CN100588713C - 转酯的油/脂肪或甘油三酯的生产方法 - Google Patents

转酯的油/脂肪或甘油三酯的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供含多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯，其具有高的消化和吸收性能以及对氧化损害的抵抗性，所述油/脂肪或甘油三酯适合应用于婴儿的改性乳、食品、健康食品和/增补剂等领域中，其通过使用1，3-位特异型脂肪酶将含多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯与植物油/脂肪或甘油三酯进行转酯而生产。

Description

转酯的油/脂肪或甘油三酯的生产方法
技术领域
本发明涉及通过脂肪酶转酯来改进微生物产生的油/脂肪或甘油三酯的方法，上述物质中含有多不饱和脂肪酸作为脂肪酸成分，以及涉及改进的油/脂肪或甘油三酯，并涉及含有改进的油/脂肪的人营养组合物。
背景技术
二十碳五烯酸(下文中称为“EPA”)和二十二碳六烯酸(下文中称为“DHA”)是特别以它们众多的生理功能而闻名的多不饱和脂肪酸，其生理功能包括对诸如动脉硬化和血栓症等成人病的预防作用、抗癌作用和学习增强作用，并且它们常常被用于药物和特定健康食品和/或增补品中。然而近年来，其他多不饱和脂肪酸的生理功能已经是日益增长关注的焦点。
花生四烯酸是这些多不饱和脂肪酸中的一种，其占构成诸如血液和肝脏等重要器官的脂肪酸的约10％(例如，人血液的磷脂中脂肪酸的组成比例为11％的花生四烯酸、1％的二十碳五烯酸和3％的二十二碳六烯酸)。作为细胞膜的主要成分，其涉及调节膜流动性，并在生物新陈代谢中起了各种作用，同时也作为***素的重要直接前体。近来关注的一个领域是花生四烯酸作为婴儿营养素的作用以及其作为内源性***碱(2-arachidonoyl monoglycerol，anandamide)的脂肪酸成分的存在，所述内源性***碱抑制神经刺激作用。富亚油酸食品通常转换成花生四烯酸，但优选花生四烯酸以甘油三酯的形式来直接消化，因为在成年病人和具有风险的人、婴儿以及年老者中，生物合成所涉及的酶的功能降低，而在这些人中，结果往往是缺乏花生四烯酸。
鱼油是EPA和DHA的丰富来源，但双同-γ-亚麻酸、花生四烯酸和4、7、10、13、16-二十二碳五烯酸(22:5 ω6)几乎不可能从普通油和脂肪来源中获得。当前，通常使用其脂肪酸组成为多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯且其通过用微生物发酵而获得。例如，根据一种被建议的方法，培养能生产含花生四烯酸作为脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯的不同微生物以产生含花生四烯酸作为脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯。这些方法包括为获得富含花生四烯酸的油/脂肪或甘油三酯而使用被孢霉(Mortierella)属真菌(参见，例如，日本未审查的专利公开No.63-44891和日本未审查专利公开No.63-12290)。包含发酵产生的花生四烯酸作为脂肪酸组成的甘油三酯，被用于需要花生四烯酸的目的，比如在婴儿营养领域，特别在改性乳中。
往改性乳中添加含花生四烯酸的油或脂肪的方法已经在婴儿营养领域公开(参见日本未审查专利公开No.11-151075、日本未审查专利公开No.10-191886)。用作添加剂的含花生四烯酸的油或脂肪通过真菌来生产，从分子组成的观点看，其可表征为含有6-24％的AAA(在分子中具有3个花生四烯酸残基的甘油三酯)。更高花生四烯酸含量被认为会导致更高的AAA含量(参见，例如，Jim-Wen Liu等，真菌油的体外水解：含花生四烯酸的三酰甘油分子种类J.Am.OilChem.Soc.，75，第507-510(1998))。
包含高浓度AAA的油或脂肪与植物油和脂肪的不同之处在于：在生理条件下能抵抗人的消化酶(胰脂肪酶)的作用，因而这种油和脂肪不容易被婴儿或具有低胰脂肪酶活性的老人所消化和吸收(参见，例如，Jim-Wen Liu等)。
由于人母乳的花生四烯酸含量为总脂肪酸的0.5％(参见，例如，Christie，W.W.，在《油和脂肪分析》中“脂肪酸在甘油三酯中的位置分布”，由Hamilton，R.J.和Russell，J.B编辑，第313-339页，Elsevier Applied Science，London(1986))，据推测，比如上面所述的AAA中每个甘油三酯分子存在一个花生四烯酸残基的概率比每个分子中更大的花生四烯酸缩合率的概率要大。因此，仅仅根据脂肪酸含量来往改性乳中添加由真菌发酵而获得的含花生四烯酸油或脂肪并不合乎需要。
已经作了许多尝试来用酶改变油和脂肪，以便增强它们的性能(口中的溶解度、结晶度、耐热性)。大多数已经涉及植物油或脂肪的酶改性，比如可可代用油的酶合成(参见，例如，日本未审查专利公开No.55-71797，日本未审查专利公开No.58-42697)。在此公开的生产技术用于显示高脂肪酶反应活性的植物油和脂肪，其中，富含活性低的多不饱和脂肪酸的油和脂肪对于脂肪酶反应活性是不大合适的。
由于其低酶反应活性，富含多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯还没有用于酶改性，但是已经尝试通过改变的固定化酶，使用富含中链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的油和脂肪来生产具有多不饱和脂肪酸结构的脂质(参见日本未审查专利申请公开No.8-214891，PCT/JP02-06702)。根据这种方法，甘油三酯的1和/或3位的脂肪酸被辛酸取代，从而释放出游离的多不饱和脂肪酸。因而富含多不饱和脂肪酸的油或脂肪并不是所期望的产品。另一个劣势是需要进一步纯化技术比如精密蒸馏等来除去游离脂肪酸。
Fujimoto等详细研究了油/脂肪结构对多不饱和脂肪酸氧化稳定性的影响，研究基于下述事实：鱼油(特别是富含EPA和DHA的油)容易氧化，而添加抗氧化剂并不能获得足够的氧化稳定性(参见，例如，Fujimoto，K.“油和脂肪结构对多不饱和脂肪酸氧化稳定性的影响”，Science and Industry，75，pp.53-60，Osaka IndustrialResearch Association(2001))。而发现通过将特定的脂肪(C8和C14中链脂肪酸的甘油三酯)加入沙丁鱼油(富含多不饱和脂肪酸)中、并用位置非特异型的脂肪酶来实施转酯，可改善氧化稳定性，在检查化学合成的多不饱和脂肪酸甘油三酯EEE(tri-EPA)的氧化反应的容易程度、以及比较在分子中分散有多不饱和脂肪酸和在相同分子中具有更高缩合的类型后，证实分散类型是令人满意的。
