再加入5mL浓硫酸溶液,待冷却后,放入100℃水浴15min。最后用紫外分光光度计测得其吸收值。根据其吸收值大小,通过标准曲线回归方程y=0.0134x+0.038可以求出紫草多糖的浓度,然后根据体积可以确定其多糖的含量,从而确定其提取条件的范围。
正交实验表及结果
实验号 | 提取次数(A) | 提取时间(B) | 固液比(C) | 误差(D) | 多糖含量 |
1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 12.59 |
2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 27.28 |
3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 36.41 |
4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 44.38 |
5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 55.44 |
6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 49.78 |
7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 70.79 |
8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 68.61 |
9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 60.02 |
K1 | 66.29 | 117.77 | 120.98 | ||
K2 | 149.61 | 151.33 | 131.68 | ||
K3 | 199.42 | 146.22 | 162.65 | ||
k1 | 22.10 | 39.26 | 40.33 | ||
k2 | 49.87 | 50.44 | 43.89 | ||
k3 | 66.47 | 48.74 | 54.22 | ||
R | 44.37 | 11.18 | 13.89 |
方差分析表
误差来源 | 方差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 显著性 |
A | 2557.924 | 2 | 1278.962 | 27.075 | .036 |
B | 102.462 | 2 | 51.231 | 1.085 | .480 |
C | 217.930 | 2 | 108.965 | 2.307 | .302 |
误差 |
从以上两表可以看出,最佳的提取条件是A3B2C3,即提取次数是3次,提取时间是1小时,提取的固液比是1∶15,方差分析可以看出提取次数有统计学意义。
4.紫草多糖的提取精制
根据正交试验的结果,我们按照以上的方法进行紫草多糖的提取与精制,精确称取新疆紫草300g,剪成碎片,加入水4500mL,100℃回流提取1h,共提取3次合并提取液,在旋转蒸发仪上减压浓缩到600mL,然后加入95%的乙醇,使乙醇含量达到80%,静置24小时以上,然后抽滤,取沉淀,60℃烘干,然后加入600mL的蒸馏水使其溶解,3000转/分钟,离心15min,去掉沉淀,在上清液中加入95%的乙醇,使乙醇含量达到80%,静置24h以上,抽滤取沉淀,60℃烘干。
将烘干的紫草粗多糖加入无水乙醇100mL,然后搅拌浸润5min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法在洗涤2次。同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡3次,最后将得到的沉淀60℃烘干,得到较纯的紫草粗多糖。
5.紫草多糖的鉴定。
多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物,其结构较复杂,目前多糖的鉴定主要通过化学显色法,和物理的方法,其中化学显色法主要包括Molish试验(a一萘酚试验),苯酚-浓硫酸实验,蒽酮一硫酸法试验,Fehling试验,淀粉的碘试验等,物理方法主要包括紫外光谱分析,红外光谱分析等。本实验根据我室的现有条件,对紫草多糖进行了以下两种化学显色法鉴定,鉴定结果符合多糖显色反应。
a-奈酚试验(Molish反应):称取紫草粗多糖10mg,加入5mL的蒸馏水使其充分的溶解,然后吸取1mL溶液,加入5滴a-奈酚溶液,混匀,沿管壁加入几滴浓硫酸溶液,静置10min后观察,可见两层液面中间有***花环。Molish反应的原理是,多糖类遇浓硫酸被水解成单糖,单糖被浓硫酸脱水闭环,形成糠醛类化合物,在浓硫酸存在的条件下与a-奈酚发生酚醛反映缩合反应,生成***缩合物。(2)苯酚-浓硫酸实验:称取紫草多糖10mg,然后加入10mL的蒸馏水使其充分的溶解,吸取2mL配好的溶液,加入1mL的5%苯酚溶液,再加入浓硫酸5mL,待其冷却后放入水浴锅中100℃水浴15min,观察其颜色的变化,可见颜色变为橙黄色。苯酚-浓硫酸实验原理是,多糖类遇浓硫酸被水解成单糖,并迅速脱水形成糠醛类化合物,再与苯酚缩合成橙黄色的化合物。
试验例二.紫草多糖的药理实验
***疣体标本的准备
标本采集于广州中医药大学第二附属医院皮肤病性病专科门诊,收集发生于外***位的典型新鲜***疣体标本.用电子天平精确称其重量后,放入匀浆器中加入适量的生理盐水研磨成CA混旋液,用生理盐水将其稀释成不同的比例,分别提取HPV-DNA,之后用荧光定量PCR仪扩增HPV-DNA,根据扩增阳性结果确定HPV-DNA的浓度。据此确定***疣体DNA浓度为106。
药物浓度的配置
精确称取按照实施例1方法提取的紫草多糖50mg.加入蒸馏水使药物浓度达到12.5mg/mL,,然后按照梯度的稀释方法稀释8个浓度。
3.药物与疣体的相互作用
将处理好的疣体混旋液加入到配置好的不同浓度的紫草多糖水溶液中,其中疣体混旋液和不同浓度的紫草多糖溶液各取5mL,混匀,置于37℃的水浴箱温育,期间经常摇匀,尽可能使药物与疣体组织充分作用,在温育的第1、3、5和7天分别取标本进行PCR检测。
4.荧光定量PCR检测HPV-DNA含量
