CN101012273A - 无指盘臭蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无指盘臭蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。该活性多肽是从中国两栖类动物无指盘臭蛙基因编码的一种环状多肽，分子量1587.98道尔顿，等电点9.7，多肽全序列一级结构为：Phe Met Pro IleLeu Ser Cys Ser Arg Phe Lys Arg Cys，其第七位半胱氨酸和第十三位半胱氨酸相成分子内二硫键。编码无指盘臭蛙分泌肽的基因由300个核苷酸组成，其中编码成熟无指盘臭蛙分泌肽为第138－177位核苷酸。人工合成的无指盘臭蛙分泌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。本发明的无指盘臭蛙分泌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。

Description

无指盘臭蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用

技术领域：

本发明涉及一种无指盘臭蛙(Rana Grahami)分泌肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。

背景技术：

青霉素的发现使得人们能够对付各类病原微生物感染所引发的种种疾病，而由此衍生出的各类抗生素，更是对保护人类健康做出了巨大贡献。但是，由于人们对这些“传统抗生素”的长期使用和滥用，导致许多细菌对它们产生了耐药性。于是人们开始寻找新的抗微生物药物。近年来的研究发现，多肽类抗生素不但具有广谱的抗微生物活性，同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性：如在很小的浓度时，就可以广谱而快速地杀死微生物(包括目前临床上的耐药性菌株)；对真菌也有抑制作用；很难诱导菌株产生耐药性；对于局部感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗微生物药物。目前，针对小肽类抗微生物药物的研制受到了日益广泛的重视。

在中国属于传统中药和民族药物中，很多两栖类动物被广泛的应用，如中华蟾蜍  (Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有：抗微生物、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、对心血管***作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床阶段。如从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的活性多肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床；Intrabiotics公司生产的活性多肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验。

我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。无指盘臭蛙(Rana Grahami)主要分布于四川、云南省，是我国特色资源动物之一。

发明人将本发明的无指盘臭蛙分泌肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的无指盘臭蛙分泌肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的具有广谱抗微生物(包括革兰氏阴、阳性细菌，真菌)的无指盘臭蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：

无指盘臭蛙分泌肽：

无指盘臭蛙分泌肽是中国两栖类无指盘臭蛙分泌肽基因编码的一种环状多肽，分子量1587.98道尔顿，等电点9.7，多肽全序列一级结构为：Phe Met ProIle Leu Set Cys Ser Arg Phe Lys Arg Cys(FMPILSCSRFKRC)，其第七位半胱氨酸和第十三位半胱氨酸相成分子内二硫键。

无指盘臭蛙分泌肽基因的克隆包括：

无指盘臭蛙皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选无指盘臭蛙分泌肽基因。扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCTGT3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的5’PCR Primer引物，其序列为5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码无指盘臭蛙分泌肽的基因由300个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

atgttcacca tgaagaaatc cctgttactc cttttcttcc ttgcgaccat caacttatct    60

ctctgtgagg aagagagaaa tgcagaagaa gaaagaagag atgatccaga tgaaatgaat    120

gctgaagtgg aaaaacgatt tatgccaata cttagttgtt caaggtttaa aagatgttga    180

aacttgaatt ggaaatcatc tgatgtggaa tatcatttag ctaaatgtac atcagatgtc    240

ttataaaaaa ataaacatgc tgcatacact aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    300

编码无指盘臭蛙成熟活性多肽为第138-177位核苷酸，其氨基酸序列为：

Phe Met Pro Ile Leu Ser Cys Ser Arg Phe Lys Arg Cys

                5                   10

无指盘臭蛙分泌肽基因作为基因工程制备无指盘臭蛙分泌肽的应用。

无指盘臭蛙分泌肽的制备方法：

根据编码无指盘臭蛙分泌肽的基因推断无指盘臭蛙分泌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardmentmass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

无指盘臭蛙分泌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。

本发明的有益效果在于：

由无指盘臭蛙分泌肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的无指盘臭蛙分泌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用。该无指盘臭蛙分泌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。

具体实施方式：

实施例一：

无指盘臭蛙分泌肽基因克隆：

I、无指盘臭蛙皮肤总RNA提取：

A.活体无指盘臭蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。

B.加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为无指盘臭蛙皮肤总RNA。

II、无指盘臭蛙皮肤mRNA的纯化：

无指盘臭蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的PolyATtract^mRNA Isolation Systems试剂盒。

A.取无指盘臭蛙皮肤总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的无指盘臭蛙皮肤mRNA。

D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

III、无指盘臭蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司Creator^TMSMART^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl无指盘臭蛙皮肤mRNA、1μlSMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

2.混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心1分钟，72℃保温2分钟。

3.将离心管在冰上孵育2分钟。

4.在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。

5.混合离心管中试剂并以12000rpm离心1分钟，在42℃保温1小时。

6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。

7.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

1.95℃预热PCR仪。

2.将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2 PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

3.在PCR仪中按以下程序扩增：

①95℃    20秒钟

②22个循环：

95℃      5秒钟

68℃      6分钟

4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的Wizard^SV Gel and PCR Clean-UpSystem试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g以12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g以12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

3.重复步骤2。

4.16,000g以12000rpm离心5分钟。

5.将离心纯化柱置于新的离心管中。

6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。

7.16,000g以12000rpm离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

1.挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD₆₀₀值达到0.35时，收获细菌培养物。

2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。

3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/L MgCl₂，20mmol/L CaCl₂)重悬每份细胞沉淀。

6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

8.每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

E.酶切、连接以及连接产物的转化：

1.在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl无指盘臭蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。

2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。

3.16℃反应2小时。

4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。

7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8.每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