转酯已被公开为一种稳定油和脂肪的方法，以防止鱼油等中多不饱和脂肪酸的氧化(参见日本未审查专利申请公开No.6-287593)。然而，鱼油等中的多不饱和脂肪酸对用于转酯反应的脂肪酶而言具有低反应活性。因此，根据这种方法，为了确保脂肪酶活性，大量使用具有高脂肪酶活性的植物油或脂肪，以稀释由鱼油等纯化而得的含一种或多种多不饱和脂肪酸的油。结果，在稳定的油或脂肪中不可能实现多不饱和脂肪酸含量增加。
发明公开
因此，所需目标是提供含多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯，其能应用于婴儿的改性乳、食品和健康食品和/或增补剂等领域中，并且能表现出诸如容易消化、吸收以及对氧化损害的抗性等性能。为了实现这个目标，本发明提供了一种通过脂肪酶转酯反应来对包含诸如花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯进行改进的方法，以生产出具有分散的多不饱和脂肪酸的油和脂肪，并且提供了含有它们的组合物和包含它们的食品或健康食品和/或增补剂。
富含多不饱和脂肪酸的油/脂肪或具有高多不饱和脂肪酸含量并表现出高的消化和吸收性能以及对氧化损害抵抗性的甘油三酯，通过下述方式成动获得：50-100重量份的一种或多种包含至少20％由真菌产生的含20个或更多碳原子以及2个或更多双键的多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯与0-50重量份的一种或多种植物油/脂肪或甘油三酯在脱氧状态下使用1，3-位特异型脂肪酶进行转酯，所述转酯中伴有温度上升。
附图的简要说明
图1表示的是棕榈油和大豆油在转酯反应中对三花生四烯酸甘油三酯(AAA)减少的影响。
发明详述
特别地，本发明提供了一种适合商业化生产通过转酯反应转化的油和脂肪的方法，该方法通过下述方式得以完成：发现一种可使用固定化酶来增加热稳定性并允许酶在高反应温度下使用的方法，并且固定化酶自身中的氧可以被除去以避免在高温下反应期间原料/反应油的氧化损害，从而防止氧化损害并完成实际的酶反应；和发现一种方法来在酶活化之后有效率地除去用于酶活化的水分，从而使游离脂肪酸、甘油一酯和甘油二酯的量最小化，这些物质在转酯发生于水解和酯合成反应达平衡时作为副产品产生，从而完成实际的酶反应。
因此，本发明提供了一种通过转酯反应来生产可食用的转酯油和脂肪的方法，其使用真菌生产的含多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯作为原料，以及提供了包含油和脂肪的组合物。
由于母乳脂质的花生四烯酸含量小于1％重量，因而推测在每个甘油三酯分子中最多仅仅存在1个花生四烯酸残基。由属于被孢霉属的真菌发酵产生的富含花生四烯酸的油/脂肪(SUNTGA40S：SuntoryCo.，Ltd.的商品名)中的分子种类见表1。
表1 SUNTGA40S中花生四烯酸的形式
  分子种类   含量(wt％)
  AAA   10.57
  XAA   37.56
  XXA   26.52
  XXX   25.35
在此，A代表与甘油三酯相键合的花生四烯酸，X代表与甘油三酯相键合的非花生四烯酸的脂肪酸。具体而言，“AAA”代表在分子中具有3个花生四烯酸残基的甘油三酯，“XAA”代表具有2个花生四烯酸残基和1个非花生四烯酸的脂肪酸残基的甘油三酯，“XXA”代表具有1个花生四烯酸残基和2个非花生四烯酸的脂肪酸残基的甘油三酯。包含花生四烯酸的甘油三酯构成了总甘油三酯的74.7％，但这由26.52％的XXA和48％的AAA或XAA所组成，XXA被推测存在于母乳中，而AAA或XAA被认为是不存在的。据信，与母乳中相接近的花生四烯酸形式可通过将48％的AAA和XAA转化成XXA形式而获得。
本发明人试图在脱氧条件下使用1，3-位特异型脂肪酶来生产转酯的油和脂肪，其目的是改进前述通过发酵产生的富含真菌花生四烯酸的油/脂肪和甘油三酯。结果，发明人成功地将原料AAA甘油三酯的1、3位结合的花生四烯酸分散，同时也接近了人母乳的结构形式(XXA)所述AAA甘油三酯大量存在于真菌花生四烯酸油和脂肪中并不能被消化和吸收。
通过该转酯方法改性的油和脂肪可被用于大量目的，包括添加入婴儿营养领域的改性乳中，以及用作食品和健康食品和/或增补品。酶活化和脱氧的方法
通过酶促转酯来改进油和脂肪的方法已经长期以来得以应用，在现有技术文献中也有描述。本发明的富含花生四烯酸的油和脂肪包括许多花生四烯酸残基，比如AAA，其不易在生理脂肪酶反应条件下具有功能，这就对转酯中酶活性而言构成了一个问题。为增大转酯效率，需要通过固定化脂肪酶和针对增大的反应温度赋予耐热性从而来改善转酯速度(参见，例如，日本未审查专利公开No.8-214891，PCT/JP02-06702)。然而，当在高温下实施反应以改善反应效率时，作为原料的富含花生四烯酸的油或脂肪倾向于发生氧化损害。特别当使用固定化酶时，除去已经渗入固定化树脂中的氧气则造成了问题。因此，本发明人发现了一种从固定化酶中有效除去氧气的方法，并开发了一种在低氧气条件下转酯的方法。
POV(过氧化值)广泛用作指示油或脂肪氧化损害程度的一个参数。在反应***中氧的量对转酯反应是变化的，通过测定POV可对油或脂肪氧化损害程度进行比较。氧的量在下面4个水平上进行调节：最高脱氧水平＝“脱气和充氮”，通过普通充氮来进行氮置换的水平＝“充氮”，反应容器绝对没有氮置换的水平＝“无氮置换”。与无氮置换相对照仅仅使用固定化酶＝“对照的”。在30℃、45℃和55℃的温度下反应预定时间之后，测定POV值。如图2所示，POV与残留氧的量成正比例而上升，特别地，在通过普通充氮来进行氮置换的水平下，由于POV随着“冲氮”脱气条件中反应温度的增加而上升，因而脱氧被认为是不充分的。这意味着这种条件下的反应不能防止油或脂肪的劣变，并且这些结果表明，通过将脱氧增加到下一水平“脱气且冲氮”可以抑制POV增加，从而获得充分优质的油或脂肪。
表2 不同条件下反应的POV
  30℃，1天   45℃，3天   55℃，1天
  脱气且充氮   0.87   0.88   0.87
  充氮   1.07   1.23   2.75
  无氮置换   1.28   1.86   3.15
  对照的   2.69   4.50   4.05
(POV：meq/kg 油/脂肪)
在得列马根霉(Rhizopus delemar)(现用名：米根霉(Rhizopusoryzae))脂肪酶的情况中，必需加入小量的水分(约2％)来活化酶。这就需要一个步骤来除去在活化固定化酶中的过量水分。该步骤也必须伴有脱氧步骤，其可以与酶活化或水分除去步骤同时实施。在酶活化阶段，将油或脂肪原料和小量的水加入固定化酶中，并在30-45℃下进行反应约1天以活化酶。对于固定化酶简单活化而言，可使用便宜的植物油或脂肪来代替昂贵的含多不饱和脂肪酸的油或脂肪。除氧可以在往固定化酶中加入含水分的油或脂肪原料的阶段之前或者期间进行，并使用真空装置如真空泵来对油或脂肪原料以及固定化酶进行脱气，同时当压力恢复到普通压力时允许氮气而非空气的泄漏。固定化酶中的氧可以通过重复这种真空/压力恢复步骤来除去。在活化反应完成后，移出油或脂肪，并进一步重复上述真空/氮气泄漏步骤来从吸收了油/脂肪的固定化酶中除去氧。然后，加入除氧(氮置换)的油/脂肪原料来进行转酯，转酯可以在防止油或脂肪甚至在高温条件下的氧化损害的同时得以完成。