4.1HPV-DNA-PCR检测的意义
大部分HPV感染无临床症状或为亚临床感染,但可致严重后果,因此,该感染不能作为一个普通的临床疾病或通过常规筛查计划或性传播疾病调查得以发现,只能通过HPV-DNA检测得知。感染HPV的型、量、持续时间决定着病变的发展与预后,是HPV检测的主要内容。由于宫颈HPV感染多为隐性亚临床感染,且HPV不能在培养环境中稳定生长,故HPV-DNA检测这一敏感而可靠的分析方法直至近10余年才较成熟。目前HPV-DNA的检测主要通过应用分子生物学方法,包括核酸杂交方法和聚合酶链反应(PCR)技术。
4.2荧光定量PCR的优势
荧光定量PCR技术是近几年发展起来的新技术。荧光定量PCR将PCR的敏感性与探针杂交的特异性相结合,在很大程度上改变了传统PCR的缺陷,而且采用闭管检测不需PCR后处理,避免了交叉污染和环境污染。采用的荧光定量检测技术可连续不断地检测PCR过程中荧光信号的变化,避免了传统PCR的“平台期效应”,准确性和灵敏度均有提高。
4.3检测的原理
TaqNan技术的要点是在普通PCR原有的一对特异性引物的基础上增加了一条特异性的荧光双标记探针(一个寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团)。该探针同样与病原体核酸特异性结合,而且结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光索,如5’端标记FAM荧光索,它发出的荧光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团,3’端一般标记TAMRA荧光素,它在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号,称为淬灭荧光基团。当PCR反应在退火阶段时,一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合,探针位于引物之间。此时探针5’端的报告荧光基团发出的荧光信号被3’端的淬灭荧光基团吸收,仪器检测不到荧光信号。当PCR反应进行到延伸阶段时,Taq酶在引物的引导下,以四种核苷酸为底物,根据碱基配对的原则,沿着模板链合成新链。当链的延伸进行到探针结合部位时,受到探针的阻碍而无法继续,此时的Taq酶发挥它的5’---3’外切核酸酶的功能,将探针切成单核苷酸,消除阻碍,将链延伸过程进行到底,合成新链。而被水解的探针其5’端和3’端的荧光素此时都游离于溶液中,5’端荧光素发出的荧光信号不再被3’端的淬灭基团吸收,荧光信号即被特殊的仪器接收。PCR进行一个循环,合成了多少条新链,就水解了多少条探针,释放了相应数目的荧光基团,荧光信号的强度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR过程的进行,重复上述过程,PCR产物呈指数形式增长,荧光信号也相应增长。如果测定每一次PCR循环结束时的荧光信号,以之为纵坐标,以PCR循环数为横坐标作图,可得一条“S”型曲线。如果标本中不含病原体,则PCR过程不进行,探针不被水解,不产生荧光信号,其扩增曲线为一水平线。以此方法测定未知标本中的病原体核酸,不仅能快速定性,还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测***和强大的信息处理能力,可以实现对病原体核酸的定量。
4.4试剂盒使用方法
采用深圳匹基公司生产的人***瘤病毒HPV(6/11型)核酸扩增荧光检测试剂盒。将标本13000r/min离心10min,去上清液,按照试剂和说明书步骤,提取瘤组织HPV-DNA。将各反应管放入ABI 7700荧光PCR检测仪上,按下列条件进行扩增:37℃ 5min;94℃ 1min;95℃ 5s;60℃ 40s。共作40个循环。反应体系设为40μL。每次检验均做阳性和阴性对照。
4.5结果分析条件设定
根据试剂盒说明书,建议使用ABI 7700荧光定量PCR仪进行结果分析时,基线(baseline)取为1-10或1-15个循环的荧光信号,阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。同时在扩增开始前或结束后设定内标标准品拷贝数。
5.实验的数据和结果
通过PCR的扩增结果和药物的浓度的计算可知,药物的最低有效浓度为0.781mg/mL.具体的结果见下表:
药物梯度 | 药物浓度(mg/mL) | 1天 | 3天 | 5天 | 7天 |
空白 | 蒸馏水 | 6.3×106 | 6.3×106 | 6.3×106 | 6.5×106 |
1∶2 | 6.250 | 阴性(<103) | 阴性(<103) | 阴性(<103) | 阴性(<103) |
1∶4 | 3.125 | 阴性(<103) | 阴性(<103) | 阴性(<103) | 阴性(<103) |
1∶8 | 1.562 | 阴性(<103) | 阴性(<103) | 阴性(<103) | 阴性(<103) |
1∶16 | 0.781 | 阴性(<103) | 阴性(<103) | 阴性(<103) | 阴性(<103) |
1∶32 | 0.390 | 5.3×106 | 阴性(<103) | 3.7×105 | 5.4×104 |
1∶64 | 0.195 | 3.7×106 | 2.6×106 | 1.2×106 | 1.1×105 |
1∶128 | 0.097 | 6.1×106 | 1.1×106 | 6.1×106 | 4.3×105 |
1∶256 | 0.048 | 6.2×106 | 2.5×106 | 6.5×106 | 9.7×105 |
表中病毒滴数的指数<103时,代表结果为阴性,即药物对病毒有作用,当扩增的病毒滴数≥103时,代表结果为阳性,即药物对病毒没有作用。
试验例三 紫草多糖的纯化
1.纯化方法
1.1活性炭脱色
精密称取紫草多糖1g,加入500mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭6g,充分混匀。放入80℃水浴锅中水浴30分钟。水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度(边加热边过滤)。再重复上述脱色过程一次,其颜色为淡黄色。