IV、无指盘臭蛙分泌肽基因克隆筛选：

扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCTGT3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library ConstructionKit中的3’PCR Primer引物，其序列为5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG3’。

PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒钟，52℃45秒钟和72℃2分30秒钟，35个循环。

首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

V、无指盘臭蛙分泌肽基因序列测定和结果：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST^TM SequencingPrimer RV-M和BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47，BcaBEST^TM SequencingPrimer RV-M序列：5’GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3’，BcaBEST^TMSequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’。基因测序结果自5’端至3’端序列为：

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ctctgtgagg aagagagaaa tgcagaagaa gaaagaagag atgatccaga tgaaatgaat    120

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aacttgaatt ggaaatcatc tgatgtggaa tatcatttag ctaaatgtac atcagatgtc    240

ttataaaaaa ataaacatgc tgcatacact aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    300

无指盘臭蛙分泌肽基因核苷酸的序列表为：序列长度为300个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：  无指盘臭蛙皮肤。

编码无指盘臭蛙成熟活性多肽为第138-177位核苷酸，其氨基酸序列为：

Phe Met Pro Ile Leu Ser Cys Ser Arg Phe Lys Arg Cys

                5                   10

无指盘臭蛙分泌肽基因作为基因工程制备无指盘臭蛙分泌肽的应用。

实施例二：

制备无指盘臭蛙分泌肽：

I、无指盘臭蛙分泌肽的制备方法：根据编码无指盘臭蛙分泌肽的基因推断无指盘臭蛙分泌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化。

II、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Ky。

III、纯化的无指盘臭蛙分泌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

无指盘臭蛙分泌肽是中国两栖类动物无指盘臭蛙分泌肽基因编码的一种环状多肽，分子量1587.98道尔顿，等电点9.7，多肽全序列一级结构为：苯丙氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-精氨酸-半胱氨酸(FMPILSCSRFKRC)，其第七位半胱氨酸和第十三位半胱氨酸相成分子内二硫键。

实施例三：

无指盘臭蛙分泌肽抑制细菌生长的作用：

抗菌活性检测，采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.1-0.3 mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1 ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。

表1，无指盘臭蛙分泌肽抑制细菌生长的作用：

菌株	最小抑菌浓度(ug/ml)
		无指盘臭蛙分泌肽
	大肠杆菌ATCC25922(Escherichia coli ATCC25922)金黄色葡萄球菌ATCC2592(Staphylococcus auneus ATCC2592)枯草杆菌(Bacillus sub tilis)		4.689.3737.5

由表1可见，合成的无指盘臭蛙分泌肽具有显著的抑制细菌生长的作用。

无指盘臭蛙分泌肽抑制真菌生长的作用：

抗真菌活性检测采用杯碟法，培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基。分别注入加热溶化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底均匀摊布，凝固后另取培养基适量加热溶化，分别向每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离放入已消毒的不锈钢杯5个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h-48h后测量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于云南大学微生物研究所，此实验做三个平行，取几何平均值，结果如表2。

表2.无指盘臭蛙分泌肽抑制真菌生长的作用：

菌株	最小抑菌浓度(ug/ml)
		无指盘臭蛙分泌肽
	白色念珠菌ATCC2002(Candia albicans ATCC2002)黄曲霉IFFI4015(Aspergillus flavus sp ATCC2592)		1.13.5

由表2可见，合成的无指盘臭蛙分泌肽具有显著的抑制真菌生长作用。

无指盘臭蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用_ST25

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>无指盘臭蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>300

<212>DNA

<213>Rana grahami

<400>l

atgttcacca tgaagaaatc cctgttactc cttttcttcc ttgcgaccat caacttatct    60

ctctgtgagg aagagagaaa tgcagaagaa gaaagaagag atgatccaga tgaaatgaat    120

gctgaagtgg aaaaacgatt tatgccaata cttagttgtt caaggtttaa aagatgttga    180

aacttgaatt ggaaatcatc tgatgtggaa tatcatttag ctaaatgtac atcagatgtc    240

ttataaaaaa ataaacatgc tgcatacact aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    300

<210>2

<211>13

<212>PRT

<213>Rana grahami

<400>2

Phe Met Pro Ile Leu Ser Cys Ser Arg Phe Lys Arg Cys

l               5                   10

Claims (4)

1.无指盘臭蛙分泌肽，其特征在于该多肽是中国两栖类无指盘臭蛙分泌肽基因编码的一种环状多肽，分子量1587.98道尔顿，等电点9.7，多肽全序列一级结构为：Phe Met Pro Ile Leu Ser Cys Ser Arg Phe Lys Arg Cys，其第七位半胱氨酸和第十三位半胱氨酸相成分子内二硫键。

2.无指盘臭蛙分泌肽基因核苷酸序列，其特征在于：cDNA由300个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为：

atgttcacca tgaagaaatc cctgttactc cttttcttcc ttgcgaccat caacttatct   60

ctctgtgagg aagagagaaa tgcagaagaa gaaagaagag atgatccaga tgaaatgaat   120

gctgaagtgg aaaaacgatt tatgccaata cttagttgtt caaggtttaa aagatgttga   180

aacttgaatt ggaaatcatc tgatgtggaa tatcatttag ctaaatgtac atcagatgtc   240

ttataaaaaa ataaacatgc tgcatacact aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   300

3.权利要求2所述的无指盘臭蛙分泌肽基因核苷酸序列，其特征在于，编码无指盘臭蛙成熟活性多肽为第138-177位核苷酸，其氨基酸序列为：

Phe Met Pro Ile Leu Ser Cys Ser Arg Phe Lys Arg Cys

                 5                  10

4.权利要求1所述的无指盘臭蛙分泌肽，作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。