除去用于酶活化的水分或者除去存在于酶中的酶的方法
必须除去前述步骤中活化的固定化酶中的过量的水分。过量水分的存在促进了通过脂肪酶进行的水解，并导致在转酯期间甘油二酯、甘油一酯的次级生产。为防止这种生产，有必要从反应体系中除去过量的水分。过量的水分可以通过下述方式除去：从活化的固定化酶中移出用于活化的油/脂肪，用反应原料的油/脂肪(已经被脱氧或脱水的油或脂肪)冲洗一次，然后使其在45℃下与粗制油/脂肪反应一天。该后续反应产生了转酯的油或脂肪，其具有低量的甘油二酯等。如果目的是降低生产成本，则可以在活化和除去水分的反应中，使用经济的植物油或脂肪，比如棕榈油来代替昂贵的含多不饱和脂肪酸的油或脂肪。
虽然用水对酶进行活化在得列马根霉的固定化酶的情况中是必要的，但是一种市售的固定化酶(Rhizomucor miehei脂肪酶ChirazymeL-9，c.-f.，C2，lyo，Berlinger Mannheim的产品)不要求用水进行活化，由于在该固定化酶中存在痕量的水因而其处于活化的状态。然而，在这种固定化酶中也存在过量的水分，因而如R.delemar的情况中一样，水分也必须被除去。用于水分除去的方法可以是上面所述的方法，且不需要特别的步骤。氧气的除去也可在该酶的脱水步骤中实施。
酶反应的反应器
基于分批***的转酯，已经在上面对酶反应作了解释。
对于使用固定化酶对一种或多种油或脂肪转酯的方法而言，柱***是分批***的一个选择。具体而言，将固定化酶填入柱型加套容器中，将油或脂肪原料引入柱中，同时温育或加热来调整柱温度，并从出口取出转酯的油/脂肪。在一些情况中，油/脂肪在通过柱的同时可以进行循环，以增大转化率。在此，在活化或除去水分期间可将油/脂肪原料通过柱，以使内部的固定化酶暴露于油，并结合真空脱气和强制充入氮气来除去氧气。油或脂肪可在活化和除去水分之后进行转酯。
用于转酯的油/脂肪原料
当一种或多种含有多不饱和脂肪酸作为脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯以50-100重量份与0-50重量份的一种或多种植物油/脂肪或甘油三酯相混合，获得了均匀的液体油或脂肪，并可如已经所描述的用脱氧固定化酶来实施转酯，从而获得含多不饱和脂肪酸的改性油或脂肪。
<植物油/脂肪>
用于反应的植物油或脂肪原料可以是食品中所普遍应用的。所用的植物油和脂肪也可是转化的油和脂肪。这种植物油和脂肪被用作转酯中饱和脂肪酸的来源。作为实例可以提到富含亚油酸的油，比如大豆油、红花油、橄榄油、米糠油、芝麻油等，富含油酸/亚油酸的油和富含饱和脂肪酸的油，比如棕榈油、棕榈仁油、可可油、椰子油、猪油等，以及通过由植物油的甘油三酯，比如MCT(含有8个碳原子的饱和中链脂肪酸以及10个碳原子的饱和中链脂肪酸、且由相同或不同脂肪酸所构成的甘油三酯)转化而获得的油。由于对氧化的抵抗性以及与母乳成分的更大相似性，优选富含饱和脂肪酸的油和脂肪。
当对转酯中用作饱和脂肪酸原料的植物油和脂肪进行比较时，比如富含饱和脂肪酸的棕榈油和相对富含不饱和脂肪酸的大豆油，在转酯期间AAA减少的速度对两种油而言大致相同，也没有发现AAA含量具有不同，因此，这些被认为表现了朝更高可消化和可吸收油/脂肪发展的一个改进效应。然而，由于转酯反应所引入的脂肪酸的差异，在对氧化损害的抵抗性上发现了一些差异。
MCT、特别是含有辛酸作为脂肪酸组成的甘油三酯，和微生物花生四烯酸甘油三酯根据本发明通过脂肪酶进行转酯，从而产生含有花生四烯酸作为脂肪酸组成的甘油三酯，比如“8A8”、“88A”。这种方法可用来经济地生产含有花生四烯酸的油和脂肪，而没有花生四烯酸的浪费，所得的含花生四烯酸的油和脂肪可用作新的具有改善消化性和吸收性的油和脂肪。
也可提到从这些油或脂肪中分离出的油和脂肪，或者通过部分氢化从而具有增大的饱和脂肪酸含量的油和脂肪，尽管可用的油和脂肪并不局限于这些。
<含有多不饱和脂肪作为脂肪酸组成的油/脂肪>
培养能产生含有多不饱和脂肪酸作为脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯的微生物是必要的。在此，微生物优选能产生ω6、ω9或ω3系列多不饱和脂肪酸中的至少一类，所述多不饱和脂肪酸具有20或更多个碳原子以及2个或更多个双键，并主要作为甘油三酯的脂肪酸组成。
作为具有20或更多个碳原子以及2个或更多个双键的ω6、ω9或ω3系列多不饱和脂肪酸，可以提到双同-γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸：DGLA)、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(20:4ω6)、DPAω6(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)、8，11-二十碳二烯酸、蜂蜜酸(5，8，11-二十碳三烯酸)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4ω3)、EPA(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、DPAω3(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)和DHA(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。
因此，根据本发明，可使用任何可产生含多不饱和脂肪酸作为脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯的微生物。作为能产生含花生四烯酸作为脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯的微生物实例，可提到属于被孢霉属、耳霉属、腐霉菌、疫霉菌、青霉菌、分支孢子菌、毛霉菌、镰刀菌、曲霉菌、红酵母、虫霉属或水霉菌的微生物。作为属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物，可提到长形被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜湿被孢霉(Mortierellahygrophila)、高山被孢霉(Mortierella alpina)等。具体而言，可提到下述菌株：比如长形被孢霉IF08570、微小被孢霉IF08571、喜湿被孢霉IF05941、高山被孢霉IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等。作为产生DHA微生物的实例，可提到那些属于Crypthecodenium、Thrautochytrium、Schizochytrium、Ulkenia、Japonochytrium、Haliphthoros等的微生物。