1.2去蛋白
将脱色后的紫草粗多糖溶液定容,然后加入其体积1/4体积的三氯甲烷。再加入三氯甲烷1/4体积的正丁纯。将上述混合液剧烈振荡30分钟。3000rp/min,离心1min。可见中间层可见大量絮状蛋白,取上层水相。将上述过程重复1次。
1.3乙醇沉淀
将以上纯化后的紫草多糖水溶液定容,然后加入95%的乙醇,使纯含量达到80%。然后将其静置48h以上然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇。得到纯化后的紫草多糖粉末。
1.4凝胶柱层析
1.4.1柱层析条件
凝胶柱1.5×40cm,SephadexG-100凝胶3g(北京慧得易科技有限公司)
紫草粗多糖40mg溶于4mL蒸馏水中 洗脱液 蒸馏水60mL
1.4.2方法
装柱:将SephadexG-1003g加入蒸馏水静置4h,使其充分溶胀的,充分搅拌后匀速均匀的倒入柱中。
上样:准确称取纯化后的紫草多糖40mg,加入4mL的蒸馏水,使其充分溶解后,打开活塞,使柱中的蒸馏水正好与凝胶的液面平时,用巴氏管轻轻地将样品加在凝胶的上层。加洗脱液:打开活塞,然后在柱下每5mL接一管。待样品基本浸入凝胶中,加入蒸馏水洗脱,并收集洗脱液。
样品的处理:将5mL浓缩到0.5mL,然后取出50ul做PCR试验。具体方法为取出以上柱层析后的收集液每管中各50μL,再加入***疣体标本50μL,置于37℃的水浴箱温育,期间经常摇匀,尽可能使药物与疣体组织充分作用,在温育的第1、3、5和7天分别取标本进行PCR检测。其PCR检测的方法同上。实验结果见下表,表明紫草总多糖中有一段分子量的紫草多糖对HPV病毒的作用有效。
管号 | PCR结果 |
■1 | 1.6×106 |
■2 | 2.5×106 |
■3 | 8.9×105 |
■4 | <103 |
■5 | <103 |
■6 | <103 |
■7 | <103 |
■8 | 6.5×105 |
■9 | 7.8×105 |
■10 | 2.4×104 |
■11 | 2.4×106 |
■12 | 1.6×106 |
注:表中病毒滴数的指数<103时,代表结果为阴性,即药物对病毒有作用,当扩增的病毒滴数≥103时,代表结果为阳性,即药物对病毒没有作用。
附图说明
紫草粗多糖的提取标准曲线图
具体实施方式
以下通过实施例进一步阐述本发明药物活性成分及其药物制剂的制备方法。
实施例1 紫草多糖制备实施例
取紫草50g,粉碎,加15倍量的水,100℃回流提取3次,每次1小时,将提取液浓缩至90mL,冷却,在快速搅拌下,加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置24h以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于100mL的蒸馏水中,60℃加热使其充分溶解后,3000转/分钟,离心15min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置24小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物;将烘干的紫草多糖提取物加入无水乙醇100mL,然后搅拌浸润5min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法再洗涤2次。同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡3次,最后将得到的沉淀于60℃烘干,得到紫草粗多糖。实施例2紫草多糖制备实施例
取紫草50g,粉碎,加15倍量的水,100℃回流提取3次,每次1小时,将提取液浓缩至90mL,冷却,在快速搅拌下,加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置24h以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于100mL的蒸馏水中,60℃加热使其充分溶解后,3000转/分钟,离心15min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置24小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
实施例3 紫草多糖制备实施例
取紫草,回流进行提取,将提取液浓缩,冷却,加入乙醇,醇沉,静置,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于水中,加热使其充分溶解后,离心,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入乙醇,醇沉,静置,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
实施例4 紫草多糖制备实施例
取紫草25g,粉碎,加4倍量的水,75℃回流提取2次,每次0.5小时,将提取液浓缩至40mL,冷却,加入85%的乙醇,使醇含量达到75%,然后室温放置10h以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于50mL的蒸馏水中,45℃加热使其充分溶解后,5000转/分钟,离心5min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入85%的乙醇,使醇含量达到75%,然后放置10h以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
实施例5 紫草多糖制备实施例
取紫草100g,粉碎,加15倍量的水,110℃回流提取3次,每次1.5小时,将提取液浓缩至200mL,冷却,加入99%的乙醇,使醇含量达到84%,然后室温放置24h以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于200mL的蒸馏水中,75℃加热使其充分溶解后,2000转/分钟,离心20min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入99%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置48h,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