这些菌株都可无限制地从发酵研究所(the Institute forFermentation)，Osaka(IFO)，美国典型培养物保藏中心(ATCC)和真菌菌种保藏中心(CBS)获得。此外，也可使用本发明人研究组从土壤中分离出的长形被孢霉SAM0219(FERM P-8703)(FERM BP-1239)。
为培养用于本发明的菌株，将孢子、菌丝或由预培养而获得的种子培养液或者从种子培养液中收集的细胞接种到用于主培养的液体或固体培养基中。在液体培养基的情况中，所用碳源可以是任何普遍应用的，比如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、溶解的淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇或糖化淀粉，然而并不限于这些。作为氮源，可使用有机氮源，包括天然碳源，比如蛋白胨、酵母提取物、麦芽膏、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、大豆蛋白、脱脂大豆、棉籽粉等，以及尿素和无机氮源，比如硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵，特别可提到源自大豆的氮源，比如大豆、脱脂大豆、豆饼、可食性大豆蛋白、豆奶渣(豆腐下料)、豆浆、干大豆粉等。更特别地，可使用一种或多种类型的热变性脱脂大豆，更优选在约70-90℃下热处理并除去其乙醇可溶性成分后的脱脂大豆，或者前述氮源的结合。如果需要，也可使用磷离子、钾离子、钠离子、镁离子和钙离子以及诸如铁、铜、锌、锰、镍、钴等金属的离子或者维生素作为微量营养源。
这些培养基成分没有特别限制，只要其浓度不致于抑制微生物的生长。在实践中，通常以0.1-40wt％、优选以1-25wt％的总量加入碳源并以2-15wt％且优选2-10％的总量加入氮源，更优选地，初始碳源以1-5wt％加入，初始氮源则以3-8wt％加入，之后在培养期间加入碳源和氮源、更优选仅仅加入碳源。为增加多不饱和脂肪酸的产出，可单独或结合使用下述物质作为不饱和脂肪酸的前体：举例而言，烃，比如十六烷或十八烷；脂肪酸，比如油酸或亚油酸或其盐，或者脂肪酸酯，比如乙酯、甘油脂肪酸酯或山梨聚糖脂肪酸酯；或者油，比如橄榄油、大豆油、菜子油、棉籽油或椰子油。所加底物的量可以是培养基的0.001-10wt％，优选为0.5-10wt％。任何这些底物都可用作进行培养的单独碳源。
产多不饱和脂肪酸的微生物的培养温度可以根据微生物而不同，但可以是5-40℃、优选20-30℃，或者可在20-30℃下培养细胞以生长，并在5-20℃持续培养以产生多不饱和脂肪酸。也可使用这种温度管理来增加多不饱和脂肪酸在所产生脂肪酸中的比例。培养基的pH值可以是4-10且优选5-9，培养方法可以是浸没培养、震荡培养、固体培养或固定液体培养。培养通常可以实施2-30天，优选为5-20天，最优选5-15天。
属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物被认为是能产生含花生四烯酸作为主要脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯的微生物，但是，通过变异前述菌株，本发明人已经获得了能产生含有双同-γ-亚麻酸作为主要脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯的微生物(参见日本未审查专利公开No.5-91887)和能产生含有ω9系列多不饱和脂肪酸作为主要脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯的微生物(参见日本未审查专利公开No.5-91888)。此外，本发明人已经获得了对高浓度碳源具有抗性的微生物(PCT专利公开WO 98/39468)，其是属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物。然而，本发明并不限于被孢霉属被孢霉亚属的微生物，任何能产生含多不饱和脂肪酸作为脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯的微生物都可以使用。
作为从上述方式培养的微生物中获得粗制油的方法，将培养液用普通固/液分离方法比如自然沉淀、离心分离和/或过滤来直接处理，或者在诸如灭菌、浓缩、酸化等处理之后进行分离处理，从而获得培养细胞。也可加入絮凝剂或助滤剂来促进固/液分离。作为絮凝剂可使用例如氯化铝、氯化钙、藻胶、壳聚糖等。作为助滤剂可使用例如硅藻土。优选对培养细胞进行冲洗、粉碎和干燥。干燥可通过冻干、吹干、流化床干燥等来实施。从干细胞中获得粗制油的方法可以是用有机溶剂提取或压榨，但优选在氮气流下用有机溶剂来实施提取。作为有机溶剂可使用乙醇、己烷、甲醇、氯仿、二氯甲、石油醚、丙酮等，也可采用甲醇/石油醚交替提取或也可使用氯仿-甲醇-水单层溶剂。然而，用来获得粗制油的提取方法不限于这些方法，任何能从细胞中有效提取油和脂肪的方法都可以使用。例如，可采用超临界提取作为有效方法。
通过在减压等条件下从用有机溶剂或超临界流体提取而获得的提取物中除去有机溶剂或超临界流体组分，可以获得所需的粗制油。作为上述方法的代替方案，也可使用湿细胞来实施提取。在这种情况中，使用与水相容的溶剂比如甲醇、乙醇或丙酮，或者含有这些溶剂以及水和/或另外的溶剂的与水相容的混合溶剂。另外，步骤则与上面所述的相同。
也可使用纯化油或脂肪而非粗制油来作为转酯的底物。油或脂肪的纯化步骤可通过普通方法比如脱胶、脱酸、蒸汽蒸馏、脱色、柱处理、分子蒸馏、过冬等来完成。
<用于转酯的脂肪酶>
作为用于本发明的脂肪酶实例，可提到那些由属于根霉属(Rhizopus)、根毛霉属(Rhizomucor)、曲霉属等微生物产生的脂肪酶，以及猪胰脂肪酶。这种酶可以是市售的。其实例包括得列马根霉脂肪酶(脂肪酶，Tanabe Seiyaku的产品)(得列马根霉当今分类学上的分类是米根霉)、雪白根霉脂肪酶(Newlase F3G，Amano EnzymeCo.，Ltd.的产品)(雪白根霉分类学上的分类与得列马根霉相同，都被认定为米根霉)、Rhizomucor miehei脂肪酶(Novo Nordisk Co.，Ltd.的Ribozyme IM或者Berlinger Mannheim的Chirazyme L-9，c.-f.，C2，lyo)和黑曲霉脂肪酶(脂肪酶A，Amano Enzyme Co.，Ltd.的产品)，对这些酶没有特别的限制，因为任何1，3-为特异型脂肪酶都可使用。
脂肪酶所用的形式优选是固定于树脂上的固定化酶，从而对于多不饱和脂肪酸而言增加反应效率，并对重复利用而言具有稳定性。作为固定化的树脂，可使用硅藻土、离子交换树脂、陶瓷、吸附蛋白质的吸附树脂等。作为实例可提到作为硅藻土的粉状硅藻土和粒状硅藻土，作为离子交换树脂的Dowex MARATHON WBA(Dow Chemical)和DIAION WA30(Mitsubishi Chemical)、作为陶瓷的SM-10(NihonGaishi)和作为吸附树脂的DIAION HP20(Mitsubishi Chemical)。
前述离子交换树脂等仅仅作为例子，新改进的树脂不断发展并在商业上供应。这种改进的树脂也被认为适合使用。
<转酯的反应温度和时间>
考虑到酶活性，转酯优选在30-60℃下实施。当使用固定化酶连续实施反应时，考虑到固定化酶的稳定性更优选在30-50℃下实施。反应所需的时间优选尽可能短，但考虑到反应后转酯的油/脂肪的XXA或AAA含量，优选反应实施1-7天。由于原料油和脂肪(富含多不饱和脂肪酸的油和脂肪)在反应期间容易氧化，因而优选以上面所述的方式将氧气除去，并优选反应在无氧条件下实施。
<转酯反应后的纯化>
通过这种方式转酯而改进的油或脂肪可以容易地同酶反应器中(不管是柱反应或是分批反应)的固定化酶相分离出。所制备的油或脂肪的大多数组分为甘油三酯的形式，这些可通过用于油和脂肪纯化的普通方法来进行纯化，比如脱酸、脱胶、脱色、蒸汽蒸馏等。
本发明的油和脂肪是改进的油/脂肪或甘油三酯，其通过对含有微生物产生的多不饱和脂肪酸作为脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯进行脂肪酶转酯而获得的，它们是含有至少20％多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯，所述多不饱和脂肪酸含有20或更多个碳原子以及2个或更多个双键，并且可提到转酯的油/脂肪或甘油三酯含至少40％的具有一个多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯，该多不饱和脂肪酸包含20或更多个碳原子以及2个或更多个双键；和/或至多4.0％的具有3个相同多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯，该多不饱和脂肪酸包含20或更多个碳原子以及2个或更多个双键。
本发明的油和脂肪优选含有至少90％的甘油三酯。油和脂肪可以是其任何形式，但在本发明中，作为转酯的所得产品，它们含有甘油二酯、甘油一酯、并可能含有痕量的游离脂肪酸，以及作为其主要产物的甘油三酯。
本发明的油和脂肪是，例如，含有至少20％花生四烯酸的油/脂肪或甘油三酯。含有至少40％的在分子中带一个花生四烯酸残基的甘油三酯、和/或至多4.0％的AAA的转酯的油/脂肪或甘油三酯具有极多可能性来用作原料以及食品、饲料、化妆品和药物中的添加剂。此外，对于它们使用的目的以及用量，则没有限制。
作为食品组合物的实例，可提到普通食品以及功能性食品、营养增补剂、用于早产儿的改性乳、婴儿的改性乳、母亲食品、孕妇食品(maternal foods)或老年食品。作为含油或脂肪的食品实例，可提到本身含有油和脂肪的天然食品，比如肉、鱼和坚果，在制备中加入油和脂肪的食品，比如汤，使用油或脂肪作为加热介质的食品，比如油炸圈饼，油或脂肪食品，比如黄油，在加工期间添加油或脂肪的加工食品，比如饼干，或者在最终加工期间用油或脂肪进行喷雾或涂覆的食品，比如硬饼干。它们也可加入不含油或脂肪的农业食品、发酵食品、牲畜食品、水产食品或饮料中。它们也可以是功能性食品或药品的形式，例如以肠营养素、粉、颗粒、锭剂、口服液、悬浮液、乳状液、糖浆等形式。
现在通过下面的实施例对本发明作出更详细的解释，应理解的是，本发明不受这些实施例任何限制。
实施例
实施例1 固定化酶的制备(通过固定化1，3-特异性脂肪酶来赋予稳定性以及脱氧)
将100g离子交换树脂(Dowex MARATHON WBA：Dow Chemical)悬浮于80ml得马列根霉脂肪酶溶液中(12.5％Talipase粉，TanabeSeiyaku的产品)，之后在减压下将悬浮液干燥从而获得固定化酶。接着，秤取含40％花生四烯酸的甘油三酯(SUNTGA40S，Sunt ory Co.，Ltd.的商品名)(25g)、棕榈油(15g)、前述固定化脂肪酶(4g)和水(800g)放入可密封的瓶中。将半开的瓶置于干燥器中，并将真空泵与之连接以便使内含物减压。(油中，从固定化酶树脂中产生气泡，所述固定化酶树脂与油一起位于内的瓶中，从而释放出固定化酶中含有的空气。)然后将氮气放入干燥器中来将干燥器内恢复到普通压力。重复减压和恢复步骤，从而使氮取代固定化树脂基体中的氧，并密封瓶。为活化固定化酶，将瓶在30℃下摇晃(100rpm)24小时。在活化完成后，除去用于活化的油，并再一次实施脱氧步骤来获得经活化的固定化酶。对于与其他植物油或脂肪的转酯而言，用于转酯的植物脂肪或油并非是用于固定化酶活化的棕榈油，而是SUNTGA40S(25g)、植物油(15g)、固定化脂肪酶(2g)和水(800μl)与前述棕榈油的混合物，并且为脂交换而实施脱氧和固定化酶活化步骤。实施例2测定油/脂肪的脂肪酸含量的方法
用大约10-10mg带螺帽试管对油或脂肪取样，并加入2mL的甲醇-盐酸和1mL的二氯甲烷，密封试管的顶部，并在50℃下实施反应3小时。反应完成后，将混合物冷却到室温，然后加入己烷来提取脂肪酸甲酯，并在减压下浓缩所收集到的己烷层。将所获得的脂肪酸甲酯溶解于己烷，并使总的脂肪酸甲酯浓度为约1％，并用于气相色谱(GC)分析。GC分析条件和成分确定根据“Fatty Acid Compositionby GLC(Method Ce 1b-89)″of Official Methods and RecommendedPractices of the AOCS，第5版(American Oil Chemists′Society，1998)，并使用Supelcowax-10柱。花生四烯酸甲酯峰面积与所检测总峰面积的比例被作为油/脂肪中的花生四烯酸含量。除花生四烯酸外，通过同样方法来测定其他脂肪酸的脂肪酸含量。
实施例3 甘油三酯分析方法
在下述条件下实施HPLC分析，来测定通过酶反应改性的油或脂肪中每一种甘油三酯的含量。
柱：反相柱(Cosmosil 4.6x250mm 5C18-MS)
溶剂：丙酮∶乙腈(1∶1)1ml/min
分析时间：55分钟
柱炉温度：40℃
检测器：折光率检测器(单元温度：40℃)
样本：油/脂肪或甘油三酯在氯仿中的10％溶液5μl
在上述测定条件下分析每一种甘油三酯。根据日本未审查专利公开No.2000-513575中公开的方法来测定每一种甘油三酯的分子种类。具体而言，分离出每一种甘油三酯的峰，然后通过甲酯转化来分析。通过GC来测定分子种类。通过分析通过上述方法由SUNTGA40S和转酯而获得的油/脂肪的甘油三酯并进行计算，可以测定SUNTGA40S花生四烯酸的形式以及每一种XXA甘油三酯的比例和含量。XXA代表LLA、PGA、OLA、PLA、OOA、POA、PPA、SOA、PSA、SSA和LC22A的总重量百分比。此处所用符号的意义如下。L：亚油酸；P：棕榈酸；G：γ-亚麻酸；O：油酸；S：硬脂酸；C22：线性饱和C22脂肪酸；X：除花生四烯酸之外的脂肪酸；A：花生四烯酸。(没有规定每个脂肪酸残基在甘油上的结合位置，)