实施例6 紫草多糖制备实施例
取紫草750g,粉碎,加12倍量的水,100℃回流提取2次,每次1小时,将提取液浓缩至60mL,冷却,加入90%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置16h,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于150mL的蒸馏水中,65℃加热使其充分溶解后,4000转/分钟,离心8min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入90%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置10h以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
实施例7 紫草多糖制备实施例
取紫草50kg,粉碎,加15倍量的水,100℃回流提取2次,每次1.5小时,将提取液浓缩至90L,冷却,在快速搅拌下,加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置36h,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于100L的蒸馏水中,60℃加热使其充分溶解后,3000转/分钟,离心15min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置24小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
实施例8 紫草多糖制备实施例
取紫草50g,粉碎,加15倍量的水,100℃回流提取3次,每次1小时,将提取液浓缩至90mL,冷却,在快速搅拌下,加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置24h以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于100mL的蒸馏水中,60℃加热使其充分溶解后,3000转/分钟,离心15min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置24小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物;将烘干的紫草多糖提取物加入无水乙醇50mL,然后搅拌浸润2min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法再洗涤2次,同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡2次,最后将得到的沉淀于40℃烘干,得到紫草粗多糖。
实施例9 紫草多糖制备实施例
取紫草90g,粉碎,加10倍量的水,90℃回流提取2次,每次1小时,将提取液浓缩至150mL,冷却,在快速搅拌下,加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置24h以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于100mL的蒸馏水中,60℃加热使其充分溶解后,3000转/分钟,离心15min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置64小时,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物;将烘干的紫草多糖提取物加入无水乙醇200mL,然后搅拌浸润10min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法再洗涤4次,同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡4次,最后将得到的沉淀于80℃烘干,得到紫草粗多糖。
实施例10 紫草多糖制备实施例
精密称取按照实施例1方法获得的紫草多糖0.5g,加入200mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭2g,充分混匀;放入50℃水浴锅中水浴60分钟;水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度;再重复上述脱色过程3次;将脱色后的紫草粗多糖溶液定容,然后加入其体积1/8体积的三氯甲烷,再加入三氯甲烷1/8体积的正丁纯,将上述混合液剧烈振荡10分钟,2000rp/min,离心0.5min,取上层水相;将上述过程重复1次;
将以上纯化后的紫草多糖水溶液定容,然后加入85%的乙醇,使纯含量达到75%,然后将其静置72h,然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇,得到纯化后的紫草多糖粉末。
实施例11 紫草多糖制备实施例
精密称取按照实施例1方法获得的紫草多糖2g,加入1000mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭15g,充分混匀;放入95℃水浴锅中水浴10分钟;水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度;再重复上述脱色过程3次;将脱色后的紫草粗多糖溶液定容,然后加入其体积1/2体积的三氯甲烷,再加入三氯甲烷1/2体积的正丁纯,将上述混合液剧烈振荡50分钟,5000rp/min,离心4min,取上层水相;将上述过程重复3次;将以上纯化后的紫草多糖水溶液定容,然后加入99%的乙醇,使纯含量达到84%,然后将其静置24h,然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇,得到纯化后的紫草多糖粉末。
实施例12 紫草多糖制备实施例