实施例4 含花生四烯酸的油/脂肪的改性(SUNTGA40S；大约40％为花生四烯酸)、使用实施例1中获得的经活化的固定化脂肪酶
通过摇晃(100rpm)用下表3所示的原料组合物来实施酶反应，在取样以证实转酯反应的程度期间继续反应。通过取样油的甘油三酯分析来测定AAA转化。
表3 反应的原料组合物
  SUNTGA40S   25g
  棕榈油或大豆油   15g
  固定化脂肪酶   2g
图1表示AAA含量的转化，其始于用含花生四烯酸的油与诸如棕榈油和大豆油等植物油进行结合和转酯，上述含花生四烯酸的油作为一类富含多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯。既使用富含饱和脂肪酸的棕榈油转酯得到的AAA下降率也与用富含不饱和脂肪酸的基于亚油酸的大豆油的结果相似。
这说明了只要混合比例相同，则根据本发明AAA消失的比率是相同的，而不管所使用植物油的类型。
实施例5 CDM测试
为了证实酶转化的富含花生四烯酸的油的氧化稳定性，准备测试样本，并通过CDM测试来测定氧化稳定性。CDM测试通过下述方式实施：在反应器中加热油样本(恒温下)，同时吹入清洁空气并将氧化产生的挥发性分解产物捕获在水中。油样本的稳定性以下述方式表示：至水的传导率发生剧变的这个点所消逝的时间。时间越短，则表示油越容易受到氧化损害。
基于实施例3，往原料油(40g)中添加2倍量的固定化酶(经活化的)(4g)，并在30℃、100rpm下实施反应。反应之后，用倾析法分离出油和固定化酶，从而获得反应油。用HPLC来分析所获油的AAA含量，并同CDM测试来测定稳定性。改变反应时间以获得具有不同AAA含量的改性油1和改性油2。
表4 改性油(转酯油)的AAA含量和稳定性
样本  CDM(hr)  AAA含量(％)
棕榈油/SUNTGA40S改性油1改性油2未改性油 6.45.74.6 3.904.446.46
棕榈油/SUNTGA40S改性油1改性油2未改性油 4.13.63.5 3.694.287.01
如表4所示，当饱和脂肪酸油、棕榈油被用作反应中的原料植物油时，有问题的AAA含量得以减少，而油对氧化的稳定性则增加。
另一方面，当亚油酸油、大豆油被用作反应中的原料时，观察到与棕榈油相似的AAA减少，但通过CDM测定，对稳定性的作用并不如棕榈油一样显著。
实施例6 随着以棕榈油稀释的富含花生四烯酸的油(SUNTGA40S)的转酯时间的成分变化、
真菌产生的富含花生四烯酸的油含有丰富的AAA，因此，通过脂肪酶转酯反应将AAA转化成XXA，以接近母乳中花生四烯酸(XXA)的形式，在成分比例随着时间的进程和改变通过实验加以测定。
图5甘油三酯成分在转酯反应中随时间的变化
Figure C0382411900231
通过实施例1中的方法将固定化酶活化，然后往2g经活化的固定化酶中加入25g的SUNTGA40S和15g棕榈油，接着在30℃下通过反应而脱氧。在不同时间取样，并通过实施例2中所述的方法(HPLC分析)来分析甘油三酯，计算每种成分的含量。如表5所示，AAA随着时间下降，而预期的转化产物XXA则上升。在这些条件下，AAA下降约1/2而XXA至少翻倍，需要从混合油开始起1星期的时间。然后，实施下述实施例来最优化反应温度和固定化酶添加量。
实施例7 转酯反应期间反应温度的影响
使用实施例1中制备的固定化酶来检测反应温度对转酯的影响。通过实施例1中的方法将固定化酶活化，然后往2g经活化的固定化酶中加入25g的SUNTGA40S和15g棕榈油，脱氧后接着在不同温度下反应。在反应1天后取样，并通过实施例2中所述的方法(HPLC分析)来分析甘油三酯，计算AAA残基的含量(表6)。
表6 温度对酯化反应的影响
 反应温度  AAA残基(％)   AAA减少(％，每24小时)
 反应之前  6.37
 30℃  5.86   9％
 45℃  4.50   29％
 55℃  2.43   62％
由于转酯反应通常在60℃下实施，因此在30℃、45℃和55℃下实施该反应，并证实了反应性。如表中所示，证实了转酯反应在较高反应温度下进行得更有效率。因此，从防止高温下反应期间氧化损害的角度看，脱氧步骤是重要的。
实施例8 用含有固定化Rhizomucor miehei脂肪酶的酶制剂进行检测
以实施例5中相同的方式，通过以10％添加的酶以及使用被棕榈油稀释的SUNTGA40S(Suntory Co.，Ltd.的商品名)，对下述酶的转酯活性作对比：实施例1中固定化并活化的得列马根霉脂肪酶，以及市售的R.miehei固定化脂肪酶(Chirazyme L-9，c.-f.，C2，lyo，Berlinger Mannheim的产品)，该市售产品不需要用水活化。
表7 用得列马根霉和R.miehei的转酯反应的对比
  分子种类   得列马根霉   R.miehei
  AAA   2.86   2.53
  XAA   14.95   14.05
  XXA   43.33   44.20
通过实施例3中所述的方法(HPLC分析)来对每一种甘油三酯进行分析，并计算每一种成分含量。如图7所示，两种酶反应都在45℃下实施48小时，对于两种酶而言，AAA下降的比率和XXA上升的比例都大致相等，这意味着它们适合用于转酯反应。
实施例9 通过转酯反应改进花生四烯酸
本发明人已经开发了一种方法来获得一种微生物，该微生物能产生包含花生四烯酸作为主要脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯，以及通过培养属于被孢霉属的微生物，以工业化规模的发酵生产来获得纯化的油和脂肪(参见Higashiyama等，Enhancement of Arachidonic AcidProduction by Mortierella alpina 1S-4，J.Am.Oil Chem.Soc.，75，pp.1501-1505(1998))。以包含花生四烯酸作为主要脂肪酸组成的油/脂肪和甘油三酯为原料、并使用脱氧、活化的固定化酶(得列马根霉脂肪酶)、以及用棕榈油为植物油/脂肪完成了转酯，上述作为原料的油/脂肪和甘油三酯通过前述方法获得，酶通过实施例1的方法获得。将包含40wt％花生四烯酸作为主要脂肪酸组成的油/脂肪(250g)、棕榈油(150g)和固定化酶(40g)在45℃下反应48小时。反应原料油/脂肪的97％部分为甘油三酯的形式，并且花生四烯酸作为主要的脂肪酸组成存在，三花生四烯酸构成甘油三酯的6.37％。将转酯获得的油过滤，以分离出固定化酶，获得385g富含花生四烯酸的油/脂肪或甘油三酯，其含有95.1％的甘油三酯、2.83％的AAA和42.3％的XXA(具有单键合的花生四烯酸残基的单花生四烯酸)。
实施例10 通过转酯改进富含双同-γ-亚麻酸(DGLA)的油/脂肪
本发明人也已经开发了一种方法来获得一种微生物，该微生物能产生包含双同-γ-亚麻酸作为主要脂肪酸组成的油/脂肪或甘油三酯，以及通过变异属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物，以工业化规模的发酵生产来获得纯化的油和脂肪(参见日本未审查专利公开No.5-91887)。以包含DGLA作为主要脂肪酸组成的油/脂肪和甘油三酯为原料、并使用脱氧、活化的固定化酶(得列马根霉脂肪酶)、以及用棕榈油为植物油/脂肪，完成了转酯，上述作为原料的油/脂肪和甘油三酯通过前述方法获得，酶通过实施例1的方法获得。将包含40wt％DGLA作为主要脂肪酸组成的油/脂肪(25g)、棕榈油(15g)和固定化酶(4g)在45℃下反应48小时。在反应开始，甘油三酯构成了97.2％，DGLA构成了脂肪酸组成的25％，三-双同-γ-亚麻酸(DDD)构成了甘油三酯的6.09％。反应后，甘油三酯构成了95.3％，DDD下降到甘油三酯的3.03％，因此，在含有DGLA作为主要脂肪酸组成的油/脂肪中，DGLA得以减少，这与含花生四烯酸的油/脂肪或甘油三酯相似。
实施例11 含花生四烯酸的油/脂肪的制备(粗制油)
使用高山被孢霉CBS754.68作为产花生四烯酸的菌株。将保藏的细胞接种到pH为6.3的1％酵母提取物、2％葡萄糖培养基中，在100rpm的搅拌速度以及28℃的温度下开始种子培养(第一阶段)，并持续3天。在50L体积的浸没培养桶中，制备30L pH为6.3的1％酵母提取物、2％葡萄糖和0.1％大豆油的培养基，之后往其中加入种子培养液(第一阶段)，在200rpm的搅拌速度、28℃的温度以及150kPa的内压下开始种子培养(第二阶段)，并持续2天。接下来，将4500L培养基(培养基A：270kg大豆粉，16.2kg KH2PO4，2.7kgMgCl2·6H2O，2.7kg CaCl2·6H2O，54kg大豆油)在121℃下灭菌20分钟。同样，将800L分离培养基(培养基B：108kg含水葡萄糖)在140℃下灭菌40秒，并加入前述培养基A中来制备成培养基C。将培养基C调节到pH 6.1之后，将种子培养液(第二阶段)转移到总量为5400L的初始培养体积中(10kL培养桶体积)。在26℃的温度、49Nm3/hr的气流和200kPa内压下开始培养。喂料培养如表8所示来进行，主培养实施210小时。培养完成后，培养液体积为7100L，这是由于喂料培养而上升以及由于蒸发而下降的结果。
表8 实施例1的喂料培养
  主培养时间   喂料培养
  19小时后   (243kg含水葡萄糖+54kg大豆油)/400L
  43小时后   243kg含水葡萄糖/400L
  67小时后   216kg含水葡萄糖/380L
  91小时后   162kg含水葡萄糖/300L
  120小时后   108kg含水葡萄糖/200L
培养完成后，在120℃下实施灭菌20分钟，然后用压滤机收集湿细胞，并用流化床干燥器将其干燥到2wt％的含水量，再用风力输送机将干细胞输送到包装位置。将所获干细胞与氮气一起包装入约100L体积的铝袋中，在密封袋口后，在低于10℃下的冷藏机中存储。
从容器袋中取出的干细胞用己烷进行提取，在过滤己烷溶液以除去固体部分之后，在减压下加热以除去己烷，并获得含有花生四烯酸
作为脂肪酸组成的粗制油。
粗制油的分析显示出94％为甘油三酯以及总脂肪酸的29.6％为花生四烯酸含量。
实施例12 实施例11中制备的油的转酯
实施例11中制备的含29.6％花生四烯酸的粗制油(94％甘油三酯)在不添加植物油或脂肪时用脂肪酶转酯进行处理，以尝试改进粗制油。使用得列马根霉的固定化脂肪酶，并用实施例1中所示方法脱氧和活化，将固定化酶(4g)加入含29.6％花生四烯酸的粗制油(40g)中，在45℃下摇晃实施反应48小时。在反应开始时，油具有6.28％AAA和24.15％XXA的组成，而在反应完成时，转化成了3.21％AAA和40.37％XXA的组成。当使用粗制油时，发现改进的油得以转酯，这与含有微生物产生的多不饱和脂肪酸为主要脂肪酸组成的油(实施例6和8中)的转酯相似，而没有特定添加植物油或脂肪。
实施例13 加入奶中
将实施例9中获得的0.44g部分的改性油(新的转酯油)加入100g奶粉中，从而制成与人母乳相接近的改性乳。该改性乳含有占总脂肪酸0.5％比例的花生四烯酸。
实施例14 加入黄油中
将实施例9中获得的1.97g部分的改性油(新的转酯油)加入100g黄油脂肪中，所述黄油脂肪在黄油生产过程期间通过搅乳去除了黄油乳。将该混合物加工成均匀的组合物以获得添加花生四烯酸的黄油。
实施例15 加入果汁中
将2g部分的β-糊精加入20ml的20％乙醇水溶液中，然后加入100mg实施例9中获得的改性油1(新的转酯油)，其含有0.05wt％的维生素E，同时用搅拌器进行搅拌，并将混合物在50℃下培养2小时。在冷却到室温后(大约1小时)，在4℃下持续温育10小时并持续搅拌。通过离心分离来回收所产生的沉淀，用正己烷冲洗后，将其冻干以获得1.8g环状糊精包合的化合物，其含有包含花生四烯酸的甘油三酯。将1g部分的这种粉与10L果汁均匀混合，从而制备成含有转酯油的果汁，该转酯油中包含花生四烯酸。
实施例16 通过转酯制备在同一分子中包含中链脂肪酸和花生四烯酸的甘油三酯、以及纯化该油/脂肪
由实施例1方法制备的固定化脂肪酶用实施例1中的脱氧和活化进行处理。具体而言，将含有40％花生四烯酸的甘油三酯(SUNTGA40S，Suntory Co.，Ltd.的商品名)(200g)、MCT(COCONARD RT，KaoCorp.的商品名)(200g)、前述固定化的脂肪酶(40g)和水(8ml)放置于可封密瓶中，并用实施例1中的脱氧和酶活化步骤进行处理。
除去用于活化步骤的油，然后往含有固定化酶的瓶中重新加入SUNTGA40S(200g)和MCT(200g)，之后在30℃下摇晃48小时(100rpm)。
反应完成后，从瓶中取出油，并通过实施例3中所述的HPLC来分析转酯油的甘油三酯。分析结果见表9。HPLC方法不能对通过转酯获得的含有中链脂肪酸和花生四烯酸的甘油三酯进行分别分析(例如，在1、2位具有辛酸以及在3位具有花生四烯酸的甘油三酯(88A)，在1、3位具有辛酸以及在2位具有花生四烯酸的甘油三酯(8A8)等)。因此，为对88A和8A8进行分别分析，结合了GC分析(条件如下所示)。88A在气相色谱第17.01分钟出现，而8A8在第17.15分钟出现。
反应所得每一种甘油三酯的含量见表10。
[GC分析方法]
柱：Frontier Ultra ALLOY UA-17-15M-0.1F(15m×0.25mm×0.1μm)
柱温度：260℃-(1℃/分钟)-290℃-(10℃/分钟)-390℃(5分钟)
分析时间：45分钟
注射口温度：310℃
检测器温度：370℃(氢电离检测器)
运载气体：氦
线速：40cm/分钟
样本：注入1μl的1％油(甘油三酯)的己烷溶液
分析后剩余的转酯油用分子蒸馏来处理，从而除去在反应后剩余MCT的大约85％。
表9 甘油三酯的比例HPLC分析结果
  甘油三酯   反应前(wt％)   反应后(wt％)