精密称取按照实施例1方法获得的紫草多糖1g,加入500mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭8g,充分混匀;放入90℃水浴锅中水浴40分钟;水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度;再重复上述脱色过程2次;将脱色后的紫草粗多糖溶液定容,然后加入其体积1/5体积的三氯甲烷,再加入三氯甲烷1/5体积的正丁纯,将上述混合液剧烈振荡30分钟,4000rp/min,离心3min,取上层水相;将上述过程重复2次;将以上纯化后的紫草多糖水溶液定容,然后加入95%的乙醇,使纯含量达到80%,然后将其静置48h,然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇,得到纯化后的紫草多糖粉末。
实施例13 紫草多糖制备实施例
精密称取按照实施例1方法获得的紫草多糖1g,加入500mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭6g,充分混匀;放入80℃水浴锅中水浴30分钟;水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度;再重复上述脱色过程一次;将脱色后的紫草粗多糖溶液定容,然后加入其体积1/4体积的三氯甲烷,再加入三氯甲烷1/4体积的正丁纯,将上述混合液剧烈振荡30分钟,3000rp/min,离心1min,取上层水相;将上述过程重复1次;将以上纯化后的紫草多糖水溶液定容,然后加入95%的乙醇,使纯含量达到80%,然后将其静置48h以上,然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇,得到纯化后的紫草多糖粉末。
实施例14 片剂制备实施例
取按照实施例1方法获得紫草粗多糖10g,淀粉80g,10%淀粉浆24g、硬脂酸镁8g、干淀粉25g;将紫草粗多糖过80目筛,与淀粉混匀,加淀粉浆制成软材,以14目筛制粒后,置70℃~80℃干燥后于12目筛整粒,加入干淀粉及硬脂酸镁混匀后,压片,制成1000片。
实施例15 颗粒剂制备实施例
取按照实施例12方法获得紫草多糖50g,糊精450g、乳糖15g,充分混合均匀,加入乙醇作黏合剂,加入适量淀粉作填充剂,制成颗粒剂。
实施例16 颗粒剂制备实施例
取按照实施例5方法获得紫草粗多糖15g,加入10g量的糖粉600g可压性淀粉混合均匀,加入70%乙醇少许,制成软材,过14目尼龙筛制粒,湿颗粒于60℃干燥,干颗粒过14目筛整粒,再过4号筛(65目),筛去细粉,制成颗粒剂。
实施例17 胶囊剂制备实施例
取按照实施例10方法获得紫草多糖1g,β-环糊精85g,淀粉浆15g,0.2g甜菊素;将紫草多糖淀粉浆与淀粉浆混匀,喷雾制粒,加β-环糊精,制成胶囊剂1000粒。
实施例18 注射液制备实施例
取按照实施例6方法获得紫草多糖5g,加注射用水适量使溶解,煮沸14分钟,放冷至室温,冷藏,滤过,滤液合并,加0.08%活性炭60℃保温10分钟,脱炭,滤液冷却至70℃以下后,加甘露醇1g,补加注射用水至适量,调pH为5~7,制成注射液。
实施例19 冻干粉针制备实施例
取按照实施例7方法获得紫草多糖50g,加注射用水适量使溶解,煮沸5分钟,放冷至室温,冷藏,滤过,滤液合并,加0.08%活性炭60℃保温25分钟,脱炭,滤液冷却至70℃以下后,加甘露醇2g,补加注射用水至适量,调pH为5~7,冻干,即得冻干粉针。
实施例20 滴丸制备实施例
取按照实施例13方法获得紫草多糖5g,木糖醇68g、***胶25g备用;
将紫草多糖加入木糖醇和***胶的混合物中,混合物在64℃加热熔融,搅拌均匀,搅拌时间为25分钟,保温,在75℃温度下滴制,滴管口径为1.4~2.5毫米,以每分钟35滴的速度滴制,滴入8℃的甲基硅油中,将形成的滴丸沥尽并擦去冷却液,待干燥后分装,制成5000粒滴丸,即得。
实施例21 分散片制备实施例
取按照实施例9方法获得紫草多糖120g、木糖醇430g、淀粉128g、微晶纤维素340g、低取代羟丙基纤维素65g、硬脂酸镁8g、75%乙醇适量;
将紫草多糖、木糖醇、淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素充分混匀,加适量75%乙醇制成软材,20目筛制粒,60℃烘干,20目筛整粒,加入硬脂酸镁混匀,压片,即得本发明分散片。
实施例22 分散片制备实施例
取按照实施例4方法获得紫草多糖18g、乳糖110g、微晶纤维素410g、羧甲基淀粉钠55g、交联聚乙烯吡咯烷酮65g、硬脂酸镁10g、乙醇适量;
将紫草多糖、乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮充分混匀,加适量75%乙醇制成软材,20目筛制粒,60℃烘干,20目筛整粒,加入硬脂酸镁混匀,压片,即得本发明分散片。
得到的分散片有如下特性:
分散均匀性:符合药典规定,即在20℃±1℃水中,三分钟应全部崩解并通过2号筛。
溶出度检查:符合规定。
实施例23 胶丸制备实施例
取明胶100g加入120g水中使其吸水膨胀,另将30g甘油加热至60℃,将膨胀的明胶加入,搅拌,熔融,保温待用;取实施例1制备的获得紫草多糖,加入适量植物油,搅匀,得原料油;将明胶液与原料油装入自动旋转轧囊机,压制成内含油状液体100mg/粒的胶丸,胶丸定型、干燥、洗涤、消毒,包装即得。
实施例24 胶丸制备实施例
取明胶100g加入140g水中使其吸水膨胀,另将30g甘油加热至70℃,将膨胀的明胶加入,搅拌,熔融,保温待用;取实施例2制备获得紫草多糖,加入植物油,搅匀,得原料油;将明胶液与原料油装入自动旋转轧囊机,压制成内含油状液体90mg/粒的胶丸,胶丸定型、干燥、洗涤、消毒,包装即得。
实施例25 胶丸制备实施例
取明胶100g加入130g水中使其吸水膨胀,另将30g甘油加热至80℃,将膨胀的明胶加入,搅拌,熔融,保温待用;取实施例3制备获得紫草多糖,加入适量植物油,搅匀,得原料油;将明胶液与原料油装入滴丸机制成内含油状液体90mg/粒的胶丸,胶丸定型、干燥、洗涤、消毒,包装即得。
实施例26 片剂制备实施例
按照实施例11获得紫草多糖50g与淀粉1∶1比例混合,将25g羧甲基纤维素钠与上述混合物混合均匀,加入75%的乙醇溶液作为黏合剂,过22目筛,40度烘箱干燥,加入适量硬脂酸镁,压片,制成300mg/片的片剂。
实施例27 包衣片剂制备实施例
将按照实施例6方法获得紫草多糖53g与17g轻质氧化镁混合,加入17g淀粉,17g乳糖,0.5%的HPMC水溶液做黏合剂,制成300mg/片的素片,以30%的尤特奇RL30D包衣,制成300mg/片的包衣制剂。
实施例28 胶囊制备实施例
将按照实施例5获得紫草多糖52g与淀粉1∶1比例混合,将25g羧甲基纤维素钠与上述混合物混合均匀,加入75%的乙醇溶液作为黏合剂,过22目筛,40度烘箱干燥,整粒,装硬胶囊,制成270mg/粒的胶囊。
实施例29 浓缩丸制备实施例
将按照实施例8获得紫草多糖53g与微晶纤维素进行混合,其中微晶纤维素的用量为紫草多糖的40%,加入水作为黏合剂制成素丸。
将上述素丸选用上海卡乐康(COLORCON)包衣技术有限公司的欧巴代(胃溶型)为本品的包衣材料进行包衣,得浓缩丸制剂。
包衣条件如下:选用水为溶解剂;包衣液浓度为20%;包衣增重5%;进风温度80℃;片床温度45℃;雾化压力2.0bar;包衣锅转速17rmp;进料流速3g/min。
实施例30 颗粒剂制备实施例
取按照实施例9获得紫草多糖53g,甲基纤维素9g,糖粉820g,混合均匀后,加入适量70%乙醇,制成软材,制粒,挥去乙醇,80℃喷雾干燥,制成颗粒剂。
实施例31 滴丸剂制备实施例
取300g聚乙二醇-6000加热至80℃,熔融后加入按照实施例13获得紫草多糖50g,搅拌均匀,移至滴丸机中,保持熔融液温度70℃,由上往下,滴速适中滴入10℃甲基硅油中,制成滴丸剂。
实施例32 滴丸剂制备实施例
取300g聚乙二醇-4000加热至75℃,熔融后加入按照实施例12获得紫草多糖53g,搅拌均匀,移至滴丸机中,保持熔融液温度65℃,由上往下,滴速适中滴入0℃液体石蜡中,制成滴丸剂。
实施例33 口服液制备实施例
将按照实施例4方法获得紫草多糖500g溶解在适量乙醇中,加入单硬脂酸甘油酯10g,蔗糖50g,充分搅拌均匀,加入蒸馏水至1000ml,过滤,灭菌,分装,即得。
实施例34 外用制剂制备实施例
取十六醇130g,硬脂酸50g,凡士林100g,液体石蜡30g,月桂氮革酮10g,按照实施例13方法获得的紫草多糖35g,甘油50g,十二烷基硫酸钠10g,羟苯乙酯0.5g,纯化水300mL;取十六醇、硬脂酸,凡士林、液体石蜡,月桂氮革酮,75℃水浴加热熔融,同向不断搅拌下将上述熔融液加至水相中,温度稍冷后再紫草多糖细粉,继续搅拌至乳剂成型,分装,制成10g/支霜剂。
实施例35 外用制剂制备实施例
取十六醇和十八醇130g、硬脂酸20g,凡士林110g,液体石蜡30g,月桂氮革酮5g,按照实施例10方法获得的紫草多糖20g,甘油50g,十二烷基硫酸钠10g,羟苯乙酯0.5g,纯化水350mL;取十六醇、十八醇、硬脂酸,凡士林、液体石蜡,月桂氮革酮,85℃水浴加热熔融,同向不断搅拌下将上述熔融液加至水相中,温度稍冷后再紫草多糖细粉,继续搅拌至乳剂成型,分装,制成5g/支霜剂。
实施例36 外用制剂乳剂制备实施例
取硬脂酸220g、十二烷基硫酸钠15g、白凡士林250g、羟苯甲酯0.25g、羟苯丙酯0.15g、丙二醇120g、按照实施例方法4获得的紫草多糖16g;取硬脂酸与白凡士林在水浴上熔化,加热至75℃,加入预先溶在水中并加热至75℃的其他成分,搅拌至冷凝,制成5g/支乳剂。
实施例36 外用制剂乳剂制备实施例
处方:取硬脂醇220g、十二烷基硫酸钠15g、白凡士林250g、羟苯甲酯0.25g、羟苯丙酯0.15g、丙二醇120g、按照实施例7方法获得的紫草多糖25g;
蒸馏水加至1000g
制法:取硬脂醇与白凡士林在水浴上熔化,加热至75℃,加入预先溶在水中并加热至75℃的其他成分,搅拌至冷凝。
实施例37 外用制剂乳剂制备实施例
处方:硬脂酸甘油酯35g、硬脂酸120g、液状石蜡60g、白凡士林10g、羊毛脂50g、三乙醇胺4ml、羟苯乙酯1g、按照实施例11方法获得的紫草多糖15g;
蒸馏水加至1000g;
制法:将油相成分(即硬脂酸甘油酯,硬脂酸,液状石蜡,凡士林,羊毛脂)与水相成分(三乙醇胺、羟苯乙酯、紫草多糖溶于蒸馏水中)分别加热至80℃,将熔融的油相加入水相中,搅拌至冷凝,制成10g/支乳剂。
实施例38 外用制剂乳剂制备实施例
处方:硬脂酸60g、聚山梨酯80 44g、油酸山梨坦16g、硬脂醇60g、液状石蜡90g、白凡士林60g、甘油100g、山梨酸2g、按照实施例11方法获得的紫草多糖15g;
蒸馏水加至1000g;
制法:将油相成分(硬脂酸、油酸山梨坦、硬脂醇、液状石蜡及凡士林)与水相成分(聚山梨酯80、甘油、山梨酸、紫草多糖及水)分别加热至80℃,将油相加入水相中,边加边搅拌至冷凝,制成15g/支乳剂。
实施例39 外用制剂乳剂制备实施例
处方:单硬脂酸甘油酯120g、蜂蜡50g、石蜡50g、白凡士林50g、液状石蜡250g、油酸山梨坦20g、聚山梨酯80 10g羟苯乙酯1g、按照实施例9方法获得的紫草多糖35g;
蒸馏水 加至1000g;
制法:将油相成分(单硬脂酸甘油酯、蜂蜡、石蜡、白凡士林、液状石蜡、油酸山梨坦)与水相成分(聚山梨酯80,羟苯乙酯、紫草多糖、蒸馏水)分别加热至80℃,将水相加入到油相中,边加边搅拌至冷凝,制成5g/支乳剂。
实施例40 外用制剂乳剂制备实施例
处方:平平加O(peregol O)25~40g、十六醇50~120g、凡士林125g、液状石蜡125g、甘油50g、羟苯乙酯1g、按照实施例9方法获得的紫草多糖15~23g;
蒸馏水 加至1000g;
制法:将油相成分(十六醇,液状石蜡及凡士林)与水相成分(平平加O,甘油,紫草多糖、羟苯乙酯及蒸馏水)分别加热至80℃,将油相加入水相中,边加边搅拌至冷,即得。
实施例41 外用制剂乳剂制备实施例
处方:硬脂酸114g、蓖麻油100g、液体石蜡114g、三乙醇胺8ml、乳化剂OP 3ml、羟苯乙酯1g、甘油160ml、蒸馏水500ml、按照实施例13方法获得的紫草多糖10g;
制法:将油相(硬脂酸,蓖麻油,液体石蜡)与水相(甘油、乳化剂OP、紫草多糖、三乙醇胺及蒸馏水)分别加热至80℃。将油、水两相逐渐混合,搅拌至冷凝,制成10g/支乳剂。
实施例42 外用制剂乳剂制备实施例