  8A8等8P88L8808AAA8AAGAALAAPAASAAC22AAC24AALLAPGAOLAPLAOOAPOAPPASOAPSASSALAC22888其他甘油三酯   0.000.000.000.004.840.000.793.065.553.971.303.720.551.880.673.040.602.971.320.901.300.930.5750.0012.04   15.876.966.5815.231.676.250.002.864.711.450.280.521.450.910.281.010.000.840.410.700.230.440.2723.277.81
8A8等：8A8(88A、8A8)、8G8、8D8的混合物
脂肪酸以文字符号代表(没有具体说明甘油骨架上的结合位置)(表中除88A和8A8之外的甘油三酯的甘油骨架位置没有在表中具体说明。)脂肪酸符号：8：辛酸；A：花生四烯酸；D：DGLA；P：棕榈油；S：硬脂酸；O：油酸；G：γ-亚麻酸；L：亚油酸；C22：C22饱和线性脂肪酸；C24：C24饱和线性脂肪酸。
表10 甘油三酯的比例GC和HPLC分析结果
  甘油三酯   反应前(wt％)   反应后(wt％)
  88A8A888G+8G888D+8D888L+8L888P+8P8880+8088AA+A8AAAAXAA+AXAXXA+XAX888其他甘油三酯   0.000.000.000.000.000.000.000.004.8418.3914.7350.0012.04   8.365.370.351.796.586.9615.236.251.679.826.5423.277.81
甘油三酯以它们脂肪酸组成的类型来代表，表中所示各脂肪酸的结合位置为1、2、3和3、2、1的次序。甘油三酯中甘油的2位是不对称碳原子，因此从严格意义上讲，1和3位在空间排列上是不同的。但是，由于1和3位在生理学意义上而言是基本等效的，这可以从脂肪酶的识别上得以证明，因此，即使两个末端在中心脂肪酸(位置2)旁调换，甘油三酯也被认为是相同的。
表中符号的解释
脂肪酸以字母数字来代表。
脂肪酸符号：A：花生四烯酸；D：DGLA；P：棕榈油；S：硬脂酸；O：油酸；G：γ-亚麻酸；L：亚油酸；C22：C22饱和线性脂肪酸；C24：C24饱和线性脂肪酸。
XAA+AXA：GAA、LAA、PAA、SAA、C22AA、C24AA的总量
XXA+XAX：LLA、PGA、OLA、PLA、OOA、POA、PPA、SOA、PSA、SSA、LAC22的总量
以XXA或XXA代表的特定甘油三酯(比如PGA)的脂肪酸结合位置没有具体说明。其特定含量见表9。

Claims (24)

1.一种转酯的油/脂肪或甘油三酯的生产方法，其使用1，3-位特异型脂肪酶，使50-100重量份的一种或多种由真菌产生的包含至少20％多不饱和脂肪酸的油/脂肪或甘油三酯与0-50重量份的一种或多种植物油/脂肪或甘油三酯进行转酯，其中前者的多不饱和脂肪酸包含20或更多个碳原子以及2个或更多双键，其中所得转酯的油/脂肪或甘油三酯包含至少20％的多不饱和脂肪酸，该多不饱和脂肪酸含有20或更多个碳原子以及2个或更多个双键，并且所述油/脂肪或甘油三酯包含至少40％的具有一个多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯，该多不饱和脂肪酸在分子中包含20或更多个碳原子以及2个或更多个双键；和/或至多4.0％的具有3个相同的多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯，该多不饱和脂肪酸包含20或更多个碳原子以及2个或更多个双键。
2.根据权利要求1的生产方法，其中转酯反应在脱氧状态下进行。
3.根据权利要求1或2的生产方法，其中真菌产生的脂肪酸是含20或更多个碳原子以及2个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸。
4.根据权利要求1或2的生产方法，其中真菌产生的脂肪酸是含20或更多个碳原子以及2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸。
5.根据权利要求1或2的生产方法，其中真菌产生的脂肪酸是花生四烯酸。
6.根据权利要求1或2的生产方法，其中脂肪酸是由属于被孢霉属的微生物产生的花生四烯酸。
7.根据权利要求1或2的生产方法，其中真菌产生的脂肪酸是双同-γ-亚麻酸。
8.根据权利要求1或2的生产方法，其中真菌产生的脂肪酸是蜂蜜酸。
9.根据权利要求1-8任一项的生产方法，其中，脂肪酶是由得列马根霉、雪白根霉、Rhizomucor miehei或米根霉产生的脂肪酶。
10.一种转酯的油/脂肪或甘油三酯，其由权利要求1-9任一项的生产方法而获得。
11.一种转酯的油/脂肪或甘油三酯，其由权利要求1-9任一项的生产方法而获得并包含至少20％的多不饱和脂肪酸，该多不饱和脂肪酸含有20或更多个碳原子以及2个或更多个双键，并且所述油/脂肪或甘油三酯包含至少40％的具有一个多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯，该多不饱和脂肪酸在分子中包含20或更多个碳原子以及2个或更多个双键；和/或至多4.0％的具有3个相同的多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯，该多不饱和脂肪酸包含20或更多个碳原子以及2个或更多个双键。
12.根据权利要求11的转酯的油/脂肪或甘油三酯，其中所述油/脂肪或甘油三酯包含至少20％的由真菌产生的ω6系列多不饱和脂肪酸。
13.根据权利要求11的转酯的油/脂肪或甘油三酯，其中所述油/脂肪或甘油三酯包含至少15％的由真菌产生的ω9系列多不饱和脂肪酸。
14.根据权利要求11的转酯的油/脂肪或甘油三酯，其中所述油/脂肪或甘油三酯包含至少20％的花生四烯酸。
15.根据权利要求11的转酯的油/脂肪或甘油三酯，其中所述油/脂肪或甘油三酯包含至少20％的双同-γ-亚麻酸。
16.根据权利要求11的转酯的油/脂肪或甘油三酯，其中所述油/脂肪或甘油三酯包含至少20％的蜂蜜酸。
17.一种人营养组合物，其含有根据权利要求10-16任一项的油/脂肪或甘油三酯。
18.一种食品组合物，其含有根据权利要求10-16任一项的油/脂肪或甘油三酯。
19.根据权利要求18的食品组合物，其特征在于该食品组合物是功能性食品。
20.根据权利要求18的食品组合物，其特征在于该食品组合物是早产儿的改性乳。
21.根据权利要求18的食品组合物，其特征在于该食品组合物是婴儿的改性乳。
22.权利要求18的食品组合物，其特征在于该食品组合物是婴儿食品、母亲食品或老年食品。
23.权利要求18的食品组合物，其特征在于该食品组合物是营养补品。
24.一种动物饲料，其含有根据权利要求10-16任一项的油/脂肪或甘油三酯。
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