聚乙二醇3350 400g,聚乙二醇400 600g,按照实施例12方法获得的紫草多糖50g;
将两种聚乙二醇混合后,在水浴上加热至65℃,加入紫草多糖,搅拌至冷凝,即得。
实施例43 外用制剂乳剂制备实施例
按照实施例12方法获得的紫草多糖50g、硬脂酸甘油酯70g、硬脂酸100g、白凡士林120g、液状石蜡100g、甘油120g、十二烷基硫酸钠10g、羟苯乙酯1g、蒸馏水480ml
将紫草多糖研细后通过60目筛,备用;取硬脂酸甘油酯,硬脂酸,白凡士林及液状石蜡加热熔化为油相;另将甘油及蒸馏水加热至90℃,再加入十二烷基硫酸钠及羟苯乙酯溶解为水相;然后将水相缓缓倒入油相中,边加边搅,直至冷凝,即得乳剂型基质;将过筛的紫草多糖加入上述基质中,搅拌均匀即得。
实施例44 片剂制备实施例
取紫草多糖450g淀粉266g淀粉浆(15%~17%)85g滑石粉25g(5%)轻质液体石蜡2.5g酒石酸2.7g;将紫草多糖与1/3量的淀粉混匀,加淀粉浆(15%~17%)制软材10~15min,过14目或16目尼龙筛制湿颗粒,于70℃干燥,干颗粒过12目尼龙筛整粒,然后将此颗粒与乙酰水杨酸混合均匀,最后加剩余的淀粉(预先在100℃~105℃干燥)及吸附有液体石蜡的滑石粉,共同混匀后,再过12目尼龙筛,颗粒经含量测定合格后,用12mm冲压片制成1000片。
实施例45 片剂制备实施例
乳糖85g糖粉12.0g、17%淀粉浆适量紫草多糖1.3g、硬脂酸镁3.0g;将上述物质混匀,压片,即得。
实施例46 片剂制备实施例
紫草多糖250g、淀粉60g、轻质氧化镁50g、硬脂酸镁8g、滑石粉80g、淀粉浆适量;将紫草多糖、淀粉浆混合,然后加入轻质氧化镁、滑石粉(60g)及淀粉混匀,分铺烘盘上,于60℃以下干燥至含水量3%以下,然后将烘干的片(块)状物粉碎成14目以下的颗粒,最后加入硬脂酸镁、滑石粉(20g)混匀,过12目筛整粒,压片、质检、包糖衣。
施例47 泡腾片制备实施例
取按照实施例7方法获得的紫草多糖5g、木糖醇30g、预胶化淀粉5g、碳酸氢钠25g、淀粉9g、柠檬酸30g备用;
将紫草多糖、木糖醇、预胶化淀粉、酸酸氢钠、淀粉,充分混合,干燥,过筛,制粒,得到备用物;向备用物中加入柠檬酸,混匀,压片,制成每片1g的泡腾片,即得。
实施例48 泡腾片制备实施例
取按照实施例10方法获得的紫草多糖15g、木糖醇8g、***胶5g、微晶纤维素10g、枸橼酸12g、碳酸钠14g备用;
将紫草多糖、木糖醇、***胶、碳酸钠、淀粉,充分混合,干燥,过筛,制粒,得到备用物;向备用物中加入枸橼酸,混匀,压片,制成每片1g的泡腾片,即得。
实施例49 滴丸制备实施例
取聚乙二醇-4000 15.0g,加热熔化,加入按照实施例13方法获得的紫草多糖7.5g,充分搅拌使其完全熔融,分散均匀,置滴丸机的贮液筒内,95℃保温20分钟,贮液筒滴头口径内径为2.5mm,外径为4.5mm;调整滴距为10cm,以40滴/分钟的滴速匀速滴入液状石蜡冷凝液中(冷凝液上部40cm的温度为43±2℃,下部30cm的温度为4±1℃),收集滴丸,沥净,搽去滴丸表面的石蜡,放置自然干燥,制成1000粒,即得。
实施例50 滴丸制备实施例
取聚乙二醇-6000 102.5g,加热熔化,加入按照实施例6方法获得的紫草多糖15.5g,充分搅拌使其完全熔融,分散均匀,置滴丸机的贮液筒内,95℃保温20分钟,贮液筒滴头口径内径为2.0mm,外径为3.5mm;调整滴距为15cm,以35滴/分钟的滴速匀速滴入液状石蜡冷凝液中(冷凝液上部15cm的温度为10±2℃,下部30cm的温度为-3±1℃),收集滴丸,沥净,搽去滴丸表面的石蜡,放置自然干燥,制成5500粒,即得。
实施例51 片剂制备实施例
取按照实施例3方法获得紫草多糖5g,淀粉65g,8%淀粉浆15g、硬脂酸镁2g、干淀粉13g;将紫草粗多糖过80目筛,与淀粉混匀,加淀粉浆制成软材,以14目筛制粒后,置75℃干燥后于14目筛整粒,加入干淀粉及硬脂酸镁混匀后,压片,制成1000片。
实施例52 颗粒剂制备实施例
取按照实施例8方法获得紫草多糖50g,糊精35g、乳糖15g,充分混合均匀,加入乙醇作黏合剂,加入适量淀粉作填充剂,制成颗粒剂。
实施例53 颗粒剂制备实施例
取按照实施例6方法获得紫草粗多糖8g,加入10g量的糖粉,82g可压性淀粉混合均匀,加入70%乙醇少许,制成软材,过14目尼龙筛制粒,湿颗粒于70℃干燥,干颗粒过14目筛整粒,再过4号筛,筛去细粉,制成颗粒剂。
实施例54 胶囊剂制备实施例
取按照实施例13方法获得紫草多糖33g,环糊精51.8g,糖粉18g、淀粉浆15g,0.2g甜菊素;将紫草多糖淀粉浆与淀粉浆混匀,喷雾制粒,加环糊精、糖粉,制成胶囊剂1000粒。
实施例55 片剂制备实施例
取按照实施例3方法获得紫草多糖40g,淀粉40g,8%淀粉浆20g;将紫草粗多糖过80目筛,与淀粉混匀,加淀粉浆制成软材,以14目筛制粒后,置75℃干燥后于14目筛整粒,压片,制成1000片。
Claims (15)
1.一种紫草多糖提取物,其特征是由下述方法制备:
取紫草,回流进行提取,将提取液浓缩,冷却,加入乙醇,醇沉,静置,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于水中,加热使其充分溶解后,离心,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入乙醇,醇沉,静置,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
2.如权利要求1所述的紫草多糖提取物,其特征是由下述方法制备:
取紫草25~100g,粉碎,加4~15倍量的水,75~110℃回流提取1~3次,每次0.5~1.5小时,将提取液浓缩至40~200mL,冷却,加入85%~99%的乙醇,使醇含量达到75%~84%,然后室温放置10小时以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于50mL~200mL的蒸馏水中,45~75℃加热使其充分溶解后,2000~5000转/分钟,离心5min~20min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入85%~99%的乙醇,使醇含量达到75%~84%,然后放置10小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
3.如权利要求2所述的紫草多糖提取物,其特征是由下述方法制备:
取紫草50g,粉碎,加15倍量的水,100℃回流提取3次,每次1小时,将提取液浓缩至90mL,冷却,在快速搅拌下,加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后室温放置24小时以上,抽滤取沉淀,得到醇沉产物,然后将沉淀溶于100mL的蒸馏水中,60℃加热使其充分溶解后,3000转/分钟,离心15min,再抽滤弃掉沉淀,在得到的溶液中加入95%的乙醇,使醇含量达到80%,然后放置24小时以上,抽滤,得到第二次的醇沉产物,合并两次醇沉产物,得紫草多糖提取物。
4.如权利要求3所述的紫草多糖提取物,其特征是由下述方法制备:
将烘干的紫草多糖提取物加入无水乙醇50~200mL,然后搅拌浸润2~10min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法再洗涤2~4次,同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡2~4次,最后将得到的沉淀于40~80℃烘干,得到精制的紫草多糖提取物。
5.如权利要求4所述的紫草多糖提取物,其特征是由下述方法制备:
将烘干的紫草多糖提取物加入无水乙醇100mL,然后搅拌浸润5min,然后抽滤,去掉液体,得到沉淀,按照同样的方法再洗涤2次。同样依次用丙酮,***,用此方法进行洗涤,分别洗涤浸泡3次,最后将得到的沉淀于60℃烘干,得到精制的紫草多糖提取物。
6.如权利要求5所述的紫草多糖提取物,其特征是由下述方法制备:
精密称取精制的紫草多糖提取物0.5~2g,加入200~1000mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭2~15g,充分混匀;放入50~95℃水浴锅中水浴10~60分钟;水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度;再重复上述脱色过程1~3次;
将脱色后的精制的紫草多糖提取物溶液定容,然后加入其体积1/8~1/2体积的三氯甲烷,再加入三氯甲烷1/8~1/2体积的正丁纯,将上述混合液剧烈振荡10~50分钟,2000~5000rp/min,离心0.5~4min,取上层水相;将上述过程重复1~3次;
将以上纯化后的精制的紫草多糖提取物水溶液定容,然后加入85~99%的乙醇,使纯含量达到75~84%,然后将其静置12小时以上,然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇,得到纯化后的精制的紫草多糖提取物。
7.如权利要求6所述的紫草多糖提取物,其特征是由下述方法制备:
精密称取精制的紫草多糖提取物1g,加入500mL蒸馏水使其完全溶解,然后加入活性炭6g,充分混匀;放入80℃水浴锅中水浴30分钟;水浴后用滤纸过滤,过滤过程中保持液体的温度;再重复上述脱色过程一次;
将脱色后的精制的紫草多糖提取物溶液定容,然后加入其体积1/4体积的三氯甲烷,再加入三氯甲烷1/4体积的正丁纯,将上述混合液剧烈振荡30分钟,3000rp/min,离心1min,取上层水相;将上述过程重复1次;
将以上纯化后的精制的紫草多糖提取物水溶液定容,然后加入95%的乙醇,使纯含量达到80%,然后将其静置48h以上,然后去掉大部分上清液,将少部分乙醇放在的水浴锅上水浴使挥发掉乙醇,得到纯化后的精制的紫草多糖提取物。
8.一种治疗***的药物组合物,其特征在于包含治疗有效量的用权利要求1~6任一所述的紫草多糖提取物和药剂学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的治疗***的药物组合物,其特征在于所述的紫草多糖提取物占重重量的1%~99%。
10.如权利要求9所述的治疗***的药物组合物,其特征在于所述的紫草多糖提取物占重重量的5%~50%。
11.如权利要求10所述的治疗***的药物组合物,其特征在于所述的紫草多糖提取物占重重量的8%~33%。
12.如权利要求8所述的治疗***的药物组合物,其特征在于所述的可接受的载体选自淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素(Avicel,MCC)、硫酸钙、磷酸氢钙及药用碳酸钙、甘露醇、蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、甲基纤维素和乙基纤维素(MC;EC)、羟丙基甲基纤维素(HpMC)、明胶溶液、蔗糖溶液、聚乙烯吡咯烷酮(pVp)的水溶液或醇溶液、酒石酸、柠檬酸、富马酸、甜菊糖、蛋白糖、高果糖、甜蜜素、苯甲醇、苯乙醇、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、磷酸、枸橼酸、叔丁基对甲酚(BHT)、吐温-80、赤藓糖醇、山梨醇、果糖、D-核糖酸-γ-内酯、低熔点琼脂糖、***胶、木糖醇、棉子糖、葡萄糖、苹果酸、异麦芽醇、乳糖醇、糊精、麦芽糖、硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、微粉硅胶水、天然粘土硅胶铝镁、大豆磷脂、蛋黄磷脂、泊洛沙姆、甘油单油酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、硬脂酸、硬脂醇、硬脂酸甘油酯、凡士林、液体石蜡、月桂氮革酮、甘油、十二烷基硫酸钠、羟苯甲酯、羟苯丙酯、羟苯乙酯、十六醇、十八醇、丙二醇、羊毛脂、聚山梨酯80、油酸山梨坦、山梨酸、蜂蜡、石蜡、平平加O(peregol O)、蓖麻油、三乙醇胺、乳化剂OP中的一种或几种。
13.如权利要求12所述的治疗***的药物组合物,其特征在于该药物可制成药剂学上任何一种制剂。
14.如权利要求1所述的紫草多糖提取物在制备治疗***的药物中的应用。
15.如权利要求14所述的紫草多糖提取物在制备治疗人***瘤病毒所致的***药物中的应用。
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